Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57782
Automatic Translation
1, 1, 1
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

Summary

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

Abstract

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא מצב של מחזור התא קבוע מעצר מופעלת בתגובה לגירויים מזיקים שונים. הפעלה של הזדקנות ביולוגית הסלולר מהווה סימן היכר של תנאים pathophysiological שונים, כולל הגידול דיכוי, רקמות שיפוץ והתיישנות. Inducers של הזדקנות ביולוגית הסלולר ויוו מאופיינים עדיין לקוי. עם זאת, מספר של גירויים יכול לשמש כדי לקדם את הזדקנות ביולוגית הסלולר ex-vivo. ביניהם, הזדקנות ביולוגית-inducers הנפוצים ביותר הם תשישות replicative, מייננת ולא מייננת, genotoxic סמים, סטרס חמצוני, demethylating, acetylating סוכנים. כאן, אנו נספק הוראות מפורטות על איך להשתמש גירוי לזירוז fibroblasts לתוך הזדקנות ביולוגית. פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים עבור סוגים שונים של תאים ראשי שורות תאים, כולל תאים סרטניים. אנו מתארים גם שיטות שונות עבור האימות של הזדקנות ביולוגית אינדוקציה. בפרט, אנו מתמקדים מדידת הפעילות של האנזים lysosomal הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), הקצב לסינתזת DNA באמצעות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) התאגדות assay, רמות הביטוי של מחזור התא p16 מעכבי p21, ואת הביטוי ואת הפרשת חברים פנוטיפ הפרשה Senescence-Associated (SASP). לבסוף, אנו מספקים תוצאות דוגמה, לדון בהמשך יישומים של פרוטוקולים אלה.

Introduction

ב-1961, Hayflick ולמורהד דיווחו כי ראשי fibroblasts בתרבות לאבד את הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מעברים רצופים1. תהליך זה נגרמת על ידי לקיצור רציפים של טלומרים לאחר כל חלוקת התא. כאשר טלומרים מגיעים באורך ביקורתי קצר, הם מזוהים התגובה נזק לדנ א (DDR) שמפעיל מעצר בלתי הפיך של התפשטות — כהגדרתו גם הזדקנות ביולוגית replicative. הזדקנות ביולוגית replicative נחשב כיום לאחד גירויים רבים ידועים כדי לגרום למצב של קבע מחזור מעצר התא שמעבדת תאים חסרי רגישות mitogens וגם אפופטוטיים להיפגע אותות2,3. התוכנית הזדקנות ביולוגית מאופיין בדרך כלל על-ידי תכונות נוספות כולל פעילות lysosomal גבוהה, תפקוד מיטוכונדריאלי, שינויים גרעינית, rearrangements כרומטין, רשתית תוך-פלזמית מתח, נזק לדנ א, הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ (SASP)3,4. תאים senescent יש תפקידים רבים בגוף: פיתוח, פצע ריפוי ו הגידול דיכוי2. באותה מידה, הם ידועים לשחק תפקיד חשוב הזדקנות ו, באופן פרדוקסלי, ב התקדמות הגידול5. לעיתים קרובות מיוחסות השפעות שליליות, סותרים באופן חלקי, הזדקנות ביולוגית SASP6.

. לאחרונה, זה הוצג כי חיסול של תאים senescent מן העכברים מוביל להארכת תוחלת החיים וכדי חיסול של רבים של הזדקנות תכונות7,8,9,10,11, 12. באותה דרך, בסמים מרובים פותחו לחסל גם את תאי senescent (senolytics) או למקד SASP13,14. הפוטנציאל הטיפולי של אנטי אייג'ינג משכה לאחרונה יותר תשומת לב השדה.

חקר מנגנוני משויך הזדקנות ביולוגית הסלולר, ההקרנות עבור התערבויות תרופתי בכבדות להסתמך על דגמי ex-vivo , במיוחד על אנושי fibroblasts העיקרי. אמנם יש כמה תכונות נפוצות מופעל על ידי inducers הזדקנות ביולוגית מגוונים, השתנות גדולה בפנוטיפ הזדקנות ביולוגית היא נצפתה ותלויים בגורמים שונים, כולל תא סוג, גירוי וזמן נקודה3,15, 16,17. זה הכרחי כדי לשקול את הטרוגניות עבור הלומדים והיעדים תאים senescent. לכן, פרוטוקול זה שואפת לספק סדרה של שיטות השתמשו כדי לגרום הזדקנות ביולוגית ב fibroblasts הראשי באמצעות טיפולים שונים. כמו זה תהיה מנומקת, השיטות בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים.

מלבד הזדקנות ביולוגית replicative, נתאר חמישה טיפולים בתדר הזדקנות ביולוגית אחרים: מייננת קרינה, קרינה אולטרה סגולה (UV), דוקסורוביצין, סטרס חמצוני, שינויים epigenetic (כלומר קידום של היסטון acetylation או דנ א demethylation) . גם, קרינה מייננת וגם קרינת UV לגרום נזק לדנ א ישיר ויפעיל, במינון המתאים, הזדקנות ביולוגית18,19. דוקסורוביצין גם גורם הזדקנות ביולוגית בעיקר באמצעות נזק לדנ א מאת intercalating לתוך ה-DNA, שיבוש טופואיזומראז II פונקציה, ובכך עצירת DNA תיקון מנגנונים20. הביטוי של גנים חיוניים עבור הזדקנות ביולוגית נשלטת בדרך כלל על-ידי acetylation היסטון מתילציה DNA. כתוצאה מכך, מעכבי deacetylase היסטון (למשל, butyrate נתרן, סאהה) וסוכני דנ א demethylating (למשל, 5-עזה) לעורר הזדקנות ביולוגית תאים נורמליים אחרת21,22.

