Summary
Syftet med denna artikel är att ge en detaljerad beskrivning av rekommenderade procedurer för att utvärdera lungfunktion hos medvetna möss genom dubbel kammare pletysmografi.
Abstract
Volym luftbyten skapad av en medveten ämne som andas spontant inom en kropp-box är grunden för pletysmografi, en teknik som används för att bedöma icke-invasivt vissa funktioner av andningsfunktionen hos människor också som försöksdjur. Denna artikel fokuserar på tillämpningen av den dubbel kammare pletysmografi (DCP) i små djur. Det ger bakgrundsinformation om metodiken samt detaljerade stegvisa anvisningar att framgångsrikt bedöma lungfunktion i medveten, andas spontant djur på ett icke-invasivt sätt. DCP: N kan användas för att övervaka lungfunktion av flera djur samtidigt, samt för att identifiera förändringar som kan framkallas av aerosolized ämnen under en vald tidsperiod och upprepad sätt. Experiment på kontroll och allergisk möss används häri att påvisa nyttan av tekniken, förklara de associera resultatet parametrarna, samt för att diskutera relaterade fördelar och brister. Sammantaget ger löstagbara giltiga och teoretiskt ljud avläsning som är betrodda att utvärdera funktionen luftvägarna av medvetna små djur både vid baseline och efter utmaningar med aerosolized ämnen.
Introduction
Den ökande användningen av små djur att modellen mänskliga andningsorganen sjukdomar har uppmanat utvecklingen av tekniker för att kvantitativt bedöma fungerar av det respiratoriska systemet hos dessa djur. För närvarande, är påtvingat svängning tekniken (FOT) erkänd som den mest exakta metoden att bedöma respiratoriska mekanik i smådjur1,2. Dock som sagt av fenotypning osäkerhetsprincipen, handlas vad är vunnit i mätning precision med FOT utanför mot en förlust i noninvasiveness3. Faktiskt, FOT mätningar förvärvas under mycket kontrollerade experimentella förhållanden som nödvändiggör anestesi, trakeotomi eller muntliga intubation, samt mekanisk ventilation; ett scenario långt från verkliga livet.
I situationer där de experimentella krav förbjuda användning av bedövningsmedel eller ring till liten eller ingen avvikelse från djurets naturliga fysiologiska tillstånd, kan dubbel kammare pletysmografi (DCP) övervägas. Som namnet antyder, består en DCP setup av två anslutna styv kammare byggd för att isolera så hermetiskt som möjligt djurets huvud (eller näsa), i främre kammaren, från dess thorax, i den baksida kammaren. Inom setup, djuret är vid medvetande och andas spontant medan att vara fastspända. Eftersom väggarna i kamrarna inte kan expandera eller dra tillbaka, genererar rörelse i luften och-ut djuret en motsvarande men motsatt vågform inne i bakre kammaren, till följd av den komprimering/dekomprimering av omgivande luft. Vågformen på grund av nasala flöde i den främre kammaren och den relaterade till bröstkorgens rörelse i bakre kammaren således separeras och fångas samtidigt. Beroende på inställningen för DCP design, kan dessa vågformer förvärvas med hjälp av antingen tryckgivare eller pneumotachographs till respektive registrera ändringarna i kammare trycket eller luftflöde in-och ut på avdelningar som funktion av tiden. Den senare metoden är mer vanligt nuförtiden.
Medan djurets andning frekvens exakt kan fastställas av någon form av pletysmografi tekniker, är situationen inte densamma för bestämning av tidalvolym och dess relaterade ventilation parametrar (t.ex., det minutventilation, exspiratorisk volym, osv). I motsats till hela kroppen plethysmograph (WBP) tekniken, där djurets tidalvolym uppskattas från rutan signal4,5, ger DCP tekniken korrekta bedömningar av tidalvolymen. Detta är relaterat till direkta förvärvet av djurets bröstkorg rörelse i bakre kammaren, som är proportionell mot förändringar i lungvolym under andning.
Utöver dessa korrekt andningshjälp parametrar (t.ex., tidalvolym, andning frekvens och minutventilation), störningar i form av andningsvägarna cykeln kan också användas att undersöka neuronala aspekter som styr den respiratorisk drive eller respiratorisk reflexer. Ett konkret exempel på att ansökan skulle vara utvärderingen av inhalerade ämnen på övre luftvägarna sensoriska nervceller6irritation potential. Här, bestäms varaktigheten av en paus i början av utandningen med en parameter som kallas slutet-inspiratorisk paus (EIP), även kallad varaktighet bromsning6. Förlängning av denna paus av irriterande ämnen är associerad med stängningen av djurets glottis, orsakar mätbar under inbromsning i den första delen av förfallodag6,7.
