Summary
Formålet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af de anbefalede procedurer til at evaluere respiratoriske funktion i bevidst mus ved dobbelt-kammer plethysmography.
Abstract
Air volumen forandringer skabt af en bevidst vejrtrækning spontant inden for en krop boks er på grundlag af plethysmography, en teknik, der anvendes til ikke-invasivt vurdere nogle funktioner af den respiratoriske funktion hos mennesker og forsøgsdyr. Denne artikel fokuserer på anvendelse af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) i små dyr. Det indeholder baggrundsoplysninger om metoden samt en detaljeret, trinvis fremgangsmåde med succes vurdere respiratoriske funktion i bevidst, spontant vejrtrækning dyr i en ikke-invasiv måde. DCP kan bruges til at overvåge den respiratoriske funktion af flere dyr i parallel samt identificere forandringer som følge af aerosolmaterialer stoffer over en valgte tidsperiode og gentagne måde. Forsøg på kontrol og allergisk mus anvendes heri til at påvise nytten af teknikken, forklare de tilknyttede resultat parametre, samt for at diskutere de dermed forbundne fordele og mangler. Samlet set giver DCP gyldig og teoretisk set forsvarligt udlæsninger, der kan have tillid til at evaluere den respiratoriske funktion bevidst små dyr både ved baseline og efter udfordringer med aerosolmaterialer stoffer.
Introduction
Den stigende brug af små dyr til model menneskelige luftvejssygdomme har opfordret udviklingen af teknikker til at vurdere kvantitativt funktioner i åndedrætsorganerne hos disse dyr. I øjeblikket, er tvungen svingning teknik (FOT) anerkendt som den mest præcise metode til at vurdere respiratorisk mekanik i små dyr1,2. Dog, som anført af fænotyper ubestemthedsprincippet, hvad er fået i målingen præcision med FOT handles ud mod et tab i noninvasiveness3. Faktisk, FOT målinger er erhvervet under stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser, der nødvendiggør anæstesi, tracheotomi eller mundtlige intubation samt mekanisk ventilation; et scenario langt fra virkelighedens.
I situationer hvor de eksperimentelle krav forbyde brugen af bedøvelsesmiddel agenter eller ring for lidt eller ingen afvigelse fra dyrets naturlige fysiologiske tilstand, kan dobbelt-kammer plethysmography (DCP) overvejes. Som navnet antyder, består en DCP setup af to forbundne stive chambers byggede for at isolere så hermetisk som muligt dyrets hoved (eller næse), i den forreste kammer, fra sin brystkasse, i den bageste kammer. Inden for opsætning, dyret er bevidst og ånder spontant samtidig med at være tilbageholdende. Fordi væggene i afdelingerne ikke kan udvide eller trække, genererer bevægelse af luft og-ud af dyret en tilsvarende men modsatte bølgeform indeni den bageste kammer, som følge af kompression/dekompression af den omgivende luft. Bølgeform på grund af nasal flow i den forreste kammer, og den vedrører de thorax bevægelse i den bageste kammer kan således adskilt og erobrede samtidig. Afhængigt af opsætningen af DCP design kan disse bølgeformer erhverves ved hjælp af et sæt af enten Tryktransducere eller pneumotachographs henholdsvis registrere ændringerne i kammeret pres eller luftstrømmen og-ud for afdelingerne som funktion af tiden. Den sidstnævnte metode er mere almindelig i dag.
Mens dyrets vejrtrækning frekvens kan bestemmes nøjagtigt ved enhver form for plethysmography teknikker, er situationen ikke det samme for bestemmelse af tidalvolumen og dens relaterede ventilation parametre (fx, minutventilation, ekspiratorisk volumen, osv.). I modsætning til hel-krops plethysmograph (WBP) teknik, hvor anslås dyrets tidalvolumen fra box signal4,5, giver DCP teknik nøjagtige vurderinger af tidalvolumen. Dette er relateret til direkte erhvervelse af dyrets bryst bevægelse i den bageste kammer, som er proportionalt med ændringerne i lunge volumen i løbet af vejrtrækning.
Ud over disse nøjagtige respiratorafhængige parametre (f.eks.tidalvolumen, vejrtrækning frekvens og minutventilation), nogle forstyrrelser i form af respiratorisk cyklus kan også bruges til at undersøge neuronal aspekter, der styrer den respiratorisk drev eller respiratorisk reflekser. Et konkret eksempel på denne anvendelse ville være evaluering af inhalerede stoffer på de øvre luftveje sensoriske neuroner6irritation potentiale. Varigheden af en pause i starten af udløb bestemmes her, ved hjælp af en parameter kaldet ende-inspiratory pause (EIP), også kaldet varighed af bremsekraft6. Forlængelsen af denne pause af et irriterende stof er forbundet med lukningen af dyrets glottis, forårsager en målbar periode af opbremsning i den første del af udløb6,7.