בסופו של דבר, ארבעה סמנים הנפוצים ביותר קשורים לתאים senescent תהיה מנומקת: הפעילות של הזדקנות ביולוגית הקשורים-β-galactosidase (SA-β-גל), שיעור לסינתזת DNA על ידי עידו התאגדות assay, ביטוי של הרגולטורים מחזור התא, p16 מעכבי קינאז תלוי-cyclin p21, ואת ביטוי, הפרשת חברי SASP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. כללי הכנה

  1. להכין D10 בינוני. תוספת DMEM בינוני-Glutamax עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוז הסופי: 100 U/mL).
  2. להכין PBS סטרילי. להמיס את הטבליות במים על פי הוראות היצרן. לחטא על ידי תא לחץ.
  3. להכין טריפסין x 1. לדלל 5 מ של טריפסין-Versene EDTA/10 x 10:1 ב- 45 מ של PBS סטרילי.
    הערה: לאורך כל הפרוטוקול, אנו משתמשים תא תרבות תנאים כי הם קרובים יותר פיזיולוגיים תנאים fibroblasts העיקרי. משמעות הדבר היא כי אנחנו דגירה תאים ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 הוא בדרך כלל סגור אבל באמצעות 5% O2 במקום 20% O "רגילה"2-
  4. להתמודד עם כל דוגמאות בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.

2. אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית

  1. הזדקנות ביולוגית replicative
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים, באמצעות שימוש תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts באוכלוסיה נמוכה הכפלה (PD) בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. לצמוח התאים חממה תא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 עד שיגיעו למפגש 70 – 80% (3-4 ימים עבור מתרבים תרבויות משטרת נמוך).
    4. לנתק את התאים באמצעות 3 מ"ל של 1 x טריפסין המקננת ~ 5 – 7 דקות חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2. נטר את התאים באופן קבוע עם מיקרוסקופ התרבות התא כדי לבדוק את תהליך התולש.
    5. כאשר תאים כדורית, לעצור את תגובת טריפסין על-ידי הוספת 9 מיליליטר D10. לא תדגור יותר מ 10 דקות
    6. לסובב את התאים ב x 300 גרם עבור תאים 5 דק יהוו גלולה בתחתית הצינורית, ואילו פסולת וחלקיקים קטנים יישארו ב- תגובת שיקוע.
    7. הסר את תגובת שיקוע, להמיס בגדר תא ב 1 מ"ל של D10 ולבצע ספירת תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית על פי הוראות היצרן או תא נויבאואר עבור ספירה ידנית. כשאנו סופרים, כוללים assay כדי לבדוק את הכדאיות של התאים (למשל, הדרה Trypan Blue23).
    8. לחשב המשטרה מצטבר באמצעות הנוסחה:
      משטרתחדש = 3.32* (LOG(cell number total)-(יומן (מספר תאים נזרע)) + PDold
      הנייד שלי סה כ = כל התאים ספרתי: מת וחי.
      . הנייד שלי נזרע = מספר התאים קיימא נזרע (8 x 105 תאים).
      משטרתבת = האוכלוסייה הכפלת ברגע של זריעה.
      משטרתחדש = האוכלוסייה הכפלת ברגע של סופר (לאחר דגירה).
      הערה: אם 7 x 105 ראשי fibroblasts (PD 35.2) היו נזרע על בקבוקון T-75, לאחר 4 ימים הם להגיע למפגש 80%, מתפצלים שוב, סופר עכשיו 1.3 x 106 תאים הכולל (מת + בחיים).
      משטרתחדש = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35.2
      משטרתחדש = 36.1
    9. Reseed 8 x 105 תאים T75 החדש, חוזר 2.1.2–2.1.8 צעדים.
      הערה: לאחר מספר קטעים רצופים, התרבות תארך זמן רב יותר כדי להגיע confluent עד תאים מפסיקים להתחלק בכלל. פעם תאים מפסיקים להתחלק, בדיקת סמנים הזדקנות ביולוגית ו/או הקציר עבור יישומים במורד הזרם.
    10. קח בחשבון כי לגודל גדול יותר של תאים senescent עלולה לגרום התרבות מופיעים מלא, ובכל זאת יש ספירת התאים נמוך. לפיכך, ניתן להניח הזדקנות ביולוגית כאשר המשטרה יציב, סמנים אחרים הזדקנות ביולוגית מופיעים בתרבות (ראו תקנות 3.1 – 3.5).
      הערה: השתמש מתרבים fibroblasts העיקרי הפקד.
  2. הזדקנות ביולוגית הנוצרות על-ידי קרינה מייננת
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. לחשוף את התאים עד 10 אפור של הקרנה גמא לפי ההוראות של המכונה בשימוש.
    5. האחות המדיום מתאי והחלף 10 מ"ל של D10.
    6. דגירה התאים 10 מ"ל של D10 ב חממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2 רק בעוד 10 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
    7. לאחר עשרה ימים, בודקים סמנים הזדקנות ביולוגית ו/או להשתמש התאים עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: השתמש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו (לפני הקרנה) כפקד.
  3. אולטרה סגול (UV) קרינה-Induced הזדקנות ביולוגית
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 1.5 – 2 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב משטרת נמוך באחד טוב של צלחת. ובכן 6 (1.5-2.0 x4 10 תאים/cm2), להוסיף 2 מיליליטר D10 בינוני.
    3. הכנס את התאים חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 , לאפשר להם לדבוק הפלסטיק לפחות 5 שעות.
    4. . תוריד את המדיום מתאי מקם את הצלחת 6-ובכן באמצע החדר קרינת UV, להוריד את המכסה מפלסטיק. להאיר עם UVB, 20 – 30 mJ/cm2...
    5. להוסיף 2 מיליליטר בינוני לכל טוב.
    6. תקופת דגירה התאים 2 מיליליטר D10 ב חממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 של עוד 7 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
      הערה: לאחר 7 ימים, התאים יכולים להיות נבדק עבור סמני הזדקנות ביולוגית, עבור יישומים במורד הזרם. השתמש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו (לפני הקרנה) כפקד.
  4. דוקסורוביצין-induced הזדקנות ביולוגית
    1. להכין 1,000 x דוקסורוביצין פתרון מניות: להפוך מלאי מיקרומטר 250 של דוקסורוביצין ב- 1 x PBS, מסנן-לעקר את הפתרון ואת aliquot ב µL 500 למחזור סטרילי. חנות המניה דוקסורוביצין ב-80 מעלות צלזיוס.
    2. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    3. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    4. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    5. לדלל 11 µL של 1,000 x דוקסורוביצין פתרון מניות ב 11 מיליליטר D10 כדי ריכוז הסופי של 250 ננומטר.
    6. האחות המדיום מתאי והחלף 10 מ"ל D10 + דוקסורוביצין.
    7. דגירה את התאים עבור בדיוק 24 שעות בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    8. האחות המדיום מתאי ולשטוף היטב פעם עם 10 מ"ל של D10.
    9. דגירה התאים 10 מ"ל של D10 עוד 6 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
    10. יום 7, הבדיקה של הזדקנות ביולוגית סמני ו/או להשתמש עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: כפי שליטה, שימוש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו טיפול 24 שעות עם הרכב (PBS) 1:1,000 ב- D10.
  5. הזדקנות ביולוגית מפגינות חמצוני
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. דגירה התאים לילה בחממה התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. להכין פתרון של ~ 200 μM מימן על-חמצני D10 בינוני על-ידי הוספת 22.6 μL של 30% חמצן ב 11 מיליליטר D10.
      הערה: לייעל את הטיפול עבור סוג התא של עניין על-ידי הפיכת עקומת מנה-תגובה להערכת רעילות.
    5. האחות המדיום מתאי ולהוסיף 10 מ ל שזה עתה הוכנו D10 בינוני + חמצן. תקופת דגירה של 2 h ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2.
    6. האחות המדיום מתאי ולשטוף פעם עם טרי D10 ללא חמצן.
    7. להוסיף 10 מ של D10 ללא חמצן.
    8. תקופת דגירה של 48 ש ח בחודש חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    9. חזור על צעדים 2.5.4–2.5.8 פעמיים יותר עבור סכום כולל של שלושה טיפולים.
    10. בדוק אם סמנים הזדקנות ביולוגית או הקציר עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: כמו לשלוט, שימוש מתרבים תאים של המשטרה באותו שטופלו µL 22.6 סטרילי מים D10 כבר שעתיים.
  6. הזדקנות ביולוגית הנגרמת epigenetically
    1. להכין מלאי פתרונות עבודה molecule(s) קטנות לשימוש על פי טבלה 1. מסנן-לעקר הפתרונות. Aliquot צינורות סטרילי. חנות ב-20 ° C.
    2. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים, למשל, באמצעות שימוש תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    3. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    4. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    5. היכונו mL 11 D10 בינוני + הפתרון עובד הטיפול הרצוי. דילול מדויק לכל טיפול ניתן לראות בטבלה1.
      1. להכין µL 11 של 1 מ מ סאהה הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
      2. להכין µL 44 של 1 מ' נתרן butyrate הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
      3. להכין µL 11 של 10 מ מ 5-עזה הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
        הערה: מטב הטיפולים עבור סוג התא עניין, למשל, ביצוע עיקול מנה-תגובה להערכת רעילות.
    6. להוסיף התרבות D10 בינוני + הפתרון עובד עבור הטיפול הרצוי.
    7. תקופת דגירה של 24 שעות ביממה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    8. חזור על צעדים 2.6.4–2.6.6 פעמיים יותר, עבור סכום כולל של שלושה טיפולים.
    9. תחליף בינוני D10 פשוטה ללא סמים.
    10. לאחר 3 ימים נוספים, תאים להפוך senescent מוכן לבדיקה של הזדקנות ביולוגית סמני ויישומים במורד הזרם.
      הערה: כפי שליטה, שימוש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו מטופל במשך שלושה ימים עם D10 בינוני + רכב. D10 בינוני + הרכב צורך לרענן כל 24 שעות במהלך שלושת הימים האלה. הרכב תלוי הטיפול בשימוש: 1:1,000 דימתיל סולפוקסיד למים סטרילי סאהה ו 5-עזה 1:250 של נתרן Butyrate.

