Summary
Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.
Abstract
Las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, la medición de los niveles de citocinas ha sido objeto de múltiples estudios en un intento de comprender los mecanismos precisos que conducen a la ruptura de la autotolerancia y autoinmunidad posterior. Enfoques hasta el momento se han basado en el estudio de un aspecto específico del sistema inmune (un solo o pocos tipos celulares o citocinas) y no ofrecen una evaluación global de la enfermedad autoinmune complejo. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas. Aquí se describe un enfoque integral de unicelular para evaluar la producción de citoquinas en varios subconjuntos de células inmunitarias, dentro del contexto de "intrínseco" específico para cada paciente de plasma factores de circulación. Este enfoque permite la monitorización de la paciente específico phenotype inmune (marcadores de superficie) y función (citoquinas), ya sea en su natural "intrínseca patógenos" enfermedad estatal, o en la presencia de agentes terapéuticos (in vivo o ex vivo).
Introduction
Las enfermedades autoinmunes son una causa importante de morbilidad y mortalidad que afecta a 3-8% de la población. En los Estados Unidos, trastornos autoinmunes se encuentran entre las principales causas de muerte entre las mujeres jóvenes y de mediana edad (edad < 65 años)1,2. Enfermedades autoinmunes se caracterizan por la presentación clínica heterogénea y los diversos procesos inmunológicos subyacentes. El espectro de la heterogeneidad del bien es representado a través de diferentes trastornos, como la participación conjunta en la artritis reumatoide (ar) y enfermedades neurológicas en la esclerosis múltiple (MS). Sin embargo, este nivel de heterogeneidad se ejemplifica también dentro de un desorden único, como el lupus eritematoso sistémico (les): algunos pacientes pueden presentar con patología renal, mientras que otros sufren de implicación hematológica o común3.
La inmunopatogénesis subyacente en los trastornos autoinmunitarios refleja la heterogeneidad clínica, con auto y hyper-activación de múltiples subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa y producción de citoquinas desregulación concomitante. Mientras que las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad autoinmune, entender su papel específico en el mecanismo de la enfermedad ha demostrado para ser un reto. Citocinas se caracterizan por pleiotropía (una citocina puede tener múltiples efectos en diferentes tipos de células), redundancia (varias citocinas pueden tener el mismo efecto), dualidad (una citocina puede tener efectos pro o antiinflamatoria bajo diversas condiciones), y plasticidad (citoquinas pueden ser moldeadas en un papel diferente de su "original", según el medio ambiente)4,5,6. Por lo tanto, métodos de nivel de la población no pueden distinguir heterogéneas respuestas celulares a la misma «medio de cytokine". Asimismo, diseños de los estudios que se centran en un aspecto específico del sistema inmune (un solo tipo de células o citocinas), no ofrecen una valoración global de todos los elementos que intervienen en complejas enfermedades autoinmunes. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas.
Recientemente, hemos desarrollado un enfoque proteómico unicelular para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el medio de pacientes "patógenos" plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. El flujo de trabajo descrito aquí se caracteriza por el uso de muestras de sangre periférica intacta, a diferencia de las células mononucleares aislados de sangre periférica (PBMCs). Sangre periférica representa el vehículo más fisiológicamente relevante para el estudio de enfermedad mediada inmune sistémica, incluyendo 1) no-células mononucleares de sangre a menudo implicados en enfermedad autoinmune (es decir, neutrófilos, plaquetas) y plasma 2) circulación de factores, tales como ácidos nucleicos, complejos inmunes y citocinas, que tienen funciones de activación inmunes. Para capturar la "intrínseca patógenos" desequilibrada producción de citoquinas, las muestras son procesadas inmediatamente después del sorteo de la sangre (T0, tiempo cero) y después de 6 h de incubación a 37 ° C (temperatura corporal fisiológica) con un transporte de la proteína periférica de la sangre inhibidor en la ausencia de cualquier condición estimulante exógeno (T6, tiempo 6 h), para detectar la producción de citoquinas (acumulación, T6-T0) que refleje el estado de "intrínseco" de la enfermedad (figura 1). Para el estudio de procesos de desregulación que reflejan sobre o debajo-activación de la señalización vías implicadas en las respuestas inmunológicas pertinentes a la enfermedad, las muestras de sangre periférica son tratados (6 h de incubación a 37 ° C con un inhibidor del transporte de la proteína) con una exógena estimular la condición que refleja la patogénesis de la enfermedad, como los agonistas de Toll-Like-Receptor (TLR) en el caso de SLE (T6 + R848, tiempo 6 h con 1 μg/mL R848), para detectar la producción de citoquinas que reflejaría una respuesta a los ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, figura 1). Para estudiar los efectos inmunomoduladores de la terapéutica disponible ex vivo, lo que se refiere a los procesos de desregulación inmune precisa para ciertos pacientes, muestras de sangre periférica son tratadas con un inhibidor JAK en la correspondiente terapéutico concentración (aquí, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tiempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), para detectar cambios en el estado de enfermedad "intrínseca" en respuesta a la droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figura 1). Un inhibidor JAK fue elegido para este estudio porque inhibidores de JAK se han demostrado para tener éxito en el tratamiento de trastornos autoinmunes como la RA
Evaluar simultáneamente los procesos de estabilización descritos en varios subconjuntos de células inmunitarias, muestras de sangre periférica de SLE pacientes y controles sanos se procesada como se describió anteriormente y se analizaron por citometría de masas. Citometría de masas, también denominada citometría-tiempo de vuelo, ofrece análisis unicelular de parámetros más de 40 sin problemas de espectral solapan de8,7,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de tierras raras en forma de iones metálicos solubles como etiquetas a los anticuerpos, en lugar de fluoróforos10. Detalles adicionales sobre la plataforma tecnológica de citometría de masas (es decir, ajuste y calibración, adquisición de muestra) se pueden encontrar en Leipold et al. y McCarthy et al. 11 , 12 la alta dimensionalidad de citometría de masas permite la medida simultánea de múltiples citocinas en subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa con granularidad unicelular (Tabla de materiales).
