Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Enkelt-celle analyse af Immunophenotype og cytokin produktion i perifere blod via masse flowcytometri

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en enkelt celle proteom tilgang til at vurdere immun fænotypiske og funktionelle (intracellulære cytokin induktion) ændringer i det perifere blodprøver, analyseret via masse flowcytometri.

Abstract

Cytokiner spiller en central rolle i patogenesen af autoimmune sygdomme. Derfor, måling af cytokin niveauer har været genstand for flere undersøgelser i et forsøg på at forstå de præcise mekanismer, der fører til fordeling af self-tolerance og efterfølgende autoimmunitet. Tilgange hidtil har været baseret på en undersøgelse af et bestemt aspekt af immunsystemet (en enkelt eller få celletyper eller cytokiner), og tilbyder ikke en global vurdering af komplekse autoimmun sygdom. Mens patienten sera-baserede undersøgelser har givet vigtige indsigt i autoimmunitet, giver de ikke specifikke cellulære kilden til dysregulated cytokiner opdaget. En omfattende encellede tilgang til at vurdere cytokin produktion i flere immun celle subsets, inden for rammerne af "iboende" patient-specifikke plasma cirkulerende faktorer, er beskrevet her. Denne tilgang giver mulighed for overvågning af patient-specifik immun fænotype (celleoverflademarkører) og funktion (cytokiner), enten i dets native "iboende patogene" sygdom stat, eller tilstedeværelse af terapeutiske agenter (in vivo eller ex vivo).

Introduction

Autoimmune sygdomme er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed, som rammer 3-8% af befolkningen. I USA, autoimmune sygdomme er blandt de førende dødsårsager blandt unge og midaldrende kvinder (aldre < 65 år)1,2. Autoimmune sygdomme er karakteriseret ved heterogent klinisk præsentation og forskellige underliggende immunologiske processer. Spektret af heterogenitet er godt repræsenteret på tværs af forskellige lidelser, såsom fælles deltagelse i leddegigt (RA) og neurologiske sygdom i multipel sklerose (MS). Men dette niveau af heterogenitet eksemplificeres også inden for en enkelt sygdom, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE): nogle patienter kan præsentere med renal patologi, mens andre lider af hæmatologiske eller fælles engagement3.

Den underliggende immunpatogenese i autoimmune sygdomme spejle den kliniske heterogenitet, der omfatter auto - og hyper-aktivering af flere medfødte og adaptive immun celle subsets, og samtidig dysregulated cytokin produktion. Mens cytokiner spiller en central rolle i patogenesen af autoimmune sygdom, forstå deres særlige rolle i mekanismen af sygdom har vist sig for at være udfordrende. Cytokiner er karakteriseret ved pleiotropy (én cytokin kan have flere effekter på forskellige celletyper), redundans (flere cytokiner kan have samme virkning), dualitet (én cytokin kan have pro - eller anti - inflammatoriske virkninger under forskellige betingelser), og plasticitet (cytokiner kan blive støbt ind i en rolle adskiller sig fra sin "original", afhængigt af miljøet)4,5,6. Derfor, befolkningen niveau metoder kan ikke skelne heterogene cellulære svar til den samme "cytokin miljø". Ligeledes studere design, der fokuserer på et specifikt aspekt af immunsystemet (en enkelt celletype eller cytokin), kan ikke tilbyde en samlet vurdering af alle de elementer, der er involveret i komplekse autoimmun sygdom. Mens patienten sera-baserede undersøgelser har givet vigtige indsigt i autoimmunitet, giver de ikke specifikke cellulære kilden til dysregulated cytokiner opdaget.

For nylig har udviklet vi en enkelt celle proteom tilgang til samtidig vurderer flere immun celletyper, og registrere deres forskellige cytokin perturbationer i milieu af patientens specifikke "patogene" perifer blodplasma cirkulerende faktorer. Arbejdsgangen beskrives her er karakteriseret ved brugen af intakt perifere blodprøver, i modsætning til isolerede perifert blod mononukleære celler (PBMC). Perifere fuldblod repræsenterer den mest fysiologisk relevante køretøj at studere systemisk immun-medieret sygdom, herunder 1) ikke-mononukleære blodceller ofte involveret i autoimmun sygdom (dvs., neutrofiler, trombocytter), og 2) plasma cirkulerende faktorer, såsom nukleinsyrer, immunkomplekser og cytokiner, der har immun aktivering roller. At fange den "iboende sygdomsfremkaldende" dysregulated cytokin produktion, perifert blod prøver behandles umiddelbart efter blod draw (T0, tid nul), og efter 6 h inkubation ved 37 ° C (fysiologiske kropstemperatur) med et protein transport hæmmer i mangel af enhver udefrakommende stimulerende tilstand (T6, tid 6 h), at opdage cytokin produktion (ophobning, T6-T0) som ville afspejle tilstanden "iboende" sygdom (figur 1). At studere dysregulated processer, der afspejler over eller under aktivering af signalering veje involveret i immunrespons, der er relevant for sygdommen, perifert blodprøver er behandlet (6 h inkubation ved 37 ° C med en protein transport hæmmer) med en udefrakommende stimulere tilstand, der afspejler sygdom patogenese, såsom Toll-lignende-Receptor (TLR) agonister for SLE (T6 + R848, tid 6 h med 1 µg/mL R848), for at opdage cytokin produktion, som ville afspejle en reaktion på nukleinsyrer (sammenligne T0 vs T6 vs T6 + R848, figur 1). For at studere immunmodulerende effekter af tilgængelige therapeutics ex vivo, som de vedrører de præcise immune dysregulated processer for specifikke patienter, behandles perifert blodprøver med en JAK hæmmer på den relevante terapeutiske koncentration (her, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tid 6 h med 5 uM ruxolitinib), til at registrere ændringer i "iboende" sygdom staten som reaktion på stoffet (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figur 1). En JAK hæmmer blev valgt for denne undersøgelse, fordi JAK hæmmere har vist sig at være vellykkede i behandlingen af autoimmune lidelser som RA.