En anden vigtig fordel ved DCP er, at det giver to validerede og ubestridte parametre, der er følsomme over for airflow obstruktion. En kaldes strømmen på midten af tidevands ekspirationsvolumen og er forkortet EF508,9,10. Det er luftgennemstrømning ved midway volumen af hver tidevandsenergi ånde under udånding. EF50 er udvundet fra sporingen af thorax flow og kan således måles uden den forreste kammer (dvs., i en hoved-out konfiguration). Anden, kaldes specifikke luftvejs modstand og er forkortet sRaw11,12,13. Bestemmelse af sRaw kræver den samtidige optagelse af dyrets nasal og thorax strømme, som det er beregnet fra tidsforsinkelse mellem disse separate respiratorisk spor på nul flow i slutningen af inspiration. Den logik, der beskriver grundlaget, som vedrører denne forsinkelse sRaw var expatiated tidligere11. Put blot, foran ændringer i lunge volumen luftbevægelse, da en trykgradient behov for at udvikle for at drive luftstrøm. I et sundt dyr trække vejret roligt, er denne forsinkelse typisk meget små. Dog er den trykgradient, der er nødvendige for at rumme et givet flow (f.eks, en flow tilstrækkeligt til at give tilstrækkelig ventilation) påvirket af graden af luftvejene modstand. Under bronchoconstriction, for eksempel, er gradienten af tryk der er nødvendige til at rumme en given flow større, hvilket indebærer, at dyret har til at arbejde hårdere for vejrtrækning. En større graduering af trykket i dyrets thorax indebærer også, at en større del af strømmen og-ud af den bageste afdeling er dekompression/kompression af luft i brystkassen, som er del af den samlede thorax udvidelse/sammentrækning, der er ude af fase med nasal strømmen. Den øgede modstand på grund af bronchoconstriction vil således øge forsinkelse mellem bageste og forreste afdelingerne og øger dermed sRaw. Gradienten af pres, der driver luftstrømmen og-ud af lungerne er også påvirket af den oprindelige thorax volumen (TGV). På en større TGV for eksempel udvidelse/sammentrækning af thorax nødvendige for at generere en given gradient pres er større (simpelthen fordi volumen forskydning, der er nødvendige for at generere en given gradient pres er større), hvilket også indebærer at den dyret har til at arbejde hårdere for vejrtrækning. Igen, disse ekstra thorax forskydninger er dem, der kræves for at dekomprimere/komprimere luft i brystkassen og er dermed ude af fase med nasal strømmen. Så, en øget TGV vil også øge forsinkelse mellem afdelingerne og øger dermed sRaw. Som det kan ses, resultere både bronchoconstriction og øget TGV i en mere vigtigt forsøg på at trække luft og-ud af lungerne. Dette er i det væsentlige den fysiologiske betydning af sRaw. Det repræsenterer det arbejde, der kræves for vejrtrækning5,14.
Det er således vigtigt at forstå, at to forskellige faktorer påvirker sRaw: luftvejene modstand og TGV. I virkeligheden, kan sRaw udtrykkes som et produkt af luftvejene modstand og TGV11. Bevidst dyr kan ændre deres TGV efter forgodtbefindende, at tilpasse deres ventilation til et givet miljø. Under sådanne forhold, hvor dyrets naturlige fysiologiske tilstand er uændret, er det således umuligt at skelne, om en ændring i sRaw stammer fra en ændring i luftvejene modstand, fra en ændring i TGV, eller fra en blanding af to. Derfor anbefales det at supplere DCP evaluering med mere invasive målinger af respiratorisk mekanik og/eller lunge diskenheder, som de leveres af FOT1,15.
Til dato, har DCP været brugt i forskellige forskning applikationer. Teknikken kan bruges med eller uden hoved salen til kvantitativt og vurdere præcist effekten af forskellige stoffer, såsom apoteksagenter, allergener, lokalirriterende eller andre mæglere på respiratoriske funktion i bevidst små dyr 16,17,18. Den forreste kammer kan også bruges som en udsætter kammer aerosolmaterialer stoffer eller varierende gas koncentrationer (hypoxi, hyperkapni, etc.)19. Bekvemt, det gør det muligt samtidig måle akutte virkninger disse engagementer. Faktisk er en af de almindelige anvendelser af DCP at vurdere graden af lydhørhed over for aerosolmaterialer methacholine i forskellige modeller af luftvejssygdomme20,21,22,23, 24 , 25.
Selv om DCP teknik er tilsyneladende enkle, kunne nogle praktiske udfordringer potentielt afskrække uerfarne brugere eller forringe den præcision og reproducerbarhed af resultaterne. Den nuværende papir giver en detaljeret beskrivelse af de anbefalede procedurer til korrekt optage respiratoriske funktion af DCP i bevidst, tilbageholdende, spontant vejrtrækning mus. Beskrivelsen er specifikke for den angivne udstyr (henvises til Tabel af materialer). Den nytte og værdi af DCP er også påvist i en fælles model for pulmonal allergisk betændelse i to stammer af mus testet ved baseline og svar på aerosolmaterialer methacholine.
Protocol
Følgende procedurer blev godkendt af Quebec hjerte og lunge Institute Animal Care Udvalget i overensstemmelse med retningslinjerne i den canadiske Rådet på Animal Care (CCAC).
1. forberedelse
- Undersøgelse
- (Kritisk) Før du udfører et eksperiment, indhente relevante godkendelser (f.eks. IACUC) og kurser (f.eks. dyr håndtering).
- Gør dig bekendt med udstyret og de driver software. Læs brugermanualer, og hvis det er nødvendigt, oprette en konfigurationsfil til at definere antallet websteder, input signaler, analysatorer og parametre.
Bemærk: Sørg for at vælge en høj samplingfrekvens (2 KHz). - Konfigurere indstillingerne analysatorer for parametrene for interesse.
- Vælg Tuning på værktøjslinjen og derefter analysatorer.
- Justere flow tærsklen til en værdi, der korrekt adskiller åndedræt (mus: 0,5 mL/s) og vælge Ti + Te til at beregne den vejrtrækning.
- Angive en værdi for lufttryk (760 mm Hg) og angive den maksimale afvigelse af inspiratory/ekspiratorisk volumen for en ånde skal betragtes som lovlig (mus: 20%).