En annan viktig fördel med DCP: N är att det ger två validerade och obestridda parametrar som är känsliga för luftvägsobstruktion. En kallas flödet vid mitten av-tidvatten exspiratorisk volym och förkortad EF508,9,10. Det är luftflödet på midway volymen av varje tidvatten andetag under utandning. EF50 utvinns från bröstkorg flöde tracen och således kan mätas utan den främre kammaren (dvs.i en huvud-out-konfiguration). Annan kallas specifika luftvägsmotståndet och är förkortat sRaw11,12,13. Bestämning av sRaw kräver samtidig inspelning av djurets nasal och bröstkorg flöden som det beräknas från tidsfördröjningen mellan dessa separat respiratoriska spår vid tidpunkten noll flöde i slutet av inspiration. Den logik som beskriver grunden som avser denna försening sRaw var expatiated tidigare11. Enkelt uttryckt, föregå förändringar i lungvolym luftrörelser eftersom en tryckgradient behöver utveckla för att driva luftflöde. I ett friskt djur andas lugnt, är denna försening normalt mycket liten. Men, tryckgradienten som krävs för att tillgodose ett visst flöde (t.ex., ett flöde som är tillräckligt för att ge tillräcklig ventilation) påverkas av graden av luftvägsmotståndet. Under bronkokonstriktion, exempelvis är gradient trycket som behövs för att tillgodose ett visst flöde större, vilket innebär att djuret har att arbeta hårdare för att andas. En större lutning av trycket i djurets bröstkorg innebär också att en större del av flödet och-ut i bakre kammaren beror på dekompression/komprimering av luften i bröstkorgen, som är del av den totala bröstkorgens expansion/infällning som är ur fas med den nasala flöden. Det öka motståndet på grund av bronkokonstriktion kommer därmed att öka fördröjningen mellan baksidan och de främre kammarna och ökar därmed sRaw. Lutningen av trycket som driver luftflöde in-och ut i lungan påverkas också av den inledande bröstkorg gasvolymen (TGV). På en större TGV till exempel den expansion/infällning på bröstkorgen som behövs för att generera en viss gradient av trycket är större (helt enkelt eftersom volymen förskjutningen som krävs för att generera en viss gradient av trycket är större), som innebär också att den djur måste arbeta hårdare för att andas. Återigen, dessa extra bröstkorg förskjutningar är de som krävs för att expandera/komprimera luften i bröstkorgen och därmed ur fas med den nasala flöden. Så, en ökad TGV kommer också att öka fördröjningen mellan kamrarna och ökar därmed sRaw. Som kan ses, resultera både bronkkonstriktion och ökad TGV i en viktigare insats för att dra in luft och-ut i lungan. Detta är i huvudsak de fysiologiskt menande av sRaw. Den representerar det arbete som krävs för andas5,14.
Det är således viktigt att förstå att två skilda faktorer påverkar sRaw: luftvägsmotståndet och TGV. I själva verket kan sRaw uttryckas som en produkt av luftvägsmotståndet och TGV11. Medvetna djur kan ändra sin TGV vid kommer, anpassa sin ventilation till en viss miljö. Under sådana förhållanden, där djurets naturliga fysiologiska tillstånd är oförändrat, är det således omöjligt att urskilja om en förändring i sRaw härrör från en ändring luftvägsmotståndet, från en förändring i TGV eller från en blandning av två. Det rekommenderas därför att komplettera DCP utvärderingen med mer invasiva mätningar av respiratoriska mekanik och/eller lungan volymer, som dem som tillhandahålls av FOT1,15.
Hittills har har löstagbara använts i olika forskningsansökningar. Tekniken kan användas med eller utan huvud kammaren att kvantitativt och utvärdera noggrant effekten av olika ämnen, såsom farmaceutiska ämnen, allergener, irriterande eller andra mediatorer, på lungfunktion i medvetna små djur 16,17,18. Den främre kammaren kan också användas som en exponera kammare aerosolized ämnen eller varierande gas koncentrationer (hypoxi, hyperkapni, etc.)19. Bekvämt, det gör att man samtidigt mäta de akuta effekterna av dessa exponeringar. I själva verket är en av de vanliga användningsområdena för DCP: N att bedöma graden av lyhördhet för aerosolized metakolin i olika modeller av luftvägssjukdomar20,21,22,23, 24 , 25.
Även om DCP tekniken är till synes okomplicerat, skulle vissa praktiska utmaningar kunna avskräcka oerfarna användare eller försämrar noggrannheten och reproducerbarheten för resultaten. Detta dokument ger en detaljerad beskrivning av rekommenderade procedurer för att framgångsrikt rekord andningsfunktionen av DCP i medvetna, återhållen, spontant andning möss. Beskrivningen är specifik för den angivna utrustningen (se Tabell för material). Nyttan och värdet av löstagbara demonstreras också i en gemensam modell av pulmonell allergisk inflammation i två stammar av möss som testas vid baslinjen och i svar på aerosolized metakolin.
Protocol
Följande procedurer godkändes av Quebec hjärta och lunga Institute djur eftervård kommittén i enlighet med riktlinjerna i det kanadensiska rådet på Animal Care (CCAC).
1. beredning
- Studie
- (Kritisk) Innan du utför några experiment, få lämpliga godkännanden (t.ex. IACUC) och utbildningar (t.ex. djurhantering).
- Bekanta dig med utrustningen och operativa programvara. Läs användarhandböcker och, vid behov, skapa en konfigurationsfil för att definiera antalet platser, mata in signaler, analysatorer och parametrar.
Obs: Se till att välja en hög samplingsfrekvens (2 KHz). - Konfigurera inställningen analysatorer för parametrar av intresse.
- Välj Tuning i verktygsfältet och sedan analysatorer.
- Justera flödet tröskeln till ett värde som korrekt separerar andetag (mus: 0,5 mL/s) och välja Ti + Te att beräkna andning.
- Ange ett värde för barometertrycket (760 mm Hg) och ange den maximala avvikelsen för inspiratorisk/exspiratorisk volym för ett andetag anses vara giltig (mus: 20%).
- Klicka på inställningen i fältet beräknat parametrar att justera gränserna för godkännande.
Obs: Följande inställningar användes för beskrivs musen experiment: Inspiration tid, 50-170 ms; förfallotid, 40 till 180 ms; frekvens av andning, 30 till 450 bpm; specifika luftvägsmotståndet, 0 till 15 cmH2O·s; midexpiratory flöde med en noggrannhet av minst 3 decimaler. - En gång fullständig, Välj Verkställ och Stäng avsluta dialogfönstret.
- Från menyn verktyg, gå till Tuning igen och sedan lagring för att ange en önskad datahastighet för lagring. Klicka på tillämpa och Stäng att stänga fönstret.
Obs: Ett genomsnitt på varje 10 s används normalt. - Skapa ett protokoll inom den operativa programvaran för att definera en sekvens av kommandon och önskad tidsinställning för var och en. Ett exempel visas i figur 1.
- Om experimentet omfattar administrering av ett ämne av aerosol, förbereda lämpliga lösningar och spädningar enligt koncentrationerna som ska testas.
- Djur
- Arbeta i ett lugnt område som är avlägsen från bostäder rummet. Att djuren att anpassa sig till förändringen av miljön.
- Väga djuren och välja lämpliga återhållsamhet storlek.