Du samtidig evaluerer dysregulated processer beskrevet ovenfor i flere immun celle subsets, perifert blodprøver fra SLE blev patienter og raske kontrolpersoner behandlet som beskrevet ovenfor og analyseret af masse flowcytometri. Masse flowcytometri, også kendt som flowcytometri-Time-Of-Flight, tilbyder enkelt-celle analyse af over 40 parametre uden problemer af spektrale overlapper7,8,9. Denne teknik benytter sjældne jordarters metal isotoper i form af opløselige metalioner som tags bundet til antistoffer, i stedet for fluorophores10. Yderligere oplysninger om masse flowcytometri teknologisk platform (dvs., tuning og kalibrering, prøven erhvervelse) kan findes i Leipold et al. og McCarthy et al. 11 , 12 high-dimensionalitet af masse flowcytometri muliggør samtidig måling af flere cytokiner i hele innat og adaptiv immun celle subsets med én celle granularitet (Tabel af materialer).

Nuværende konventionelle klinisk og laboratoriemæssig parametre er ofte ikke følsomme eller konkret nok til påvisning af igangværende sygdomsaktivitet eller svar på specifikke hæmmende13, afspejler behovet for at bedre afgrænse den underliggende immun ændringer, der drive flare-ups. Givet omsiggribende cytokin dysregulering i autoimmune sygdom, en overflod af behandlingsmetoder, der bruger antistoffer eller små molekylære hæmmere målretning cytokiner eller signalering proteiner involveret i reguleringen af cytokin produktion har for nylig opstået. I sin grundlæggende format giver den perifere blod analytiske fremgangsmåde beskrevet her en platform for at identificere patienten-specifikke dysregulated celle subsets og deres unormale cytokin produktion i autoimmune sygdom med systemiske manifestationer. Denne metode giver mulighed for brugertilpasning af terapeutiske muligheder som specifikke dysregulated cytokiner kan identificeres, og særlig behandling muligheder kan være testet ex vivo til at vurdere deres evne til at immunomodulate den patient bestemt sygdom proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den Colorado flere institutionelle Review Board (COMIRB) på University of Colorado. Alle beskrevet nedenstående procedurer bør udføres i en steril vævskultur hætte, medmindre andet er angivet, med filtreret pipette tips, og alle reagenser filtreret.

1. forberedelse af reagenser til perifere fuldblod forarbejdning

  1. Forberede ruxolitinib stock delprøver (10 – 15 μl/hætteglas til enkelt brug) på 10 mM ved at fortynde den frysetørrede reagens i DMSO ifølge producentens anvisninger (opbevares ved-80 ° C). Holde DMSO koncentrationer i alle assays herunder unstimulated kontrolelementer under 0,2% (vol/vol).
  2. Forberede R848 (resiquimod) bestand delprøver (10 – 15 μl/hætteglas til enkelt brug) på 1 μg/μL ved at fortynde den frysetørrede reagens i sterilt vand som den pr fabrikantens anvisninger. Opbevares ved-80 ° C.
  3. Forberede LPS (LPS) bestand delprøver (5 μl pr. hætteglas til kun én gang til brug) på 1 μg/μL ved at fortynde den frysetørrede reagens i sterilt vand ifølge producentens anvisninger. Opbevares ved-80 ° C.
  4. Forberede celle farvning medier (CSM) ved hjælp af PBS, 0,5% BSA og 0,02% NaN3.
  5. Erhverve og holde klar protein transport inhibitor (PTI) cocktail (Tabel af materialer).
  6. Tø og fortynd ruxolitinib stock hætteglas (10 mM) 1:10 i steril PBS (1 mM). Der er afsat ved stuetemperatur i en vævskultur hætte.
  7. Tø og fortynd R848 stock hætteglas (1 μg/µL) 1:10 i steril PBS (0,1 μg/µL). Der er afsat ved stuetemperatur i en vævskultur hætte.
  8. Tø og fortyndes LPS stock hætteglas (1 μg/µL) 1: 100 i steril PBS (0,01 μg/µL). Der er afsat ved stuetemperatur i en vævskultur hætte.
  9. Pre varm sterile RPMI (ingen L-glutamin) i en standard 37 ° C vandbad (i mindst 10 min).
  10. Fortynd lyse/fix bufferen af 1:5 i filtreret ddH2O (arbejdende koncentration) på benchtop (ikke behøver at være steril).
    Bemærk: 1 mL fuldblod kræver 20 mL af arbejdende koncentration af lyse/fix buffer.
    1. Gøre lyse/fix buffer for 5 betingelser af 1 mL fuldblod pr. (mindst 100 mL). Alikvot 20 mL af den arbejdende koncentration af lyse/fix buffer i 50 mL konisk rør pr. milliliter af fuldblod (holde lyse/løsning ved 37 ° C indtil brug for). Label betingelser på de koniske rør indeholdende lyse/fix buffer som følger: T0 (tid nul), T6 + 5R (tid 6 h med 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tid 6 h med 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tid 6 h med 0,1 μg/mL LP'ER), T6 (tid 6 h).
  11. Label runde bunden sterile polystyren rør med hætter og 1 mL microcentrifuge rør med den samme nomenklatur som i trin 1.10.