- Klik på indstillingen i feltet beregnet parametre til at justere grænserne for accept.
Bemærk: Følgende indstillinger blev brugt til de beskrevne mus eksperimenter: Inspiration tid, 50-170 ms; udløbstid, 40 til 180 ms; frekvensen af vejrtrækningen, 30 til 450 bpm; specifikke luftvejs modstand, 0 til 15 cmH2O·s; midexpiratory flow med en præcision af mindst 3 decimaler. - Når du er færdig, skal du vælge Anvend og luk for at afslutte dialog rude.
- Bar-menuen værktøj, gå til Tuning igen og derefter Storage for at indstille en ønskede data opbevaring sats. Klik på Anvend og luk for at forlade vinduet.
Bemærk: Et gennemsnit på hver 10 s bruges typisk. - Oprette en protokol inden for den driver software til at definere en sekvens af kommandoer og den ønskede timing for hver enkelt. Et eksempel er vist i figur 1.
- Hvis forsøget omfatter administration af et stof af aerosol, forberede passende løsninger og fortyndinger efter koncentrationer skal testes.
- Dyr
- Arbejde i et roligt område langt fra boliger værelse. Tillade, at dyr til at tilpasse sig ændringer i miljøet.
- Vejes dyrene og vælg den passende tilbageholdenhed størrelse.
- (Kritisk) Vænne dyrene til Tilbageholderen og procedurer før starten af forsøget. Afhængigt af det eksperimentelle design, flere acclimation sessioner for at øge varighed (f.eks. 5-30 min) kan være nødvendigt.
Bemærk: Dyr, der ikke acclimate bør fjernes fra undersøgelsen.- Ved hver acclimation session, Indsæt dyr inden for Tilbageholderen, fra den tilbage åbne; holder enheden vertikalt kan være nyttige.
- Når dyret er i position, indsætte tilbage stemplet og forsigtigt låse det på plads uden at anvende en overdreven kraft.
- (Kritisk) Kontroller visuelt at dyret ånder normalt. Hvis det er nødvendigt, justere sin position ved at flytte låsemekanismen. Sørg for, at dyrets nares fremspringende uden for næsen-kegle med sin snude hviler mod de indvendige vægge af Tilbageholderen.
- Frigøre bagpanelet af thorax salen, indsætte Tilbageholderen indeholdende dyr gennem gummi åbning i thorax salen og lukke salen.
- Vedhæfte den hoved kammer og give en bias flow. Bruge en strøm af 0,5 L/min for en mus.
- Tillad dyret til at slappe af i 5 min.
- Når dyret er rolig, starte optagelse af nasal og thorax flow signaler. Kontrol på computerskærmen, at sporene er glat og at de viser en regelmæssig åndedrætsmønster; Se eksemplet i figur 2.
Bemærk: Hvis protokollen indebærer aerosol administration af et stof, kan en saltvand udfordring medtages i acclimation procedure. - I slutningen af hver session, fjerne dyret fra thorax kammeret og Tilbageholderen og returnere det til sin bolig bur og værelse.
- Udstyr
- Start en eksperimentel session på dagen af forsøget, og indlæse den passende konfigurationsfil.
Bemærk: Kontroller, at det indeholder den ønskede protokol for eksperimentet. - Gå til Kør i menuen værktøj advokatstanden. Angiv eksperimentet og dyrets oplysninger. Når det er gjort, klik på knappen Run i bunden af vinduet.
- Fortsætte med kalibrering af systemet. Kalibrere hvert websted og input signal separat.
- Tænd bias flow generator, tilsluttes hoved kammeret via et stykke af slangen, og justere flow.
- Lukke den øverste åbning af hoved salen med en fælles landbrugspolitik.
- Frigøre bagpanelet af thorax kammer, sæt fast kalibreringsværktøj inde gummi åbning mellem hovedet og kroppen kammeret til at skabe en hermetiske forsegling. Derefter lukke og re-vedhæfte bagpanelet af thorax salen.
- Kontroller, at havnens side af thorax salen er udjævnet.
- Gå til Tuning og derefter kalibreresoftware værktøj bar menuen.
- Gå til Input 1 (thorax) og vælg Kalibrer til lancering kalibrering dialogboksen for thorax flow signal.
- (Kritisk) Kontroller, at de anførte parametre i calibration dialog rude viser de relevante indstillinger, dvs. fysisk stress anvendes lav værdi: 0; Fysisk stress anvendes høj værdi:-20 mL/s; Prøver: integrere. Når det er gjort, klik på lav i vinduet eksempler .
- Kontroller, at signalet genereret er konstant i hele displayvinduet og derefter klikke på Luk.
- Tilslut et 20 mL-sprøjten gennem havnens side af thorax kammeret ved hjælp af en plastic-stik og et stykke af slangen.
- (Kritisk) Vælg høj i vinduet eksempler og straks injiceres 20 mL luft ind i kammeret over en 2 s periode på en så konstant som muligt strømningshastighed.
- Kontroller, at signalet genereret vises helt inde i displayvinduet. Brug pileikon til at kontrollere, om signalet er centreret og symmetrisk omkring nul linje. Klik derefter på Luk. Fjern eventuelle forskydning fra nul ved at klikke på Fjern AC forskydning i vinduet eksempler
Bemærk: Høj værdi kalibrering kan fornyes, hvis det er nødvendigt. - Kontroller, at den resulterende Skaleret Input interval er inden for det anbefalede interval (mus: ±280 til ±420 mL/s). (Kritisk) Gentag trinene kalibrering, hvis værdierne er uden for det acceptable område.