Parámetros clínicos y de laboratorio convencionales actuales no son a menudo sensible o lo suficientemente específicos para la detección de actividad de la enfermedad actual o la respuesta a los inmunomoduladores específicos13, reflejando la necesidad de delimitar mejor la inmune subyacente cambios que impulsan las llamaradas. Dada la omnipresencia del cytokine dysregulation en enfermedad autoinmune, tiene una plétora de enfoques de tratamiento que utilizan anticuerpos o inhibidores moleculares pequeños contra citoquinas o señalización de las proteínas implicadas en la regulación de la producción de citoquinas recientemente surgido. En su formato básico, el enfoque analítico de sangre periférica descrito aquí proporciona una plataforma para identificar subconjuntos de la célula altera específico para cada paciente y su producción anormal de citocinas en la enfermedad autoinmune con manifestaciones sistémicas. Esta metodología permite la personalización de opciones terapéuticas como citoquinas altera específico pueden ser identificados, y tratamiento específico pueden ser opciones prueba ex vivo para evaluar su capacidad de immunomodulate el paciente enfermedad específica proceso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Colorado múltiples institucional de junta (COMIRB) de la Universidad de Colorado. Todos los procedimientos descritos a continuación deben realizarse en una campana de cultivo estériles para tejidos, salvo estipulación en contrario, con las puntas de pipeta filtrada, y filtraron todos los reactivos.
1. preparación de reactivos para el procesamiento de la sangre periférica
- Preparar el ruxolitinib alícuotas stock (10-15 μL/vial de un solo uso) en 10 mM por diluir el Reactivo liofilizado en DMSO según las instrucciones del fabricante (conservar a-80 ° C). Mantener concentraciones de DMSO en todos los ensayos incluidos los controles sin estimular por debajo del 0.2% (vol/vol).
- Preparar R848 alícuotas stock (resiquimod) (10-15 μL/vial de un solo uso) en 1 μg/μL, diluyendo el Reactivo liofilizado en agua estéril como el instrucciones del fabricante. Tienda a-80 ° C.
- Prepare los lipopolisacáridos alícuotas stock (LPS) (5 μL por vial para un sólo uso) en 1 μg/μL diluir el Reactivo liofilizado en agua estéril siguiendo las instrucciones del fabricante. Tienda a-80 ° C.
- Preparar la célula tinción de medios (CSM) con PBS, 0,5% BSA y 0.02% NaN3.
- Adquirir y mantener listo el cóctel de inhibidor (PTI) de transporte de la proteína (Tabla de materiales).
- Descongelar y diluir el ruxolitinib frasco stock (10 mM) 1:10 en PBS estéril (1 mM). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
- Descongelar y diluir el frasco stock R848 (1 μg/μl) 1:10 en PBS estéril (0,1 μg/μl). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
- Descongelar y diluir el LPS frasco stock (1 μg/μl) 1: 100 en PBS estéril (0.01 μg/μl). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
- Caliente previamente estéril RPMI (sin L-glutamina) en un baño estándar 37 ° C (durante al menos 10 minutos).
- Diluir el buffer lyse/fix 1:5 en ddH filtrada2O (concentración de trabajo) en el escritorio (no necesita ser estéril).
Nota: 1 mL de sangre entera requiere 20 mL de la concentración de trabajo de lyse/solución tampón.- Hacer lyse/fix buffer 5 condiciones de 1 mL de sangre cada uno (por lo menos 100 mL). Alícuota 20 mL de la concentración de trabajo del buffer de lyse y arreglos en tubos cónicos de 50 mL por mililitro de sangre entera (mantener la solución de lyse/solución a 37 ° C hasta que se necesite). Etiqueta las condiciones en los tubos cónicos con tampón de lyse y arreglos como sigue: T0 (tiempo cero), T6 + 5R (tiempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tiempo 6 h con 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tiempo 6 h con 0,1 μg/mL LPS), T6 (tiempo de 6 h).
