Summary
Här beskriver vi en encellig proteomiska metod för att utvärdera immun fenotypiska och funktionell (intracellulära cytokin induktion) förändringar i perifera hela blodprover analyseras via massa flödescytometri.
Abstract
Cytokiner spelar en nyckelroll i patogenesen för autoimmuna sjukdomar. Mätning av cytokin nivåer har därför varit i fokus för flera studier för att försöka förstå de exakta mekanismer som leder till nedbrytning av self-tolerance och efterföljande autoimmunitet. Metoder hittills har baserats på att studera en viss aspekt av immunförsvaret (en enda eller några celltyper eller cytokiner) och erbjuder inte en helhetsbedömning av komplexa autoimmun sjukdom. Medan patienten sera-baserade studier har gett viktiga insikter i autoimmunitet, ger de inte den specifika cellulära källan av den dysreglerad cytokiner upptäcks. En encellig helhetssyn att utvärdera cytokin produktion i flera immunceller delmängder, inom ramen för ”inneboende” patient-specifika plasma cirkulerar faktorer, beskrivs här. Detta tillvägagångssätt möjliggör övervakning av patientspecifika immun fenotypen (yta markörer) och funktion (cytokiner), antingen i dess infödda ”inneboende patogena” sjukdomen tillstånd, eller i närvaro av terapeutiska medel (i vivo eller ex vivo).
Introduction
Autoimmuna sjukdomar är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet påverkar 3-8% av befolkningen. I USA, autoimmuna sjukdomar är bland de vanligaste dödsorsakerna bland unga och medelålders kvinnor (åldrar < 65 år)1,2. Autoimmuna sjukdomar kännetecknas av heterogena kliniska presentation och olika underliggande immunologiska processer. Spectrumen av heterogenitet är väl representerad över olika störningar, såsom gemensamma engagemang i reumatoid artrit (RA) och neurologisk sjukdom vid multipel skleros (MS). Emellertid, denna nivå av heterogenitet exemplifieras också inom en enda sjukdom, såsom systemisk lupus erythematosus (SLE): vissa patienter kan uppvisa nedsatt patologi, medan andra lider av hematologiska eller gemensamma engagemang3.
Den underliggande immunpatogenes i autoimmuna sjukdomar speglar den kliniska heterogenitet, som omfattar auto - och hyper-aktivering av flera medfödd och adaptiv immunceller delmängder, och samtidig dysreglerad cytokin produktion. Medan cytokiner spelar en nyckelroll i patogenesen av autoimmun sjukdom, har förstå deras specifika roll i mekanismen för sjukdom visat sig vara utmanande. Cytokiner kännetecknas av pleiotropy (ett cytokin kan ha flera effekter på olika celltyper), redundans (flera cytokiner kan ha samma effekt), dualitet (ett cytokin kan ha pro - eller anti - Anti-Inflammatory effekter under olika förhållanden), och plasticitet (cytokiner kan formas i en roll som skiljer sig från dess ”ursprungliga”, beroende på miljön)4,5,6. Följaktligen kan inte befolkningen nivå metoder skilja heterogena cellulära svar till den samma ”cytokin miljön”. Likaså erbjuder studiedesigner som fokuserar på en specifik aspekt av immunförsvaret (en enda celltyp eller cytokin), inte en helhetsbedömning av alla element som ingår i komplexa autoimmun sjukdom. Medan patienten sera-baserade studier har gett viktiga insikter i autoimmunitet, ger de inte den specifika cellulära källan av den dysreglerad cytokiner upptäcks.
Nyligen har utvecklat vi en encellig proteomiska för att samtidigt bedöma flera immunceller typer, och upptäcka deras olika cytokin-störningar i miljön i särskilda ”patogena” perifer blodplasma cirkulerande patientfaktorer. Arbetsflödet beskrivs här kännetecknas av användning av intakt perifer helblod prover, i motsats till isolerade perifera mononukleära blodceller (PBMC). Perifera helblod representerar mest fysiologiskt relevanta fordonet att studera systemiska immunmedierade sjukdomar, inklusive (1) icke-mononukleära blodkroppar ofta inblandade i autoimmun sjukdom (dvs, neutrofiler, trombocyter), och 2) plasma cirkulerande faktorer, såsom nukleinsyror, immunkomplex och cytokiner, vilka har immun aktiverande roller. Att fånga de ”inneboende patogena” dysreglerad cytokin produktion, perifert blod prover bearbetas omedelbart efter blodprov (T0, tid noll), och efter 6 h inkubation vid 37 ° C (fysiologiska kroppstemperatur) med en proteintransport hämmare i avsaknad av något EXOGEN stimulerande tillstånd (T6, tid 6 h), att upptäcka cytokin produktion (ackumulering, T6-T0) som skulle spegla tillståndet ”inneboende” sjukdom (figur 1). Att studera dysreglerad processer som reflekterar över eller under aktivering av signalering inblandade i immunsvar som är relevanta för sjukdomen, perifert blodprover är behandlade (6 h inkubation vid 37 ° C med ett protein transport hämmare) med en exogen stimulera tillstånd som återspeglar sjukdomspatogenes, såsom Toll-Like-Receptor (TLR)-agonister vid SLE (T6 + R848, tid 6 h med 1 µg/mL R848), för att upptäcka cytokin produktion som skulle återspegla ett svar till nukleinsyror (jämföra T0 vs. T6 vs. T6 + R848, figur 1). För att studera immunmodulerande effekter av tillgängliga therapeutics ex vivo, som de avser exakt immun dysreglerad processerna för specifika patienter, behandlas perifert blodprover med en JAK-hämmare på relevanta terapeutiska koncentration (här, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tid 6 h med 5 uM ruxolitinib), upptäcka förändringar i ”inneboende” sjukdomstillstånd som svar på läkemedlet (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, figur 1). En JAK-hämmare valdes för denna studie eftersom JAK-hämmare har visat sig vara framgångsrik vid behandling av autoimmuna sjukdomar såsom RA.