- Kalibrere den hoved afdeling i en lignende måde som thorax salen (trin 1.3.3.6). Denne gang skal du vælge Input 2 (nasal).
Bemærk: (Vigtigt) Værdien for fysisk stress anvendes høj værdi skal indstilles til + 20 mL/s. Dette vil ændre polariteten af flowet i det forreste kammer i forhold til den bageste kammer. Når dyret vejrtrækning, bliver to flow signalerne derfor næsten i fase, bortset fra den forsinkelse, der bruges til at beregne sRaw.
- Start en eksperimentel session på dagen af forsøget, og indlæse den passende konfigurationsfil.
2. lunge-funktion målinger
- Vejes dyrene og Bemærk deres krop vægte.
- Indsæt dyr inden for Tilbageholderen og placere den inde i thorax plethysmograph kammer (trin 1.2.3.1 til 1.2.3.5).
- Tillad dyret til at slappe af i mindst 5 min.
- Starte protokollen af kommandoer ved at vælge det første trin, og klik derefter på Udfør.
- Tjek på computerskærmen at dyrets vejrtrækning signaler er regelmæssig og glat (figur 2). Softwaren viser automatisk de parametre, der er beregnet på grundlag af ånde af ånde. Kontroller, at dyrets parametre er stabil.
- Optage åndedrætsmønster på baseline betingelser for op til 10 minutter.
- For protokoller vedrørende administrationen af et prøvestof af aerosol, gør som følger:
- Justere forstøver på tid og pligt cyklussen, som kræves.
Bemærk: I eksemplerne i denne artikel, forstøver blev drevet på en 5% normeret maksimalydelse for 10 s. - Udføre et køretøj udfordring (f.eks. saltvand) og optage svaret.
- Hvis det er nødvendigt, udsætte dyret til at øge koncentrationen af prøvestof ved at ændre koncentrationen i forstøver i eskalerende trin (f.eks. fordobling koncentrationer). Post svar efter hver administration.
- I slutningen af den eksperimentelle session, hvis det ikke gøres automatisk, stop optagelsen og vende tilbage dyret boliger bur og værelse.
- Justere forstøver på tid og pligt cyklussen, som kræves.
- Hvis det er nødvendigt, Vælg Kør fra menuen værktøj advokatstanden hen til opstille en anden eksperimentel session.
- Mellem sessioner, ren plethysmograph kamre og skyl forstøver med vand.
Bemærk: Brug af alkohol kan forårsage uoprettelige skader på plethysmograph.
- Mellem sessioner, ren plethysmograph kamre og skyl forstøver med vand.
- Hvis undersøgelsen involverer gentagne evalueringer over tid, gentage hele måling sekvensen på hver valgte tidspunkt.
Bemærk: Det anbefales klogt at supplere studiet med nogle præcise målinger af respiratorisk mekanik og/eller lunge bind1,15.
3. dataanalyse
Bemærk: Softwaren automatisk gemmer filen eksperimentelle og eksporterer de registrerede parametre, når de eksperimentelle session er blevet lukket.
- Beregne en baseline gennemsnit for parametrene for interesse for hvert dyr og eksperimenterende gruppe.
Bemærk: tabel 1 opregner en række typiske parametre, kategoriseret baseret på typen oplysninger, de indeholder. - Når det er relevant, vurdere effekten af stoffets aerosolmaterialer studerede på parametre af interesse for hver koncentration ved hjælp af et bestemt punkt (f.eks. maksimal eller minimal værdi), et gennemsnit, eller fuld tid-kursus; også kan betragtes som en normalisering grundlinjen.
- Rapportere resultaterne ved hjælp af gruppe betyder og fejl i en tabel eller grafisk format. Analysere resultaterne statistisk.
Bemærk: I den foreliggende undersøgelse, to-vejs ANOVAs med gentagne foranstaltninger blev brugt til at vurdere virkningen af methacholine, allergen-hus-støv mide (HDM)- og deres interaktion på forskellige DCP udlæsninger (sRaw og EF50) samt på forskellige FOT udlæsninger (RN, G og H), i begge stammer af mus. Sidaks flere sammenligning test blev derefter brugt til at bestemme koncentrationen af methacholine hvor de allergiske mus adskiller sig fra kontrol-musene. De samme test blev anvendt til at vurdere effekten af dage, HDM og deres interaktion ved baseline (dvs.før methacholine) på udlæsninger af luftvejsobstruktion (sRaw og EF50) og ventilation mønster (BF, TV, MV og EIP). Pearsons korrelationer blev brugt til at vurdere sammenhængen mellem sRaw fremstillet med DCP og RN fremstillet med FOT. Alle statistiske analyser og grafer blev udført ved hjælp af alternative standard statistisk software (f.eks.GraphPad prisme). p ≤ 0,05 blev anset for tilstrækkeligt til at afvise nulhypotesen.
Representative Results
Resultaterne af gentagne evalueringer af respiratoriske funktion af DCP, udført under baseline betingelser på tre på hinanden følgende dage (dage 12, 13 og 14 i protokollen illustreret i figur 1) i kontrol og allergisk BALB/c mus, er vist i figur 3 . De parametre, der var udvalgt til at vurdere mønstret af vejrtrækning inkluderet vejrtrækning frekvens (figur 3A), tidalvolumen (figur 3B), minutventilation (figur 3 c) og ende-inspiratory pause (figur 3D). De parametre, der bruges til at vurdere luftvejsobstruktion var EF50 (figur 3) og sRaw (figur 3F). Resultaterne af hver valgte parameter var stabilt over disse tre på hinanden følgende dage i begge grupper, med ingen tilsyneladende effekt forårsaget af allergiske inflammation.