3. סמנים של הזדקנות ביולוגית

  1. הכנה
    1. להכין 20 מ"ג/מ"ל X-גל: לפזר 20 מ"ג X-גל ב 1 מ"ל של dimethylformamide או דימתיל סולפוקסיד. לאחסן ב-20 ° C מוגן מפני אור.
    2. הכנת 0.1 M חומצה ציטרית פתרון: להמיס g 2.1 monohydrate חומצה ציטרית ב- 100 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    3. להכין הפתרון סודיום פוספט 0.2 מ': 2.84 להמיס g של סודיום פוספט dibasic או 3.56 גרם של סודיום פוספט dibasic מייבשים ב- 100 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    4. להכין 0.2 מ' חומצת לימון/סודיום פוספט pH 6.0: להמיס 36.85 מ"ל של פתרון חומצה ציטרית 0.1 M ו- mL 63.15 של 0.2 מ' סודיום פוספט. התאם בדיוק ל pH 6.0. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. להכין ferrocyanide אשלגן 100 מ מ: להמיס 2.1 גרם אשלגן ferrocyanide ב 50 מ ל מים. לאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    6. להכין ferricyanide אשלגן 100 מ מ: להמיס 1.7 g של אשלגן ferricyanide ב 50 מ ל מים. לאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    7. להכין 5 מ' נתרן כלורי: להמיס 14.6 גר' נתרן כלוריד ב 50 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    8. להכין 1 מ' מגנזיום כלוריד: להמיס 4.8 גרם מגנזיום כלוריד ב 50 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    9. להכין 2% פורמלדהיד + 0.2% גלוטראלדהיד ב- PBS: להמיס 800 µL של 25% גלוטראלדהיד, µL 12.5 פורמלין 16% בμl 100 ל- PBS. לאחסן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
    10. להכין פתרון מוכתמים טריים על פי בטבלה 2.
  2. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase מכתים
    1. עבור כל דגימה, זרע תאים4 עונה 1 פרק 10 אחד לפחות טוב של ובכן 24 צלחת (5.2 x3 10 תאים/cm2) המכיל µL 500 של D10 כך התאים הם דלילים. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב.
    2. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    3. רחץ תאים פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    4. תיקון 3-5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות μL 500/טוב של 2% פורמלדהיד + 0.2% גלוטראלדהיד ב- PBS.
    5. רחץ תאים פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    6. להכין טרי מכתימה את הפתרון, על פי מספר דוגמאות כתם.
    7. להוסיף פתרון מכתימים (500 µL טוב), לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות.
      הערה: אידוי עשויה לגרום קריסטלים לטופס, לעכב את התצפית מתחת למיקרוסקופ.
    8. דגירה תאים בחושך (למשל יתעופף) ב- 37 מעלות צלזיוס חממה יבש (ללא CO2) עבור h 12-16.
      הערה: CO2 עלול להשפיע על רמת ה-pH ושנה ולכן התוצאות. סוגי תאים מסוימים עשויים לדרוש זמן דגירה קצרים יותר.
    9. לשטוף פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    10. להעריך את התוצאות. תאים חיוביים להציג כחולה (בעיקר) perinuclear מכתים במיקרוסקופ אור רגיל (איור 1 א').
    11. על כימות, לצפות לפחות מאה תאים עבור דגימה, לספור את מספר התאים חיובי. מאז תאים senescent לשנות צורה, לעתים קרובות קשה להגדיר את גבולות התא, לספור את התאים. Counterstain עם דאפי כדי להקל על ויזואליזציה, כימות של תאים בודדים (איור 1B). לכמת את הדגימות (אחוז של תאים חיוביים לעומת הסכום הכולל של תאים) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1C). צלם תמונות מרובות המדגם אותו כך בסופו של דבר אתה יכול לספור לפחות 100 חד-תאים להעריך את אחוז תאים חיוביים SA-β-גל אותם.
    12. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת שלהם הפקד המתאים לטיפול בשימוש.
      הערה: שיתוף מכתים עם עידו על הדגימה זהה אפשרי. קח בחשבון כי תאים צריך ואז להיות נזרע על coverslips.
  3. עידו התאגדות Assay
    1. הכניסו coverslip/באר צלחת 24-ובכן לפי מספר דוגמאות כדי להעריך.
    2. זרע עונה 1 פרק 104 תאים טוב אחד לפחות של צלחת 24-טוב (5.2 x3 10 תאים/cm2) לכל תנאי שמכילה µL 500 של D10 כך התאים הם דלילים. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב.
    3. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. להפוך את פתרון 20 מיקרומטר של עידו ב- D10 (1:250) על פי מספר דוגמאות לטיפול (250 μL עבור דגימה).
    5. להסיר חצי של המדיום (250 μL) מכל קידוח לטפל ולהחליף אותו עם D10 + עידו פתרון זה רק היה מוכן. ריכוז אדו הסופי הוא 10 מיקרומטר.
    6. דגירה 18 – 24 h בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2. השתמש באותו זמן דגירה שליטה, תאים senescent.
    7. לשטוף 2 x עם μL 500 ל- PBS.
    8. לתקן את התאים עבור 10 דקות עם μL 500 פורמלין 4% ב- PBS.
    9. דגירה 5 דקות ב- 500 μL מ"מ טריס (pH 7.6).
    10. Permeabilize התאים 10 דקות ב- 500 μL של 0.1% X-100 Triton ב- PBS.
    11. רחץ 3 x עם PBS.
    12. היכונו μL 50 של תווית לערבב כל coverslip, הוספת הרכיבים לפי הסדר הבא: µL 44.45 ל- PBS, 0.5 µL של Cu (II) אז4, 0.05 µL של sulfo-Cy3-אזיד, 5 µL של נתרן-ascorbate.
    13. . שים μL 50 של המיקס תווית חתיכה של מצלמות-מיקרוסקופים הרם את coverslip בעזרת זוג מלקחיים, מחט, תן לזה לנוח. מעל התערובת תווית עם משטח המכילות את התאים פונה כלפי מטה. ודא כי ישנם אין בועות ו פני coverslip נוגעת המיקס תווית. תקופת דגירה של 30 דקות בחושך.
    14. להחזיר את התאים הבארות של צלחת 24-ובכן, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
    15. לטעון עם טעינת מדיה (כולל דאפי להמחיש גרעינים) על גבי מדרון זכוכית ולתת להן להתייבש למשך הלילה.
    16. דמיינו את התאגדות EdU באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במסנן המתאים Cy3 (עירור/פליטה: 552/570 ננומטר).
    17. צלם תמונות מרובות של התאים על כימות מאוחר יותר של תאים לפחות 100 לכל תנאי (Cy3 ודאפי).
    18. לכמת את אחוז תאים משולבים EdU באמצעות הנוסחה הבאה:
      תאים חיוביים אדו (%) = (ספירת התאים חיובי אדו (Cy3) / סה כ ספירת התאים (דאפי)) * 100
    19. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת שלהם הפקד המתאים לטיפול בשימוש.
      הערה: שיתוף מכתים עם SA-β-גל על הדגימה זהה אפשרי. קח בחשבון כי תאים צריך עדיין להיות נזרע על coverslips.
  4. ביטוי גנים של p16, p21 SASP
    1. להכין פריימר-סטים של גנים של הריבית (פריימר 50 מיקרומטר).
      הערה: qPCR של p16 p21, כמה גורמים SASP הרלוונטי הוא אינפורמטיבי של מצב הזדקנות ביולוגית. הפרוטוקול המתואר כאן גורם לשימוש של מערכת הספרייה בדיקה יוניברסל (UPL) כימות יחסית באמצעות PCR בזמן אמת. טבלה 3 מציג סקירה של תחל המשמש לצורך זיהוי של CDK מעכבי p16 ו- p21, מחברי SASP הרלוונטי ביותר, כמו גם עבור טובולין ואני אקטין, אשר לשמש גנים התייחסות עבור וזמינותו. העמודה האחרונה בטבלה 3 מגייס את החללית UPL מסוים שישמש עבור כל וזמינותו.
    2. להכין תערובת התגובה qPCR נפרד מבחני הרצוי. תמיד כוללים את הגן התייחסות גם על פי בטבלה 4.
    3. הפעל כל דוגמאות כפול או משולש.
    4. העומס 7.5 µL/טוב של המיקס תגובה qPCR על צלחת 384-. טוב.
    5. להוסיף ~ 5 ng של cDNA מומס µL 2.5 RNase ללא מים.
      הערה: עדיף לאכול כמויות דומות של cDNA עבור כל הדגימות לצורך השוואה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות כמויות שוות של RNA עבור שעתוק לאחור.
    6. מכסה את הצלחת עם כלב ים, אוודא שזה יתבצע כהלכה כיסוי אחיד כל הבארות בצלחת.
    7. לסובב את הצלחת ב x 2,000 g עבור 1 דקות.
    8. הפעל את הצלחת ב Lightcycler 40 מחזורים באמצעות פרוטוקול הבאים:
      95 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות
      40 מחזורי 95 ° C עבור 5 s ו- 60 ° C ל 30 s
      37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה
    9. לניתוח של התוצאות, השתמש בשיטה תעצומ Livak ועמיתיו לנתח נתונים qPCR24. השתמש טובולין או אקטין כמו גנים התייחסות כדי לחשב את ΔCt ערך להשתמש את הפקד המתאים כדי לחשב הערך ΔΔCt לטיפול ספציפי בתדר הזדקנות ביולוגית.
  5. הפרשת IL6 וביטוי חלבונים
    1. זרע 5 – 10 x 10 תאים4 בבאר אחת לפחות של צלחת 6-טוב (5.2 – 10.5 x 103 תאים/cm2) לכל תנאי המכיל 2 מיליליטר D10. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב. . תן לה לעמוד בין לילה לאחר זריעה.
    2. להסיר את המדיום ולהחליף עבור 2 מ של DMEM בינונית ללא FBS. דגירה בתנאים נורמליים עבור 24 שעות.
    3. לאסוף את המדיום בשפופרת 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה המדגם-300 גרם x עבור 5 דק בינוני ניתן לאחסן ב- 80 ° C עד תטופל.
    5. בצע את הוראות היצרן כדי לבצע את אליסה.
    6. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת הפקד המתאים לטיפול ספציפי בתדר הזדקנות ביולוגית

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העשרה של SA-β-גל מכתים ב senescent fibroblasts

Β-galactosidase (β-גל) הוא אנזים lysosomal זה מתבטא כל התאים וזה של ה-pH האופטימלי של25,4.026. עם זאת, במהלך הזדקנות ביולוגית, lysosomes להגביר את גודל ולצבור, כתוצאה מכך, תאי senescent β-גל. הכמויות מוגברת של אנזים זה מאפשרים לזהות את פעילותה אפילו ב- 6.025,pH שיוצרת27. איור 1A מציג תמונות נציג של ההכתמה SA-β-גל ב מתרבים לעומת fibroblasts הראשי senescent. התאים נראים גם מוגדלת, עם גוף התא לא סדיר. כאמור, זה יכול להיות קשה להבחין תאים בודדים, כך מכתים במשותף עם דאפי מקלה על ויזואליזציה ותא לספור (איור 1B). זה הכרחי לצלם תמונות במיקרוסקופ זריחה כדי להיות מסוגל להתבונן ההכתמה דאפי. פירוש הדבר כי תמונות בערוץ שדה בהיר יילקחו בשחור/לבן, כך ההכתמה "כחול" של SA-β-גל מופיע שחור על התמונות. ראוי לציין, לא כל התאים בתוך מדגם הם חיוביים עבור β-גל. היעילות של הזדקנות ביולוגית אינדוקציה תלויה מאוד גירוי - ותא הסוג/המתח בשימוש. הפרוטוקולים המתוארים כאן הניב > 50% חיובי β-גל בתאים fibroblasts הראשי (BJ ו WI-38) בידיים שלנו.

תאים פחות לשלב אדו לאחר אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית

עידו הוא אנלוגי של תימידין nucleoside זה, במהלך לסינתזת DNA פעילה, ישולבו לתוך ה DNA28. שילוב של עידו לתוך ה-DNA, ניתן לאבחן לאחר ביצוע cycloaddition Copper-Catalyzed אזיד-אלקין (CuAAC) אדו, תגובה שאינה ניתנת לביצוע של תימידין רגילים כיוון שיחסר בו קבוצה של אלקין28. ב פרוטוקול מסוים זה, Sulfo-Cy3-אזיד נמצא בשימוש. אם זיווג אזיד אלקין התרחש, תאים יציג פלורסצנטיות תחת מסנן Cy3 (איור 2 א). חשוב לקחת בחשבון כי על-ידי ביצוע וזמינותו התאגדות אדו, התאים הם מתרבים ניתן להבדיל בין תאים שאינם מתרבים. התאים שאינם מתרבים יכול להיות או השבתה הדרגתית או senescent, כלומר וזמינותו התאגדות אדו לא יכול להפלות בין שני סוגים אלה של מחזור התא מעצר.

Fibroblasts senescent upregulate CDK מעכבי p16 ו- p21

תאים senescent להפוך להשתמש של מעכבי של CDKs כדי לעצור את מחזור התא29. במיוחד p16 ו p21 נמדדת לעתים קרובות כסמנים של תאים senescent3. סמני באחד או בשני הם בדרך כלל upregulated בתאים senescent, קולטנים upregulation נמדדת לעתים קרובות באותה רמת גנים ברמת השעתוק. זה מומלץ להשתמש בו זמנית שני הסמנים מאז כמה תאים לעשות לא upregulate p16 ברמת תעתיק p21 היא סמן הזדקנות ביולוגית15,17,30אוניברסלי אבל לא ספציפי. איור 3 מראה נציג quantifications היחסית של p16, mRNA p21 ב fibroblasts המושרה על הזדקנות ביולוגית. טכניקות אחרות כגון immunostaining ו/או סופג המערבי כדי לזהות רמות החלבון הינן גם אפשריות.

Senescent Fibroblasts להציג SASP

תאים senescent ביותר transcriptionally upregulate מספר גנים קידוד עבור מופרש חלבונים, תופעה הנקראת SASP6. מטריצה חוץ-תאית (ECM) השפלה, למשל, MMPs, אך היא הטרוגנית מאוד SASP כוללת גורמים מעורבים דלקת, למשל, אפופטוזיס, נוגדנים. אינדוקציה של גורמים SASP ניתן להעריך על ידי מדידת רמות הביטוי mRNA דרך qPCR או רמות של חלבון המופרש ויה Enzyme-Linked חיסונית Sorbent Assay (אליסה). איור 4 מציג תמונת הנציגה מציג קולטנים את upregulation של IL6 ברמות גנים ברמת השעתוק והתרגום המופרש. השתמשנו IL6 רק כייצוג; עם זאת, זה מומלץ למדוד את מספר חברי SASP מהרשימה המוצע על פרוטוקול 3.4.

Figure 1
איור 1: העשרה של SA-β-גל מכתים ב fibroblasts הראשי senescent. BJ העורלה העיקרי fibroblasts (PD 34.1) היו שנגזרות כדי הזדקנות ביולוגית לחשוף אותם לקרינה מייננת (10 Gy). התאים היו מוכתם SA-βgal עשרה ימים לאחר הקרנה. (א) נציג תוצאות ההכתמה SA-βgal ב BJ fibroblasts הראשי לא מטופל (למעלה) או חשיפה לקרינה מייננת (למטה). ההגדלה הסופי: 100 X. (B) דמות ייצוגית של SA-β-גל במשותף צבעונית עם דאפי עבור BJ fibroblasts הראשי גם ללא טיפול (שלושה השמאלי פאנלים) או חשיפה לקרינה מייננת (שלושת לוחות נכון). דאפי מכתים (כחול) מסייעת להמחיש תאים בודדים הקלת כימות. תמונות שצולמו בשדה בהיר מופיעים בשחור/לבן. לכן, בתמונות האלה מסוים SA-β-gal מכתים ייראה כמו כתמים שחורים perinuclear. ההגדלה הסופי: 100 X. (ג) כימות של SA-β-גל חיובי תאים מתרבים (Prol., לבן) BJ fibroblasts לעומת מייננת עמיתיהם שטופלו מוקרן (משנת, כחול). כימות בוצעה באמצעות משכפל ביולוגי שלושה עם קווי שגיאה מציג שגיאת התקן של הממוצע. מובהקות סטטיסטית נקבע על ידי מבחן t אינטראקצית דו-זנבית של סטודנט על ערכי דלתא-CT. (n = 3, ± SEM, * * * = p value < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: פחות תאים לשלב אדו לאחר אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית. (א) תמונה ייצוגית של וזמינותו התאגדות אדו WI-38 מתרבים fibroblasts 43.86 PD (משמאל) ואת עמיתיהם לקרינה ionizing (מימין). ההגדלה הסופי: 100 X. (B) כימות של עידו חיובי תאים מתרבים (Prol., לבן) BJ fibroblasts (PD 38.7) לעומת עמיתיהם לקרינה (משנת, כחול). כימות בוצעה באמצעות משכפל ביולוגי שלושה עם קווי שגיאה מציג שגיאת התקן של הממוצע. מובהקות סטטיסטית נקבע ע י מבחן t אינטראקצית דו-זנבית של סטודנט על ערכי דלתא-CT (n = 3, ± SEM, * * * = p value < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: Senescent fibroblasts upregulate CDK מעכבי p16 ו- p21. (א) כימות p16 mRNA ביטוי מתרבים (Prol., לבן, PD 35.3) או 5-עזה-מטופלים BJ תאים (משנת, כחול). (B) כימות של mRNA p21 ביטוי מתרבים (Prol., לבן, PD 35.3) או 5-עזה-מטופלים BJ תאים (משנת, כחול). כימות בוצעה באמצעות שלושה משכפל ביולוגי (כל אחד עם שני טכני משכפל) עם קווי שגיאה מציג שגיאת התקן של הממוצע. מובהקות סטטיסטית נקבע ע י מבחן t אינטראקצית דו-זנבית של סטודנט על ערכי דלתא-CT (n = 3, ± SEM, * * * = p הערך < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Senescent fibroblasts להציג את הפרשה פנוטיפ (SASP). (א) כימות של IL6 mRNA ביטוי BJ fibroblasts גם מתרבים (Prol., לבן, PD 38.7) או המושרה על הזדקנות ביולוגית על ידי קרינה מייננת (משנת, כחול). (B) כימות IL6 ביטוי חלבון מתרבים 38.6 PD (Prol.., לבן) או קרינה מייננת שטופלו WI38 fibroblasts (משנת, כחול). כימות בוצעה באמצעות משכפל ביולוגי שלושה עם קווי שגיאה מציג שגיאת התקן של הממוצע. במקרה של הנתונים qPCR, כל שכפול הביולוגי היו שני כפילויות טכני. מובהקות סטטיסטית נקבע ע י מבחן t אינטראקצית דו-זנבית של סטודנט על ערכי דלתא-CT (n = 3, ± SEM, * * * =p value < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Diluent פתרון מניות הפתרון עובד דילול לטיפול ריכוז סופי
סאהה דימתיל סולפוקסיד 100 מ מ 1 מ מ 1:1,000 1 מיקרומטר
נתרן butyrate במים סטריליים --- 1 מ' 1:250 4 מ מ
5-עזה-2'-deoxycytidine (5-עזה) דימתיל סולפוקסיד 100 מ מ 10 מ מ 1:1,000 10 מיקרומטר

טבלה 1: מניות ופתרונות עובד עבור הטיפולים שונים שימשו Epigenetically-induced הזדקנות ביולוגית.

רכיב נפח ריכוז סופי
20 מ"ג/מ"ל X-גל 1 מ"ל 1 מ"ג/מ"ל
0.2 מ' חומצת לימון/סודיום פוספט מאגר ph 6.0 4 מ"ל 40 מ מ
ferrocyanide אשלגן 100 מ מ 1 מ"ל 5 מ מ
ferricyanide אשלגן 100 מ מ 1 מ"ל 5 מ מ
5 מ' נתרן כלוריד 0.6 מ"ל 150 מ מ
1 מ' מגנזיום כלוריד 0.04 מ 2 מ מ
מים 12.4 mL -
סה 20 מ

טבלה 2: ההרכב של הפתרון מכתים להשתמש עבור הזדקנות ביולוגית הקשורים (SA) - β - גל מכתים.

היעד קדימה פריימר (5' -> 3') הפוך פריימר (5' -> 3') בדיקה UPL
טובולין CTTCGTCTCCGCCATCAG CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC #40
אקטין B ccaaccgcgagaagatga ccagaggcgtacagggatag #64
P16 GAGCAGCATGGAGCCTTC CGTAACTATTCGGTGCGTTG #67
P21 tcactgtcttgtacccttgtgc ggcgtttggagtggtagaaa #32
IL6 CAGGAGCCCAGCTATGAACT GAAGGCAGCAGGCAACAC #45
IL8 GAGCACTCCATAAGGCACAAA ATGGTTCCTTCCGGTGGT #72
IL1a GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA TGCTGACCTAGGCTTGATGA #6
CXCL1 CATCGAAAAGATGCTGAACAGT ATAAGGGCAGGGCCTCCT #83
CXCL10 GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA #34
CCL2 AGTCTCTGCCGCCCTTCT GTGACTGGGGCATTGATTG #40
CCL20 GCTGCTTTGATGTCAGTGCT GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG #39
PAI1 AAGGCACCTCTGAGAACTTCA CCCAGGACTAGGCAGGTG #19
MMP1 GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA TTTGTGCGCATGTAGAATCTG #7
MMP3 CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT CATCTTTTGGCAAATCTGGTG #72
MMP9 GAACCAATCTCACCGACAGG GCCACCCGAGTGTAACCATA #53

טבלה 3: פריימר רצפים, בדיקה UPL המקביל שלהם לגילוי mRNA של הזדקנות ביולוגית סמני בדגימות ממקור אנושי.

רכיב נפח/מדגם
מיקס Sensifast בדיקה Lo-רוקס 5 ΜL
פריימר-set (50 מיקרומטר) 0.1 ΜL
בדיקה UPL 0.1 ΜL
נוקלאז ללא מים 2.3 ΜL
cDNA (~ 4 ng) 2.5 ΜL
סה 7.5 ΜL

טבלה 4: הרכב של התגובה qPCR מערבבים עבור מערכת UPL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המוסברת אופטימציה להצגה fibroblasts העיקרי אנושית, במיוחד BJ ותאי WI-38. הפרוטוקולים עבור הזדקנות ביולוגית replicative, קרינה מייננת, דוקסורוביצין, הוחלו בהצלחה על סוגים אחרים של fibroblasts (HCA2 ו- IMR90), סוגי תאים אחרים (כלומר neonatal מלנוציטים ו keratinocytes או cardiomyocytes נגזר iPSC) במעבדה שלנו. עם זאת, ניתן למטב עיבודים סוגי תאים נוספים על-ידי התאמת כמה פרטים כגון מספר תאים הזריעה, שיטות כימיקלים כדי לסייע תאים עבור חיבור/ניתוק כדי תומך פלסטיק, את המינון של הטיפול כדי למנוע רעילות.

אפילו את השימוש העיקרי fibroblasts מהווה מספר אתגרים. תאים senescent הם בדרך כלל יותר קשה לנתק מאשר מקביליהם proliferating, והם לעתים קרובות יותר רגישה כדי trypsinization או כל סוג אחר של השיטה, כלומר הכדאיות לאחר ניתוק הוא נמוך במקצת מזו של ניתוק תאים מתרבים. הבחירה של הפקד המתאים על השיטות השונות בתדר הזדקנות ביולוגית היא קשה. למשל, עבור הטיפולים מבוססי סמים כמו דוקסורוביצין, אנו מציעים טיפול קצר עם הרכב: PBS במשך 24 שעות ביממה במקרה של דגימות הבקרה עבור תאים שטופלו דוקסורוביצין ואחריו מיידית קציר/עיבוד. ניתן לטעון כי תאים המושרה על הזדקנות ביולוגית לעבור תקופה ממושכת תרבות לאחר הטיפול הוחל (שישה ימים נוספים של תרבות עבור תאים שטופלו דוקסורוביצין), כי תאים שליטה להיות בתרבית באותה כמות הזמן לאחר הסרה של PBS. עם זאת, תרבות כזה ארוך תאפשר את התאים לחלק נוסף, להפוך confluent יתר או לדרוש עוד יותר passaging, כדי להגדיל את PD. הנהרות יתר עלולה לגרום הזדקנות ביולוגית סמנים, כגון SA-β-גל להופיע למרות תאי שמירה על שלהם מתרבים פוטנציאליים31. המשטרה מוגברת להשיג אותם קרוב יותר ממגבלת שכפול (וכדי הזדקנות ביולוגית replicative) ולגרום להם פחות להשוות המקבילים שטופלו דוקסורוביצין. מצב דומה לבקש משאר הטיפולים. הצענו את הפקדים שלדעתנו מתאים יותר עבור כל מקרה.