För att samtidigt bedöma de dysreglerad processer som beskrivs ovan i flera immunceller delmängder, perifert blodprover från SLE var patienter och friska kontroller bearbetas enligt ovan och analyseras av massa flödescytometri. Massa flödescytometri, även känd som flödescytometri-Time-Of-Flight, erbjuder enskild cell analys av över 40 parametrar utan problem av spektral överlappar7,8,9. Denna teknik använder sällsynta jordartsmetaller metall isotoper i form av lösliga metalljoner som Taggar bunden till antikroppar, i stället för fluorophores10. Ytterligare detaljer om den tekniska plattformen för massa flödescytometri (dvs, tuning och kalibrering, provtagning) kan hittas i Leipold et al. och McCarthy et al. 11 , 12 de hög-dimensionerna av massa flödescytometri möjliggör samtidig mätning av flera cytokiner i hela medfödd och adaptiv immunceller undergrupper med encelliga granularitet (Tabell för material).
Nuvarande konventionella kliniska och laboratorie-parametrar är ofta inte känslig eller tillräckligt specifik för att upptäcka pågående sjukdomsaktivitet eller svar på specifika immunomodulatorer13, vilket återspeglar behovet av att bättre avgränsa den underliggande immun förändringar som driver flare-ups. Med tanke på den ökande användningen av cytokin dysreglering vid autoimmun sjukdom, en uppsjö av behandlingsmetoder som använder antikroppar eller små molekylära hämmare inriktning cytokiner eller signalering proteiner involverade i regleringen av cytokin produktion har nyligen uppstått. I dess grundläggande format ger den perifera analytisk metod som beskrivs här en plattform för att identifiera patientspecifika dysreglerad cell underdelar och deras onormala cytokin produktion i autoimmun sjukdom med systemiska manifestationer. Denna metod möjliggör personalisering av terapeutiska alternativ som specifika dysreglerad cytokiner kan identifieras, och specifik behandling alternativ kan vara testade ex vivo att bedöma deras förmåga att immunomodulate patientens specifika sjukdomen processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den Colorado flera institutionella i styrelsen (COMIRB) av University of Colorado. Alla beskrivs nedan bör utföras i en steril vävnadsodling huva om inte annat anges, med filtrerade pipettspetsar, och alla reagenser filtreras.
1. beredning av reagens för perifera helblod bearbetning
- Förbereda ruxolitinib lager alikvoter (10 – 15 μL/injektionsflaska för engångsbruk) på 10 mM genom att späda ut det frystorkade reagenset i DMSO enligt tillverkarens instruktioner (store vid-80 ° C). Hålla DMSO koncentrationer i alla analyser inklusive ostimulerade kontroller under 0,2% (vol/vol).
- Förbereda R848 (resiquimod) lager alikvoter (10 – 15 μL/injektionsflaska för engångsbruk) på 1 μg/μL genom att späda ut det frystorkade reagenset i sterilt vatten som den enligt tillverkarens instruktioner. Förvaras vid-80 ° C.
- Förbereda lipopolysackarid (LPS) lager alikvoter (5 μL per injektionsflaska för endast användas en gång) på 1 μg/μL genom att späda ut det frystorkade reagenset i sterilt vatten enligt tillverkarens anvisningar. Förvaras vid-80 ° C.
- Förbereda Cell färgning Media (CSM) använder PBS, 0,5% BSA och 0,02% NaN3.
- Förvärva och hålla redo protein transport hämmare (PTI) cocktail (Tabell för material).
- Tina och späd ruxolitinib lager injektionsflaska (10 mM) 1:10 i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (1 mM). Avsatt vid rumstemperatur i en vävnadskultur huva.
- Tina och späd R848 lager injektionsflaskan (1 μg/µL) 1:10 i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (0,1 μg/µL). Avsatt vid rumstemperatur i en vävnadskultur huva.
- Tina och späd den LPS lager injektionsflaska (1 μg/µL) 1: 100 i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (0,01 μg/µL). Avsatt vid rumstemperatur i en vävnadskultur huva.
- Pre varma sterila RPMI (ingen L-glutamin) i standard 37 ° C vattenbad (för minst 10 min).