Graden af lydhørhed over for methacholine blev evalueret af DCP på hinanden følgende dage (dage 12, 13 og 14 i protokollen illustreret i figur 1) i både kontrol- og allergisk BALB/c mus. Resultaterne, vist i figur 4, vises ændringerne i de to parametre, der er følsomme over for luftvejsobstruktion, nemlig sRaw (figur 4A, B og C) og EF50 (figur 4D, E og F). Som forventet, incremental koncentrationer af methacholine gradvis øget sRaw og gradvist faldt EF50. Disse svar var forstærkede af allergiske inflammation, især i den endelige koncentration testet, som bevidnet tilstedeværelsen af hyperresponsivitet. Resultaterne viser også, at overdrevne graden af lydhørhed var begrænset til den første dag (dag 12), så det ikke blev observeret under de to efterfølgende vurderinger (dvs., på dage, 13 og 14).
Resultaterne af vurderingen af respiratorisk mekanik af FOT, udføres på den sidste dag i forsøgsplan (dag 15; Figur 1) i både kontrol- og allergisk BALB/c mus, er vist i figur 5. Disse eksperimenter blev inkluderet i undersøgelsen at supplere DCP evalueringer. FOT er anerkendt som en mere præcis metode til at vurdere respiratoriske funktion2. En af sine stærke sider er, at det giver topografiske indsigt, hvilke områder af lungen (udførelse airways versus perifere airways og lungevæv) påvirkes af de testede interventioner (fx, allergen og methacholine). Den anbefalede metode til at vurdere respiratorisk mekanik med FOT var tidligere beskrevet1. Heri, blev tre FOT parametre brugt til at beskrive ændringerne i respiratoriske mekanik induceret af allergisk betændelse og methacholine. Disse parametre inkluderet: 1-newtonsk modstand (RNielsen; Figur 5A), en parameter, som ændringer i værdi primært afspejler variationer i modstanden af store strømførende luftvejene; 2-væv dæmpning (G; Figur 5B), en parameter, som ændringer i værdi primært afspejler variationer i væv modstand; og 3-væv elastance (H; Figur 5 c), en parameter, som ændringer i værdi primært afspejler variationer i væv stivhed2. Som forventet, var der en stigning i hver af disse parametre i svar til trinvis koncentrationer af methacholine. Overensstemmelse med sRaw og EF50 resultaterne med DCP fra den foregående dag (dag 14; Figur 1), ændringer i RN induceret af methacholine (figur 5A) var sammenlignelig mellem kontrol og de allergiske mus. I virkeligheden, værdierne af sRaw på dag 14 korreleret med værdier af RN på dag 15 (fig. 5 d). Stigningen i H induceret af methacholine var også lignende mellem kontrol og de allergiske mus (figur 5B). Den methacholine-induceret stigning i G var dog betydeligt større i de allergiske mus (figur 5 c). Dette resultat viser tilstedeværelsen af en vedvarende hyperresponsive fænotype i allergiske mus på dag 15, som ikke blev opdaget af DCP evalueringer udføres på de to foregående dage.
Hele undersøgelsen blev gentaget med C57BL/6 mus. Resultaterne af de successive DCP evalueringer af sRaw, dage 12, 13 og 14 i protokollen (figur 1), og af FOT evalueringen af RN, i dag 15, er vist i figur 6. I denne særlige mus stamme, blev den overdrevne methacholine svar observeret i allergiske mus opretholdt i de tre på hinanden følgende dage (fig. 6A, Bog C). Denne hyperresponsive fænotype blev også skildret med FOT på dag 15 af en stigning i RN induceret af methacholine, der var mere udtalt i de allergiske mus (figur 6E). Disse var i skarp kontrast med de opnåede resultater med BALB/c mus, hvor en gradvis aftagende af hyperresponsivitet opstod fra dage 12-14 (figur 4) og en manglende forskel i den methacholine-induceret stigning i RN blev observeret på dag 15 (figur 5A). Sammen, viste disse resultater et tidsvarierende effekt af allergen på den methacholine-induceret reaktion mellem to stammer af mus. Vigtigst, blev denne stamme forskellen afbildet af både DCP og FOT. Konkurrenceloven, værdier af sRaw målt ved DCP på dag 14 korreleret med værdierne af RN målt af FOT på dag 15 (figur 6F), som blev observeret med BALB/c mus (fig. 5 d).