- (Kritisk) Acklimatiserar sig djuren de fasthållning och förfaranden före starten av experimentet. Beroende på experimentell design, flera acklimatisering sessioner av ökande varaktighet (t.ex. 5-30 min) kan behövas.
Obs: Djur som inte acklimatisera bör tas bort från studien.- Vid varje acklimatisering session, infoga djuret inom den fasthållning, från den tillbaka öppning; hålla enheten lodrätt kan vara till hjälp.
- När djuret är i position, sätt tillbaka kolven och försiktigt låsa den på plats utan att tillämpa en överdriven kraft.
- (Kritisk) Kontrollera visuellt att djuret andas normalt. Om det behövs, justera dess position genom att flytta låsmekanismen. Kontrollera att djurets nares sticker ut utanför näskotten-med nosen vilar mot de inre väggarna i fasthållning.
- Ta loss baksidan av bröstkorg kammaren, infoga den fasthållning som innehåller djuret genom gummit öppning i bröstkorg kammaren och Stäng kammaren.
- Fäst den head avdelningen och ge ett bias flöde. Använda ett flöde av 0,5 L/min för en mus.
- Låt djuret att koppla av i 5 min.
- När djuret är lugnt, börja inspelningen av nasal och bröstkorg flöde signalerna. Kontrollera på datorskärmen att spåren är slät och att de visar en vanlig andningsmönster; Se exempel i figur 2.
Obs: Om protokollet innebär aerosol administrering av ett ämne, kan en saltlösning utmaning ingå i förfarandet för acklimatisering. - I slutet av varje session, ta bort djuret från bröstkorg kammaren och fasthållning och returnera den till dess bostäder bur och rum.
- Utrustning
- På dagen för experimentet, starta en experimentell session och hämta lämpliga konfigurationsfilen.
Obs: Kontrollera att det innehåller önskade protokoll för experimentet. - Gå till springa i menyn verktyg. Ange experimentet och djurets information. När gjort, klicka på knappen Kör längst ned i fönstret.
- Fortsätt med kalibrering av systemet. Kalibrera varje plats och insignal separat.
- Slå på bias flödesgeneratorn, ansluta den till den head avdelningen via en bit av slangen och justera flödet.
- Nära övre öppningen av den head avdelningen med en mössa.
- Ta loss baksidan av bröstkorg kammare, sätt in kalibreringsverktyget inuti gummit öppning mellan huvudet och kroppen kammaren att skapa en hermetisk tätning. Stäng sedan och åter fästa bakpanelen på bröstkorg kammaren.
- Verifiera att sidoingången av bröstkorg kammaren är utjämnat.
- Från menyn programvara verktyg, gå till Tuning och sedan kalibrera.
- Gå till ingång 1 (bröstkorg) och välj kalibrera att starta dialogrutan kalibrering för bröstkorg flöde signalen.
- (Kritisk) Kontrollera att angivna parametrarna kalibrering i dialogfönstret visar lämpliga inställningar, dvs fysisk stress tillämpas lågt värde: 0; Fysisk stress tillämpas högt värde:-20 mL/s; Prover: integrera. När detta är gjort, klicka på låg i fönstret exempel .
- Kontrollera att signalen genereras är konstant över fönstret bildskärm och klicka sedan på Stäng.
- Ansluta en 20 mL-spruta via sidoingången av bröstkorg kammaren med en plast-kontakt och en bit av slangen.
- (Kritisk) Välj hög i fönstret exempel och omedelbart injicera 20 mL luft in i kammaren under 2 s med en flödeshastighet som är så konstant som möjligt.
- Kontrollera att signalen genereras visas helt inuti fönstret bildskärm. Använd pilen ikonen kontrollera om signalen är centrerad och symmetrisk runt nollinjen. Klicka sedan på Stäng. Ta bort eventuell förskjutning från noll genom att klicka på ta bort AC offset i fönstret exempel
Obs: Högt värde kalibreringen kan göras, om det behövs. - Kontrollera att den resulterande Skalad Indataområde är inom det rekommenderade intervallet (mus: ±280 till ±420 mL/s). (Kritisk) Upprepa kalibreringen steg om värden ligger utanför det godtagbara intervallet.
- Kalibrera den head avdelningen på ett liknande sätt som bröstkorg kammaren (steg 1.3.3.6). Denna tid, Välj Input 2 (nasal).
Obs: (Viktigt) Värdet för fysiska påfrestningar tillämpas högt värde måste anges till + 20 mL/s. Detta kommer att ändra polariteten av flödet i den främre kammaren i förhållande till den baksida kammaren. Därför, när djuret andas, två flöde signalerna blir nästan i fas, bortsett från den försening som används för att beräkna sRaw.
- På dagen för experimentet, starta en experimentell session och hämta lämpliga konfigurationsfilen.
2. lung funktion mätningar
- Väga djuren och observera deras kroppsvikt.
- Infoga djuret inom fasthållning och placera den inuti bröstkorg plethysmograph kammaren (steg 1.2.3.1 till 1.2.3.5).
- Låt djuret att koppla av i minst 5 min.
- Starta protokollet av kommandon genom att markera det första steget och klicka på Execute.
- Kolla på datorskärmen att djurets andning signalerar är regelbunden och slät (figur 2). Programvaran visar automatiskt beräknade parametrarna på basis av andetag för andetag. Kontrollera att djurets parametrar är stabila.
- Spela in andningsmönstret baslinjen villkor för upp till 10 minuter.
- För protokoll som rör administrationen av en testsubstans av aerosol, gör följande:
- Justera nebulisatorn i tid och tullen cykeln, som krävs.
Obs: I exemplen i denna artikel, fungerades nebulisatorn vid en 5% intermittens för 10 s. - Utför ett fordon utmaning (t.ex. koksaltlösning) och registrera svaret.
- Om det behövs, utsätta djuret att ökande koncentrationer av testämnet genom att ändra koncentrationen i nebulisatorn i eskalerande steg (t.ex. fördubbling koncentrationer). Registrera svaret efter varje administrering.