- Späd den lyse/fix buffert av 1:5 i filtrerade ddH2O (arbetande koncentration) på den bänkmonterade (inte behöver vara steril).
Obs: 1 mL helblod kräver 20 mL av arbetande koncentration av lyse/fix buffert.- Gör lysera/fix buffert för 5 villkor 1 ml helblod (minst 100 mL vardera). Alikvotens 20 mL arbetande koncentrationen av lyse/fix buffert i 50 mL koniska rör per milliliter av helblod (hålla lyse/fix lösningen vid 37 ° C tills det behövs). Etikett förhållandena på de koniska rör som innehåller lysera/fix buffert enligt följande: T0 (Time zero), T6 + 5R (tid 6 h med 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tid 6 h med 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tid 6 h med 0,1 μg/mL LPS), T6 (tid 6 h).
- Etiketten rund botten sterila polystyren rör med lock och 1 mL mikrocentrifugrör med samma nomenklatur som i steg 1.10.
2. stimulering och bearbetningen perifer helblod (figur 1)
- Placera den märkta rund botten polystyren rören från steg 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) på ett rack.
Obs: Alla följande steg utförs i denna typ av tube om inget annat anges. Cap rören vid överföring mellan vävnadsodling huva och inkubator att upprätthålla sterilitet. - Tillsätt 1 mL 37 ° C RPMI (ingen L-glutamin) till vart och ett av rören (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Invertera bloduppsamlingsrör flera gånger, tillsätt 1 mL helblod i varje rör och Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda med RPMI (utspädning med RPMI förhindrar klumpar av blod under inkubationstiden 6 h).
- Tillsätt 10 μl av 1:10 ruxolitinib till T6 + 5R. Blanda med P1000 pipett. Placera racket av rör i inkubatorn vid 37 ° C och börja timing ruvning (T = 0).
- Bearbeta T0 provet enligt följande.
- Pipettera över hela innehållet av T0 röret till en märkt koniska rör innehållande 20 mL 37 ° C arbetar koncentration lysera/fix buffert. För att optimera cell återhämtning, skölj röret med arbetande koncentration lysera/fix buffert. Blanda genom att vända den koniska rör.
- Inkubera vid 37 ° C i 15 min att lysis och fixering. Efter fixering, utföra alla efterföljande steg på bänkmonterade. Centrifugera celler vid 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten. Att resuspendera cellerna i 1 mL av is kallt PBS att bryta upp pelleten, sedan fylla den koniska 15 mL volym med PBS.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Dekantera supernatanten. Upprepa den PBS tvätten (steg 2.4.3–2.4.4) om pellets är röd. Att resuspendera cellerna i 1 mL CSM att bryta upp pelleten och sedan överföra till märkt mikrocentrifug röret (steg 1.11) för antikroppar färgning. Ta en 10 µL prov att räkna celler med en automatisk cell counter eller hemocytometer.
Obs: Eftersom alla celler är fasta på denna punkt, det är inte nödvändigt att inkludera en livskraft fläck. - Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten, lämnar pelleten i ~ 60 µL residualvolym. Hålla denna pellet på is tills prover från andra villkor har avslutat behandlingen.
- Vid T = 30 min, flytta röret racket (steg 2,3) till vävnadsodling huven och utför följande.
- Tillsätt 10 μL av den 0,1 μg/μL R848 till T6 + R848. Blanda med P1000 pipett.
- Tillsätt 10 μL av de 0,01 μg/μL LPS till T6 + LP-skivor. Blanda med P1000 pipett.
- Tillsätt 4 μL av protein transport hämmare (lager på 500 X) till T6, LPS (men inte till T6 + R848) och T6, T6 + 5R, och tillbaka proven till inkubatorn tills T = 6 h. blanda noga med P1000 pipett varje 2 h.
Obs: R848 är en endoplasmic TLR-agonist och kräver därför en tidsmässig försening i tillägg av den protein transport-hämmaren som möjliggör tillgång till dess målet receptor.
- Vid T = 2 h, tillsätt 4 μL av protein transport hämmare cocktail (lager på 500 X) till T6 + R848 tube. Blanda alla prover med P1000 pipett och tillbaka racket till inkubatorn tills T = 6 h.
- Blanda proverna med en P1000 en gång vid T = 4 h.
- Vid T = 6 h, bearbeta T6, T6 + LPS, T6 + R848 och T6 + 5R blod provrör som beskrivs i steg 2,4 för T0 provet.
- Lagra cell pellets i CSM residualvolym vid-80 ° C att bearbeta på ett framtida datum. Alternativt, gå vidare till streckkodning och antikropp färgning utan lagring.
3. streckkod lyserat/fast blodkroppar
- Tina de lyserat/fast cellprover från-80 ° C lagring långsamt på is; högst 20 prover kan märkas med unika streckkoder och sammanslogs med detta system. Späd 10 X barcoding perm bufferten av 1:10 med PBS; gör tillräckligt buffert för ~ 3 mL per prov.
- Fyll en icke-sterila tråg med CSM och en med 1 X barcoding perm bufferten. Tillsätt 1 mL av is kallt CSM till nybakade tinade prover, blanda väl med en pipett, och överföra till respektive före märkt polypropylen kluster rören.