Figur 1 . Protokoller, der bruges til at fremkalde pulmonal allergisk inflammation og vurdere graden af lydhørhed over for methacholine. Denne undersøgelse blev udført på kvindelige BALB/c og C57BL/6 mus af 7 til 9 ugens i alder. Rækkefølgen af interventioner foretaget over hele undersøgelsen er vist i panelet (A). Halvdelen af musene var udsat for 50 µg hus-støv mide (HDM) ekstrakt intranasalt på 14 dage i træk til at fremkalde pulmonal allergisk betændelse. Anden halvdelen blev udsat for saltvand og bruges som kontrol. Respiratoriske funktion blev vurderet af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) på tre forskellige tidspunkter (dage 12, 13 og 14, sorte cirkler) efter en acclimation session (dag 11, grå cirkel), der indeholdt en udfordring med aerosolmaterialer saltvand. Under hver session, blev baseline respiratoriske funktion og svar på methacholine vurderet ved hjælp af automatiserede protokollen vist i panelet (B). På dag 15, blev en invasiv vurdering af respiratorisk mekanik med tvungen svingning teknik (FOT) udført som tidligere beskrevet1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Repræsentative flow signaler fra en sund BALB/c mus. Panelerne viser typiske optagelse spor fremkommer ved dobbelt-kammer plethysmography i en kontrol mus oprindelige betingelser. Thorax flow er vist i det øverste panel og nasal flow er vist i nederste panel. Negative værdier er under inspiration og positive værdier er under udånding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Gentagne evalueringer af respiratoriske funktion i bevidst BALB/c mus. Baseline respiratoriske funktion blev vurderet af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) kontrol (åben symboler) og mus, allergisk (solid symboler) på dage, 12, 13 og 14 i protokollen illustreret i figur 1. DCP parametre bruges til at vurdere respiratoriske funktion indgår vejrtrækning frekvens i (A), tidalvolumen (TV) i (B), minutventilation (MV) i (C), ende inspiratory pause (EIP) i (D), flow på midten af tidevands ekspirationsvolumen ( EF50) i (E) og specifikke luftvejs modstand (sRaw) i (F). Værdier af vejrtrækning frekvens, TV, MV, sRaw og EIP for hver mus var de gennemsnitlige værdier indspillet over 1,5 min. Værdien af EF50 var minimal værdien opnået i denne registrering periode. Resultaterne er præsenteret som gruppe betyder ± standardafvigelse (n = 5/gruppe). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Methacholine bronchoprovocation test i bevidst BALB/c mus. Methacholine lydhørhed blev vurderet af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) kontrol (åben symboler) og mus, allergisk (solid symboler) på dage, 12, 13 og 14 i protokollen illustreret i figur 1. DCP parametre bruges til at vurdere svaret medtages specifikke luftvejs modstand (sRaw) i (A) gennem (C) og flow på midten af tidevands ekspirationsvolumen (EF50) i (D) gennem (F). Bronchoprovocation blev udført af aerosolizing methacholine i DCP hoved afdeling for 10 s ved trinvis koncentrationer. Svaret blev overvåget under 1,5 min efter hver koncentration. Værdien af sRaw for hver mus ved hver koncentration var den gennemsnitlige værdi registreres over 1,5 min. Værdien af EF50 var minimal værdien opnået i denne registrering periode. Resultaterne er præsenteret som gruppe betyder ± standardafvigelse (n = 5/gruppe). Den stjerne symbol * betegner en statistisk signifikant forskel (p 
Figur 5 . Invasive vurdering af respiratorisk mekanik i BALB/c mus. Respiratorisk mekanik ved baseline og svar på methacholine blev evalueret af tvungen svingning teknik (FOT) på dag 15 i protokollen illustreret i figur 1. Kontrol (åben symboler) og allergiske (solid symboler) mus var de samme som dem, der er testet af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) på dage, 12, 13 og 14. De parametre, der bruges til at vurdere respiratorisk mekanik var newtonske modstand (RN) i (A), væv elastance (H) i (B) og væv dæmpning (G) i (C). Bronchoprovocation blev udført af Forstøvningsudstyr incremental koncentrationer af methacholine direkte i endotrakealtube bedøvede, tracheotomized, lammede og mekanisk ventilerede mus i liggende stilling. Svaret blev overvåget under 5 min efter hver koncentration. Værdi for hver parameter for hver mus ved hver koncentration var peak værdien opnået i denne registrering periode. Resultaterne er præsenteret som gruppe betyder ± standardafvigelse (n = 5/gruppe). Panel (D) viser sammenhængen mellem specifikke luftvejs modstand (sRaw) målt af DCP dag 14 og RN målt ved FOT på dag 15. De åbne symboler repræsenterer værdierne ved baseline og de faste symboler repræsenterer de maksimale værdier med den højeste koncentration af methacholine testet for enten kontrol (cirkler) eller allergisk (firkanter) mus. Indsatsen viser determinationskoefficienten (r2). Den stjerne symbol * betegner en statistisk signifikant forskel (p ≤ 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Respiratoriske funktion og invasive respiratorisk mekanik i C57BL/6 mus. Specifikke luftvejs modstand (sRaw) blev vurderet af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) ved baseline og svar på methacholine kontrol (åben symboler) og mus, allergisk (solid symboler) på dage 12 (A), 13 (B) og 14 (C) af den protokollen illustreret i figur 1. Newtonske modstand (RN) ved baseline og svar på methacholine blev vurderet af tvungen svingning teknik (FOT) på dag 15 (D). Bronchoprovocations blev udført som beskrevet i figur 4 og figur 5 for DCP og FOT, henholdsvis. Resultaterne er præsenteret som gruppe betyder ± standardafvigelse (n = 5/gruppe). Panel (E) viser sammenhængen mellem sRaw målt af DCP på dag 14 og RN målt ved FOT på dag 15. De åbne symboler repræsenterer værdierne ved baseline og de faste symboler repræsenterer de maksimale værdier med den højeste koncentration af methacholine testet for enten kontrol (cirkler) eller allergisk (firkanter) mus. Indsatsen viser determinationskoefficienten (r2). Den stjerne symbol * betegner en statistisk signifikant forskel (p ≤ 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Parameter | Enhed | Beskrivelse | Oplysninger |
| F | BPM | Vejrtrækning frekvens | Mønster af ventilation |
| TV | mL | Tidalvolumen | |
| MV | mL | Minutventilation | |
| Ti | MS | Indåndingstid | |
| Te | MS | Ekspiratorisk tid | |
| PIF | mL/s | Peak inspiratorisk flow | |
| PEF | mL/s | Peak ekspiratorisk flow | |
| EV | mL | Ekspiratorisk volumen | |
| NTV | mL | Nasal tidalvolumen | |
| NEV | mL | Nasal ekspirationsvolumen | |
| EIP | MS | Ende inspiratory pause | |
| EEP | MS | Ende ekspiratorisk pause | |
| dT | MS | Tidsforsinkelse | Airflow obstruktion |
| sRaw | cmH2O·s | Specifikke luftvejs modstand | |
| sGaw | 1/cmH2O·s | Specifikke luftvejs ledningsevne | |
| EF50 | mL/s | Flow på midten af tidevands ekspirationsvolumen | |
| SR | % | Succesrate | Kvalitetskontrol |
| N | Antallet af gyldige vejrtrækninger |
Tabel 1. Liste over typiske parametre fremstillet af dobbelt-kammer plethysmography. Parametrene, der var grupperet efter arten af de oplysninger, de giver i løbet af en respiratorisk funktionsevaluering.
