Summary
Este trabalho apresenta um método para executar uma optogenetic unidade única gravação confiável de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida.
Abstract
É uma grande preocupação em neurociência como diferente tipos de neurônios funcionam em circuitos neurais. Avanços recentes em optogenetics permitiram a identificação do tipo neuronal na vivo eletrofisiológicos experiências em regiões do cérebro amplo. Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. No entanto, muitas vezes é difícil entregar-se a luz de estimulação às regiões profundas do cérebro da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Aqui, descrevemos um método para gravar respostas de pico à luz de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz nas regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.
Introduction
O sistema nervoso central consiste de vários tipos de neurônios, que têm funções diferentes. Como esses diferentes tipos de neurônios funcionam dentro do circuito neural é uma das principais preocupações da neurociência. No entanto, em muitas regiões do cérebro, tem sido impossível distinguir os tipos neuronais em gravações na vivo de actividades eléctricas, porque não há nenhuma diferença clara no sinal elétrico spike em si, com algumas exceções. Avanços recentes em optogenetics fizeram uma descoberta1,2. Usando animais transgénicos na qual opsin sensíveis à luz (por exemplo, channelrhodopsin-2) é expressa em tipos específicos de neurônios, tornou-se possível distinguir os tipos neuronais eficientemente na vivo gravações3, 4,5,6. Nestes animais, os neurônios com opsin sensíveis à luz estão animados, dando estímulos de luz durante as gravações elétricas, mas outros neurônios não são. Os neurônios opsin-positivo, portanto, facilmente são distintos dos outros tipos de neurônio por suas respostas à luz.
Em experimentos de optogenetics, é essencial para fornecer a luz para o local de gravação. Como um método não-invasivo, a luz é muitas vezes dirigida da superfície do cérebro. No entanto, porque a força da luz reduz conforme passa pelo tecido cerebral, é difícil estimular as regiões cerebrais profundas da superfície do cérebro. Especialmente, é difícil para a luz de estimulação atingir as regiões profundas do cérebro quando a transparência óptica da superfície do cérebro é baixa, como é frequentemente o caso com gravações de animais acordados. Eletrofisiológicos experimentos frequentemente foram realizados em animais anestesiados porque o movimento do corpo provoca ruído nas gravações. Como está bem documentado, no entanto, anestesia é conhecida para alterar as respostas neurais7,8,9,10. Assim, é necessário utilizar animais acordados para estudar as respostas neurais, sem os efeitos artificiais da anestesia. Ao contrário das experiências com animais anestesiados, as gravações eletrofisiológicas são executadas após a recuperação da cirurgia nos experimentos com animais acordados. Durante o intervalo entre a cirurgia e as gravações, o exsudato tecido frequentemente se acumula na superfície do cérebro e faz com que a transparência óptica da superfície do cérebro baixa.
Aqui, descrevemos um método para gravar gravações unitárias de um rato acordado usando um optrode de vidro sob medida. Neste método, a luz é fornecida através do eléctrodo de vidro de gravação é possível estimular confiantemente o neurônio gravado com luz em regiões profundas do cérebro. Este sistema de optrode sob medida consiste de materiais acessíveis e baratos e é fácil de montar.
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Protocol
Todos os procedimentos são feitos em conformidade com os princípios orientadores da sociedade Physiological do Japão e com a aprovação do Animal conta Comissão de Kanazawa médica Universidade.
1. construção do titular do Optrode de vidro
Nota: Para construir um suporte de optrode de vidro, um porta-eletrodo comercial é utilizado (figura 1A).
- Suavemente retire o tubo de aço para controle de pressão do cilindro do titular.
- Por perfuração, alargar o buraco do lado do assento pin no cano do titular. Faça o furo de 3 mm de diâmetro e 12 mm em profundidade.
- Colocar um tubo de aço inoxidável (3 mm de diâmetro, de espessura 0,5 mm e 8 mm de comprimento; Figura 1A 2) no buraco.
- Inserir uma cerâmica de dividir o acasalamento manga para virolas de ⌀2.5 mm (figura 1A1) no orifício.
- Consertar o cano do porta eletrodo para uma ranhura em forma de L com adesivo epóxi.
- Faça os furos (3 mm de diâmetro) na ranhura e anexá-lo para um manipulador com parafusos.
2. cabeça pós instalação
- Prepare um Custom-Built post cabeça feito de um espaçador de placa de circuito. Fazer o espaçador de placa de circuito colunar em forma cuboidal com uma fresa e corte em 2 lugares de cabeça com uma serra (figura 1B). Achate a parte inferior do post principal com uma fresa.
- Prepare o animal geneticamente modificado em que um opsin sensível à luz é expresso em um tipo de neurônio específico para o estudo. Neste trabalho, é usado o rato transgénico (ratos VGAT-ChR2) em que os neurônios inibitórios expressam channelrhodopsin-2 (ChR2)11 .
- Anestesia o animal com uma mistura de 0,3 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam e 5,0 mg/kg de butorfanol pela administração intraperitoneal. Para confirmar que o animal é totalmente anestesiado, teste suas reações para beliscar da cauda.
- Coloque o mouse em uma armação estereotáxica em uma almofada de aquecimento. Limpo, o aquecimento e a armação estereotáxica almofada antecipadamente com álcool a 70%. Coloque os dentes no buraco da barra dentada e aperte levemente o grampo do nariz. Corrigi a ambos os lados da cabeça usando barras de orelha. Quando a cabeça é fixada corretamente pelas barras de orelha, aperte o grampo do nariz. Aplica uma pomada oftálmica nos olhos.
- Raspar a pele da cabeça com uma tesoura pequena e limpar o couro cabeludo com um cotonete de gluconato de clorexidina. Antes da cirurgia, esterilize todos que os instrumentais cirúrgicos e uma cabeça de postar com uma autoclave (121 ° C, 15 min).
- Corte o couro cabeludo ao longo da linha mediana com uma tesoura e empurrá-lo de lado. Fazer a incisão na parte de trás da cabeça para os olhos (cerca de 20 mm). Remover o periósteo com um cotonete embebido em álcool a 70% e secar o crânio.
- Anexe o posto de cabeça para o manipulador. Posicione o post cabeça plana no crânio em torno do bregma usando o manipulador.
- Misture o monômero (4 gotas), catalisador (1 gota) e polímero (1 colher pequena) de cimento dental em um pequeno prato que é tranquilo na geladeira com antecedência. Ponha o cimento dental (abaixo de 1 g) frontal e parietal osso do crânio para fixar a coifa cabeça no crânio.
- Depois que o cimento dental torna-se difícil, retire o mouse da armação estereotáxica. Coloque uma pomada antibiótica na pele exposta. Injete o antagonista de medetomidina (0,3 mg/kg) e os antibióticos (oxitetraciclina, 20 mg/kg). Coloque e monitorar o mouse sobre a almofada do calor em uma gaiola até que ele acorda e devolvê-lo para uma gaiola de habitação.
- Casa do animal em uma gaiola de habitação individual com algum dispositivo de enriquecimento. Mude o papel de animal fundamento diariamente para manter a gaiola limpa e prevenir a infecção. Monitore cuidadosamente se o animal mostra qualquer sinal de desconforto. Aplicam-se lidocaína a ferida se houver suspeita de qualquer dor. Administrar meloxicam ou carprofeno uma vez a cada 24h por 48h após ambos a cabeça pós instalação e craniotomia cirurgias. A lidocaína local pode ser dado além disso se o AINE não é adequada.
3. a aclimatação
- (No mínimo) dois dias após a recuperação da anestesia, adapte os animais ao estado cabeça-fixo na câmara de gravação. Realize as sessões de aclimatação para pelo menos 5 dias.
- Durante as sessões de aclimatação, coloca o animal na câmara de gravação com o post cabeça fixado para uma pinça custom-built. Durante a sessão, a fim de limitar o movimento, a tampa do corpo com um tubo de resina feito por metade (Figura 1), feita usando uma impressora 3D.
Nota: No dia 1, a sessão de aclimatação deve ser longo 5 min. Ele é então aumentado diariamente para 10, 20, 40 e 60 min para dias 2, 3, 4 e 5, respectivamente. - No final de cada sessão, o animal de dar uma recompensa de comida. Se o animal se esforça continuamente durante a aclimatação, interromper a sessão.
4. craniotomia
Nota: Após a aclimatação, uma craniotomia é feita sobre a região do cérebro para a gravação. A craniotomia é realizada no quadro estereotáxicos sob anestesia, como com a cabeça pós instalação. O procedimento de pós operação é o mesmo como a cabeça pós instalação.
- Antes a craniotomia, limpe o crânio com um cotonete de algodão com clorexidina gluconato e 70% de álcool.
- Raspe cuidadosamente o crânio sobre o local de gravação com uma broca de dentista. Quando o osso torna-se bastante fino, cortar com a ponta do bisturi e removê-lo.
- Colocar cimento dental em torno da região exposta a fim de reforçar o crânio.
- Cobrir a área do cérebro exposto com adesivo de silicone após o cimento dental torna-se difícil. O procedimento pós-operatório é conforme descrito na etapa 2.8.
5. eletrofisiológica gravação
- Permitir que o animal se recuperar pelo menos 1 dia após a craniotomia antes de executar a gravação eletrofisiológica. Coloque o animal na câmara de gravação da mesma forma que foi feito durante as sessões de aclimatação, quando inicia a gravação.
- Fazer vidro pipetas de capilares de vidro de borosilicato (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm de comprimento) apontou um extrator de eletrodo. Seu diâmetro de ponta é de 2 – 3 µm, e sua resistência é 4-6 MΩ quando eles estão cheios de 10mm PBS. O comprimento do eletrodo é de 40 – 50 mm. Em algumas gravações, 2% neurobiotin é adicionado para o PBS de 10 mM.
- Anexe a pipeta de vidro preenchida ao titular do optrode sob medida.
- Coloque o fio de prata Ag-Cl revestido (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de vidro. Ligue o fio de prata a um pino através de um fio elétrico revestido fino. Conecte o pino para o headstage do amplificador de gravação.
- Conecte o cabo de remendo de fibra óptica (núcleo = 960 µm, revestimento = 1.000 µm, at = 0,63) com uma virola de zircônia (OD = 2,5 mm) para a divisão de acasalamento manga no porta-optrode. Empurre o cabo de remendo na manga até a ponta da virola entra em contato com as costas da pipeta vidro. O cabo de remendo oferece a luz (comprimento de onda = 465 nm) de LED. O diodo emissor de luz é controlada por um controlador de LED de canal único.
- Remova o adesivo de silicone sobre a craniotomia. Colocar soro aquecido (38 ° C) sobre a superfície do cérebro periodicamente para evitar que a superfície do cérebro de secagem durante a sessão de gravação. Se necessário, remova a dura-máter com Pinças afiadas.
- Introduza o eléctrodo de vidro o tecido do cérebro com um manipulador. Monitore a resistência do eletrodo, quando ele é inserido. Substitua o eletrodo quando a resistência é menor do que o esperado porque a ponta do eletrodo pode ser danificada. Na profundidade de interesse, Pesquisar e isolar os picos da única unidade ajustando a profundidade em passos de 2 a 5 µm.
- Depois que a unidade está isolada, entregar o diodo emissor de luz e observar a resposta aos estímulos leves.
- Grave as atividades neurais após a identificação dos tipos de célula. Realize as gravações de 2 – 3 h. Se a gravação é feita em dias consecutivos (máxima de 2 dias), cubra a craniotomia com adesivo de silicone. Quando a gravação estiver concluída, e o animal é sacrificado, recuperar o post cabeça e colocá-lo em acetona para lavar e reutilizá-lo.
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Representative Results
Na Figura 2, examinamos os efeitos do tamanho da ponta e do comprimento das pipetas de vidro sobre o poder de luz na ponta das pipetas (Fig. 2A-B). O poder da luz foi medido por um medidor de potência óptica colocado 1 mm da ponta. O comprimento total foi definido como 50 ± 2 mm quando o tamanho da ponta variado, enquanto o tamanho da ponta foi definido como 2,5 µm, quando todo o comprimento variado. A haste da pipeta vidro foi definida para 8 mm. O poder de luz na ponta, variou entre 3-5 mW (média ± DP; Figura 2A: 3,77 ± 0,29 mW, n = 20; Figura 2B: 4,24 ± 0,31 mW, n = 21). O tamanho da ponta (Figura 2A) das pipetas correlacionou-se mal com o poder de luz (R = 0.1555). O comprimento da pipeta apenas ligeiramente correlacionou-se com o poder da luz de forma negativa (R =-0.2054). Estes resultados sugerem que a ponta e o comprimento das pipetas raramente afetam o poder de luz na ponta. Nós também verificamos se a quantidade de carga de volume da solução nas pipetas de vidro (10 mM PBS) afeta o poder de luz (Figura 2). O volume da solução foi avaliado pelo comprimento da solução na pipeta. Os dados foram registrados de 4 pipetas (dica tamanho: 0,25 µm, o comprimento total: 50 ± 2 mm, o comprimento da haste: 8 mm). Nós achamos que variar o volume da solução em pipeta não afetou o poder de luz (Figura 2).
Na Figura 3, mostramos as respostas de pico gravadas no colículo inferior (IC) de ratos de VGAT-ChR2 acordados (2 – 4 meses de idade). O IC é um centro auditivo no mesencéfalo e consiste de glutamatérgico e gabaérgica neurônios12,13, ambos os quais respondem ao som de3,4. Nos ratos IC de VGAT-ChR2, os neurônios gabaérgica especificamente expressam ChR24. Em trabalho anterior, foi demonstrado que os neurônios gabaérgica e glutamatérgico eram animados ou suprimidos, respectivamente, quando elas foram dadas a estímulos de luz3,4. Nos ratos acordados, encontramos os dois tipos de neurônios (Figura 3A-B). Quando o estímulo luz é entregue através do eletrodo de vidro, ele evocou respostas de pico em alguns neurônios (Figura 3A). Em contrapartida, em outros neurônios, os estímulos de luz suprimiram as respostas de spike evocadas por estímulos sonoros (Figura 3B). Esses resultados mostram que um optrode de vidro pode gravar a atividade de unidade única bem isolados e confiantemente, estimular os neurônios gravados pela luz.
Figura 1: Acessórios de titular e gravação de Optrode. Painéis (A) e (B) mostrar o titular optrode. Painel (A) mostra a estrutura de parte do titular do optrode. (1) é uma divisão de cerâmica da luva de acoplamento. (2) este é um tubo de aço inoxidável. (3) este é um barril do titular. (4) esta é uma máquina de lavar do cone. (5) esta é uma tampa de policarbonato. Painel (B) mostra o titular optrode montado. Panels (C) e (D) mostram o post cabeça custom-built. Painel (C) mostra uma vista lateral do post principal. Painel (D) mostra uma vista oblíqua do post principal. Os dois posts de cabeça (à direita) são feitos de um espaçador de placa de circuito (à esquerda). Painéis (E), (F) e (G) mostrar o tubo de resina feito por metade. Painéis (E) e (F) mostrar desenhos dimensionais do tubo metade resina. Painel (E) mostra uma vista frontal do tubo metade resina. Painel (F) mostra uma vista lateral do tubo metade resina. Painel (G) mostra uma imagem da foto do meio tubo. Os números em painéis (E) e (F) indicar as desenho dimensões em mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: o efeito da configuração das pipetas de vidro sobre o poder de luz na ponta. (A) a ponta do tamanho foi plotado contra o poder da luz. O comprimento total da pipeta foi definido como 50 ± 2 mm. O comprimento da haste foi definido para 8 mm. (B) o comprimento da pipeta foi plotado contra o poder da luz. O tamanho da ponta foi definido como 0,25 µm. O comprimento da haste foi definido para 8 mm. (C) este painel mostra o efeito da carga de volume da solução (10mm PBS) sobre o poder da luz. Os dados de 4 pipetas são indicados por linhas e símbolos diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : As respostas de luz-evocada na IC de acordado ratos VGAT-ChR2. (A), a luz de estímulos (caixa azul, 0,03 s) evoca respostas de pico. (B) a luz de estímulos (caixa azul, 0,03 s) suprimiu as respostas de spike evocadas pelo som (caixa cinza). Os superiores 3 traços são a resposta ao som, e os menores 3 traços são a resposta ao som e a luz foram dadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Optogenetics tornou-se uma ferramenta poderosa em neurociência. Ele tem sido utilizado para identificar neurônio específico tipos na vivo , bem como manipular as atividades das vias neuronais específicas. O esclarecimento da actividade neural de diferentes tipos neuronais promove a compreensão do mecanismo dos circuitos neurais. Aqui, temos demonstrado um método para fornecer a luz para o local de gravação através de um eléctrodo de vidro na IC de ratos de VGAT-ChR2 acordados.
Existem vários passos críticos no método descrito. Primeiro, é a exigência de utilizar animais com uma expressão de opsins nos neurônios alvo suficiente e específico. Para identificar as respostas à luz com as gravações extracelulares, é necessário que a ativação do opsin evoca os picos nos neurônios alvo. Em algumas variedades transgênicas, é possível que o nível de expressão do transgene em neurônios é baixo em animais jovens de14, e pode haver uma idade mínima para o experimento. Além disso, pode ser necessário realizar alguns experimentos adicionais para confirmar se as respostas aos estímulos leves são específicas para os tipos de neurônio de destino (por exemplo, imuno-histoquímica). Quando o neurônio alvo é excitatório, seria necessário distinguir as respostas evocadas diretamente das respostas synaptically evocadas, que poderiam ser feitas por limiarização a latência da resposta. Em segundo lugar, é fundamental para garantir que o tecido cerebral é tão limpo quanto possível. Uma manutenção de limpeza é especialmente necessária para evitar qualquer sangramento durante a craniotomia e as gravações. Além disso, a superfície do cérebro deve ser impedida de secagem após a craniotomia, cobrindo a superfície firmemente com adesivo de silicone.
Para fornecer a luz eficientemente desde a ponta do eletrodo, é fundamental para reduzir qualquer perda no caminho óptico. Em nossa configuração da optrode, a energia de luz cai dez vezes através do eléctrodo: o poder da luz é de 45 mW no final do cabo de remendo do fibra óptica, enquanto é 3-5 mW na ponta da pipeta de vidro. Conforme os resultados, o tamanho da ponta e o comprimento total não afetou o poder de luz na ponta (Figura 2). Estes resultados indicaram que a atenuação da luz era bastante estável, independentemente da configuração da pipeta de vidro. Esta atenuação da luz não importou na gravação de neurônios de IC em camundongos VGAT-ChR2 porque confirmamos que era possível gravar luz picos registrados na borda ventral (2 mm de profundidade) do IC, embora pode importar em outras configurações de gravação. Seria difícil reduzir a atenuação da luz dramaticamente, mas pode haver possibilidades de melhoria. Primeiro, pode ser eficaz usar quartzo em vez de um vidro de borosilicato como uma pipeta de eletrodo. É conhecido que o quartzo tem melhor luz condutividade, assim pode reduzir a perda de luz através do eletrodo15. Além disso, foi relatado que o polonês da extremidade da pipeta reduziu a perda de luz na superfície de contato entre a pipeta e cabo de remendo15. Se a melhoria na atenuação da luz não é suficiente, que seria eficaz usar um laser em vez de LED, embora laser custa mais do que levou.
Uma das vantagens do eléctrodo de pipeta de vidro é que é possível realizar procedimentos histológicos adicionando marcadores ou vetores para a solução de enchimento. Os procedimentos histológicos irão adicionar uma grande quantidade de informações úteis (o local da gravação), a morfologia do neurônio gravado, etcpara os dados eletrofisiológicos. Além disso, foi relatado que é possível realizar pesquisas farmacológicas usando o eletrodo de vidro com bloqueadores da solução de enchimento15. Em contraste com estas vantagens, a limitação do eléctrodo de pipeta de vidro é que ele não pode gravar a partir de várias unidades isoladas. Para alcançar várias gravações, é possível colocar um fio tetrode dentro da pipeta de vidro em vez de um único fio de Ag-Cl revestido. Neste caso, seria necessário usar uma pipeta com um tamanho maior de ponta (30 a 60 µm, o tamanho da ponta típico de um tetrode) e deixe o fim do tetrode para fora da ponta da pipeta.
Enquanto optrodes relatado anteriormente exigido muitas vezes complexa fabricação16,17, Marcos e seus colegas desenvolveram um optrode usando pipetas de vidro padrão conforme com o optrode nós projetamos18. Em seu método, inserem uma fina fibra óptica para a pipeta para entregar a luz. Para tornar a fibra fina o suficiente para inserir a haste da pipeta, eles gravado 125 µm fibra de revestimento com um 9 µm núcleo para um diâmetro de 8 – 10 µm na ponta. A vantagem deste método é que isso se aplicaria mesmo para a pipeta curvada que é frequentemente utilizada para iontoforese. No entanto, pode ser difícil de usar LED como uma fonte de luz porque LEDs comerciais padrão não iria conseguir suficiente poder de luz através de uma fibra de núcleo 9 µm.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores foram apoiados pela sociedade de Japão para a promoção da ciência KAKENHI Grant JP16K11200 e 17H 02223 e o subsídio para a pesquisa da universidade médica S2016 de Kanazawa-8 e C2017-3. Yuhichi Kuda Agradecemos seu apoio em tirar as fotos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
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