- Ta en 10 μL prov att räkna celler med en automatisk cell counter eller hemocytometer. Normalisera blodkroppar till 1,5 – 2 x 106 celler per prov i varje kluster rör: avlägsna och kassera volymen av överskjutande celler ovanför 2 x 106 celler.
- Centrifugera cellerna vid 600 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Att resuspendera cellerna i 1 mL av 1 X barcoding perm buffert med en flerkanalspipett och centrifugera vid 600 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Aspirera av supernatanten.
- Rada upp kluster rören på ett rack i samma ordning som anges på nyckeln streckkoden så att provet överensstämmer med dess streckkod. Lägga till 800 μL 1 X streckkodning perm buffert av multikanalspipett i alla prover i klustret rören utan att vidröra cellpelleten med pipett tips (ingen blandning) att minska cellförlust. Ställ undan racket med kluster rör.
- Ta bort 20-plex Pd Barcoding Kit tube remsor från-20 ° C och Tina i rumstemperatur. Tillsätt 100 μl av 1 X barcoding perm buffert, blanda omsorgsfullt och överför 120 μl av den återsuspenderade streckkod mix till de motsvarande cell proverna i klustret rören.
- Blanda omsorgsfullt genom flerkanalspipett så det finns ingen korskontaminering mellan individuellt barcoded prover. Inkubera kluster rör för 30 min i rumstemperatur så att streckkoderna att märka cellerna.
- Centrifugera vid 600 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 mL av CSM.
- Centrifugera och återsuspendera i CSM igen som i steg 3,8.
Anmärkning: Varje prov är nu märkt med en unik streckkod och prover är redo att delas. - Centrifugera vid 600 x g i 5 min i rumstemperatur och Aspirera supernatanten. Med en enda pipett och använder samma tips, överföra alla cell pellets i ~ 70 – 80 μl residualvolym till en polystyren röret. Mata inte pipettspetsen; Ställ undan den enda pipetten med detta tips.
- Med en flerkanalspipett och nya tips, lägga till ~ 100 μL CSM till varje ursprungliga klustret tube att maximera cell återhämtning. Med enda pipetten med spetsen som upphävdes, överföra alla cell pellets i ~ 100 μL residualvolym till samma polystyren röret.
- Lägg till CSM till toppen av polystyren röret (~ 3 mL). Räkna och registrera cell antalet poolade streckkoden anges. Centrifugera vid 600 x g i 5 min i rumstemperatur och Aspirera supernatanten. Gå vidare till färgning barcoded proverna på samma dag.
Obs: Det är normalt att förvänta sig ~ 20 – 30% cellförlust i processen streckkodning.
4. färgning av Barcoded fast lyserat/blodkroppar och beredning för analys på massa flödescytometri Instrument
Obs: Varje 1 X titer för färgning antikropp (1 μL av antikropp per 100 μL färgning reaktion), kan vanligtvis färga 3 – 4 x 106 celler. Därför, när alla barcoded prover sammanförs i en tub, mängden antikroppar måste skalas upp. Om 20 barcoded prover uppgår till 30 x 106 celler, och varje 1 X titer kan färga 3 – 4 x 106 celler, kräver barcoded provet endast en 10 X titer, i motsats till färgning varje prov individuellt, vilket skulle kräva en 20 X mängd antikroppar (1 X per enskilda tube). Koncentrationen av antikroppen till cell nummer bör titreras noggrant för varje enskild antikropp cocktail (inte diskuteras här).
- Färga celler med hjälp av antikroppar (Tabell för material) för surface färgning och cytokin induktion.
- Gör ytan färgningen cocktail genom att beräkna beloppet som läggs till och redovisning för pipettering fel (dvs.om färgning 20 barcoded prover av 2 x 106 celler i varje prov, en 10 X titer fläcken krävs; för slutlig volymberäkningar, kompensera för pipettering fel genom att göra en 10.5 X slutliga färgning lösning).
- Lägga till 10 X värt av ytan färgning volym till barcoded cellpelleten. För att minska cellförlust, med samma tips, blanda och mäta upp ytliga missfärgningar och cellpelleten volym.
- Baserat på volymen av celler och färgning cocktail, lägga till CSM en färgning slutvolymen av 50 μl per antalet cellprover (dvs.om kör en uppsättning av 20 prover, 50 μl X 20 = 1 mL). Inkubera i 30 minuter vid 4 ° C. Agitera provet varje 15 min för att främja även färgning.
- Under ytan fläcken ruvning, förbereda Perm/tvättbuffert (Tabell för material) genom att späda 1:10 med filtrerade ddH2O. förbereda volymer av 2 mL för permeabilisering och 5 mL för tvätt. Hålla vid 4 ° C eller på is.
- Toppa med ytan färgning tube med CSM och centrifugera vid 600 x g vid 4 ° C i 5 min. Aspirera supernatanten. Återsuspendera barcoded provet i 4 ° C, 1:10 2 mL förtunningsbuffert Perm/tvätt. Inkubera vid 4 ° C för 20 – 30 min till fullt permeabilize cellerna.