רוב טכניקות השתמשו כדי ליצור תאים לתוך הזדקנות ביולוגית נראה יחסית קל, ישר קדימה, אבל גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה של הניסויים. למשל, ריכוז גלוקוז נורמלי של תא קונבנציונאלי תרבות המדיה עבור fibroblasts הוא 4.5 גר'/ל' עם זאת, עבור סוגי תאים מסוימים כגון תאי גזע, ריכוז נמוך יותר של גלוקוז להאריך שלהם proliferative פוטנציאל32, בעוד אחרים ריכוז גבוה עלול לגרום הזדקנות מוקדמת ביולוגית33. יתר על כן, תאים senescent הם מאוד מטבולית, לבזבז כמויות גבוהות של אנרגיה כדי לייצר גורמים המופרש34, עשוי להיות מושפע פנוטיפים אחרים הקשורים הזדקנות ביולוגית על-ידי תנודות בריכוז הגלוקוז.

עוד פוטנציאל משתנה במדיום התרבות התא הוא סרום. ההרכב של הסרום בדרך כלל אינו מוגדר ותנועת משתנה על פי מקור החיות, האצווה. במיוחד, הסכום של גורמי גדילה וחלבונים הפרו דלקתיים יכולים להשפיע על הזדקנות ביולוגית35. אנו ממליצים כי מאותה אצווה של נסיוב משמש עבור הניסוי כולו כדי להימנע השתנות מבלבלים ומיותר. ובכל זאת, כמה תנאים טכניים נמנע בהן: בינונית ללא סרום משמש כמה פרוטוקולים מבוססי אליסה יכול להפחית את הביטוי SASP.

מתח החמצן חשוב אינדוקציה הזדקנות ביולוגית מלאה. היפוקסיה יכול לעכב geroconversion, כך התאים לא להתרבות, אך אינם בלתי הפיך נעצרו36. עם זאת, הבעיה הנפוצה ביותר בכיוונון ניסיוני אינו היפוקסיה אלא מעידות. אכן, תנאים תרבות רגיל להשתמש לעתים קרובות 20% חמצן כמו "normoxia", אך בתנאים פיזיולוגיים עבור רוב סוגי תאים נמוכים. עכבר blastocysts להציג סמנים של הזדקנות ביולוגית (SA-βgal ו- DNA נזק) כאשר תרבותי ב 20% חמצן, בניגוד שלהם ויוו-נגזר עמיתיהם או לאותם תאים תרבותי ב 5% חמצן37. יתר על כן, העכבר fibroblasts תרבותי-בתנאים פיזיולוגיים נוספים (3% חמצן) ולא על אלה (20% חמצן) צג רגיל של SASP38. כאן השתמשנו 5% חמצן בכל התרבויות, ניסויים, ואנו מפצירים חוקרים לשקול מחדש את ריכוז חמצן המשמש עבור הסוג לתא מסוים ריבית.

בסופו של דבר, גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא הטרוגניות מהותי של תאים senescent. מצד אחד, לסוגי תאים שונים וללחצים תא אפילו להציג הבדלים פנוטיפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. למשל, זנים מסוימים של fibroblasts לעשות לא upregulate p16 ברמת תעתיק על הזדקנות ביולוגית אינדוקציה15,16,17, כמו גם באיור איור 3A, שם למרות לראות קולטנים של upregulation של p16, זה לא היה משמעותי סטטיסטית. P16 נשלטת גם ברמת translational ו post-translational, כדי למדוד את רמות החלבון עשוי במקרים מסוימים להפגין פעילות מוגברת של מעכב CDK הזה. עם זאת, ייתכן כי כמה תאים פשוט לסמוך על אחרים מעכבי CDK כמו p21. מומלץ למדוד את רמות תעתיק של שניהם. ההרכב המדויק של SASP תלויה גם התא שמייצר אותו3. יתר על כן, כמה תאים צורונים מבטאים את רמות גבוהות של β-galactosidase, נותן תוצאה חיובית SA-β-גל מכתים כי אינה מעידה בהכרח על הזדקנות ביולוגית3. במקרים מסוימים, בעיה זו ניתן יהיה להתגבר על ידי הפחתת זמן הדגירה עם פתרון מכתימים במהלך פרוטוקול מכתימים SA-β-גל. כאמור, תאים confluent יתר עלול גם כתם עם SA-β-gal בלעדיהם להיות senescent31, אז אנו מפצירים חוקרים התרבות תאים בדלילות לביצוע הזה מכתים. מצד שני, פנוטיפ הזדקנות ביולוגית עצמה אינה יציבה39. ההרכב של SASP המראה של סמנים אחרים של הזדקנות ביולוגית תלויי-זמן17,40בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כאן, אנחנו הראו נקודות זמן לאחר כל טיפול שבו תאים נחשב באופן מלא senescent, זה נעשה שימוש באופן שגרתי במעבדה שלנו. חשוב לציין, מדידת סמנים בנקודת זמן קצר עלול להפוך תוצאות שליליות עקב הזדקנות ביולוגית לא שלם40. יתר על כן, מאז ברוב הטיפולים אחוז של תאים לא יהפכו senescent, באמצעות נקודת זמן ארוך ייתן מספיק זמן עבור התאים הלא-senescent כמה להרחיב, לעקוף את התרבות, הפחתת הביטוי של סמנים senescent. בתצוגות של הטרוגניות של תאים senescent, את אזהרות מרובות סמנים שונים, אנו מעודדים מאוד לחוקרים להשתמש מספר סמני הזדקנות ביולוגית בתוך באותה דגימת זרע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

N/A

Acknowledgments

אנו מודים חברי המעבדה Demaria דיונים פוריים, ואת Thijmen van Vliet לשיתוף נתונים, פרוטוקול על הזדקנות ביולוגית UV-induced.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Media - GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 136 הזדקנות ביולוגית הסלולר הזדקנות סרטן גידול דיכוי רקמות תיקון הפרשת ביטוי גנים genotoxic מתח כימותרפיה הקרנה אפיגנטיקה
אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez-Segura, A., Brandenburg,… More

Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter