Summary
免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導) を評価する単一細胞プロテオミクスの手法をここで述べる末梢全血サンプル、大量のフローサイトメトリーによる分析の変化。
Abstract
サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たします。したがって、サイトカインの測定以降自己免疫自己寛容の崩壊へとつながる正確なメカニズムを理解する試みの複数の研究の焦点となっています。アプローチはこれまで免疫システム (単一または少数細胞の種類またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に関する研究に基づいているし、複雑な自己免疫疾患の世界的な評価を提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。循環要因、「本質的な」患者固有のプラズマのコンテキスト内で、複数の免疫細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を評価する包括的な単一セルのアプローチを紹介します。このアプローチにより、患者固有の免疫表現型 (表面マーカー) の監視といずれかのネイティブ関数 (サイトカイン)"組み込み病原性」病状態、または治療薬 (in vivoまたは前のヴィヴォ) の存在。
Introduction
自己免疫疾患は、罹患率と死亡率が人口の 3-8% に影響を与える主要な原因です。自己免疫疾患は若年・中年層の女性の間で死の主要な原因の中で、アメリカ合衆国 (年齢 < 65 歳)1,2。自己免疫疾患は、異機種混在の臨床プレゼンテーションと多様な基になる免疫学プロセスによって特徴付けられます。不均一性のスペクトルも共同参画慢性関節リウマチ (RA) と神経疾患多発性硬化症 (MS) などの別の疾患の間で表されます。ただし、このレベルの不均一性の全身性エリテマトーデス (SLE) など、単一の障害内例でも: 何人かの患者は腎病理呈することがある血液や共同関与3他の人苦しむ間。
自己免疫疾患の基になる回は自動とハイパー-アクティブ化の複数の自然免疫と適応免疫細胞サブセットおよびサイトカイン産生調節不全の合併を含む、臨床不均質をミラー化します。サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たす、間は病気のメカニズムでの特定の役割を理解することに挑戦すると証明しました。サイトカインの発現によって特徴付けられる (1 つのサイトカインは、異なる種類の細胞に複数の効果を持つことができます)、(多数のサイトカインが同じ効果を持つことができます) の冗長性、二元性 (1 つのサイトカインは、異なる条件の下でプロや抗炎症効果を持つことができます)、可塑性 (サイトカインはその「オリジナル」の 1 つは、環境に応じて異なる役割に成形することができます)4,5,6。その結果、人口レベルのメソッドは、同じ「サイトカイン ・ ミリュー」レスポンスの異種細胞を区別できません。同様に、免疫システム (単一の細胞型またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に焦点を当てる研究デザインは、複雑な自己免疫疾患に関連するすべての要素のグローバル アセスメントを提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。
最近では、同時に複数の免疫細胞の種類を評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出する単一細胞プロテオミクス手法を開発しました。ここで説明したワークフローは、孤立した末梢血単核球 (PBMCs) ではなく、そのまま末梢全血サンプルの使用が特徴です。末梢全血を表します (すなわち、好中球、血小板)、自己免疫疾患および 2) 血漿中しばしば関与 1) 非単核白血球細胞を含む、全身性の免疫疾患を勉強する最も生理学的関連車両核酸、免疫複合体、サイトカインなどの要因を循環免疫活性化の役割があります。キャプチャする、"本質的な病原性「サイトカイン産生調節不全、末梢血サンプル処理直後に血液 (T0、時間ゼロ) とタンパク質輸送の 37 ° c (生理的体温) 6 時間後「本質的な」病気の状態 (図 1) を反映するサイトカイン産生 (蓄積、T6 T0) を検出する外因性刺激条件 (T6、時間 6 h)、不在の阻害剤。外因性物質と扱われる (タンパク質輸送阻害剤と 37 ° C で 6 時間培養) を上反映調節不全プロセスやシグナル伝達経路、病気に関連する免疫応答に関与する末梢血サンプルの下活性化研究サイトカイン産生核酸への応答を反映するを検出する (T6 + R848、時間 6 h 1 μ g/ml の R848)、SLE の場合フリー ダイヤル様受容体 (TLR) アゴニストなどの病気の発症を反映する条件を刺激 (対 T0、T6 T6 対の比較 +R848、図 1)。特定の患者のための免疫調節不全の正確なプロセスに関連する利用できる治療前のヴィヴォの免疫調節効果を勉強するには、末梢血サンプルは治療に関連する JAK 阻害で扱われています。濃度 (ここでは、5 uM ruxolitinib;T6 + 5R、時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、(対 T0、T6 T6 対 + 5R、図 1) 薬物への応答で「本質的な」病気の状態の変化を検出します。JAK 阻害剤がラーなど自己免疫疾患の治療に成功するために示されているために、この研究のため選ばれたの JAK 阻害剤