- I slutet av den experimentella sessionen, om inte sker automatiskt, stoppa inspelningen och tillbaka djuret till dess bostäder bur och rum.
- Justera nebulisatorn i tid och tullen cykeln, som krävs.
- Om det behövs, markerar du Kör från menyn verktyg att köra en annan experimentell session.
- Mellan sessionerna, rengör plethysmograph avdelningar och skölj nebulisatorn med vatten.
Obs: Användning av alkohol kan orsaka obotliga skador på plethysmograph.
- Mellan sessionerna, rengör plethysmograph avdelningar och skölj nebulisatorn med vatten.
- Om studien innebär upprepade utvärderingar över tid, upprepa sekvensen hela mätningen på varje vald tidpunkt.
Obs: Det rekommenderas klokt att komplettera studien med några exakta mätningar av respiratoriska mekanik och/eller lungan volymer1,15.
3. dataanalys
Obs: Programvaran sparar experimentella filen och exporterar de inspelade parametrarna när den experimentella sessionen automatiskt.
- Beräkna ett utgångsvärde medelvärde för parametrar av intresse för varje djur och experimentell grupp.
Obs: tabell 1 listar ett antal typiska parametrar, kategoriseras baserat på vilken typ av information de tillhandahåller. - När det är relevant, utvärdera effekten av det aerosolized ämne som studeras på parametrar av intresse vid varje koncentration som använder en viss punkt (t.ex. maximal eller minimal värde), genomsnitt eller heltid-kursen; en normalisering till baslinjen kan också övervägas.
- Rapportera resultatet med hjälp av grupp medel och fel i en tabell eller grafiskt format. Analysera resultaten statistiskt.
Obs: I den aktuella studien, tvåvägs ANOVAs med upprepade åtgärder användes för att bedöma effekten av metakolin, allergenet – house-Damm kvalster (HDM) – och deras samspel på olika DCP utläsningar (sRaw och EF50) samt på olika FOT utläsningar (RN, G och (H), i båda stammar av möss. Sidaks flera jämförelsetester användes sedan för att fastställa koncentrationerna av metakolin som allergisk möss skiljer sig från kontroll möss. Samma tester användes för att bedöma effekten av dagar, HDM och deras interaktion vid baseline (dvs.före metakolin) på avläsning av luftvägsobstruktion (sRaw och EF50) och ventilation mönster (BF, TV, MV och EIP). Pearsons korrelationer användes för att utvärdera korrelationerna mellan sRaw erhålls med DCP och RN erhålls med FOT. Alla statistiska analyser och grafer utfördes med alternativa standard statistisk programvara (t.ex., GraphPad Prism). p ≤ 0,05 ansågs tillräcklig för att förkasta nollhypotesen.
Representative Results
Resultaten av upprepade utvärderingar av andningsfunktionen av DCP, utförs under baslinjen förhållanden på tre dagar (dagar 12, 13 och 14 i protokollet illustreras i figur 1) i kontroll och allergisk BALB/c-möss, visas i figur 3 . De parametrar som valdes för att bedöma mönstret av andning ingår andas frekvens (figur 3A), tidalvolym (figur 3B), minutventilation (figur 3 c) och slutet-inspiratorisk paus (figur 3D). De parametrar som används för att bedöma luftvägsobstruktion var EF50 (figur 3E) och sRaw (figur 3F). Resultaten av varje vald parameter var stabila under dessa tre dagar i båda grupperna, utan någon uppenbar effekt som orsakas av allergisk inflammation.
Graden av lyhördhet för metakolin utvärderades av DCP på varandra följande dagar (dagar 12, 13 och 14 i protokollet illustreras i figur 1) i både kontroll och allergisk BALB/c-möss. Resultaten visas i figur 4, visas ändringarna i de två parametrarna som är känsliga för luftvägsobstruktion, nämligen sRaw (figur 4A, B och C) och EF50 (figur 4 d, E och F). Som förväntat, inkrementell koncentrationer av metakolin successivt ökade sRaw och successivt minskade EF50. Dessa svar var förstärkte av allergisk inflammation, särskilt vid den slutliga koncentrationen testade, som styrkt förekomsten av hyperreaktivitet. Resultaten visar också att den överdrivna graden av lyhördhet var begränsad till den första dagen (dag 12), som det inte observerats under de två efterföljande bedömningarna (dvspå dag 13 och 14).
Resultaten av bedömningen av respiratoriska mekanik av FOT, utförs på den sista dagen i det experimentellt protokollet (dag 15; Figur 1) i både kontroll och allergisk BALB/c-möss, visas i figur 5. Dessa experiment ingick i studien att komplettera de DCP utvärderingarna. FOT är erkänd som en mer exakt metod att bedöma lungfunktion2. En av dess styrkor är att det ger topografiska insikter om vilka platser i lungan (genomför airways kontra perifera luftvägar och lungvävnad) påverkas av de testa insatserna (t.ex., allergen och metakolin). Rekommenderas som distribueringsmetod för bedöma respiratoriska mekanik med FOT var tidigare beskrivna1. Häri, har tre FOT parametrar använts för att beskriva förändringar i luftvägarna mekanik induceras av allergisk inflammation och metakolin. Dessa parametrar som ingår: 1-newtonska motstånd (RN; Figur 5A), en parameter som förändringarna i värde främst återspeglar variationer i motståndet av de stora bedriver luftvägarna; 2-vävnad dämpning (G; Figur 5B), en parameter som förändringarna i värde främst återspeglar variationer i vävnad motstånd; och 3-vävnad elastans (H; Figur 5 c), en parameter som förändringarna i värde främst återspeglar variationer i vävnad stelhet2. Som förväntat, var ökningen i var och en av dessa parametrar som svar till inkrementell koncentrationer av metakolin. Överensstämmer med sRaw och EF50 resultat som erhållits med löstagbara från föregående dag (dag 14; (Se figur 1), förändringar i RN induceras av metakolin (figur 5A) var jämförbara mellan kontrollen och allergisk möss. I själva verket värdena för sRaw dag 14 korrelerade med värdena för RN på dag 15 (figur 5 d). Ökningen av H induceras av metakolin var också liknande mellan kontrollen och allergisk möss (figur 5B). Men var den metakolin-inducerad ökningen av G signifikant större i de allergiska möss (figur 5 c). Detta resultat visar förekomsten av en ihållande hyperreaktiv fenotyp i allergisk mössen på dag 15, vilket inte upptäcktes av de DCP-utvärderingar som utförts på de två föregående dagarna.
Hela studien upprepades med C57BL/6 möss. Resultaten av de successiva DCP utvärderingarna av sRaw, dagar 12, 13 och 14 i protokollet (figur 1), och av den FOT-utvärderingen av RN, på dag 15, visas i figur 6. I specifika mus stam bibehölls den överdrivna metakolin svar observerades i de allergiska möss under tre på varandra följande dagar (figur 6A, Boch C). Denna hyperreaktivitet fenotyp skildrades också med en FOT på dag 15 av en ökning RN induceras av metakolin som var mer uttalad i de allergiska möss (figur 6E). Dessa stod i skarp kontrast med de resultat som erhålls med de BALB/c-möss, där en gradvis avtagande av hyperreaktivitet inträffade från dag 12 till 14 (figur 4) och en brist på skillnaden i den metakolin-inducerad ökningen av RN observerades på dag 15 (figur 5A). Tillsammans, visade dessa resultat en tidsvarierande effekten av allergen på metakolin-inducerad reaktionen mellan de två stammarna av möss. Viktigast av allt, var denna stam skillnad avbildad av både löstagbara och FOT. Konkurrenslagen, värdena för sRaw mätt med löstagbara dag 14 korrelerade med värdena för RN mätt av FOT på dag 15 (figur 6F), som observerades med BALB/c möss (figur 5 d).
Figur 1 . Protokoll som används för att framkalla pulmonell allergisk inflammation och bedöma graden av lyhördhet för metakolin. Denna studie genomfördes på kvinnliga BALB/c och C57BL/6 möss av 7 till 9 veckors ålder. Sekvensen av interventioner utförs över hela studien visas i panelen (A). Hälften av mössen utsattes för 50 µg hus-dammkvalster (HDM) extrakt intranasalt på 14 dagar att inducera pulmonell allergisk inflammation. Den andra hälften var utsätts för saltlösning och används som kontroll. Andningsfunktionen bedömdes genom dubbel kammare pletysmografi (DCP) vid tre separata tillfällen (dagar 12, 13 och 14; svarta ringar) efter en acklimatisering sessionen (dag 11; grå cirkel) som inkluderade en utmaning med aerosolized saltlösning. Under varje session bedömdes baslinjen lungfunktion och svaret till metakolin med hjälp av automatiserade protokollet visas i panelen (B). I dag 15 framfördes en invasiv bedömning av respiratoriska mekanik med påtvingat svängning tekniken (FOT) som tidigare beskrivits1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa flöde signaler från en friska BALB/c-mus. Panelerna visar typiska inspelning spår erhålls genom dubbel kammare pletysmografi i en kontroll mus baslinjen villkor. Bröstkorgens flöde visas i den övre panelen och nasala flöde visas i den nedre panelen. Negativa värden är under inspiration och positiva värden är under utandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Upprepade utvärderingar av andningsfunktionen hos medvetna BALB/c-möss. Baslinjen lungfunktion bedömdes genom dubbel kammare pletysmografi (DCP) i kontroll (öppna symboler) och allergisk (solid symboler) möss på dagar 12, 13 och 14 i protokollet illustreras i figur 1. DCP parametrarna används för att bedöma lungfunktion ingår andas frekvens i (A), tidalvolym (TV) (B), minutventilation (MV) i (C), slutet inspiratorisk pausa (EIP) i (D), flöde vid mitten av-tidvatten exspiratorisk volym ( EF50) i (E) och specifika luftvägsmotståndet (sRaw) i (F). Värdena för andning frekvens, TV, MV, sRaw och EIP för varje mus var de genomsnittliga värdena registreras över 1,5 min. Värdet av EF50 var minimala värdet erhålls under denna inspelning. Resultaten presenteras som grupp medel ± standardavvikelse (n = 5/grupp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Metakolin bronchoprovocation test i medvetna BALB/c-möss. Metakolin lyhördhet bedömdes genom dubbel kammare pletysmografi (DCP) i kontroll (öppna symboler) och allergisk (solid symboler) möss på dagar 12, 13 och 14 i protokollet illustreras i figur 1. DCP parametrarna används för att bedöma svaret ingår särskilda luftvägsmotståndet (sRaw) (A) genom (C) och flöde vid mitten av-tidvatten exspiratorisk volym (EF50) i (D) genom (F). Bronchoprovocation utfördes av aerosolizing metakolin i DCP huvud kammaren för 10 s vid inkrementell koncentrationer. Svaret övervakades under 1,5 min efter varje koncentration. Värdet av sRaw för varje mus vid varje koncentration var det genomsnittliga värdet registreras över 1,5 min. Värdet av EF50 var minimala värdet erhålls under denna inspelning. Resultaten presenteras som grupp medel ± standardavvikelse (n = 5/grupp). Symbolen asterisk * designerar en statistiskt signifikant skillnad (p 
Figur 5 . Invasiv bedömning av respiratoriska mekanik i BALB/c möss. Respiratoriska mekanik vid baseline och bemöta metakolin utvärderades av påtvingat svängning tekniken (FOT) på dag 15 i protokollet illustreras i figur 1. Kontrollen (öppna symboler) och allergisk (solid symboler) möss var samma som de som testats av dubbel kammare pletysmografi (DCP) dagar 12, 13 och 14. De parametrar som används för att bedöma respiratoriska mekanik var newtonska motstånd (RN) (A), vävnad elastans (H) (B) och vävnad dämpning (G) (C). Bronchoprovocation framfördes av nebulisatorer inkrementell koncentrationer av metakolin direkt i endotrakealtub sövda, tracheotomized, förlamad och mekaniskt ventilerade möss i ryggläge. Svaret övervakades under 5 min efter varje koncentration. Värde för varje parameter för varje mus vid varje koncentration var toppvärdet erhållits under denna inspelning. Resultaten presenteras som grupp medel ± standardavvikelse (n = 5/grupp). Panelen (D) visar sambandet mellan specifika luftvägsmotståndet (sRaw) mätt av DCP på dag 14 och RN mätt av FOT på dag 15. Öppna symbolerna representerar värden vid baseline och solid symbolerna representerar de maximala värdena vid den högsta koncentrationen av metakolin testas för antingen kontroll (cirklar) eller allergisk (rutor) möss. Infällt visar determinationskoefficienten (r2). Symbolen asterisk * designerar en statistiskt signifikant skillnad (p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Respiratoriska funktion och invasiv respiratoriska mekanik i C57BL/6 möss. Specifika luftvägsmotståndet (sRaw) bedömdes genom dubbel kammare pletysmografi (DCP) vid baseline och bemöta metakolin i kontroll (öppna symboler) och allergisk (solid symboler) möss på dagar 12 (A), 13 (B) och 14 (C) av den protokoll som illustreras i figur 1. Newtonska motstånd (RN) vid baseline och bemöta metakolin bedömdes av påtvingat svängning tekniken (FOT) på dag 15 (D). Bronchoprovocations utfördes som beskrivs i figur 4 och figur 5 för DCP: N och FOT, respektive. Resultaten presenteras som grupp medel ± standardavvikelse (n = 5/grupp). Panelen (E) visar sambandet mellan sRaw mätt av DCP på dag 14 och RN mätt med FOT på dag 15. Öppna symbolerna representerar värden vid baseline och solid symbolerna representerar de maximala värdena vid den högsta koncentrationen av metakolin testas för antingen kontroll (cirklar) eller allergisk (rutor) möss. Infällt visar determinationskoefficienten (r2). Symbolen asterisk * designerar en statistiskt signifikant skillnad (p ≤ 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametern | Enhet | Beskrivning | Information |
| F | BPM | Andnings-frekvens | Mönster av ventilation |
| TV | mL | Tidalvolymen | |
| MV | mL | Minutventilation | |
| TI | MS | Inandningstid | |
| Te | MS | Exspiratorisk tid | |
| PIF | mL/s | Topp inspiratoriskt flöde | |
| PEF | mL/s | Peak expiratory flow | |
| EV | mL | Exspiratorisk volym | |
| NTV | mL | Nasal tidalvolym | |
| NEV | mL | Nasal exspiratorisk volym | |
| EIP | MS | Slutet inspiratorisk paus | |
| EEP | MS | Slutet exspiratorisk paus | |
| dT | MS | Tidsfördröjning | Luftvägsobstruktion |
| sRaw | cmH2O·s | Specifika luftvägsmotståndet | |
| sGaw | 1/cmH2O·s | Specifika luftvägarna konduktans | |
| EF50 | mL/s | Flöde vid mitten av-tidvatten exspiratorisk volym | |
| SR | % | Framgång | Kvalitetskontroll |
| N | Antal giltiga andetag |
Tabell 1. Lista över typiska parametrar erhålls från dubbel kammare pletysmografi. Parametrarna grupperades beroende på arten av den information de ger under en lungfunktion utvärdering.
| Fördelar | Begränsningar |
| · Medvetna djur | · Nödvändighet för att styra den omgivande miljön |
| · Korrekt ventilation parametrar | · Tidigare acklimatisering av djuren |
| · Obestridda index av luftvägsobstruktion (sRaw, EF50) | · Kravet att hermetiskt skilja nasal och bröstkorg flöden |
| · Anpassningsbar till olika arter och djur storlekar | · Absoluta värdet variabilitet för vissa resultat parametrar |
| · Används i många Forskningsansökningar | · sRaw inte en sann mätning av resistans |
| · Okomplicerad teknik | · Förekomsten av de övre luftvägarna |
| · Känsliga att ändra | · Kompletterar mätningarna med en invasiv bedömning |
Tabell 2. Lista över fördelar och begränsningar som är associerade med dubbel kammare pletysmografi.
| Dubbel kammare pletysmografi | Påtvingat svängning teknik | |
| Djurets tillstånd av medvetande | Oförändrat | Bedövas (och vanligtvis förlamad) |
| Djurets position | Upprätt | Liggande |
| Djurets tillgänglighet | Begränsade inom avdelningen | Tillgänglig |
| Djur integration till mätinstrument | Näsa eller hals sigill | Trakeotomi eller oral intubation |
| Djurets luftvägarna träd | Intakt | Delvis – övre luftvägarna segmentet uteslutna (dvs. nasal bedriver, svalg och struphuvud) |
| Lungvolym där parametrarna resultatet erhålls | Variabel - spontan volym antogs av djuret | Standardiserade - med hjälp av kontrollerade rekrytering manövrar och positiva slut-utandningstryck. |
| Frekvens vid vilken parametrarna resultatet bedöms | Variabel - spontanandningen frekvens antas av djuret | Kontrollerade - med hjälp av fördefinierade vågformer på angivna frekvenser |
| Bidrag från övre luftvägarna segment till resultatet parametrar | Kan förväntas | Kringgås |
| Platsen för aerosol leverans | Inne i huvudet kammaren | Direkt i luftstrupen |
| Effekten av övre luftvägarna segment på inhalerad dos / aerosol nedfall mönster | Kan förväntas | Hindrade |
| Förmåga att upptäcka förändring - baserat på resultaten från föreliggande studie | Observerade | Observerade |
| Inneboende variabilitet av tekniken - baserat på resultaten från föreliggande studie | Fluktuationer i variationskoefficienten för sRaw vid baslinjen: 7,5-20,6% | Fluktuationer i variationskoefficienten för RN vid baslinjen: 3,6-13,4% |
Tabell 3. Jämförelse mellan dubbel kammare pletysmografi och påtvingat svängning tekniker.