| Fordele | Begrænsninger |
| · Bevidst dyr | · Nødvendigheden af at kontrollere den omgivende miljø |
| · Præcis ventilation parametre | · Forudgående acclimation af dyrene |
| · Ubestridte indekser af airflow obstruktion (sRaw, EF50) | · Kravet om hermetisk adskille de nasale og thorax strømme |
| · Kan tilpasses til forskellige arter og dyr størrelser | · Absolut værdi variation for nogle resultatet parametre |
| · Anvendes i mange applikationer, forskning | · sRaw ikke en ægte måling af modstand |
| · Enkel teknik | · Tilstedeværelsen af de øvre luftveje |
| · Følsomme over for ændringer | · Som supplement til målinger med en invasiv vurdering |
Tabel 2. Liste over fordele og begrænsninger i forbindelse med dobbelt-kammer plethysmography.
| Dobbelt-kammer Plethysmography | Tvungen svingning teknik | |
| Dyrets tilstand af bevidsthed | Uændret | Bedøvede (og normalt lammet) |
| Dyrets position | Opretstående | Liggende |
| Dyrets tilgængelighed | Kun i kammer | Tilgængelige |
| Animalske integration til måling enhed | Næse eller hals segl | Tracheotomi eller oral intubation |
| Dyrets luftvejs tree | Intakt | Delvis – øvre luftveje segment udelukket (dvs. nasal gennemfører, svælget og strubehovedet) |
| Lunge volumen hvor parametrene resultat er opnået | Variabel - spontan volumen vedtaget af dyret | Standardiseret - ved hjælp af kontrolleret rekruttering manøvrer og positive ende-udåndingstrykket. |
| Frekvens hvormed parametrene resultatet vurderes | Variabel - spontan vejrtrækning frekvens vedtaget af dyret | Kontrolleret - ved hjælp af foruddefinerede bølgeformer på angivne frekvenser |
| Bidrag fra øvre luftveje segment til resultatet parametre | Forventes | Omgås |
| Site af aerosol levering | Inde i hovedet salen | Direkte i luftrøret |
| Effekten af øvre luftveje segment på inhalerede dosis / aerosol deposition mønster | Forventes | Forhindrede |
| Evne til at detektere ændringer - baseret på resultaterne af den foreliggende undersøgelse | Observeret | Observeret |
| Iboende variation af teknikken - baseret på resultaterne af den foreliggende undersøgelse | Udsving af variationskoefficienten for sRaw på baseline: 7,5-20,6% | Udsving af variationskoefficienten for RN på baseline: 3,6-13,4% |
Tabel 3. Sammenligning mellem dobbelt-kammer plethysmography og tvungen svingning teknikker.
Discussion
Evnen til at måle lungefunktion i bevidst dyr er klart begrundet i respiratoriske forskning. Generelt, er DCP en interessant tilgang til at vurdere funktionen ventilation af åndedrætsorganerne i bevidste og spontant vejrtrækning dyr26. Mere specifikt rammer DCP eller dens hoved-out variant, ofte den rette balance mellem kvaliteten af oplysningerne og det ønskede niveau af invasiv3 (tabel 2). Teknikken kan tilpasses til forskellige arter (f.eks. mus, rotter, marsvin) eller animalske størrelser og kan bruges i mange forskning applikationer. Det er især nyttigt at vurdere mange dyr på én gang i en parallel undersøgelse design, til at overvåge den respiratoriske funktion i gentagne måde og fange kinetik af en reaktion over tid. Derudover teknikken er enkel og kan læres i et relativt rettidigt. I det foreliggende papir, en protokol beskæftiger DCP målinger i mus blev brugt som et eksempel til at beskrive de praktiske aspekter af dette tilbageholdende plethysmography teknik samt for at diskutere de kritiske trin og relaterede resultater.
Når du arbejder med bevidste dyr, er det vigtigt at kontrollere betingelserne for det omgivende miljø (fx, roligt værelse med et begrænset antal mennesker eller aktivitet) for at generere reproducerbare resultater. Da restrainers kommer i forskellige dimensioner, er det vigtigt at starte med en passende størrelse, så vejrtrækningen bevægelser er uforstyrrede. Det er også nyttigt og ofte nødvendigt at vænne dyrene til eksperimentel opsætning og procedurer, som det er godt etableret i mus at fastholdende påvirker vejrtrækning frekvens12. Afhængigt af de eksperimentelle design eller betingelser, kan flere sessioner af trinvise varigheder være nødvendig. Endelig er giver tid i starten af et eksperiment for at justere værelse ændringer og nødvendige håndtering dyrene en simpel overvejelse, der viste sig at være effektiv til at sikre, at åndedrætsmønster er konsekvent regelmæssig og afslappet på baseline. Arbejde under forhold, hvor dyrene er komfortable, veltilpasset og roligt vil også gavne resultat variation og kvalitet. Det begrænser også nogen stress-induceret frigivelse af katekolamin, som kan øge luftvejene kaliber og dæmpe en inducerede bronchoconstriction.