同時に複数の免疫細胞のサブセットは、sle 患者末梢血サンプルで説明した調節不全のプロセスを評価するには、患者と健常者だった前述の処理し、質量フローサイトメトリーで分析します。として知られているフローサイトメトリー-飛行時間型の質量フローサイトメトリーはスペクトルの問題7,8,9の重複なし 40 を超えるパラメーターの単一細胞解析を提供しています。この手法は、行きの抗体の同時10の代わりにタグとして水溶性の金属イオンの形で希土類金属の同位体を利用しています。リチャードライポルトらとマッカーシーらの (すなわち、チューニングし校正、サンプルの収集) 質量フローサイトメトリーの技術プラットフォームに関する詳細を見つけることができます。11,12質量フローサイトメトリーの高次元単一セルの粒度 (材料表) と自然免疫と適応免疫の細胞のサブセットの中で複数のサイトカインの同時測定が可能。 にします。
従来の臨床的および検査パラメーターを現在は多くの場合機密情報や継続的な疾患活動性または特定免疫13より根本的な免疫を線引きする必要性を反映する応答を検出するために十分に特定再燃をドライブの変更。自己免疫疾患におけるサイトカイン調節不全の普及を考えると、抗体または小分子阻害剤サイトカインをターゲットやサイトカイン産生の調節に関与するタンパク質のシグナルを使用する処置のアプローチの茄多があります。最近浮上しました。その基本的な形式では、ここで説明した末梢血分析アプローチは、患者固有の調節不全の細胞のサブセットと全身症状と自己免疫疾患での異常なサイトカイン生産を識別するためのプラットフォームを提供します。この方法により治療法の選択の個人用設定を特定の調節不全サイトカインを識別できるとオプションは、特定の治療法をテスト immunomodulate する能力を評価するためにex vivo患者特定疾患プロセス。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドで、コロラド州複数制度レビュー ボード (COMIRB) のコロラド州の大学を承認されています。フィルター処理されたピペット チップで、特記しない限り、滅菌のティッシュ文化フードの下すべての記載されている手順を実行すべき、すべて試薬フィルターします。
1. 末梢全血処理試薬の調製
- 準備 ruxolitinib ストック因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) 10 mM で製造元の指示に従って (-80 ° C で保存) DMSO で凍結乾燥試薬を希釈します。DMSO 濃度を 0.2% (巻/巻) 下処理コントロールを含むすべてのアッセイにおいて。
- R848 を準備 (resiquimod) 在庫因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) として滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈して 1 μ g/μ L で、製造元の指示に従って。-80 ° C でストア
- 製造元の指示に従って滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈してリポ多糖 (LPS) ストック因数 (1 回のみ使用のバイアルあたり 5 μ L) 1 μ g/μ L でを準備します。-80 ° C でストア
- 0.02% ナン30.5 %bsa、PBS を使用して細胞染色メディア (CSM) を準備します。
- 取得し、タンパク質輸送阻害剤 (PTI) カクテル (資材表) を準備してください。
- 解凍し、ruxolitinib ストック バイアル (10 mM) 1:10 滅菌 PBS (1 mM) で希釈します。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。
- 解凍し、R848 株式バイアル (1 μ g/μ L) を 1:10 滅菌 PBS で希釈 (0.1 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。
- 解凍し、滅菌 PBS 中に組合ストック バイアル (1 μ g/μ L) の 1: 100 希釈 (0.01 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。
- あらかじめ滅菌 RPMI (L-グルタミン) (少なくとも 10 分) の標準の 37 ° C の水浴中を温めます。
- 1:5 でフィルター処理された ddH2O (作業濃度) (滅菌する必要はありません) または卓上 lyse/修正プログラム バッファーを希釈します。
注: 全血 1 mL 20 mL の溶解/修正プログラム バッファーの使用濃度が必要です。- 全血各 (少なくとも 100 mL) 1 mL の 5 条件の溶解/修正プログラム バッファーを作る。全血 (37 ° c まで必要な lyse/修正プログラム ソリューションを維持) の 1 ミリリットルあたり 50 mL の円錐管に lyse/修正プログラム バッファーの作業濃度の分注 20 mL。ラベルを次のように溶解/修正プログラム バッファーを含む円錐管の条件: T0 (時間 0) T6 + 5R (時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、T6 + R848 (1 μ g/ml の R848 6 h を時間)、T6 + LP (0.1 μ g/mL lps 時間 6 h) T6 (時間 6 h)。
- ラベルの下部キャップ滅菌ポリスチレン管とステップは 1.10 と同じ名目で 1 mL 遠心チューブをラウンドします。
2. 刺激し末梢全血 (図 1) の処理
- ラウンド下ポリスチレン チューブ ステップ 1.11 から (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) ラックにラベルを配置します。
注: 次のすべての手順を行った管のこのタイプの指定がない限りティッシュ文化フードと無菌性を維持するためにインキュベータ間転送するときチューブをキャップします。 - チューブ (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) のそれぞれに 37 ° C RPMI (L-グルタミン) の 1 つの mL を追加します。数回、採血管を反転、各管に全血 1 mL を追加し、上下に数回 RPMI で徹底的にミックスするピペット、(RPMI で希釈は、6 時間の潜伏期間中に血液の凝集を防ぐ)。
- 1:10 の 10 μ L を追加 T6 + 5R ruxolitinib。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。37 ° C でインキュベーターでチューブのラックを置き、孵化のタイミングを開始 (T = 0)。
- T0 サンプルのように処理します。
- 20 mL の 37 ° C 作業濃度溶解/修正プログラム バッファーを含むラベルの付いた円錐管にピペットの T0 管の全体の内容。細胞回復を最適化するためには、濃度溶解/修正プログラム バッファー管をすすいでください。円錐形の管を反転でミックスします。
- 換散の固定できるように 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。次の固定、ベンチトップでのすべての後続の手順を実行します。室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。
- 上清をデカントします。1 mL の氷冷 PBS、ペレットを分割するのに細胞を再懸濁します、PBS で 15 mL のボリュームに円錐形を埋めます。
- 室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。上清をデカントします。ペレットが赤い場合は、PBS 洗浄 (手順 2.4.3–2.4.4) を繰り返します。ペレットを分割し、抗体の汚損のためのラベル付き遠心管 (ステップ 1.11) に転送する CSM の 1 mL の細胞を再懸濁します。自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。
注: すべてのセルがこの時点で固定されているため、性染色を含める必要はありません。 - 室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。残気量の ~ 60 μ L のペレットを残して上清を吸引します。その他の条件からのサンプルは、処理が完了するまでは、このペレット氷の上を保ちます。
- T = 30 分管ラック (ステップ 2.3) をティッシュ文化フードに移動し、以下を実行します。
- 0.1 μ g/μ L の 10 μ L を追加 T6 + R848 R848。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。
- T6 + LP に 0.01 μ g/μ LPS の 10 μ L を追加します。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。
- T6、T6 と 5 r、T6 + (しかしないT6 + R848) LPS に蛋白質輸送阻害剤 (500 X の株式) の 4 μ L を追加し、インキュベーターに T までサンプルを返す = 6 h ミックス P1000 ピペットすべて 2 h で徹底的に。
注: R848 小 TLR アゴニストは、したがってその標的受容体へのアクセスを許可する蛋白質輸送阻害剤の添加で一時的な遅れが必要です。
- T = 2 h タンパク質輸送阻害剤カクテル (500 X の株式) の 4 μ L を加える T6 + R848 チューブ。すべてのサンプルを混ぜて P1000 ピペットと T までインキュベーターにラックを返す = 6 h。
- T で 1 つのより多くの時間、P1000 でサンプルをミックス = 4 h。
- T = 6 h を T6、T6 + LP、T6 + R848、T6 処理 + 5R 血液サンプル チューブに記載手順 T0 サンプルの 2.4。
- 細胞ペレットを将来の日付で処理する-80 ° C で残留の CSM のボリュームに格納します。また、バーコードと抗体染色を格納せずに進みます。
3. バーコードの血液細胞の分離・固定
- ゆっくりと氷上;-80 ° C のストレージから分離固定細胞サンプルを解凍します。最大 20 個のサンプルのユニークなバーコードでラベル付けできますが、このシステムを使用してプールします。1:10 と PBS; によって 10 の X barcoding パーマ バッファーを希釈します。サンプル 1 〜 3 mL の十分なバッファーを作る。
- CSM と 1 X barcoding パーマ バッファー 1 つ 1 つの非滅菌トラフを入力します。氷の 1 mL を追加し、新鮮なマスクのサンプルの冷たい CSM ピペット、徹底的に混ぜてし、それぞれ事前ラベルの付いたポリプロピレン クラスター チューブに転送。
- 自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。1.5-2 各クラスター チューブのサンプルあたり 10 の6セル × セル数を正規化: 削除し、余分な細胞は 2 x 10 の6セル上のボリュームを破棄します。
- 室温で 5 分間 600 x g で細胞を遠心します。マルチ チャンネル ピペットと 600 x g で室温で 5 分間遠心 1 X barcoding パーマ バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します。上清を離れて吸い出しなさい。
- サンプルのバーコードと一致するようにバーコード キーに記載されている同じ順序でラックにクラスター チューブのラインアップします。マルチ チャンネル ピペットで 800 μ L 1 バーコード パーマ バッファー X を追加すると、セル損失を低減するピペット チップ (ない混合) と細胞ペレットに触れることがなくクラスター チューブのすべてのサンプル。クラスター チューブをラック置いておきます。
- -20 ° C と室温で融解から 20-プレックス Pd バーコード キット チューブ ストリップを削除します。1 X barcoding パーマ バッファーの 100 μ L を加えて混和、クラスター チューブ内の対応するセルのサンプル再懸濁バーコード ミックス 120 μ に転送。
- 個別にバーコード サンプル間交差汚染がないように、マルチ チャンネル ピペットによって徹底的にミックスします。クラスター用セルのラベルにバーコードを許可する部屋の温度で 30 分間インキュベートします。
- 室温で 5 分間 600 × g で遠心分離機します。、上清を吸引し、CSM の 1 mL で再懸濁します。
- 遠心分離機し、ステップ 3.8 のように再び CSM で再懸濁します。
注: 各サンプルに一意のバーコード ラベルが作成されました、サンプルはプールする準備ができています。 - 室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。シングル ピペットと同じチップを使用して、転送 〜 70-80 のすべての細胞のペレット 1 ポリスチレン管 μ L 残気量。ピペットの先端をイジェクトしません。このヒントでシングル ピペット置いておきます。
- マルチ チャンネル ピペットと新しいヒント、細胞回復を最大化する各元のクラスター チューブに 〜 100 μ L CSM を追加します。脇に設定された先端の単一のピペットと同じポリスチレン管に 〜 100 μ L 残留量のすべての細胞のペレットを転送します。
- CSM をポリスチレン管 (〜 3 mL) を先頭に追加します。数とレコード プールされたバーコードのセルの数を設定します。室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。同じ日にバーコード サンプルを染色に進みます。
メモ: バーコード処理に 〜 20-30% のセル損失を期待することは正常です。
4. バーコードの染色によって/血液細胞と分析のための準備に固定質量フローサイトメトリー装置
注: 各 1 X 抗体抗体の汚損 (1 μ L あたり 100 抗体の μ L 反応染色)、通常 3-4 x 10 の6セルを汚すことができます。したがって、すべてのバーコードのサンプルは 1 つの管にプールされるとき抗体の量をスケール アップする必要があります。バーコード サンプルがのみ、10 X 抗体価、各サンプルを個別に、染色ではなく抗体 (1 X あたりの 20 倍量を必要とするを必要がある場合は 30 x 106セル、および各 1 X 価 20 バーコード サンプル量は、3-4 x 10 の6セルを汚すことができる、個々 の管)。セル番号に抗体の濃度は、それぞれ個々 の抗体のカクテルの (ここでは説明しません) 慎重に滴定する必要があります。
- 表面の染色とサイトカイン誘導抗体 (資材表) を用いて細胞を染色します。
- カクテルを作る表面の汚損に追加と会計のピペッティング エラー量を計算することによって (すなわち、各サンプルの 2 x 10 の6セルの 20 のバーコード サンプルを汚す場合価染色 × 10 が必要です; 最終巻計算のため誤差を補正ピペッティング 10.5 X 最終的なソリューションを染色することによって)。
- バーコード細胞ペレットにボリュームを染色表面の価値がある 10 X を追加します。同じチップでのセル損失を減らすためにミックスし、表面の汚れと細胞ペレットの量を測定します。
- 細胞と染色カクテルの量に基づいて、最終的な染色細胞サンプル (すなわち、20 サンプル、20 = 1 mL × 50 μ L のセットを実行している場合) 数あたり 50 μ L 量に CSM を追加します。4 ° C で 30 分間インキュベートします。染色を促進するサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。
- 表面の汚れ、インキュベーション中に希釈 1:10 フィルター ddH2によって透過性、2 mL と 5 mL の洗浄のための o. 準備ボリューム パーマ/洗浄バッファー (材料表) を準備します。4 ° c または氷の上に保ちます。
- 染色の CSM は、管表面の締めくくり、4 ° C で 600 x g で 5 分間遠心上清を吸引します。4 ° C、1:10 の 2 mL でバーコード サンプルを再懸濁します希釈パーマ/洗浄バッファー。完全にセルを permeabilize 20-30 分のための 4 ° C で孵化させなさい。
- 4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。
- 細胞内染色 (表面の汚損) に関しては同様の染色手順に従います。ただし、4 ° C、1:10 を使用して合計のセルの細胞内染色を通して permeabilizing の環境のまま、ボリュームを染色する CSM ではなく希釈パーマ/洗浄バッファー。
- 細胞表面にカクテルの抗体染色と細胞ペレット (手順 4.1.2–4.1.17) グリセリンを追加します。携帯サンプル数あたり 50 μ L にボリュームを染色の合計をもたらします。4 ° C で 60 分間インキュベートします。染色できるようにサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。
- 細胞内染色中インターカレーター ソリューションの準備: 900 μ L フィルター処理された PBS + フィルター 16% の 100 μ L の PFA (1.6% の最終的な集中 PFA) + 500 uM のインターカレーター色素 (材料表) の 0.2 μ L。
- パーマ/洗浄バッファー細胞ペレット + 細胞抗体カクテル冷たい 1:10 トップします。
- 4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。CSM と染色したチューブの締めくくり。カウントし、細胞の数を記録します。4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。ステップ 4.9 からインターカレーター溶液 1 mL の細胞を再懸濁します。室温におけるインターカレーションで少なくとも 20 分間インキュベートまたは 4 ° C (インターカレーター ソリューションのサンプルが 4 ° C で最大 1 週間滞在質量フローサイトメトリー装置にそれらを実行する前に) で一晩します。
- 質量フローサイトメトリー装置のセルを準備します。
- フィルター処理された ddH2O、3 mL と 600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心管の締めくくりこの懸濁液は破片や質量フローサイトメトリー装置を詰まらせる可能性があります可能性のある集計をすべて削除する 100 μ m フィルターを通過フィルター ddH2o. を渡す 3 mL のセルを再停止しなさい。
- カウントし、セルの番号後ろ過を記録します。600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心
- 1:10 フィルター ddH2o. でそれを希釈することによってビードのキャリブレーションソリューション (材料表) の準備します。
- ステンド グラス、再懸濁します 1:10 の必要なボリュームのセル希釈キャリブレーションソリューション ビーズ 〜 106セル/mL x 1 の細胞濃度を達成するために。
注: 45 μ L/分 CyTOF1、推奨される最適なは 5 x 10 の5セル/mL;30 μ L/分、7.5 x 105セル/mL でヘリオスの - 質量フローサイトメトリー装置9サンプルで実行に進みます。
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Representative Results
図 1を示して刺激のためのワークフローと血液サンプル因数の配分などを含めた末梢血サンプルの処理刺激剤、タンパク質の添加のタイミング輸送阻害剤カクテル、およびインキュベーション赤血球 (RBC) 換散および固定までの時間。刺激的なエージェントの選択は、評価の対象となるシグナルとサイトカイン経路によって異なります。たとえば、ここで説明したプロトコルでは TLR アゴニストは複数の細胞のタイプ間で生得免疫検出メカニズムを評価するためにされます。代表的な細胞外 (LP、TLR4 アゴニスト) と小 (R848、TLR7/8 アゴニスト) アゴニストが選ばれました。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) およびイオノマイシン (PMAIONO) は、T 細胞の活性剤として機能することができます、他の刺激的なエージェントが含まれます。として、特定のサイトカインがまた使える刺激剤、その他の特定の B および T 細胞の抗原と共に。
このプロトコルで記述されている実験的アプローチを示すためには、図 2図 3、および図 4を示す代表の結果として PMAIONO、R848、LP を使用して条件を刺激します。図 3と図 4実証する種類の異なる (そして選択的な) 細胞とサイトカイン活性化/誘導 T 対 TLR アゴニスト (LP、R848) への応答でデータが表示されます PMAIONO の使用されたプロトコルで記述されていませんが、細胞の活性化 (PMAIONO)。26 表面マーカー (材料表) は、複数の自然免疫と適応免疫細胞のサブセットを区別するために使用されていることを考える様々 な T、B、NK、単球、および樹状細胞サブセット学ぶことができます同時に 1 つのサンプルの内で。さらに、免疫細胞の活性化のマーカーは CD86 などアイコス B 細胞と T 細胞の PD1、含まれています。CD14hi 単球の評価を示す戦略をゲーティング限られた代表は図 2に示します。ただし、さらに詳細なオゴルマンと謝らとオゴルマンと香港ら我々 の以前に発行された仕事で T、B、NK、単球、樹状突起、および顆粒球の細胞のサブセットの拡張ゲートを見つけることができます。14,15また、教師を含む解析手法 (とに限定されない) Xshift20 Phenograph19, 柑橘類18visNE17スペード16質量フローサイトメトリー データ (ないを評価する使用できますここで説明)。代表的な自然免疫と適応免疫の細胞のサブセットとして CD14hi 単球と cd4 陽性 T 細胞を使用して、これらの細胞型のサイトカインの誘導を示すデータは図 3のとおりです。サイトカインの選択数は IL-12 (p40 サブユニット) を選択的に誘導する R848 MCP1 組合中 CD14hi 単球ではないことを示すに選ばれました (図 3)。PMAIONO、強力な T 細胞活性化 CD14hi 単球 (図 3) サイトカイン誘発しないが、インターフェロン γ (肝腎) と腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) cd4 陽性 T 細胞 (図 4) では誘導します。図 3および図 4において例示するとおり、末梢血サンプル刺激と処理の成功法はサイトカイン誘導刺激条件と免疫のサブセットに特定のパターンを示しています。26 表面マーカーにキャプチャされた細胞の種類で記載されて 14 サイトカインの完全な分析は、オゴルマンと謝らとオゴルマンと香港ら参照してくださいしてください。14,15
健康なドナーと比較した場合、SLE の図 5に示しますサイトカイン誘導などにこのプロトコルで記述されている実験的アプローチが全身性自己免疫疾患の「本質的な」病原性の状態をキャプチャする方法を示すため (Mip1β とMCP1) 部分で発見、病変の末梢血サンプルのみ (B)、不在で (T6 に比べて T0) 外因性の刺激の CD14hi 単球。これらのサイトカインが"変調/減「JAK 阻害療法 ruxolitinib (T6 + T6 と比較して 5 r) 病気の末梢血サンプルのみ (B 部) で。
図 1。刺激および質量のフローサイトメトリー解析のための末梢血の処理の実験的ワークフロー 。赤血球の溶解と固定病末梢血サンプル直後コレクション (T0) または蛋白質輸送阻害剤 (PTI) がない場合は任意の外因性物質 (T6) や LP (T6 + LP)、37 ° C で 6 時間培養後 R848 のプロトコル (T6 + R848。タンパク質輸送阻害剤の孵化 4 h のみ)、または ruxolitinib (T6 + 5 r)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。CD14hi 単球の識別のための戦略をゲート代表します。固定と RBC 換散、個人分離/固定細胞サンプル健康なドナーからバーコード、26 表面マーカー抗体が付いた、グリセリン、14 (材料表) のサイトカイン抗体で染色しました。CD14hi 単球の識別を表す限定ゲーティング戦略が表示されます。左から右に、表される各 2 D プロットですが親の人口からの人口のサブセット ゲート (青のボックス) 2 D プロットからすぐに左にオゴルマンと謝らとオゴルマンと香港ら拡張ゲート戦略を見つけることができます。14,15この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。PMAIONO、R848、LPS 刺激 CD14hi 単球におけるサイトカイン誘導例。末梢血の代表的な質量のフローサイトメトリー解析サンプル LPS (T6 + LP)、R848 刺激し、健康なドナーから時 0 (T0) 些細 (T6) (T6 + R848)、PMAIONO (T6 + PMAIONO) が表示されます。CD14hi 単球におけるサイトカイン誘導の例です。選択したサイトカイン刺激的なエージェントの使用 (T 細胞活性化対 TLR アゴニスト) に特異的に描かれています。オゴルマンと謝らとオゴルマンと香港らこの質量フローサイトメトリー抗体パネルをもって確定され複数の免疫細胞のサブセットの間ですべてのサイトカイン誘導の拡張データを見つけることができます。14,15この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。次の PMAIONO、R848、LPS 刺激細胞の CD4 のサイトカイン誘導の例。末梢血の代表的な質量のフローサイトメトリー解析サンプル LPS (T6 + LP)、R848 刺激し、健康なドナーから時 0 (T0) 些細 (T6) (T6 + R848)、PMAIONO (T6 + PMAIONO) が表示されます。CD4 T 細胞のサイトカイン誘導の例が表示されます。選択したサイトカイン刺激的なエージェントの使用 (T 細胞活性化対 TLR アゴニスト) に特異的に描かれています。オゴルマンと謝らとオゴルマンと香港らこの質量フローサイトメトリー抗体パネルをもって確定され複数の免疫細胞のサブセットの間ですべてのサイトカイン誘導の拡張データを見つけることができます。14,15この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。SLE 疾患患者から CD14hi 単球におけるサイトカイン誘導の例です。から健康なドナー (A) と (B) SLE 病患者末梢血サンプルの代表的な質量のフローサイトメトリー解析が表示されます。CD14hi 単球のサイトカイン誘導の例SLE の病気「固有の」病原性プロセス (T6) に特異的にサイトカインを選択 (すなわち、SLE 患者でのみ MIP1β と MCP1 の誘導)、免疫調節剤 ruxolitinib (T6 + 5R) の効果が描かれていると。オゴルマンと Kongらのこの質量フローサイトメトリー抗体パネルをもって確定され複数の免疫細胞のサブセットの間ですべてのサイトカイン誘導の拡張データを見つけることができます。15この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで小説、単一セル、種類の免疫細胞を同時に評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出するプロテオミクスの手法について述べる。このメソッドでは、分析の車両と免疫細胞の表現型および機能異常の評価のためのツールとして質量フローサイトメトリー末梢全血を採用しています。メソッドは、人間およびマウス研究21、適用が容易ですし、シグナル伝達異常14の検出など、他の免疫機能解析と互換性が。
ユーザーは、このプロシージャの成功に影響を与えることができる変数の数を認識する必要があります。我々 の経験に基づいて、細胞内サイトカイン (データは示されていない) のベースライン誘導を避けるためにコレクションの 2 時間以内の血液サンプルに処理されます。採血する必要がありますまま室温 (25 ° C) で待っている間処理。血液を採取することができますいずれかのナトリウム ヘパリンまたは EDTA 管、説明アッセイに干渉することがなく。住んでいるし、死んだ細胞の差別、シスプラチン22を使用して大量のフローサイトメトリーにより評価されます。しかし、このような評価はコレクションの後すぐに (または 2 時間以内) に血液が処理されると仮定すると上記で説明したプロトコルでは省略されます。また、処理のサンプルが遅れた場合でも、凍結の欠如はライブ/デッド差別の不作為のできます。細胞死が下流解析の結果を影響可能性があります任意の研究の実行可能性の差別のシスプラチンの使用をお勧めします、ただし、します。
さらに、我々 は慎重に選択し、刺激的なエージェントの滴定はターゲットを絞った免疫経路/サイトカイン誘導の評価に不可欠なを発見しました。まず、刺激的なエージェントの選択は、1) 免疫に基づいている必要があります経路従事/評価するため、2) 対象機能読み出し (タンパク質やサイトカインの生産をシグナリング) かどうか。たとえば、目標は T 細胞の活性化と異なる T のヘルパー細胞 (Th) のサブセットと彼らのそれぞれのサイトカイン誘導を評価した場合 PMAIONO または抗 CD3/抗 CD28 の組み合わせになる適切な刺激条件。しかし、目標が単球サブセットの活性化を評価するなら、TLR アゴニスト (またはこれらの組み合わせ) があります最高。第二に、これらの刺激的なエージェントの各濃度は厳しくセル表面のマーカーを変更することがなく細胞の活性化やサイトカイン誘導を引き出すために最適化する必要があります。あまり刺激的なエージェントの使用目的のセル型の活性化につながるはありません、あまりにも多くの使用は、過剰な細胞死につながる、免疫の変化細胞表面マーカーの個体識別、サイトカイン誘導は認めないです。安静時の状態で表示されません刺激状態に。第三に、刺激の動力学はまた重要な変数です。6 h は以前 TLR 刺激14,23に応えてプロ炎症性サイトカインの誘導を最大にする最適な刺激期間として公開されており中に、異なる刺激 timepoint が必要他のエージェント。同様に、あらゆる治療薬の in vitro末梢血サンプルの使用は、濃度と timepoint に細心の注意を払いながら刺激的なエージェントと同じように滴もする必要があります。
このプロトコルでは、細胞内サイトカイン誘導 (と検出) はより堅牢で凍結保存したサンプルと比較した場合に効果的な新鮮な末梢全血サンプルを使用します。述べるここのプロトコルの PBMCs ではなく全血の使用病気プロセスに関連する免疫異常の「本質的な」自然に貢献する要因を循環血漿の存在として。これらのプラズマ循環要因と干渉するかもしれない抗 IgM の追加など、末梢血中に追加条件を刺激、抗-igg B 細胞受容体に従事するプラズマ抗体、赤血球の循環によって拘束されるので。したがって、刺激的な慎重に選択条件読んで実験が成功のために重大が末梢全血を使用してアウト。末梢全血を使用してには利点 (体内プラットフォーム) と短所 (干渉・ プラズマ ・循環要因)。しかし、PBMCs は「長所」、「短所」の異なるセットを提供します。(全血) ではなく新鮮な PBMCs は同じプロセス/プロトコルを受けるし、刺激が異なる TLR エージェントを使用して、わずかに低い大きさ14,23にサイトカイン誘導の同じ「パターン」を観察します。このプロトコルに従い冷凍 PBMCs の使用より堅牢なサイトカイン誘導につながるし、したがって、直接処理した凍結の新鮮な処理後のサンプルからの結果を比較することに対してお勧めします。
新鮮凍結試料と最適なデータ品質の新鮮なサンプルの使用のための好みの点を考えると、ここで説明したプロトコルに適しています人間の前向き研究ヶ月歳までの期間の患者サンプルの収集場所。サンプルの-80 ° C で保存および後でバッチ処理で染色できる赤血球溶解と固定段階に達すれば、前述のように、末梢血サンプルを処理ことができます。この技術的なアプローチ中ほとんどの人間学有利も固定後ターゲットのエピトープにバインドできる抗体を使用しての問題が生じます。材料表は、テストされているし、特定の染色のポスト固定を示すそれぞれの抗体のクローンを一覧表示します。複数のサンプルのバーコード (n = 20) 1 の利点を提供しています) 複数のサンプルがかなり一貫性があり信頼性の高い; したがって条件サンプルの比較を行う 1 つの管で一緒に染色技術変動を減少2) 総抗体使用量削減 (プロトコル セクション 4.1 を参照)。・ 3) 6 異なるパラジウム同位体/「を選択」3 のバーコード方式は、ダブレット (以上 4 パラジウム同位体陽性細胞) の排除をもたらします。これらの利点は、Zunder と Fickらで詳しく説明します。24また、バーコード処理が必要ですセルの修正彼らはされる弱グリセリン バーコード化試薬 (パラジウム同位元素)24のインターカレーションのする必要があります。したがって、ライブ染色は実行できませんこのプロトコルに続きます。(ここで説明した固定セル バーコード) ではなくライブ携帯バーコードは可能性25,26, しかし、格納できるし、バッチが同時に処理するのでここのプロトコル、セルを固定するに注意してください。
バッチ サンプル処理、労働から有利である一方、時間効率という観点、独自の課題があります。バッチ処理の慎重キュレーション正規化処理の必要性があります。この正規化のプロセスは、大量のフローサイトメトリー ワークフローのさまざまなステップで対処できます。最初に、セル番号に抗体の濃度は、バッチ間で一貫性のある保管すべき。我々 は、この一貫した濃度を達成するために効果的な方法はセル番号に抗体濃度の 1) 慎重な滴定してバーコードを一緒には、サンプルのそれぞれのセルの数 2) 正規化 (すなわち、100 万を発見しました。すべて 20 バーコード サンプルのサンプルあたりのセル)。第二に、計器信号強度変動 (実行時間をかけて調整、校正、および信号減衰の別の日) に、サンプルする必要があります再停止して分析する適切な正規化ビーズ ソリューション (テーブルで大量の cytometer で材料の)、ファイル正規化データ集録27後 (しかし debarcoding の前に) 続く。Zunder と・ フィンクらで説明するツールを使用して全体のバーコード ファイルを正規化されています後、個々 のサンプル、debarcoded24第三に、手動抗体染色技術の可変性を考慮するをお勧めします、単一の研究、すなわち、1 つドナー (人間の研究) からは 1 つのサンプルを分析各バーコード セットと「アンカー」サンプルを含めることと他の研究のサンプルと同じ方法で処理されています。このサンプルに研究分析バーコード セットごとに配布するのに十分な量に 1 回生成されます。各バーコードからこれらのアンカーのサンプルを使用して分散するバーコードの研究サンプルを渡る信号の変動を補正するための係数が生成されます (すなわちバーコード 8 からアンカー サンプル使用されますバーコード 8 の変動を補正するため)。
もう一つの重要な最適化ステップ質量フローサイトメトリー抗体パネルでは、関連性の高い免疫細胞サブセットとサイトカインは、評価のアセンブリであります。抗体パネル アセンブリで主な変数のいくつかは、(上記の対処) クローン、最小限のバック グラウンド信号に対する抗体価の選択、抗体の標的の抗原の豊かさとチャンネル感度に基づく同位体チャネル選択」同位体の不純物と酸化、個々 の抗体多く変動に基づく信号波及の補償」。他の最適化手順を宛て28ここで説明したプロトコルの範囲内にないです。
末梢血中の免疫異常の勉強にこの単一細胞プロテオミクスの手法を使用すると、免疫細胞のサブセットの異常な表現型を識別することが可能かどうかだが人口周波数違いかの発現の変化(細胞の活性化のマーカー) など特定のセル表面のマーカー。さらに、それも、免疫細胞のサブセット、または内で下のようなサイトカインの過剰産生の機能的異常を識別するために可能です。最後に、サンプルを比較するプロセスすぐに固定 (T0) 固定と 6 時間後の外因性物質 (T6) なしの潜伏は、免疫細胞の種類とサイトカインの異常 (T6 T0) につながる「本質的な」の病原性プロセスをについて説明します。このアプローチは、さまざまな全身性の免疫プロセスの研究や複数の免疫細胞のサブセットおよび刺激剤によって経路の関与に合わせて可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
彼女の知的入力と有用なコメントがエイミー ピュー-ベルナールに感謝したいと思います。この作品は、生物医学研究賞のベッチャー財団ウェッブ waring 氏と番号 K23 1K23AR070897 NIH からエレナ大学院謝によって支えられました。彼女はまた子供の健康、スタンフォード CTSA UL1 TR001085 と子供の健康の研究のため受賞番号 K12 HD000850ユーニス · ケネディ · シュライバー国立研究所からの母子保健と人間開発とルシル Packard 財団によって支えられました。スタンフォード大学の研究所の大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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