Discussion
Förmågan att mäta lungfunktion hos medvetna djur är klart motiverad i respiratorisk forskning. I allmänhet är DCP: N en intressant metod att utvärdera funktionen ventilation av det respiratoriska systemet i medvetna och andas spontant djur26. Mer specifikt slår löstagbara eller dess huvud ut variant, ofta en avvägning mellan kvaliteten på informationen och önskad grad av invasivitet3 (tabell 2). Tekniken kan anpassas till olika arter (t.ex. mus, råtta, marsvin) eller djur storlekar och kan användas i många forskningsansökningar. Det är särskilt användbart för att bedöma många djur på en gång i en parallell studiedesign, att övervaka lungfunktionen på upprepad sätt och att fånga kineticsen av svar över tid. Dessutom tekniken är enkel och kan läras i relativt god tid. I detta dokument, ett protokoll som sysselsätter DCP mätningar i möss användes som ett exempel för att beskriva de praktiska aspekterna av denna återhållsamma pletysmografi teknik också för att diskutera de kritiska steg och relaterade resultat.
När du arbetar med medvetna djur, är det viktigt att kontrollera villkoren i den omgivande miljön (t.ex., tyst rum med ett begränsat antal personer eller aktivitet) för att generera reproducerbara resultat. Eftersom restrainers kommer i olika dimensioner, är det viktigt att börja med lämplig storlek så att andningen rörelserna är oberörd. Det är också bra och ofta krävs att vänja djuren till experimental set-up och förfaranden, som det är väl etablerat i möss att besöksförbud påverkar andning frekvens12. Beroende på experimentell design eller villkor, kan flera sessioner av inkrementella varaktigheterna behövas. Slutligen är ger tid i början av ett experiment för djuren att justera rum förändring och nödvändig hantering en enkel fråga som visat sig vara effektiva för att andningsmönstret är konsekvent regelbunden och avslappnad vid baslinjen. Arbeta under förhållanden där djuren är bekväma, välanpassade och lugn kommer också att gynna avseende resultatet variabilitet och kvalitet. Det begränsar också någon stressinducerade version av katekolamin, vilket kan öka luftvägarna kaliber och dämpa en inducerad bronkokonstriktion.
Det är viktigt att förstå att det finns ett behov att skilja så hermetiskt som möjligt nasal och bröstkorg flöden. Beroende på systemet eller arter studeras, kan tätningsmekanism variera i form såväl som i effekt. I den löstagbara vi beskrivs häri, skapas tätningen mellan djurets nos och besöksförbud enheten. Vid bedömningen av lungfunktion av DCP, är det också viktigt att ge en tillräcklig och kontinuerlig bias flöde, som en minskning av nivån av syre tillgängligt för djuret kommer att resultera i signifikanta effekter. Med hänsyn till välbefinnandet hos djur i fasthållning begränsar benägenheten för luftläckage skapad av agitation och maximerar därmed kvaliteten på data. Contrastingly, ett avbrott i försegla kommer att resultera i antingen avvisade datamängder eller en underskattning av vissa parametrar.
Dessutom för att aktivera separat registrering av nasala flöde signalen, används den head avdelningen vanligtvis att utsätta djuret för aerosolized ämnen. Som illustreras i denna artikel, kan detta utnyttjas för att utföra ett bronchoprovocation test för att påvisa olika grader av lyhördhet. I sådana experiment, justera spänna av testade koncentrationerna kan behövas beroende på art, stam, eller sex djur studeras. Som tidigare visats8,9,10,27visar nuvarande resultaten att metakolin-inducerade förändringar i sRaw korrelerade väl med invasiv FOT mätningar av luftvägsmotståndet. Resultaten visar också att DCP tekniken inte är lika känslig som FOT för sin förmåga att upptäcka respiratoriska dysfunktion och identifiera en förändrad svar lokaliserade inom de lägsta delar av lungan (lungvävnad eller små perifera luftvägar) . Eftersom djurets airways är intakt, kan närvaron av de övre luftvägarna, som står för den största delen av det totala respiratoriska motståndet till luftflöde28, påverka aerosol spridning och nedfall i tillägg att dämpa bidraget från nedre luftvägarna att en mätning. Tabell 3 sammanfattar andra skillnader mellan DCP tekniken och FOT. Slutligen, medan det skulle vara teoretiskt möjligt att uppskatta djurets totala luftvägsmotståndet (inklusive övre luftvägarna) från en mätning av sRaw, det är allmänt rekommenderas att komplettera DCP utvärderingen med en invasiv mätmetod som den FOT29 att få direkta mätningar av detaljerade respiratoriska mekanik. Beroende på syftet med studien, kan mätningar av övre luftvägarna motstånd också anses vara30,31,32.
Slutsats
På grund av dess begränsade grad av invasivitet är DCP: N en teknik som kan uppfylla ett viktigt behov i respiratorisk forskning. Det ska kunna ge korrekt avläsning av ventilation mönster i medvetna djur samtidigt med några obestridda index av luftvägsobstruktion. Den information som erhålls också verkligen kompletterar som från mer invasiva metoder.
Disclosures
DB och AR är anställda av SCIREQ vetenskapliga respiratoriska utrustning Inc, en kommersiell enhet som deltar i ämnen relaterade till innehållet i denna artikel. DB äger även lager. SCIREQ Inc. är en emka teknik.
Acknowledgments
SML stöds av en STUDENTTILLVARO av kanadensiska institut för hälsa forskning, MG stöds av ett stipendium från respiratorisk hälsa nätverket av FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) och YB är en forskning lärd från FRQS.
FÖRFATTARNAS BIDRAG
Alla författare bidragit till befruktningen av manuskriptet och/eller video. SML och LD insamlade data. SML, LD, YB, DM, DB och AR bidragit till analys, generering av siffror och manuskript skrivande. YB, AR, KL och MG var inblandade i förbereda video skriptet. Pjäsen spelades av YB, KL och MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
| House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
| DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
| flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |
References
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis Exp. (75), e50172 (2013).
- Bates, J. H. T. CORP: Measurement of lung function in small animals. J Appl Physiol (1985). 123 (5), 1039-1046 (2017).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (4), 1297-1306 (2003).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. J Vis Exp. (90), e51755 (2014).
- Enhorning, G., van Schaik, S., Lundgren, C., Vargas, I. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals? Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Vijayaraghavan, R., Schaper, M., Thompson, R., Stock, M. F., Alarie, Y. Characteristic modifications of the breathing pattern of mice to evaluate the effects of airborne chemicals on the respiratory tract. Arch Toxicol. 67 (7), 478-490 (1993).
- Willis, D. N., Liu, B., Ha, M. A., Jordt, S. E., Morris, J. B. Menthol attenuates respiratory irritation responses to multiple cigarette smoke irritants. FASEB J. 25 (12), 4434-4444 (2011).
- Neuhaus-Steinmetz, U., et al. Sequential development of airway hyperresponsiveness and acute airway obstruction in a mouse model of allergic inflammation. Int Arch Allergy Immunol. 121 (1), 57-67 (2000).
- Glaab, T., et al. Tidal midexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 280 (3), L565-L573 (2001).
- Glaab, T., et al. Noninvasive measurement of midexpiratory flow indicates bronchoconstriction in allergic rats. J Appl Physiol (1985). 93 (4), 1208-1214 (2002).
- Pennock, B. E., Cox, C. P., Rogers, R. M., Cain, W. A., Wells, J. H. A noninvasive technique for measurement of changes in specific airway resistance. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (2), 399-406 (1979).
- DeLorme, M. P., Moss, O. R. Pulmonary function assessment by whole-body plethysmography in restrained versus unrestrained mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 47 (1), 1-10 (2002).
- Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J Appl Physiol (1985). 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Criee, C. P., et al. Body plethysmography--its principles and clinical use. Respir Med. 105 (7), 959-971 (2011).
- Robichaud, A., et al. Automated full-range pressure-volume curves in mice and rats. J Appl Physiol (1985). 123 (4), 746-756 (2017).
- Mizutani, N., Goshima, H., Nabe, T., Yoshino, S. Complement C3a-induced IL-17 plays a critical role in an IgE-mediated late-phase asthmatic response and airway hyperresponsiveness via neutrophilic inflammation in mice. J Immunol. 188 (11), 5694-5705 (2012).
- Nabe, T., et al. Roles of basophils and mast cells infiltrating the lung by multiple antigen challenges in asthmatic responses of mice. Br J Pharmacol. 169 (2), 462-476 (2013).
- Morris, J. B., et al. Immediate sensory nerve-mediated respiratory responses to irritants in healthy and allergic airway-diseased mice. J Appl Physiol (1985). 94 (4), 1563-1571 (2003).
- Merazzi, D., Mortola, J. P. Effects of changes in ambient temperature on the Hering-Breuer reflex of the conscious newborn rat. Pediatr Res. 45 (3), 370-376 (1999).
- Rao, R., Nagarkatti, P. S., Nagarkatti, M. Delta(9) Tetrahydrocannabinol attenuates Staphylococcal enterotoxin B-induced inflammatory lung injury and prevents mortality in mice by modulation of miR-17-92 cluster and induction of T-regulatory cells. Br J Pharmacol. 172 (7), 1792-1806 (2015).
- Agrawal, A., et al. Inhibition of mucin secretion with MARCKS-related peptide improves airway obstruction in a mouse model of asthma. J Appl Physiol (1985). 102 (1), 399-405 (2007).
- Mabalirajan, U., Aich, J., Agrawal, A., Ghosh, B. Mepacrine inhibits subepithelial fibrosis by reducing the expression of arginase and TGF-beta1 in an extended subacute mouse model of allergic asthma. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (3), L411-L419 (2009).
- Desmet, C., et al. Treatment of experimental asthma by decoy-mediated local inhibition of activator protein-1. Am J Respir Crit Care Med. 172 (6), 671-678 (2005).
- Zang, N., et al. Pulmonary C Fibers Modulate MMP-12 Production via PAR2 and Are Involved in the Long-Term Airway Inflammation and Airway Hyperresponsiveness Induced by Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol. 90 (5), 2536-2543 (2015).
- Shukla, M., et al. Carryover of cigarette smoke effects on hematopoietic cytokines to F1 mouse litters. Mol Immunol. 48 (15-16), 1809-1817 (2011).
- Murphy, D. J. Respiratory function assessment in safety pharmacology. Curr Protoc Pharmacol. , Chapter 10 Unit10 19 (2003).
- Lofgren, J. L., et al. Restrained whole body plethysmography for measure of strain-specific and allergen-induced airway responsiveness in conscious mice. J Appl Physiol (1985). 101 (5), 1495-1505 (2006).
- DiMaria, G. U., Wang, C. G., Bates, J. H., Guttmann, R., Martin, J. G. Partitioning of airway responses to inhaled methacholine in the rat. J Appl Physiol (1985). 62 (3), 1317-1323 (1987).
- Hoymann, H. G. Lung function measurements in rodents in safety pharmacology studies. Front Pharmacol. 3, 156 (2012).
- Agrawal, A., Singh, S. K., Singh, V. P., Murphy, E., Parikh, I. Partitioning of nasal and pulmonary resistance changes during noninvasive plethysmography in mice. J Appl Physiol (1985). 105 (6), 1975-1979 (2008).
- McLeod, R. L., Young, S. S., Erickson, C. H., Parra, L. E., Hey, J. A. Characterization of nasal obstruction in the allergic guinea pig using the forced oscillation method. J Pharmacol Toxicol Methods. 48 (3), 153-159 (2002).
- Miyahara, S., Miyahara, N., Takeda, K., Joetham, A., Gelfand, E. W. Physiologic assessment of allergic rhinitis in mice: role of the high-affinity IgE receptor (FcepsilonRI). J Allergy Clin Immunol. 116 (5), 1020-1027 (2005).