2. stimulation og behandling af perifere fuldblod (figur 1)

  1. Placer den mærket rund bund polystyren rør fra trin 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LP'ER, T6) på en rist.
    Bemærk: Alle følgende trin er udført i denne type af rør, medmindre andet er angivet. Cap rør ved overførsel mellem vævskultur hood og inkubator at opretholde sterilitet.
  2. Der tilsættes 1 mL af 37 ° C RPMI (ingen L-glutamin) til hver af rør (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LP'ER, T6). Invertere blod collection tube flere gange, tilsættes 1 mL fuldblod til hver tube og pipetteres op og ned flere gange for at blandes grundigt med RPMI (fortynding med RPMI forhindrer sammenklumpning af blodet i 6 h inkubationsperiode).
  3. Der tilsættes 10 μL af 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Blandes grundigt med en P1000 pipette. Placere rack af rør i varmeskab ved 37 ° C og begynde timing inkuberingen (T = 0).
  4. Behandle T0 prøven som følger.
    1. Der afpipetteres hele indholdet af T0 røret i en mærket koniske rør indeholdende 20 mL af 37 ° C arbejder koncentration lyse/fix buffer. For at optimere celle opsving, skyl tube med arbejdende koncentration lyse/fix buffer. Blandes ved at vende den koniske rør.
    2. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min til at tillade lysis og fiksering. Efter fiksation, udføre alle efterfølgende trin på benchtop. Der centrifugeres celler på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Dekanteres. Resuspend celler i 1 mL af is kold PBS til at bryde op pellet, derefter udfylde den koniske til en 15 mL volumen med PBS.
    4. Der centrifugeres celler på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Dekanteres. Gentag PBS vask (trin 2.4.3–2.4.4), hvis pellets er røde. Resuspend celler i 1 mL af CSM at bryde op pellet og derefter overføre til mærket microcentrifuge tube (trin 1.11) for antistoffarvning. Tag en 10 µL prøve at tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter eller hemocytometer.
      Bemærk: Da alle celler er fast på dette punkt, det er ikke nødvendigt at medtage en levedygtighed pletten.
    5. Der centrifugeres celler på 500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Opsug supernatanten, forlader pelleten i ~ 60 µL af residualvolumen. Holde denne pellet på is, indtil prøver fra andre betingelser har afsluttet behandlingen.
  5. På T = 30 min, flytte røret rack (trin 2.3) til vævskultur hood og udføre følgende.
    1. Tilsæt 10 μl af 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Blandes grundigt med en P1000 pipette.
    2. Tilføje 10 μl 0,01 μg/μL LP'ER til T6 + LPS. Blandes grundigt med en P1000 pipette.
    3. Tilføje 4 μL af protein transport inhibitor (bestand på 500 X) til T6, T6 + 5R, og T6 + LPS (men ikke til T6 + R848) og vende tilbage prøverne til rugemaskine indtil T = 6 h. blandes grundigt med en P1000 pipette hver 2 h.
      Bemærk: R848 er en endoplasmic TLR agonist og derfor kræver en tidsmæssig forsinkelse i tilsætning af protein transport-hæmmer til at give adgang til sit mål receptor.
  6. På T = 2 h, tilføje 4 μL af protein transport hæmmer cocktail (bestand på 500 X) til T6 + R848 tube. Bland alle prøver med en P1000 pipette og vende tilbage rack til rugemaskine indtil T = 6 h.
  7. Bland prøverne med en P1000 endnu en gang på T = 4 h.
  8. På T = 6 h, behandle T6, T6 + LP'ER, T6 + R848 og T6 + 5R blod prøve rør som beskrevet i trin 2.4 for T0 prøve.
  9. Gemme celle pellets i CSM residualvolumen ved-80 ° C til at behandle på et senere tidspunkt. Alternativt, gå videre til stregkodesystem og antistof farvning uden at gemme.

3. stregkode af mængden/faste blodlegemer

  1. Tø mængden/faste celle prøver fra-80 ° C opbevaring langsomt på isen; højst 20 prøver kan være mærket med unikke stregkoder og samles ved hjælp af dette system. Fortyndet 10 X barcoding perm buffer ved 1:10 med PBS; gøre nok buffer for ~ 3 mL pr. prøve.
  2. Fyld en ikke-sterile trug med CSM og en med 1 X barcoding perm buffer. Der tilsættes 1 mL af is kold CSM til frisk optøede prøver, blandes grundigt med en pipette, og overføre til de respektive forud mærket polypropylen klynge rør.
  3. Tag en 10 μL prøve at tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter eller hemocytometer. Normalisere celletal 1,5 – 2 x 106 celler pr. prøve i hver klynge tube: Fjern og kassér mængden af overskydende celler over 2 x 106 celler.
  4. Der centrifugeres celler på 600 x g i 5 min ved stuetemperatur. Resuspend celler i 1 mL af 1 X barcoding perm buffer med en multikanalpipette og centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved stuetemperatur. Opsug off supernatanten.
  5. Linje op de klynge rør på en rist i samme rækkefølge som er angivet på tasten stregkode, så prøven svarer med sin stregkode. Tilføje 800 μL 1 X stregkodesystem perm buffer af multikanalpipette til alle prøver i klynge rør uden at røre den celle pellet med pipette tips (ingen blanding) til at reducere celletab. Der er afsat rack med cluster-rør.
  6. Fjerne 20-plex Pd Barcoding Kit tube strimler fra-20 ° C og tø ved stuetemperatur. Tilsæt 100 μL af 1 X barcoding perm buffer, blandes grundigt, og overføre 120 μl af den resuspenderede stregkode blanding i de tilsvarende celle prøver i klynge rør.
  7. Blandes grundigt ved multikanalpipette derfor er der ingen krydskontaminering mellem individuelt barcoded prøver. Inkuber klynge rør i 30 min. ved stuetemperatur til at tillade stregkoder at mærke cellerne.
  8. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved stuetemperatur. Opsug supernatanten, så resuspend i 1 mL af CSM.
  9. Der centrifugeres og resuspend i CSM igen som i trin 3.8.
    Bemærk: Hver prøve er nu mærket med en unik stregkode og prøver er klar til at samles.
  10. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved stuetemperatur og Opsug supernatanten. Med en enkelt pipette og bruger den samme tip, overføre alle celle pellets i ~ 70 – 80 μl residualvolumen til én polystyren tube. Ikke skubber pipette tip; der er afsat til enkelt pipette med dette tip.
  11. Med en multikanalpipette og nye tips, tilføje ~ 100 μL CSM til hver oprindelige klynge tube at maksimere celle opsving. Overføre alle celle pellets i ~ 100 μL residualvolumen til samme polystyren røret med den enkelt pipette med spidsen, der var afsat.
  12. Tilføje CSM til toppen af polystyren røret (~ 3 mL). Tælle og registrere celle antal poolede stregkoden sæt. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min ved stuetemperatur og Opsug supernatanten. Fortsæt til farvning barcoded prøver på samme dag.
    Bemærk: Det er normalt at forvente ~ 20 – 30% celletab i stregkodesystem proces.

4. farvning af Barcoded faste mængden/blodlegemer og forberedelse til analyse på masse flowcytometri Instrument

Bemærk: Hver 1 X titer af farvning antistof (1 μl antistof pr. 100 μL farvning reaktion), kan normalt pletten 3 – 4 x 106 celler. Derfor, når alle barcoded prøver er samlet i ét rør, mængden af antistof skal skaleres. Hvis 20 barcoded prøver udgør 30 x 106 celler, og hver 1 X titer kan plette 3 – 4 x 106 celler, kræver barcoded prøve kun en 10 X titer, i modsætning til farvning hver prøve individuelt, hvilket ville kræve en 20 X mængde antistof (1 X pr. enkelte rør). Koncentration af antistof mod celle nummer bør omhyggeligt titreres for hver enkelte antistof cocktail (ikke drøftet her).

  1. Pletten celler ved hjælp af antistoffer (Table of Materials) for overflade pletter og cytokin induktion.
    1. Gøre overfladen farvning cocktail ved beregningen af beløbet for at blive tilføjet og tegner sig for pipettering fejl (dvs., hvis farvningen 20 barcoded prøver af 2 x 106 celler i hver prøve, en 10 X titer pletten er påkrævet, for endelige rumfang beregninger, kompensere for pipettering fejl ved at foretage en 10,5 X endelige farvning løsning).
    2. Tilføje 10 X værd af overfladen farvning volumen til barcoded celle pellet. For at reducere celletab, med den samme tip, mix og måle op mængden af overflade pletter og celle pellet.
    3. Baseret på antallet af celler og farvning cocktail, tilføje CSM til en endelige farvning rumfang 50 μl pr. antal celle prøver (dvs., hvis kører et sæt af 20 prøver, 50 μL X 20 = 1 mL). Inkuber i 30 min. ved 4 ° C. Agitere prøve hver 15 min for at fremme selv farvning.
    4. Under overfladen pletten inkubation, forberede Perm/vaskebuffer (Table of Materials) ved at fortynde 1:10 med filtreret ddH2O. Forbered bind 2 mL for permeabilization og 5 mL til vask. Holde ved 4 ° C eller på is.
    5. Hinden overfladen farvning tube med CSM, og der centrifugeres ved 600 x g ved 4 ° C i 5 min. Aspirér supernatanten. Resuspend barcoded prøven i 4 ° C, 1:10 sættes 2 mL fortynding Perm/Wash buffer. Der inkuberes ved 4 ° C i 20-30 min til fuldt permeabilize cellerne.
    6. Der centrifugeres ved 600 x g ved 4 ° C i 5 min og Opsug supernatanten.
    7. Intracellulær farvning, Følg lignende farvning trin (med hensyn til overflade farvning). Men, bruge de 4 ° C, 1:10 fortynding Perm/Wash buffer i stedet for CSM gøre alt farvning volumen, således at cellerne i et permeabilizing miljø i hele intracellulær farvning.
    8. Tilføj den intracellulære antistof cocktail til overfladen farves og permeabilized celle pellet (trin 4.1.2–4.1.17). Bringe alt farvning lydstyrken til 50 μl pr. antal celle prøver. Inkuber i 60 min. ved 4 ° C. Agitere prøve hver 15 min for at sikre selv farvning.
    9. Under intracellulær farvning, forberede intercalator løsning: 900 μl af filtrerede PBS + 100 μL af filtrerede 16% PFA (endelig koncentration på 1,6% PFA) + 0,2 μL af 500 uM af intercalator farvestof (Tabel af materialer).
    10. Hinden celle pellet + intracellulære antistof cocktail med koldt 1:10 Perm/Wash buffer.
    11. Der centrifugeres ved 600 x g ved 4 ° C i 5 min, og Opsug supernatanten. Hinden farvning røret med CSM. Tælle og registrere celle nummer. Der centrifugeres ved 600 x g ved 4 ° C i 5 min, og Opsug supernatanten. Resuspend celler i 1 mL af intercalator løsning fra trin 4.9. Inkuber i mindst 20 min. ved stuetemperatur for fuld intercalation, eller natten over ved 4 ° C (prøver i intercalator løsning kan bo på 4 ° C i op til 1 uge før du kører dem på masse flowcytometri instrument).
  2. Forberede masse flowcytometri instrument cellerne.
    1. Hinden tube med 3 mL filtreret ddH2O og centrifugeres ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspend celler i 3 mL filtreret ddH2O. passere denne suspension gennem en 100 μm filter til at fjerne snavs eller aggregeringer, der potentielt kunne tilstoppe masse flowcytometri instrument.
    2. Tælle og registrere celle nummer efter filtrering. Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min. ved 4 ° C
  3. Forberede perle kalibreringsopløsningen (Table of Materials) ved at fortynde det 1:10 i filtreret ddH2O.
  4. Resuspend den farvede celler i den krævede mængde i 1:10 Fortyndet kalibreringsopløsning perle til at nå en celle koncentration af ~ 1 x 106 celler/mL.
    Bemærk: For en CyTOF1 på 45 µL/min er den anbefalede optimale 5 x 105 celler/mL; til Helios 30 µL/min., 7,5 x 105 celler/mL.
  5. Gå videre til at køre prøven på masse flowcytometri instrument9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsprocesser for stimulering og behandling af perifert blodprøver, herunder tildeling af blod prøve delprøver, timing af tilsætning af stimulation agenter, protein transport hæmmer cocktail og inkubation gange indtil de røde blodlegemer (RBC) lysis og fiksering. Valget af stimulerende stoffer vil afhænge af den signalering og cytokin veje, der er beregnet til vurdering. For eksempel, i den protokol, der er beskrevet her, bruges TLR agonister til at vurdere medfødte immun sensing mekanismer på tværs af flere celletyper. Repræsentative ekstracellulære (LP'ER, TLR4 agonist) og endoplasmic (R848, TLR7/8 agonist) agonister blev valgt. Andre stimulerende stoffer omfatter Phorbol 12-Myristate 13-acetat (PMA) og Ionomycin (PMAIONO), som kan fungere som T-celle aktivatorer. Specifikke cytokiner kan også bruges som stimulerende agenter, sammen med andre specifikke B og T-celle antigener.