Det er vigtigt at forstå, at der er behov for at adskille så hermetisk som muligt de nasale og thorax strømme. Afhængigt af systemet eller arter studerede, kan forsegling mekanismen variere i form såvel som i effektivitet. I DCP vi beskrevet heri, oprettes tætningen mellem dyrets snude og fastholdende enheden. Ved vurderingen af den respiratoriske funktion af DCP, er det også vigtigt at give en tilstrækkelig og vedvarende bias flow, da et fald i niveauet af ilt til rådighed til dyret vil resultere i betydelige virkninger. Under hensyntagen til dyret i Tilbageholderen velvære begrænser tilbøjelighed for luft lækager lavet af agitation og maksimerer derved kvaliteten af dataene. Contrastingly, en banebrydende i seglet vil resultere i enten afviste datasæt eller en undervurdering af nogle parametre.
Desuden hvis du vil aktivere separat registrering af nasal flow signal, bruges hoved salen typisk til at udsætte dyret til aerosolmaterialer stoffer. Som illustreret i denne artikel, kan det blive udnyttet til at udføre en bronchoprovocation test for at vise forskellige grader af lydhørhed. I sådanne forsøg, justere rækken testet koncentrationer kan være nødvendigt afhængig af art, stamme eller sex af dyrene studerede. Som tidligere påvist8,9,10,27viser nuværende resultaterne, at de methacholine-inducerede ændringer i sRaw korreleret godt med invasive FOT målinger af luftvejene modstand. Resultaterne viser også, at DCP teknik ikke er så følsomme områder som FOT for sin evne til at opdage respiratorisk dysfunktion og identificere en ændret svar lokaliseret inden for de nedre rum af lunge (lungevæv og/eller små perifere luftveje) . Da dyrets airways er intakt, kan tilstedeværelsen af de øvre luftveje, som tegner sig for den største del af den samlede respiratoriske modstand til luftstrømmen28, påvirke aerosol distribution og deposition desuden til at dæmpe bidrag fra de nedre luftveje for en måling. Tabel 3 opsummerer andre forskelle mellem DCP teknik og FOT. Endelig, selv om det ville være teoretisk muligt at anslå dyrets samlede luftveje modstand (herunder øvre luftveje) fra en måling af sRaw, det er generelt anbefales at supplere DCP evaluering med en invasiv måling teknik som FOT29 at opnå direkte målinger af detaljerede respiratorisk mekanik. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan målinger af øvre luftveje modstand også betragtes30,31,32.
Konklusion
På grund af dens begrænset grad af invasiv er DCP en teknik, der kan opfylde et stort behov i respiratoriske forskning. Det er købedygtig levere nøjagtig aflæsning af ventilation mønster i bevidst dyr samtidig med nogle ubestridte indekser af airflow obstruktion. De indhentede oplysninger også virkelig supplerer fra mere invasive metoder.
Disclosures
DB og AR er ansat af SCIREQ videnskabelige respiratorisk udstyr Inc, en kommerciel enhed involveret i emner relateret til indholdet af denne artikel. DB ejer også lager. SCIREQ Inc. er en emka teknologier selskab.
Acknowledgments
SMG understøttes af en studentship fra den canadiske institutter for sundhedsforskning, MG er støttet af et legat fra den respiratoriske Health Network af FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) og YB er en forskning videnskabsmand fra FRQS.
FORFATTERNES BIDRAG
Alle forfattere har bidraget til udformningen af håndskriftet og/eller video. SMG og LD indsamlet dataene. SMG, LD, YB, DM, DB og AR bidraget til dataanalyse, generation af tal og manuskriptet skrives. YB, AR, KL og MG var involveret i udarbejdelsen af den video script. Stykket blev udført af YB, KL og MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
| DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
References
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis Exp. (75), e50172 (2013).
- Bates, J. H. T. CORP: Measurement of lung function in small animals. J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. J Vis Exp. (90), e51755 (2014).
- Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals? Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract. Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).
- Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).
- Neuhaus-Steinmetz, U., et al. Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).
- Glaab, T., et al. Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).
- Glaab, T., et al. Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats. J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).
- Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).
- DeLorme, M. P., Moss, O. R. Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Criee, C. P., et al. Body plethysmography--its principles and clinical use. Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).
- Robichaud, A., et al. Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats. J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).
- Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice. J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).
- Nabe, T., et al. Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice. Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).
- Morris, J. B., et al. Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice. J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).
- Merazzi, D., Mortola, J. P. Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat. Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).
- Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells. Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).
- Agrawal, A., et al. Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma. J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).
- Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).
- Desmet, C., et al. Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1. Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).
- Zang, N., et al. Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).
- Shukla, M., et al. Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters. Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).
- Murphy, D. J. Respiratory function assessment in safety pharmacology. Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).
- Lofgren, J. L., et al. Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice. J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).
- DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat. J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).
- Hoymann, H. G. Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies. Front Pharmacol. 3, 156 (2012).
- Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice. J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).
- McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).
- Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI). J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).