- Centrifugera vid 600 x g vid 4 ° C i 5 min och Aspirera supernatanten.
- Intracellulära färgning, gör liknande färgning här (när det gäller ytan färgning). Dock använda 4 ° C, 1:10 förtunningsbuffert Perm/tvätt istället för CSM att göra den totala färgning volym så att cellerna finns kvar i en permeabilizing miljö i hela den intracellulära färgning.
- Lägga till intracellulära antikroppen cocktail till ytan färgas och permeabilized cellpelleten (steg 4.1.2–4.1.17). Ta den totala färgning volymen till 50 μl per antalet cellprover. Inkubera under 60 minuter vid 4 ° C. Agitera provet varje 15 min för att säkerställa även färgning.
- Under den intracellulära färgning, förbereda intercalator lösningen: 900 μl av filtrerade PBS + 100 μL av filtrerade 16% PFA (slutlig koncentration 1,6% PFA) + 0.2 μL av 500 uM av intercalator dye (Tabell för material).
- Toppa den cellpelleten + intracellulära antikroppar cocktail med kall 1:10 Perm/tvättbuffert.
- Centrifugera vid 600 x g vid 4 ° C i 5 min och Aspirera supernatanten. Toppa färgning röret med CSM. Räkna och anteckna antalet cell. Centrifugera vid 600 x g vid 4 ° C i 5 min och Aspirera supernatanten. Att resuspendera cellerna i 1 mL intercalator lösning från steg 4,9. Inkubera i minst 20 min i rumstemperatur för full interkalation, eller över natten vid 4 ° C (prover i intercalator lösning kan bo vid 4 ° C i upp till 1 vecka innan du kör dem på massa flödescytometri instrumentet).
- Förbereda cellerna för massa flödescytometri instrumentet.
- Toppen av röret med filtrerade ddH2O 3 mL och centrifugera vid 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Att resuspendera cellerna 3 ml filtrerade ddH2O. passera denna suspension genom en 100 μm filter för att ta bort skräp eller aggregat som potentiellt skulle kunna täppa till massa flödescytometri instrumentet.
- Räkna och anteckna cell nummer efter filtrering. Centrifugera vid 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C
- Förbereda pärla kalibreringslösningen (Tabell för material) genom att späda ut den 1:10 i filtrerade ddH2O.
- Återsuspendera den färgade celler i volymen som krävs av 1:10 utspädd pärla kalibreringslösningen att uppnå en cell koncentration av ~ 1 x 106 celler/mL.
Obs: För en CyTOF1 på 45 µL/min, den rekommendera optimaln är 5 x 105 celler/mL; för Helios på 30 µL/min, 7,5 x 105 celler/mL. - Fortsätta att köra provet på massa flödescytometri instrument9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar arbetsflödet för stimulering och bearbetning av perifert blodproverna, inklusive tilldelning av blod prov alikvoter, tidpunkten för tillägg av stimulering ombud, protein transportera hämmare cocktail, och inkubation gånger tills den röda blodkroppar (RBC) lysis och fixering. Valet av stimulerande medel beror på den signalering och cytokin vägar som är avsedda för bedömning. Exempelvis i protokollet som beskrivs här, används TLR-agonister för att utvärdera medfödd immun fjärranalys mekanismer över flera celltyper. Representativa extracellulära (LPS, TLR4 agonist) och endoplasmic (R848, TLR7/8-agonist) agonister valdes. Andra stimulerande medel inkluderar Phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) och Ionomycin (PMAIONO), som kan fungera som T-cell aktivatorer. Specifika cytokiner kan också användas som stimulerande medel, tillsammans med andra specifika T-cell och B-antigener.
För att demonstrera det experimentella tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll, figur 2, figur 3och figur 4 visar representativa resultat som erhållits med LPS, R848 och PMAIONO som stimulerande villkor. Medan användningen av PMAIONO inte var beskrivs i protokollet, visas data i figur 3 och figur 4 för att visa att olika (och selektiv) celltyper och cytokiner är aktiverat/inducerad svar på TLR-agonister (LPS och R848) kontra en T cell aktivator (PMAIONO). Med tanke på att 26 yta markörer (Tabell för material) har använts för att avgränsa flera medfödd och adaptiv immunceller delmängder, kan olika T, B, NK, monocyt och dendritiska cellen undergrupper samtidigt studeras inom ett enda prov. Dessutom ingår markörer av immunceller aktiveringen också, såsom CD86 eller ICOS för B-celler och PD1 för T-celler. En begränsad gating strategi visar bedömningen av CD14hi monocyter representant visas i figur 2. Dock mer detaljerad och utökade gating T, B, NK, monocyt, dendritiska, och granulocytic cell undergrupper kan hittas i vår tidigare publicerade arbete i O'Gorman och Hsieh et al. och O'Gorman och Kong et al. 14 , 15 dessutom unsupervised analysmetoder inklusive (och inte begränsat till) SPADE16, visNE17, Citrus18, Phenograph19och Xshift20 kan användas för att utvärdera massa flödescytometri data (inte här diskuteras). Använda CD14hi monocyter och CD4 T-celler som representativa medfödd och adaptiv immunceller delmängder, visas uppgifter som visar cytokin induktion inom dessa celltyper i figur 3. Ett utvalt antal cytokiner valdes för att visa att R848 selektivt inducerar IL-12 (p40 subunit) och MCP1 i CD14hi monocyter medan LPS inte (figur 3). PMAIONO, en potent T cell aktivator inducerar inte cytokiner i CD14hi monocyter (figur 3) men inducerar interferon gamma (IFNγ) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) i CD4 T-celler (figur 4). Framgångsrik teknik i perifert blod prov stimulering och bearbetning visar mönster av cytokin induktion specifika stimulerande villkor och immun delmängder, som exemplifieras i figur 3 och figur 4. För fullständig analys av de 14 cytokiner som beskrivs här i de celltyper som fångas inom de 26 yta markörerna, se O'Gorman och Hsieh et al., och O'Gorman och Kong et al. 14 , 15
Att demonstrera hur det experimentella tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll fångar en systemisk autoimmun sjukdom ”inneboende” patogena tillstånd såsom vid SLE jämfört med en frisk givare, figur 5 illustrerar cytokin induktion (Mip1β och MCP1) i CD14hi monocyter hittade i den sjuka perifert blod prov endast (del B), i avsaknad av något exogen stimulering (T6 jämfört T0). Dessa cytokiner minskade ”modulerad /” JAK hämning terapi ruxolitinib (T6 + 5R jämfört med T6) i den sjuka perifert blod prov endast (del B).
Figur 1. Experimentell arbetsflöde för stimulering och bearbetning av perifert blod för massa flödescytometri analys. Protokollet för RBC lysis och fixering av sjukdom perifert blod omedelbart följande provtagning (T0) eller efter 6 h inkubation vid 37 ° C med ett protein transport hämmare (PTI) i avsaknad av något EXOGEN agent (T6) eller med LPS (T6 + LP-skivor), R848 (T6 + R848; protein transport hämmare inkubation i 4 h), eller ruxolitinib (T6 + 5R). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant gating strategi för identifiering av CD14hi monocyter. Efter fixering och RBC lysis fast individen lyserat/cellprover från en frisk givare var barcoded, märkt med 26 antikroppar mot yta markörer, permeabilized och färgas med 14 antikroppar mot cytokiner (Tabell för material). Den begränsa Usenets strategi som representerar identifiering av CD14hi monocyter visas. Från vänster till höger är varje 2D tomt representerade en befolkning delmängd från överordnade befolkningen som är gated (blue box) från 2D handlingen omedelbart till vänster. En utökad Usenets strategi kan hittas i O'Gorman och Hsieh et al.och O'Gorman och Kong et al. 14 , 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på cytokin induktion i CD14hi monocyter efter stimulering med LPS, R848 och PMAIONO. En representativ massa flödescytometri analys av perifert blod prover från en frisk givare på tiden noll (T0), ostimulerade (T6), och efter stimulering med LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), och PMAIONO (T6 + PMAIONO) visas. Ett exempel av cytokin induktionen i CD14hi monocyter visas; valda cytokiner med specificitet till stimulerande agenten används (TLR agonist kontra T cell aktivator) skildras. Utökade data för alla cytokin induktion över flera immunceller delmängder konstaterat med bara massa flödescytometri antikropp panelen kan hittas i O'Gorman och Hsieh et al.och O'Gorman och Kong et al. 14 , 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på cytokin induktion i CD4 T-celler efter stimulering med LPS, R848 och PMAIONO. En representativ massa flödescytometri analys av perifert blod prover från en frisk givare på tiden noll (T0), ostimulerade (T6), och efter stimulering med LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), och PMAIONO (T6 + PMAIONO) visas. Exempel på cytokin induktion i CD4 T-celler visas; valda cytokiner med specificitet till stimulerande agenten används (TLR agonist kontra T cell aktivator) skildras. Utökade data för alla cytokin induktion över flera immunceller delmängder konstaterat med bara massa flödescytometri antikropp panelen kan hittas i O'Gorman och Hsieh et al.och O'Gorman och Kong et al. 14 , 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Exempel av cytokin induktion i CD14hi monocyter från SLE sjukdomen patienten. En representativ massa flödescytometri analys av perifert blodprover från friska givare (A) och SLE sjukdomen patienten (B) visas. Exempel på cytokin induktion i CD14hi monocyter; valt cytokiner med specificitet för SLE sjukdomen ”inneboende” patogena processen (T6) (dvs, induktion av MIP1β och MCP1 endast i SLE patienten), och effekten av immunmodulerande ruxolitinib (T6 + 5R) skildras. Utökade data för alla cytokin induktion över flera immunceller delmängder konstaterat med bara massa flödescytometri antikropp panelen kan hittas i O'Gorman och Kong et al. 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en roman, encelliga, proteomiska strategi att samtidigt bedöma flera immun celltyper och upptäcka deras olika cytokin-störningar i miljön i särskilda ”patogena” perifer blodplasma cirkulerande patientfaktorer. Denna metod använder perifera helblod som analytisk fordon och massa flödescytometri som verktyget för utvärdering av immun cellulära fenotypiska och funktionella avvikelser. Metoden är lättillämpliga till människa och möss studier21, och är kompatibel med andra immun funktionalanalys, såsom att upptäcka signalering avvikelser14.
Användaren ska vara medveten om ett antal variabler som kan påverka framgång av proceduren. Baserat på vår erfarenhet, bör blodprov bearbetas inom 2 h för att undvika baslinjen induktion av intracellulära cytokiner (inga data anges). Blodprov bör förbli i rumstemperatur (25 ° C) i avvaktan på bearbetning. Blodprov kan tas antingen natrium heparin eller EDTA-rör utan inblandning med beskrivna analysen. Levande och döda cellen diskriminering kan utvärderas av massa flödescytometri med cisplatin22. Sådan utvärdering utelämnas dock i det protokoll som beskrivs ovan förutsatt att blod behandlas snarast (eller inom 2 h) efter insamling. Dessutom, även om prover var försenade i bearbetning, tillåter avsaknaden av frysförvaring för utelämnandet av live/dead diskriminering. Vi skulle, men rekommenderar användning av cisplatin för livskraft diskriminering för någon studie där celldöd kan påverka resultatet av den efterföljande analysen.
Dessutom har vi funnit att den omsorgsfullt val och titrering av stimulerande agent är viktigt att utvärdera riktade immun vägar/cytokin induktion. Det första valet av stimulerande agenten bör baseras på 1) immunförsvaret vägar avsedda att engagera/utvärdera, och 2) riktade funktionsavläsningar (om signalering proteiner eller cytokin produktion). Till exempel om målet var att utvärdera T cellaktivering och olika T helper cell (Th) undergrupper och deras respektive cytokin induktion, skulle PMAIONO eller en kombination av anti-CD3/anti-CD28 vara ett lämpligt stimulerande villkor. Om målet var att utvärdera monocyt delmängd aktiveringen, kan en TLR-agonist (eller en kombination av dem) dock bästa. Andra behöver koncentrationen för varje av dessa stimulerande medel optimeras för att framkalla cellaktivering och cytokin induktion, utan att allvarligt förändra de cell yta markörerna. Användning av för lite stimulerande agent kommer inte att leda till aktivering av önskade celltyper och ingen cytokin induktion kommer att observeras, medan användning av för mycket kommer att leda till överdriven celldöd och förändringar i immunförsvaret cell yta markörer så att populationer identifierade i villkoret ostimulerade kommer inte att finnas i villkoret stimuleras. Tredje, kineticsen av stimulering är också en viktig variabel. Medan 6 h har tidigare publicerats som en optimal stimulering tidsram att fånga maximal induktion av pro-inflammatoriska cytokiner som svar på den TLR stimulering14,23, kan en tidpunkt för olika stimulering behövas för andra medel. Likaså bör användningen av någon terapeutisk i vitro med perifert blodproverna också titreras på samma sätt som den stimulerande agenten, samtidigt betala nära uppmärksamhet till koncentration och tidpunkt.
I detta protokoll använder vi färska perifera helblod prover, intracellulära cytokin induktion (och upptäckt) är mer robust och effektiv jämfört med nedfrysta prover. Vi beskriver i protokollet här användningen av helblod i motsats till PBMC, eftersom förekomsten av plasma cirkulerar faktorer bidrar till den immuna avvikelser relaterade till sjukdomen som är processaa ”inneboende” karaktär. Dessa plasma-cirkulerande faktorer kan störa stimulera villkor till den perifera helblod, såsom tillägg av anti-IgM och anti-IgG för att engagera B-cells receptor, som de är bundna av plasma cirkulerande antikroppar och röda blodkroppar. Därför omsorgsfullt val av den stimulerande villkor när du använder perifera helblod är avgörande för framgångsrika experiment Läs outs. Med perifera helblod har sina fördelar (i vivo plattform) och nackdelar (störande plasma cirkulerande faktorer). PBMC erbjuder dock en annan uppsättning ”-” och ”nackdelar”. När färska PBMC (i motsats till helblod) genomgå samma process/protokoll och med stimulering använder olika TLR agenter, vi observerat samma ”mönster” av cytokin induktion, om än i en något mindre magnitud14,23. Efter detta protokoll, användning av frysta PBMC leder till en mindre robust cytokin induktion, och därför vi skulle rekommendera mot direkt jämföra resultaten från prover bearbetas efter frysförvaring med de bearbetade färska.
Med tanke på förbehållet av fresh kontra frysta prover och preferensen för användning av färska prover för optimal datakvalitet, är i protokollet som beskrivs här lämplig för prospektiva studier på människa där patientprover samlas över en tidsram på månader till år. Perifert blodprover kan bearbetas som beskrivs, och när de når RBC lysis och fixering scenen, prover kan vara lagrade i-80 ° C och färgade i omgångar senare. Detta tekniska synsätt, utgör medan fördelaktigt för de flesta mänskliga studier, också utmaningen att använda antikroppar som kan binda till det målet epitop efter fixering. Tabell för material visar klonerna för respektive antikroppar som har testats och visa specifik färgning post fixering. Har flera prover (n = 20) erbjuder fördelarna med 1) minskade tekniska variationer, som flera prover färgas tillsammans i en tub, därför att göra jämförelser av prover över förhållanden ganska konsekvent och pålitlig; (2) minskning av totala antikropp användning (se protokollet avsnitt 4.1). och 3) streckkodning systematik ”6 olika palladium isotoper/Välj 3” leder med undantag av dubletter (celler positivt för mer än 4 palladium isotoper). Dessa fördelar diskuteras i detalj i Zunder och Fick et al. 24 dessutom streckkodning processen kräver att fastställas celler, eftersom de måste vara milt permeabilized för interkalation av streckkodning reagens (palladium isotoper)24. Därför levande färgning kan inte utföras efter detta protokoll. Det bör noteras att levande cell streckkodning (i motsats till fasta cell streckkodning beskrivs här) är en möjlighet25,26, men i protokollet här, celler korrigeras så att de kan lagras och batch bearbetas tillsammans.
Batch-prov bearbetning, medan fördelaktigt ur ett arbete och tid effektivitet synvinkel, också har sina egna utmaningar. Med batch-bearbetning finns det ett behov av en noggrant handplockade normalisering process. Denna normalisering process kan ställas på olika steg av massa flödescytometri arbetsflödet. Först, koncentrationen av antikroppar mot antalet celler bör hållas konsekvent över batchar. Vi har funnit att ett effektivt sätt att uppnå detta konsekvent koncentration är genom 1) noggrann titrering av antikroppkoncentrationen till cell nummer, och 2) normalisering av cellen numrera av varje prov som är barcoded tillsammans (dvs.1 miljon celler per prov, för alla 20 barcoded prover). För det andra, för att redovisa instrumentet signal intensiteten variabilitet (olika dagar av tuning, kalibrering och signal förfaller under körning), prover bör resuspended och analyseras på en massa cytometer med en lämplig normalisering pärla lösning (tabell material), följt av fil normalisering efter data förvärv27 (men före debarcoding). Enskilda prover är debarcoded efter hela barcoded filen har varit normaliserade använda verktygen som beskrivs i Zunder och Finck o.a. 24 för det tredje för att redogöra för manuell antikropp färgning tekniska variabilitet, rekommenderar vi införandet av ett ”ankare” prov med varje streckkod som analyseras för en enda studie, dvs., ett enda prov som är från en donator (mänskliga studier) och har behandlats på samma sätt som de andra studien proverna. Detta prov ska genereras en gång i tillräckligt stor mängd för att fördelas till varje streckkod uppsättning analyseras för studien. Dessa ankare prover från varje streckkod används för att generera en koefficient på variansen att korrigera för signal variabilitet över studien proverna för att streckkoden (dvsankare prov från streckkod 8 används för att korrigera för variationen i streckkoden 8).
Ett annat viktigt optimering steg är montering av panelen massa flödescytometri antikropp, som kommer att bedöma relevanta immunceller underdelar och cytokiner. Några viktiga variabler i antikropp panel församling är valet av kloner (berördes ovan), antikropp titer för minimal bakgrund signal, val av antikropp mål och isotopen kanaler baserat på antigen överflöd och kanal känslighet ” ersättning ”signal spillover baserat på isotop orenhet och oxidation och enskilda antikropp hel variabilitet. Dessa optimering steg behandlas på annan plats28 och inte omfattas av det protokoll som beskrivs här.
Använder denna encelliga proteomiska metod att studera immun avvikelser i perifert blodprover, är det möjligt att identifiera onormala fenotyper av immunceller delmängder, oavsett om det är befolkningen frekvens skillnader eller förändringar i uttrycket av viss cell yta markörer (t.ex markörer för cellaktivering). Dessutom är det också möjligt att identifiera funktionella avvikelser inom immunceller delmängder, enlighet eller överproduktion av cytokiner. Slutligen, processen att jämföra provet omedelbart fast (T0) kontra fast efter 6 h inkubation utan en exogen agent (T6) visar ”inneboende” patogena processer som leder till immunceller typ och cytokin avvikelser (T6-T0). Detta synsätt skulle kunna anpassas till studiet av olika systemiska immunmedierade processer och engagemang av flera immunceller underdelar och vägar beroende på stimulering agenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Aimee Pugh-Bernard för hennes intellektuella ingång och hjälpsamma kommentarer. Detta arbete stöds av Boettcher Foundation Webb-Waring biomedicinsk forskning- stipendiet antalet K23-1K23AR070897 från NIH till Elena W.Y. Hsieh. Hon var också stöds av award antal K12-HD000850 från Eunice Kennedy Shriver National Institute barns hälsa och mänskliga utvecklingen och den Lucile Packard Foundation för barnens hälsa, Stanford CTSA UL1 TR001085 och barn hälsoforskning Institutet av Stanford University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