For at demonstrere den eksperimentelle metode beskrevet i denne protokol, figur 2, figur 3og figur 4 viser repræsentative resultater opnået med LP'ER, R848 og PMAIONO som stimulerende betingelser. Mens brugen af PMAIONO ikke var beskrevet i protokollen, er data vist i figur 3 og figur 4 viser, at forskellige (og selektiv) celletyper og cytokiner er aktiveret/induceret svar på TLR agonister (LP'ER og R848) versus en T celle aktivator (PMAIONO). Eftersom 26 celleoverflademarkører (Table of Materials) har været anvendt til at afgrænse flere medfødte og adaptive immun celle subsets, kan forskellige T, B, NK, monocyt og dendritiske celle subsets samtidig studeres inden for en enkelt prøve. Derudover er markører for immun celle aktivering også medtaget, såsom CD86 eller ICOS for B-celler og PD1 for T-celler. En begrænset gating strategi viser vurderingen af CD14hi monocytter repræsentant er vist i figur 2. Imidlertid yderligere detaljeret og udvidet gating T, B, NK, monocyt, dendritiske, og granulocytic celle subsets kan findes i vores tidligere publicerede artikler i O'Gorman og Hsieh et al. og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Derudover unsupervised analysemetoder, herunder (og ikke begrænset til) SPADE16, visNE17, Citrus18, Phenograph19, og Xshift20 kan bruges til at evaluere masse flowcytometri data (ikke diskuteret her). Brug CD14hi monocytter og CD4 T-celler som repræsentative innat og adaptiv immun celle subsets, er data, der viser cytokin induktion i disse celletyper vist i figur 3. Et udvalgt antal af cytokiner blev valgt til at vise, at R848 selektivt inducerer IL-12 (p40 subunit) og MCP1 i CD14hi monocytter mens LP'ER ikke (figur 3). PMAIONO, en potent T celle aktivator fremkalde ikke cytokiner i CD14hi monocytter (figur 3) men fremkalde interferon gamma (IFNγ) og tumor nekrose faktor alfa (TNFα) i CD4 T-celler (figur 4). Vellykket teknik i perifert blod prøve stimulation og behandling vil demonstrere mønstre af cytokin induktion specifikke stimulerende betingelser og immun delmængder, som eksemplificeret i figur 3 og figur 4. Komplet analyse af de 14 cytokiner beskrevet her i celletyper fanget inden for de 26 celleoverflademarkører, se venligst O'Gorman og Hsieh et al.og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15

At demonstrere, hvordan den eksperimentelle tilgang i denne protokol beskrevne indfanger en systemisk autoimmun sygdom "iboende" patogene tilstand som i SLE i forhold til en sund donor, figur 5 illustrerer cytokin induktion (Mip1β og MCP1) i CD14hi monocytter syge perifert blod prøve kun (del B), i mangel af enhver udefrakommende stimulation (T6 sammenlignet med T0). Disse cytokiner er "moduleret/faldt" af JAK hæmning terapi ruxolitinib (T6 + 5R sammenlignet med T6) i den syge perifere blod prøve kun (del B).