- Etiqueta redonda de fondo tubos de poliestireno estéril con tapas y tubos de microcentrífuga de 1 mL con la misma nomenclatura que en el paso 1.10.
2. estimulación y procesamiento de sangre periférica (figura 1)
- Coloque la etiqueta redonda inferior tubos de poliestireno de paso 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) sobre una rejilla.
Nota: Los siguientes pasos se realizan en este tipo de tubo a menos que se especifique lo contrario. Tapa los tubos cuando se transfiere entre la campana de cultivo de tejidos y la incubadora para mantener la esterilidad. - Añadir 1 mL de 37 ° C RPMI (sin L-glutamina) a cada uno de los tubos (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Invertir el tubo de la colección de sangre varias veces, añadir 1 mL de sangre a cada tubo y pipeta arriba y abajo varias veces para homogeneizar con RPMI (dilución con RPMI previene la aglutinación de la sangre durante el período de incubación de 6 h).
- Añada 10 μL de la 1:10 el ruxolitinib T6 + 5R. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000. Coloque la rejilla de los tubos en la incubadora a 37 ° C y comenzar la incubación de la sincronización (T = 0).
- Procesar la muestra T0 como sigue.
- Pipetear todo el contenido del tubo T0 en un tubo cónico etiquetado que contiene 20 mL de tampón de lyse y arreglos de concentración de trabajo de 37 ° C. Para optimizar la recuperación de la célula, enjuague el tubo con tampón de lyse/corrección trabajo concentración. Mezclar por inversión del tubo cónico.
- Incubar a 37 ° C durante 15 min permitir la lisis y la fijación. Tras fijación, realice todos los pasos subsecuentes en la sobremesa. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Decantar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de PBS frío hielo para romper los pellets y luego llenar la cónica a un volumen de 15 mL con PBS.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante. Repita el lavado PBS (medidas 2.4.3–2.4.4) si los gránulos son de color rojos. Resuspender las células en 1 mL de CSM para romper los pellets y luego transferir al tubo de microcentrífuga etiquetados (paso 1.11) para la tinción de anticuerpo. Tomar un 10 μl de muestra para contar las células usando un contador de células automatizado o hemocitómetro.
Nota: Puesto que todas las células están fijadas en este punto, no es necesario incluir una tinción de viabilidad. - Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, dejando el sedimento en ~ 60 μL de volumen residual. Mantenga este pellet en hielo hasta muestras de otras condiciones hayan completado el procesamiento.
- En T = 30 min, mover el portatubos (paso 2.3) a la campana de cultivo de tejidos y realice lo siguiente.
- Añada 10 μL de los 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000.
- Añada 10 μL de los 0.01 μg/μL de LPS a T6 + LPS. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000.
- Agregar 4 μL de inhibidor de proteína del transporte (acciones a 500 X) T6, T6 + 5R y T6 + LPS (pero no a T6 + R848) y devolver las muestras a la incubadora hasta T = 6 h. mezcla cuidadosamente con una pipeta de P1000 cada 2 h.
Nota: R848 es un agonista TLR endoplasmic y por lo tanto requiere un retardo temporal en la adición del inhibidor proteína de transporte para permitir el acceso a su receptor de destino.
- En T = 2 h, añadir 4 μL de inhibidor de transporte la proteína cóctel (acciones a 500 X) T6 + R848 tubo. Mezclar todas las muestras con una pipeta P1000 y reacomode la rejilla en la incubadora hasta T = 6 h.
- Mezclar las muestras con una P1000 una vez más en T = 4 h.
- En T = 6 h, proceso T6 T6 + LPS, T6 + R848 y T6 + 5R tubos de muestras de sangre como se describe en el paso 2.4 para la muestra T0.
- Almacenar los pellets de células en volumen residual del CSM a-80 ° C para procesar en una fecha futura. Como alternativa, proceda a código de barras y anticuerpo tinción sin almacenar.
3. código de barras de las células de la sangre lisada o fijo
- Descongelar las muestras fija lisis de la célula desde el almacenaje de-80 ° C lentamente sobre el hielo; un máximo de 20 muestras puede ser etiquetado con código de barras único y agruparon mediante este sistema. Diluir el buffer de perm X barcoding 10 1:10 con PBS; hacer suficiente amortiguamiento para ~ 3 mL por muestra.
- Llenar un canal no estéril con el CSM y uno con el buffer de perm X barcoding 1. Añadir 1 mL de hielo frío CSM a muestras recién descongeladas, mezclar cuidadosamente con una pipeta y transferir a los tubos respectivos cluster de polipropileno previamente etiquetados.
- Tome una muestra μL 10 para contar las células usando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Normalizar el recuento a 1.5 – 2 x 106 células por muestra en cada tubo de cluster: Retire y deseche el volumen de exceso por encima de 2 x 106 células.
- Centrifugar las células a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 1 mL de tampón de la ondulación permanente de 1 X barcoding con una pipeta multicanal y centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar apagado el sobrenadante.
- Alinee los tubos de clúster en un estante en el mismo orden como se indica en la clave de código de barras para que la muestra coincide con su código de barras. Añadir 800 μL 1 X buffer de código de barras de la ondulación permanente por pipeta multicanal para todas las muestras en los tubos de clúster sin tocar el precipitado de células con las puntas de pipeta (no mezcla) para reducir la pérdida de la célula. Dejar de lado la gradilla con los tubos de cluster.
- Quitar 20-plex Pd Barcoding Kit tubo tiras de-20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Añada 100 μL de tampón de perm X barcoding 1, mezclar bien y transferir 120 μL de la mezcla de código de barras resuspendidos en las correspondientes muestras de células en los tubos de cluster.
- Mezclar bien con una pipeta multicanal por lo que hay no hay contaminación cruzada entre muestras de código de barras individual. Incubar tubos de racimo durante 30 min a temperatura ambiente para permitir que los códigos de barras etiquetar las células.
- Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de CSM.
- Centrifugar y resuspender en CSM otra vez como en el paso 3.8.
Nota: Cada muestra ahora se etiqueta con un código de barras único, y las muestras están listas para combinarse. - Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Con una sola pipeta y utilizando la misma punta, transferir todos los pellets de célula en ~ 70-80 volumen residual μL a un tubo de poliestireno. Expulsar la punta de la pipeta; dejar de lado la pipeta solo con este Consejo.
- Con una pipeta multicanal y puntas nuevas, añadir ~ 100 μL CSM a cada tubo de clúster original para maximizar la recuperación de la célula. Con la pipeta solo con la punta que había reservada, transferir todos pellets de células en volumen residual de ~ 100 μL al mismo tubo de poliestireno.
- Añadir CSM para rematar el tubo poliestireno (~ 3 mL). Conteo y registro el número del celular del código de barras combinado conjunto. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Proceder a la coloración de las muestras con código de barras en el mismo día.
Nota: Es normal esperar 20 – 30% pérdida de la célula en el proceso de código de barras.
4. tinción de código de barras lisis/fijo glóbulos y preparación para el análisis de citometría de masas instrumento
Nota: Cada 1 X título de anticuerpo de tinción (1 μL del anticuerpo por 100 μL de reacción de tinción), puede manchar generalmente 3-4 x 106 células. Por lo tanto, cuando todas las muestras de código de barras se combinaron en un tubo, la cantidad de anticuerpo debe ampliarse. Si 20 cantidad de muestras con código de barras 30 x 106 células, y cada título de X 1 puede manchar 3 – 4 x 106 células, la muestra de código de barras sólo requiere un 10 X título, a diferencia de la tinción de cada muestra individualmente, que requeriría una cantidad de X 20 de anticuerpo (1 X por tubo individual). La concentración de anticuerpos al numero de celular debe titularse con cuidado para cada Cóctel de anticuerpos individuales (no discutido aquí).
- Mancha las células con anticuerpos (Tabla de materiales) para la inducción superficial de coloración y citoquinas.
- Hacer la tinción superficial cóctel calculando la cantidad para ser añadido y contabilidad para error de pipeteo (es decir, si 20 muestras de código de barras de 2 x 106 células en cada muestra, la coloración 10 X mancha del título es necesario para cálculos de volumen final, compensar errores de pipeteo haciendo un 10.5 X coloración de la solución final).
- Agregue 10 X valor de volumen para la pelotilla de celular con código de barras la coloración de la superficie. Para reducir la pérdida de la célula, con la misma punta, mezclar y medir el volumen de las manchas superficiales y el sedimento celulares.
- Basado en el volumen de células y tinción de cóctel, añadir CSM a un volumen de coloración final de 50 μL por número de muestras de células (por ejemplo, si ejecuta un conjunto de 20 muestras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 ° C. Agite la muestra cada 15 minutos para promover incluso manchas.
- Durante la incubación de mancha superficial, preparar el tampón de Perm/lavado (Tabla de materiales) por dilución 1:10 con ddH filtrada2O. preparar volúmenes de 2 mL para permeabilización y 5 mL para lavado. Mantener a 4 ° C o en hielo.
- Fuera la superficie del tubo con el CSM la coloración, y centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min aspirar el sobrenadante. Resuspender la muestra con código de barras en 2 mL de 4 ° C, 1:10 tampón de dilución de Perm/lavado. Incubar a 4 ° C durante 20-30 min a permeabilizar totalmente las células.
- Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante.
- Para la tinción intracelular, siga los pasos de tinción similares (en cuanto a la coloración superficial). Sin embargo, utilizar los 4 ° C, 1:10 tampón de dilución de Perm/lavado en lugar del CSM para hacer el total volumen de tinción para que las células permanezcan en un ambiente permeabilizing durante la tinción intracelular.
- Añadir el anticuerpo intracelular cóctel a la superficie manchada y permeabilized pellets celulares (medidas 4.1.2–4.1.17). Traer el total volumen de 50 μL por número de muestras de células de tinción. Incubar por 60 min a 4 ° C. Agite la muestra cada 15 minutos para asegurar incluso la coloración.
- Durante la tinción intracelular, preparar la solución intercalator: 900 μL de PBS filtrada + 100 μL del filtrado 16% PFA (concentración final de 1.6% PFA) + 0,2 μL de 500 uM de tinte intercalator (Tabla de materiales).
- Rematar el precipitado de células + anticuerpo intracelular cóctel con frío 1:10 solución de Perm/lavado.
- Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante. Rematar el tubo tinción con CSM. Cuente y anote el número de celular. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de solución intercalator paso 4.9. Incubar durante al menos 20 min a temperatura de intercalación completo, o durante la noche a 4 ° C (muestras en solución intercalator pueden permanecer a 4 ° C hasta una semana antes de ejecutar el instrumento de la citometría de masas).
- Preparar las células para el instrumento de la citometría de masas.
- Fuera el tubo con 3 mL de filtrado ddH2O y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 3 mL de filtrado ddH2O. pasar esta suspensión a través de un filtro μm 100 para quitar cualquier suciedad o agregados que potencialmente podrían obstruir el instrumento de la citometría de masas.
- Contar y registrar la filtración posterior al número de celular. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C
- Preparar la solución de calibración de grano (Tabla de materiales) diluyendo 1:10 en el ddH filtrada2O.
- Resuspender la tinción las células en el volumen requerido del 1:10 diluyeron solución de calibración de grano para lograr una concentración celular de ~ 1 x 106 células/mL.
Nota: Para una CyTOF1 en 45 μl/min, el óptimo recomendado es de 5 x 105 células/mL; para Helios en 30 μL/min, 7.5 x 105 células/mL. - Proceder a ejecutar el ejemplo en la citometría de masas instrumento9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1 muestra el flujo de trabajo para la estimulación y procesamiento de las muestras de sangre periférica, incluyendo asignación de alícuotas de la muestra de sangre, momento de la incorporación de agentes de estimulación, proteína transporte inhibidor de Cóctel e incubación veces hasta la lisis de glóbulos rojos (gr) y la fijación. La elección de los agentes estimulantes dependerá de las vías de señalización y citoquinas que son objeto de evaluación. Por ejemplo, en el protocolo descrito aquí, se utilizan agonistas TLR para evaluar mecanismos de detección inmunes innatos a través de múltiples tipos de células. Representante extracelulares (LPS, agonista de TLR4) y endoplasmic (R848, TLR7/8 agonista) agonistas fueron elegidos. Otros agentes estimulantes incluyen forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y Ionomycin (PMAIONO), que pueden actuar como activadores de la célula de T. Citocinas específicas pueden ser utilizado también como estimulante de agentes, junto con otros antígenos de células B y T específicas.
Para demostrar el enfoque experimental descrito en el presente Protocolo, figura 2, figura 3y figura 4 muestran resultados representativos obtenidos utilizando LPS y R848 PMAIONO como estimular condiciones. Mientras que el uso de PMAIONO no fue descrito en el protocolo, los datos se muestran en la figura 3 y figura 4 demuestran que los cytokines y tipos de células diferentes (y selectiva) activado, inducido en respuesta a agonistas TLR (LPS y R848) versus T activador celular (PMAIONO). Dado que 26 marcadores de superficie (Tabla de materiales) se han utilizado para delimitar los varios subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa, varios T, B, NK, monocitos y subconjuntos de células dendríticas pueden simultáneamente estudiar dentro de una sola muestra. Además, también se incluyen, como CD86 ICOS para las células de B y PD1 para células T marcadores de activación inmune de la célula. Un representante limitada gating estrategia demostrando la evaluación de CD14hi monocitos se muestra en la figura 2. Sin embargo, más detallada y ampliada gating de T, B, NK, monocitos, dendríticas y subconjuntos de células granulocytic puede encontrarse en nuestro trabajo previamente publicado en O'Gorman y Hsieh et al. y O'Gorman y Kong et al. 14 , 15 además, sin supervisión de métodos de análisis incluyendo (y no limitado a) espada16visNE17, cítricos18, Phenograph19y Xshift20 pueden utilizarse para evaluar los datos de la citometría de masas (no discutido aquí). Usando CD14hi de monocitos y linfocitos T CD4 como subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa representante, datos que demuestran la inducción de citocinas dentro de estos tipos celulares se muestran en la figura 3. Un número selecto de citoquinas fue elegido para mostrar que R848 induce selectivamente la IL-12 (subunidad p40) y MCP1 en monocitos CD14hi mientras LPS no (figura 3). PMAIONO, un activador potente de la célula T no induce citoquinas en monocitos de CD14hi (figura 3) pero inducir interferón gamma (IFNγ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) en las células T CD4 (figura 4). Exitosa técnica de estímulo de muestra de sangre periférica y procesamiento demostrar patrones de inducción de citocinas específica condiciones estimulantes e inmunes subconjuntos, como se ejemplifica en la figura 3 y figura 4. Para el análisis completo de las 14 citoquinas descrito aquí en los tipos de la célula capturados dentro de los marcadores superficiales 26, consulte O'Gorman y Hsieh et al.y O'Gorman y Kong et al. 14 , 15
Para demostrar cómo el enfoque experimental descrito en el presente Protocolo captura el estado patógeno "intrínseco" de una enfermedad autoinmune sistémica como en SLE en comparación con un donante sano, figura 5 ilustra la inducción de citoquinas (Mip1β y MCP1) en CD14hi de monocitos en la sangre periférica de enfermos muestra única (parte B), en ausencia de cualquier estímulo exógeno (T6 respecto a T0). Estas citoquinas son "modulados disminuido" por JAK inhibición terapia ruxolitinib (T6 + 5R comparado con T6) en la sangre periférica de enfermos muestra única (parte B).
Figura 1. Flujo de trabajo experimental para la estimulación y el procesamiento de la sangre periférica para análisis de citometría de masas. Protocolo de lisis RBC y la fijación de la enfermedad arterial periférica inmediatamente siguiente muestrario (T0), o después de 6 h de incubación a 37 ° C con un inhibidor del transporte de la proteína (PTI) en ausencia de algún agente exógeno (T6), o con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; proteínas transporte inhibidor de la incubación durante 4 horas solamente), o el ruxolitinib (T6 + 5R). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representante bloquean la estrategia para la identificación de monocitos CD14hi. Después de la fijación y lisis RBC, el individuo lisis/fija muestras de células de un donante sano fueron con código de barras, etiquetado con 26 anticuerpos contra marcadores de superficie, permeabilized y teñidas con 14 anticuerpos contra citoquinas (Tabla de materiales). Se muestra la estrategia bloquea limitada que representa la identificación de monocitos CD14hi. De izquierda a derecha, cada parcela 2D representada es un subconjunto de la población de la población de padres (compartimento azul) de la parcela 2D inmediatamente a la izquierda. Una estrategia bloquea extendida puede encontrarse en O'Gorman y Hsieh et al.y O'Gorman y Kong et al. 14 , 15 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ejemplo de inducción de citoquinas en monocitos de CD14hi tras la estimulación con LPS y R848 PMAIONO. Muestras de un análisis de citometría de masas representativas de sangre periférica de un donante sano en tiempo cero (T0), sin estimular (T6) y tras estimulación con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), y se muestra PMAIONO (T6 + PMAIONO). Se muestra un ejemplo de la inducción de citoquinas en monocitos de CD14hi; las citocinas con especificidad para el agente estimulante utilizado (agonista TLR vs T cell activator) están representados. Datos extendidos por toda la inducción del cytokine en varios subconjuntos de células inmunitarias comprobados con este panel de anticuerpos de citometría de masas pueden encontrarse en O'Gorman y Hsieh et al.y O'Gorman y Kong et al. 14 , 15 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Ejemplo de inducción de citoquinas en T CD4 de las células tras la estimulación con LPS y R848 PMAIONO. Muestras de un análisis de citometría de masas representativas de sangre periférica de un donante sano en tiempo cero (T0), sin estimular (T6) y tras estimulación con LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), y se muestra PMAIONO (T6 + PMAIONO). Se muestra un ejemplo de inducción de citoquinas en las células T CD4; las citocinas con especificidad para el agente estimulante utilizado (agonista TLR vs T cell activator) están representados. Datos extendidos por toda la inducción del cytokine en varios subconjuntos de células inmunitarias comprobados con este panel de anticuerpos de citometría de masas pueden encontrarse en O'Gorman y Hsieh et al.y O'Gorman y Kong et al. 14 , 15 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Ejemplo de inducción de citoquinas en monocitos CD14hi de paciente de enfermedad SLE. Un análisis de citometría de masas representativas de muestras de sangre periférica de donantes sanos (A) y paciente de enfermedad SLE (B) se muestran. Ejemplos de la inducción de citoquinas en monocitos de CD14hi; seleccionado de citoquinas con especificidad al SLE "intrínseca" patógeno proceso de la enfermedad (T6) (es decir, la inducción de MIP1β y MCP1 solo en paciente de SLE), y muestran el efecto del inmunomodulador ruxolitinib (T6 + 5R). Datos extendidos por toda la inducción del cytokine en varios subconjuntos de células inmunitarias comprobados con este panel de anticuerpos de citometría de masas se pueden encontrar en O'Gorman y Kong et al. 15 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí describimos una novela, unicelular, enfoque proteómico para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el ambiente de paciente "patógenos" plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. Este método emplea sangre periférica como el vehículo analítico y la citometría de masas como herramienta para la evaluación de anormalidades fenotípicas y funcionales celulares inmunes. El método es fácilmente aplicable a humanos y ratones estudios21y es compatible con otros análisis funcional inmune, como la detección de anormalidades señalización14.
El usuario debe ser consciente de una serie de variables que pueden afectar el éxito de este procedimiento. Basándonos en nuestra experiencia, las muestras de sangre deben procesarse dentro de las 2 h de colección para evitar inducción basal de citoquinas intracelulares (datos no mostrados). Muestras de sangre deben permanecer a temperatura ambiente (25 ° C) espera de procesamiento. Muestras de sangre se pueden recoger en cualquier sodio heparina o EDTA los tubos, sin interferencia con el ensayo descrito. Vivo y discriminación de células muertas puede ser evaluada por citometría de masas usando cisplatino22. Sin embargo, dicha evaluación se omite en el protocolo descrito suponiendo que sangre se procesa inmediatamente (o dentro de 2 h) después de la recolección. Además, incluso si las muestras se retrasaron en el proceso, la falta de la criopreservación permite la omisión de la discriminación en vivo/muerto. Sin embargo, recomendamos el uso de cisplatino para discriminación de viabilidad para cualquier estudio en el que muerte celular podría afectar los resultados de los análisis posteriores.
Además, hemos encontrado que la cuidadosa selección y titulación del agente estimulante es esencial para evaluar inducción inmune específica vías/citocinas. En primer lugar, la elección del agente estimulante debe basarse en 1) inmune pretende realizar/evaluar y 2) objetivo lecturas funcionales (independientemente de si la señalización producción proteínas o citoquinas). Por ejemplo, si el objetivo fue evaluar la activación de la célula de T y diferentes subconjuntos de células helper (Th) T y la inducción de citoquinas respectivas, PMAIONO o una combinación de anti-CD3/anti-CD28 sería una condición estimulante apropiada. Sin embargo, si el objetivo fue evaluar la activación de monocitos subconjunto, un agonista TLR (o una combinación de ellos) puede ser mejor. En segundo lugar, la concentración de cada uno de estos agentes estimulantes debe ser optimizada para obtener la activación celular y la inducción de citocinas, sin alterar gravemente los marcadores de superficie celular. Uso de agente estimulante poco no dará lugar a la activación de tipos celulares deseados y no se observarán inducción de citoquinas, mientras que el uso de demasiado conducirá a la muerte celular excesiva y cambios en la inmune celular marcadores de superficie que las poblaciones identificadas en el estado sin estimular no estará presente en la condición estimular. En tercer lugar, la cinética de la estimulación es también una variable importante. Mientras que 6 h ha sido previamente publicado como un tiempo de estimulación óptima para capturar la máxima inducción de las citoquinas pro inflamatorias en respuesta a la estimulación de TLR14,23, un punto de estimulación diferente puede ser necesaria para otros agentes. Del mismo modo, el uso de cualquier fármaco terapéutico en vitro con las muestras de sangre periférica debe también titularse de la misma manera que el agente estimulante, prestando especial atención a la concentración y punto.
En este protocolo, usamos muestras de sangre periférica fresca, como la inducción del cytokine intracelular (y detección) son más robusta y efectiva en comparación con las muestras criopreservadas. Describimos el protocolo aquí el uso de sangre entera en lugar de PBMCs, como la presencia de plasma factores de circulación contribuye a la naturaleza "intrínseca" de las anormalidades inmunes relacionados con el proceso de la enfermedad. Estos factores circulantes en plasma pueden interferir estimulando las condiciones que se agregan a la sangre periférica, como la adición de anti-IgM y anti-IgG para activar el receptor de la célula de B, como están obligados por el plasma circulan anticuerpos y glóbulos rojos. Por lo tanto, la elección cuidadosa de los estimulantes condiciones cuando con sangre entera periférica es crucial para el exitoso experimento leer salidas. Con sangre entera periférica tiene sus ventajas (en vivo la plataforma) y desventajas (factores circulantes del plasma que interfieren). Sin embargo, PBMCs ofrecen un conjunto diferente de "pros" y los "contras". Cuando PBMCs frescos (en lugar de sangre entera) sufren el mismo proceso/protocolo y con estimulación con diversos agentes TLR, observamos el mismo "patrón" de la inducción de citoquinas, aunque en una magnitud un poco menor14,23. Siguiendo este protocolo, el uso de PBMCs congeladas conduce a una inducción de citocinas menos robusta, y por lo tanto recomendamos contra directamente comparar resultados de muestras procesadas después de la criopreservación con los procesado fresco.
Teniendo en cuenta la advertencia de fresco versus muestras congeladas y la preferencia por el uso de muestras frescas de óptima calidad, el protocolo descrito aquí es conveniente para futuros estudios en humanos donde se recogen las muestras del paciente durante un plazo de meses a años. Muestras de sangre periférica pueden procesarse como se describe, y una vez que alcanzan la etapa de lisis y fijación de RBC, muestras pueden almacenarse en-80 ° C y teñidas en lotes más adelante. Este enfoque técnico, mientras que ventajoso para estudios más humanos, también plantea el reto de la utilización de anticuerpos que pueden unirse al epitopo de destino después de la fijación. La Tabla de materiales listas de los clones de los respectivos anticuerpos que han sido probados y demuestran la fijación de post coloración específica. Código de barras de muestras múltiples (n = 20) ofrece las ventajas de 1) disminuyó la variabilidad técnica, como se tiñen las muestras múltiples en un tubo, por lo tanto hacer comparaciones de las muestras en condiciones bastante consistente y confiable; 2) reducción del uso de anticuerpos totales (véase la sección de protocolo 4.1); y 3) el esquema de código de barras de "6 paladio diferentes isótopos/elegir 3" conduce a la exclusión de Dobletes (células positivas para más de 4 isótopos del paladio). Estas ventajas se discuten en detalle en Zunder y Fick et al. 24 además, el proceso de código de barras requiere que las células se fija, como tienen que ser suavemente permeabilized para la intercalación de los código de barras reactivo (isótopos del paladio)24. Por lo tanto, la coloración viva no se puede realizar siguiendo este protocolo. Cabe señalar que el código de barras células vivas (en oposición al código de barras fijo celular descrito aquí) es una posibilidad de25,26, pero en el protocolo las células son fijos por lo que se puede almacenar y lotes procesan juntos.
Lotes de procesamiento de la muestra, mientras que ventajoso de una mano de obra y tiempo de punto de vista de eficiencia, también tiene sus propios desafíos. Con procesamiento por lotes es necesario para un proceso de normalización cuidadosamente curada. Este proceso de normalización puede ser abordada en diferentes pasos del flujo de trabajo de citometría de masas. En primer lugar, la concentración de anticuerpo al numero de celular debería mantenerse constante a través de lotes. Hemos encontrado que una forma efectiva de lograr esta concentración constante es 1) cuidadosa titulación de la concentración de anticuerpo a numero de celular y 2) normalización del número de células de cada una de las muestras que están juntos con código de barras (es decir, 1 millón células por muestra, para las 20 muestras de código de barras). En segundo lugar, para tener en cuenta la variabilidad de intensidad de señal de instrumento (diferentes días de ajuste, calibración y decaimiento de la señal en tiempo de ejecución), las muestras deben ser suspendidas y analizan en el citómetro de masa con una solución apropiada normalización de grano (tabla de materiales), seguido por la normalización del archivo después de la adquisición de datos27 (pero antes de debarcoding). Las muestras individuales son debarcoded después de que el archivo entero con código de barras ha sido normalizado utilizando las herramientas descritas en Zunder y Finck et al. 24 en tercer lugar, para tener en cuenta para el anticuerpo manual variabilidad técnica de tinción, recomendamos la inclusión de una muestra de "anclaje" con cada conjunto de código de barras que se analiza para un solo estudio, es decir, una muestra que proviene de un donante (estudios en humanos) y ha sido procesada de la misma manera como las otras muestras de estudio. En este ejemplo se debe generar una vez en cantidad lo suficientemente grande como para ser distribuidos en cada conjunto de código de barras analizada para el estudio. Estas muestras de anclaje de cada código de barras servirá para generar un coeficiente de variación para corregir la variabilidad de la señal a través de las muestras de estudio para ese código de barras (es decir, muestra de anclaje de barras 8 se utilizará para corregir la variabilidad en código de barras 8).
Otro paso importante de la optimización es el montaje del panel de anticuerpos de citometría de masas, que evaluará citoquinas y subconjuntos de células inmunitarias competentes. Algunas de las variables clave en el conjunto del panel de anticuerpos incluyen la elección de clones (tratados anteriormente), título de anticuerpos para la señal de fondo mínimo, elección de objetivos de anticuerpo y canales de isótopo basados en abundancia de antígeno y la sensibilidad del canal " compensación"de contagio de señal basado en impureza del isótopo y la oxidación y la variabilidad entre lotes de anticuerpo individual. Estos pasos de optimización son abordados en otra parte28 y no dentro del ámbito del protocolo descrito aquí.
Usando este acercamiento sola célula proteómica al estudio de anormalidades inmunes en muestras de sangre periférica, es posible identificar fenotipos anormales de subconjuntos de células inmunitarias, ya sea población frecuencia diferencias o cambios en la expresión de marcadores de superficie celular específicos (como los marcadores de activación de la célula). Además, también es posible identificar anormalidades funcionales dentro de los subconjuntos de células inmunes, tales como debajo o sobreproducción de citoquinas. Por último, el proceso de comparar la muestra inmediatamente fijo (T0) versus fija después de 6 h de incubación sin un agente exógeno (T6) muestra "intrínsecos" procesos patogénicos que conducen a las anormalidades de tipo y del cytokine de células inmunitarias (T6-T0). Este enfoque podría ser adaptado para el estudio de una variedad de procesos inmune-mediados sistémicas y la participación de varios subconjuntos de células inmunitarias y vías según el agente de estimulación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Aimee Pugh-Bernard por su entrada intelectual y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por el Premio de investigación biomédica Boettcher Foundation Webb Waring y Premio número K23-1K23AR070897 de los NIH a Elena W.Y. Hsieh. Ella también fue apoyada por número de concesión HD000850 K12 del Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano y la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños, Stanford CTSA UL1 TR001085 e investigación en salud infantil Instituto de Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