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelle arbejdsgang for stimulation og behandling af perifert blod for masse flowcytometri analyse. Protokol for RBC lysis og fiksering af sygdom perifert blod prøve umiddelbart følgende samling (T0), eller efter 6 h inkubation ved 37 ° C med en protein transport inhibitor (PTI) i mangel af enhver udefrakommende agent (T6), eller med LP'ER (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; protein transport hæmmer inkubation i 4 h kun), eller ruxolitinib (T6 + 5R). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Repræsentant gating strategi til identifikation af CD14hi monocytter. Efter fiksering og RBC lysis fast den enkelte mængden/celle prøver fra raske donorer blev barcoded, mærket med 26 antistoffer mod overflade markører, permeabilized og farves med 14 antistoffer mod cytokiner (Tabel af materialer). Den begrænsede gating strategi repræsenterer identifikation af CD14hi monocytter er vist. Fra venstre mod højre er hver 2D plot repræsenteret, befolkningen undersæt fra den overordnede befolkning, der er gated (blå boks) fra 2D plottet umiddelbart til venstre. En udvidet gating strategi kan findes i O'Gorman og Hsieh et al.og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Eksempel på cytokin induktion i CD14hi monocytter efter stimulation med LP'ER, R848 og PMAIONO. En repræsentant masse flowcytometri analyse af perifert blod prøver fra en sund donor på tidspunktet nul (T0), unstimulated (T6), og efter stimulation med LP'ER (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), og PMAIONO (T6 + PMAIONO) er vist. Er vist et eksempel af cytokin induktion i CD14hi monocytter; valgte cytokiner med specificitet til den stimulerende middel anvendes (TLR agonist vs T-celle aktivator) er afbildet. Udvidet data for alle cytokin induktion på tværs af flere immun celle subsets opgøres med denne masse flowcytometri antistof panel kan findes i O'Gorman og Hsieh et al.og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Eksempel på cytokin induktion i CD4 T celler efter stimulation med LP'ER, R848 og PMAIONO. En repræsentant masse flowcytometri analyse af perifert blod prøver fra en sund donor på tidspunktet nul (T0), unstimulated (T6), og efter stimulation med LP'ER (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), og PMAIONO (T6 + PMAIONO) er vist. Eksempel på cytokin induktion i CD4 T-celler er vist; valgte cytokiner med specificitet til den stimulerende middel anvendes (TLR agonist vs T-celle aktivator) er afbildet. Udvidet data for alle cytokin induktion på tværs af flere immun celle subsets opgøres med denne masse flowcytometri antistof panel kan findes i O'Gorman og Hsieh et al.og O'Gorman og Kong et al. 14 , 15 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Eksempel på cytokin induktion i CD14hi monocytter fra SLE sygdom patienten. En repræsentant masse flowcytometri analyse af perifert blodprøver fra raske donorer (A) og SLE sygdom patienten (B) er vist. Eksempler på cytokin induktion i CD14hi monocytter; valgt cytokiner med specificitet i SLE sygdom "iboende" patogene processen (T6) (dvs., induktion af MIP1β og MCP1 kun i SLE patienten), og effekten af Immunmodulator ruxolitinib (T6 + 5R) er afbildet. Udvidet data for alle cytokin induktion på tværs af flere immun celle subsets opgøres med denne masse flowcytometri antistof panel kan findes i O'Gorman og Kong et al. 15 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en roman, encellede, proteom tilgang til samtidig vurderer flere immun celletyper og afsløre deres forskellige cytokin perturbationer i milieu af patientens specifikke "patogene" perifer blodplasma cirkulerende faktorer. Denne metode beskæftiger perifere fuldblod som analytisk køretøj, og masse flowcytometri som redskab til evaluering af immun cellulære fænotypiske og funktionelle abnormiteter. Metoden kan let anvendes på menneskelige og mus undersøgelser21, og er kompatibel med andre immun funktionel analyse, såsom afsløring signaling abnormiteter14.

Brugeren skal være bevidste om en række variabler, der kan påvirke succes af denne procedure. Baseret på vores erfaringer, skal blodprøver behandles inden for 2 h af samling at undgå baseline induktion af intracellulære cytokiner (data ikke vist). Blodprøver skal forblive ved stuetemperatur (25 ° C) mens vi venter på behandling. Blodprøver kan indsamles i enten natrium heparin eller EDTA-rør, uden indblanding med den beskrevne assay. Levende og døde celle forskelsbehandling kan vurderes af masse flowcytometri ved hjælp af cisplatin22. Dog er sådan vurdering udeladt i den protokol, der er beskrevet ovenfor antager blod behandles straks (eller inden for 2 h) efter indsamling. Desuden, selv hvis prøver var forsinket i behandling, manglen på kryopræservering giver mulighed for udeladelsen af live/døde forskelsbehandling. Vi vil dog anbefale brugen af cisplatin til levedygtighed forskelsbehandling for enhver undersøgelse, hvori celledød kunne påvirke resultatet af den efterfølgende analyse.

Derudover har vi fundet at de omhyggelige valg og titrering af det stimulerende agent er vigtigt at evaluere målrettede immun veje/cytokin induktion. For det første valget af den stimulerende middel bør baseres på 1) immun veje til formål at engagere/evaluere, og 2) målrettet funktionelle udlæsninger (om signalering proteiner eller cytokin produktion). For eksempel, hvis målet var at vurdere T-celle aktivering og forskellige T hjælper celle (Th) delmængder og deres respektive cytokin induktion, ville PMAIONO eller en kombination af anti-CD3/anti-CD28 være en passende stimulerende tilstand. Men hvis målet var at vurdere monocyt delmængde aktivering, en TLR agonist (eller en kombination af dem) kan være bedst. Andet skal koncentration for hver af disse stimulerende stoffer optimeres for at fremkalde celle aktivering og cytokin induktion, uden at alvorligt ændre de celle overflade markører. Brug af for lidt stimulerende agent vil ikke føre til aktivering af ønskede celletyper og ingen cytokin induktion vil observeres, mens brug af for meget vil føre til overdreven celledød, og ændringer i immun celle celleoverflademarkører, således at befolkningerne identificeret i den unstimulated tilstand vil ikke være til stede i den stimuleret tilstand. For det tredje er kinetik af stimulation også en vigtig variabel. Mens 6 h har tidligere været udgivet som en optimal stimulation tidsramme at fange maksimal induktion af pro-inflammatoriske cytokiner som svar på TLR stimulation14,23, kan en anden stimulation tidspunkt blive behov for andre agenter. Ligeledes bør brugen af enhver terapeutisk stof i vitro med perifert blodprøver også titreres på samme måde som de stimulerende agent, mens meget opmærksomme på koncentration og tidspunkt.

I denne protokol bruger vi friske perifere blodprøver, som intracellulære cytokin induktion (og detection) er mere robuste og effektive i forhold til befrugtede prøver. Vi beskriver i protokol her brugen af fuldblod i modsætning til PBMC, idet tilstedeværelsen af plasma cirkulerende faktorer bidrager til den "iboende" karakter af de immun abnormiteter relateret til sygdomsprocessen. Disse plasma-cirkulerende faktorer kan forstyrre stimulere betingelser føjet til de perifere fuldblod, såsom tilføjelsen af anti-IgM og anti-IgG for at engagere den B-celle receptoren, som de er bundet af plasma cirkulerende antistoffer og røde blodlegemer. Derfor omhyggelig med valg af den stimulerende betingelser når ved hjælp af perifere fuldblod er afgørende for vellykket eksperiment læse outs. Ved hjælp af perifere blod har sine fordele (i vivo platform) og ulemper (interfererende plasma cirkulerende faktorer). Men PBMC tilbyder et andet sæt af "fordele" og "ulemper." Når frisk PBMC (i modsætning til fuldblod) underkastes den samme proces/protokol og med stimulation ved hjælp af forskellige TLR agenter, vi observerede den samme "mønster" af cytokin induktion, omend i en lidt mindre størrelsesorden14,23. Efter denne protokol, brugen af frosne PBMC fører til en mindre robust cytokin induktion, og derfor vi vil anbefale imod direkte sammenligne resultater fra prøver behandles efter kryopræservering med dem forarbejdet friske.

Givet advarsel af frisk versus frosne prøver og præferencen for brug af friske prøver for optimal datakvalitet, er protokollen beskrevet her egnet til potentielle humane undersøgelser hvor patientprøver er indsamlet over en tidsramme af måneder til år. Perifert blodprøver kan behandles som beskrevet, og når de når RBC lysis og fiksering scenen, prøver kan opbevares i-80 ° C og farves i partier senere. Denne tekniske tilgang, udgør mens fordelagtige for mest humane undersøgelser, også udfordringen, ved hjælp af antistoffer, der kan binde til target epitop efter fiksering. Tabel af materialer lister kloner til de respektive antistoffer, der er blevet testet og påvise specifikke farvning post fiksering. Stregkodesystem flere prøver (n = 20) tilbyder fordelene ved 1) faldt tekniske variabilitet, som flere prøver farves sammen i ét rør, derfor gør sammenligninger af prøver over betingelser temmelig konsekvent og pålidelig; 2) reduktion af samlede antistof brug (se protokollen afsnit 4.1); og 3) ordningen stregkodesystem af "6 forskellige palladium isotoper/vælge 3" fører til udelukkelse af dubletter (celler positive for mere end 4 palladium isotoper). Disse fordele er drøftet i detaljer i Zunder og Fick et al. 24 Derudover stregkodesystem proces kræver at fastsættes celler, som de skal være mildt permeabilized for intercalation af stregkodesystem reagens (palladium isotoper)24. Derfor, live farvning kan ikke udføres efter denne protokol. Det skal bemærkes, at levende celle stregkodesystem (i modsætning til faste celle stregkodesystem beskrevet her) er en mulighed for25,26, men i protokol her, celler er fast så de kan være gemt og batch behandles sammen.

Batch-prøve behandling, mens fordelagtige, en arbejdskraft og tid effektivitet synspunkt, også har sine egne udfordringer. Med batch-behandling er der behov for en nøje kurateret normalisering proces. Denne normalisering proces kan behandles på forskellige trin i arbejdsprocessen masse flowcytometri. Først, koncentrationen af antistof mod celle nummer bør holdes konsistent på tværs af partier. Vi har fundet, at en effektiv måde at opnå denne overensstemmelse koncentration er af 1) omhyggelig titrering af antistof koncentration til celle nummer, og 2) normalisering af celle antallet af hver af de prøver, der er barcoded sammen (dvs.1 million celler pr. prøve, for alle 20 barcoded prøver). For det andet for at tage hensyn til instrument signal intensitet variation (forskellige dage i tuning, kalibrering og signal henfald run tidens), bør prøver genopslemmes og analyseret på en masse forskellige med en passende normalisering perle løsning (tabel af materialer), efterfulgt af fil normalisering efter data erhvervelse27 (men før debarcoding). Individuelle prøver er debarcoded efter den hele barcoded fil er blevet normaliseret ved hjælp af de værktøjer, der beskrives i Zunder og Finck et al. 24 for det tredje for at tage hensyn til manuel antistof farvning tekniske variabilitet, anbefaler vi optagelse af en "anker" prøve med hver stregkode, der er analyseret for en enkelt undersøgelse, dvs., en enkelt prøve, der er fra en donor (humane undersøgelser) og er blevet behandlet på samme måde som andre undersøgelse prøverne. Denne prøve skal genereres en gang i stor nok mængde til at blive distribueret til hvert stregkode sæt analyseret for undersøgelsen. Disse anker prøver fra hver stregkode vil blive brugt til at generere en koefficient af varians til at korrigere for signal variation på tværs af undersøgelsen prøver for at stregkode (dvs., anker prøve fra stregkode 8 vil blive brugt til at korrigere for variation i stregkode 8).

En anden vigtig optimering skridt er forsamlingen af panelet masse flowcytometri antistof, som vil vurdere relevante immun celle subsets og cytokiner. Nogle af de vigtigste variabler i antistof panel forsamling omfatter valg af kloner (behandlet ovenfor), antistof titer for minimal baggrund signal, valg af antistof mål og isotop kanaler baseret på antigen overflod og kanal følsomhed " godtgørelse"af signal spillover baseret på isotop urenhed og oxidation og enkelte antistof masse variation. Disse optimering trin er rettet andetsteds28 og ikke er omfattet af protokollen beskrevet her.

Bruger denne encellede proteom tilgang til at studere immun abnormiteter i perifert blodprøver, er det muligt at identificere unormale fænotyper af immun celle subsets, uanset om det er befolkning frekvens forskelle eller ændringer i udtryk for bestemt celle overflade markører (som markører for celle aktivering). Derudover er det også muligt at identificere funktionelle abnormiteter i immunsystemet celle subsets, sådan som i eller overproduktion af cytokiner. Endelig, processen med at sammenligne prøven straks fast (T0) versus fast efter 6 h inkubation uden en udefrakommende agent (T6) viser "iboende" patogene processer, der fører til immun celle type og cytokin abnormiteter (T6-T0). Denne tilgang kunne være skræddersyet til undersøgelse af en række forskellige systemiske immun-medieret processer og engagement af flere immun celle subsets og veje afhængigt af stimulation agent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Aimee Pugh-Bernard for hendes intellektuelle input og nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award og prisen antallet K23-1K23AR070897 fra NIH til Elena W.Y. Hsieh. Hun blev også støttet af award nummer K12-HD000850 fra Eunice Kennedy Shriver National Institute for børns sundhed og menneskelige udvikling og Lucile Packard Foundation for børns sundhed, Stanford CTSA UL1 TR001085 og barn sundhedsforskning Institut for Stanford University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruxolitinib Santa Cruz SC-364729A Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848 Invivogen tlrl-r848-5 Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK Invivogen tlrl-eklps Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS Lonza 17-516F
Lyse/Fix Buffer BD biosciences 558049 Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I BD biosciences 557885 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI Gibco 21870-076
Sodium Azide (NaN3) Sigma-Aldrich S-8032 Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI) eBiosciences 00-4980-93 Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator Fluidigm 201192B Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM) PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer Fluidigm 201057 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set Fluidigm S0014 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution Thermo 28908 Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes VWR 60818-496 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes Light Labs A-9001 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument Fluidigm Helios All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c Biolegend L161 Mass: 161
CD3 BD UCHT1 Mass: 144
CD4 Biolegend SK3 Mass: 174
CD7 BD M-T701 Mass: 149
CD8 Biolegend SK1 Mass: 142
CD11b Fluidigm ICRF44 Mass: 209
CD11c BD B-ly6 Mass: 152
CD15 BD HI98 Mass: 115
CD14 Biolegend M5E2 Mass: 154
CD16 eBioscience/Thermo B73.1 Mass: 165
CD19 Santa Cruz SJ25C1 Mass: 163
CD21 Biolegend Bu32 Mass: 141
CD27 BD L128 Mass: 155
CD38 Fluidigm HIT2 Mass: 172
CD45 total Biolegend HI30 Mass: 89
CD45RA Biolegend HI100 Mass: 153
CD56 Miltenyi REA196 Mass: 168
CD66 BD B1.1/CD66 Mass: 113
CD86 Fluidigm IT2.2 Mass: 150
CD123 Fluidigm 6H6 Mass: 143
CD278/ICOS Biolegend C398.4A Mass: 156
CD179/PD1 Biolegend EH12.2H7 Mass: 162
IgD Biolegend IA6-2 Mass: 146
IgM Biolegend MHM-88 Mass: 151
CXCR5 BD RF8B2 Mass: 173
HLADR Biolegend L243 Mass: 167
Cytokines
IL-1α Biolegend 364-3B3-14 Mass: 147
IL-1β Biolegend  H1b-98 Mass: 169
IL-1RA Santa Cruz  AS17 Mass: 157
IL-6 Biolegend MQ2-13A5 Mass: 164
IL-8 BD E8N1 Mass: 160
IL-12/IL-23p40 Biolegend  C8.6 Mass: 171
IL-17A Biolegend  BL168 Mass: 148
IL23p19 eBioscience/Thermo 23dcdp Mass: 176
MIP1β BD D21-1351 Mass: 158
MCP1 BD 5D3-F7 Mass: 170
IFNα Miltenyi  LT27:295 Mass: 175
IFNγ Biolegend 4S.B3 Mass: 165
PTEN BD A2B1 Mass: 159
TNFα Biolegend Mab11 Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
  2. Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
  3. Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
  4. Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
  5. Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
  6. Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
  7. Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
  8. Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
  9. Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  10. Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
  12. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
  13. Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
  14. O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
  15. O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
  16. Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
  17. Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
  18. Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
  19. Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  20. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
  21. Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
  22. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  23. Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
  24. Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  25. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
  26. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  27. Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  28. Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).

Tags

Immunologi og infektion sag 136 autoimmunitet cytokiner celle subsets perifere fuldblod plasma antistof masse flowcytometri immunomodulation
Enkelt-celle analyse af Immunophenotype og cytokin produktion i perifere blod via masse flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baxter, R. M., Kong, D. S.,… More

Baxter, R. M., Kong, D. S., Garcia-Perez, J. E., O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y. Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57780, doi:10.3791/57780 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter