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Developmental Biology

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण और मांयता

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57782
Automatic Translation
1, 1, 1
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

Summary

यहां, हम प्रेरण और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में सेलुलर वार्धक्य के सत्यापन के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला पर चर्चा । हम विभिंन वार्धक्य उत्प्रेरण उत्तेजनाओं पर ध्यान केंद्रित करने और आम वार्धक्य के ठहराव-जुड़े मार्करों का वर्णन । हम एक मॉडल के रूप में fibroblasts का उपयोग तकनीकी विवरण प्रदान करते हैं, लेकिन प्रोटोकॉल विभिंन सेलुलर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

सेलुलर वार्धक्य स्थायी सेल चक्र विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय गिरफ्तारी के एक राज्य है । सेलुलर वार्धक्य के सक्रियकरण ट्यूमर दमन सहित विभिंन pathophysiological स्थितियों की एक बानगी है, ऊतक remodeling और उंर बढ़ने । vivo में सेलुलर वार्धक्य की उत्प्रेरणा अभी भी खराब विशेषता है । हालांकि, सेलुलर वार्धक्य ex vivoको बढ़ावा देने के लिए कई उत्तेजनाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । उनमें से, सबसे आम वार्धक्य-उत्प्रेरण प्रतिकृति थकावट, और गैर-विकिरण, genotoxic दवाओं, ऑक्सीडेटिव तनाव, और demethylating और acetylating एजेंटों हैं । यहां, हम कैसे इन उत्तेजनाओं का उपयोग करने के लिए वार्धक्य में fibroblasts प्रेरित पर विस्तृत निर्देश प्रदान करेगा । इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन प्रकार के प्राथमिक कोशिकाओं और कोशिका लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कैंसर की कोशिकाओं सहित । हम भी वार्धक्य प्रेरण के सत्यापन के लिए विभिंन तरीकों का वर्णन । विशेष रूप से, हम lysosomal एंजाइम वार्धक्य-जुड़े β-galactosidase (SA-β-gal) की गतिविधि को मापने पर ध्यान केंद्रित, डीएनए संश्लेषण की दर का उपयोग कर 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) निगमन परख, कोशिका चक्र की अभिव्यक्ति के स्तर अवरोधकों p16 और p21, और वार्धक्य-संबद्ध स्रावी Phenotype (SASP) के सदस्यों की अभिव्यक्ति और स्राव । अंत में, हम उदाहरण के परिणाम प्रदान करते है और इन प्रोटोकॉल के आगे अनुप्रयोगों पर चर्चा ।

Introduction

१९६१ में, Hayflick और मूरहेड ने बताया कि संस्कृति में प्राथमिक fibroblasts सफलता मार्ग1के बाद अपने प्रफलन क्षमता खो देते हैं । यह प्रक्रिया क्रमिक छोटा telomeres के प्रत्येक कक्ष विभाजन के बाद के कारण होता है । जब telomeres एक गंभीर रूप से कम लंबाई तक पहुंचने, वे डीएनए-क्षति प्रतिक्रिया (DDR) है कि प्रसार की एक अपरिवर्तनीय गिरफ्तारी-भी नकल वार्धक्य के रूप में परिभाषित सक्रिय द्वारा मांयता प्राप्त हैं । प्रतिकृति वार्धक्य वर्तमान में कई उत्तेजनाओं है कि स्थाई कोशिका चक्र की गिरफ्तारी के एक राज्य है कि renders कोशिकाओं दोनों mitogens को असंवेदनशील और अपोप्तोटिक संकेतों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है में से एक है2,3। वार्धक्य कार्यक्रम सामान्य रूप से उच्च lysosomal गतिविधि, mitochondrial रोग, परमाणु परिवर्तन, क्रोमेटिन पुनर्व्यवस्थाओं, endoplasmic जालिका तनाव, डीएनए क्षति और एक वार्धक्य-जुड़े सहित अतिरिक्त सुविधाओं की विशेषता है स्रावी phenotype (SASP)3,4. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के शरीर में कई कार्य किया है: विकास, घाव भरने और ट्यूमर दमन2। समान रूप से, वे उंर बढ़ने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है और, विडंबना, ट्यूमर प्रगति5में । नकारात्मक, और आंशिक रूप से विरोधाभासी, वार्धक्य के प्रभाव अक्सर SASP6के लिए जिंमेदार ठहराया है ।

हाल ही में, यह दिखाया गया है कि चूहों से वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के उंमूलन आयु विस्तार की ओर जाता है और उंर बढ़नेसुविधाओं के कई उंमूलन7,8,9,10,11, 12. उसी तरह, कई दवाओं या तो वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं को खत्म करने के लिए विकसित किया गया है (senolytics) या SASP13,14को लक्षित करने के लिए. विरोधी उंर बढ़ने चिकित्सीय क्षमता हाल ही में क्षेत्र के लिए और अधिक ध्यान आकर्षित किया है ।

सेलुलर वार्धक्य से जुड़े तंत्र का अध्ययन और औषधीय उपायों के लिए प्रदर्शन भारी विशेष रूप से मानव प्राथमिक fibroblasts पर पूर्व vivo मॉडल, पर भरोसा करते हैं । जबकि वहाँ कुछ आम सुविधाओं विविध वार्धक्य उत्प्रेरण द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, वार्धक्य phenotype में एक बड़ी परिवर्तनशीलता मनाया जाता है और सेल प्रकार, उत्तेजना और समय बिंदु3,15सहित विभिन्न कारकों पर निर्भर है, 16,17. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के अध्ययन और लक्ष्यीकरण के लिए विविधता पर विचार करना अनिवार्य है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन उपचार का उपयोग करके प्राथमिक fibroblasts में वार्धक्य प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक श्रृंखला प्रदान करना है । के रूप में यह समझाया जाएगा, तरीकों को आसानी से अंय प्रकार के सेल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

इसके अलावा नकल वार्धक्य से, हम पांच अंय वार्धक्य उत्प्रेरण उपचार का वर्णन: विकिरण, पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, डॉक्सोरूबिसिन, ऑक्सीडेटिव तनाव और epigenetic परिवर्तन (अर्थात् हिस्टोन acetylation या डीएनए के लिए पदोंनति) . दोनों, विकिरण और यूवी-विकिरण प्रत्यक्ष डीएनए क्षति का कारण है और, उचित खुराक पर, ट्रिगर वार्धक्य18,19. डॉक्सोरूबिसिन भी मुख्य रूप से डीएनए में intercalating द्वारा डीएनए क्षति के माध्यम से वार्धक्य का कारण बनता है और चतुर्थ तोपोइसोमेरसे द्वितीय समारोह में खलल न डालें और इस तरह डीएनए की मरंमत20तंत्र को रोकने । वार्धक्य के लिए आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति सामान्य रूप से हिस्टोन acetylation और डीएनए मिथाइल द्वारा नियंत्रित किया जाता है । एक परिणाम के रूप में, हिस्टोन deacetylase अवरोधकों (जैसे, सोडियम butyrate और साहा) और डीएनए demethylating (जैसे, 5-aza) एजेंटों ट्रिगर अंयथा सामान्य कोशिकाओं21,22में वार्धक्य ।

अंत में, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं से जुड़े सबसे आम मार्करों के चार समझाया जाएगा: वार्धक्य की गतिविधि-β-galactosidase (SA-β-gal), EdU निगमन परख द्वारा डीएनए संश्लेषण की दर, सेल चक्र नियामकों की अधिकता का इजहार और cyclin-आश्रित कळेनासे अवरोधकों p16 और p21, और SASP के सदस्यों के लिए और अधिक से अधिक व्यक्त और स्राव ।

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Protocol

1. सामान्य तैयारी

  1. D10 माध्यम तैयार करें । अनुपूरक DMEM मध्यम-Glutamax के साथ 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin (अंतिम एकाग्रता: १०० यू/एमएल) ।
  2. बाँझ पंजाबियों तैयार करें । निर्माता के निर्देशों के अनुसार पानी में गोलियाँ भंग. आटोक्लेव द्वारा निष्फल ।
  3. 1x trypsin तैयार करें । पतला Trypsin के 5 मिलीलीटर-Versene EDTA/४५ मिलीलीटर में बाँझ पंजाब के 1:10/
    नोट: प्रोटोकॉल के दौरान, हम उन सेल कल्चर स्थितियों का उपयोग करते हैं जो प्राथमिक fibroblasts के लिए शारीरिक स्थितियों के करीब हैं. इसका मतलब यह है कि हम ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर कोशिकाओं की मशीन के रूप में आम तौर पर किया है, लेकिन 5% हे2 का उपयोग कर के बजाय "मानक" 20% हे2 ।
  4. एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके बाँझ शर्तों में सभी नमूनों को संभाल । 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।

2. वार्धक्य की प्रेरण

  1. नकल वार्धक्य
    1. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि) बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं, एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके. 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    2. बीज 7 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक कम जनसंख्या में दोहरीकरण (पीडी) एक T75 कुप्पी में (~ ९.३ x 103 कोशिकाओं/सेमी2) D10 के 10 मिलीलीटर युक्त.
    3. ३७ ° c पर एक सेल मशीन में कोशिकाओं के बढ़ने के साथ 5% सह2 और 5% हे2 जब तक वे पहुंच 70-80% संगम (proliferating संस्कृतियों के लिए 3-4 दिन एक कम पीडी में) ।
    4. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में ~ 5-7 मिनट के लिए, 1x trypsin के 3 मिलीलीटर का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग करें । अलग प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप के साथ नियमित रूप से कोशिकाओं की निगरानी.
    5. कोशिकाओं गोलाकार होते हैं, D10 के 9 मिलीलीटर जोड़कर trypsin प्रतिक्रिया बंद करो । 10 मिनट से अधिक समय तक नहीं मशीन ।
    6. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कक्षों को स्पिन करें । कक्षों में ट्यूब के नीचे एक गोली बनेगी, जबकि मलबा और छोटे कण supernatant में रहेंगे ।
    7. supernatant निकालें और D10 के 1 मिलीलीटर में सेल गोली को भंग करने और एक सेल गणना निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर या मैनुअल गिनती के लिए एक Neubauer चैंबर प्रदर्शन करते हैं । जबकि गिनती, एक परख के लिए कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच शामिलहै (जैसे, Trypan नीले अपवर्जन23) ।
    8. इस सूत्र का उपयोग करके संचयी पीडी परिकलित करें:
      पीडीनया =-() (कक्ष संख्या कुल)-(लॉग (सेल संख्या बीज)) + PDold
      कक्ष संख्या कुल = गिना सभी कोशिकाओं: मृत और जीवित ।
      कक्ष संख्या वरीयता प्राप्त = व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या वरीयता प्राप्त (8x105 कोशिकाओं) ।
      पीडीओल्ड = सीडिंग के समय जनसंख्या दोहरीकरण ।
      पीडीनई = गिनती के क्षण में जनसंख्या दोहरीकरण (गर्मी के बाद) ।
      नोट: यदि 7 x 105 प्राथमिक fibroblasts (पीडी ३५.२) एक टी-७५ कुप्पी पर वरीयता प्राप्त थे और, 4 दिनों के बाद वे ८०% संगम तक पहुँचने और फिर से विभाजित कर रहे हैं, अब गिनती १.३ x 106 कुल कोशिकाओं (मृत + जिंदा).
      पीडीनया = () (1300000 कोशिकाओं)-लॉग (700000)) + 35.2
      पीडीनई = ३६.१
    9. बीज एक नई T75 में 8 x 105 कोशिकाओं, दोहरा कदम 2.1.2 – 2.1.8 ।
      नोट: कई लगातार मार्ग के बाद, संस्कृति अब लेने के लिए जब तक कोशिकाओं को सब पर विभाजित बंद धाराप्रवाह मिल जाएगा । एक बार कोशिकाओं विभाजन बंद करो, वार्धक्य मार्करों के लिए परीक्षण और बहाव अनुप्रयोगों के लिए/
    10. विचार है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के बड़े आकार संस्कृति पूर्ण प्रकट करने के लिए कारण हो सकता है और अभी तक एक कम सेल गिनती है । इस प्रकार, पीडी स्थिर है और अन्य वार्धक्य मार्करों संस्कृति में दिखाई देते हैं जब वार्धक्य ग्रहण किया जा सकता है (देखें प्रोटोकॉल 3.1 – 3.5).
      नोट: proliferating प्राथमिक fibroblasts नियंत्रण के रूप में उपयोग करें ।
  2. विकिरण प्रेरित वार्धक्य
    1. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि), एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं । 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    2. बीज 7 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक T75 कुप्पी में एक कम पीडी में (~ ९.३ एक्स 103 कोशिकाओं/सेमी2) युक्त D10 के 10 मिलीलीटर.
    3. 5% सह2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में रात भर कोशिकाओं को मशीन ।
    4. उपयोग में मशीन के निर्देशों के अनुसार गामा विकिरण के 10 ग्रे करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब ।
    5. कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण और D10 के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
    6. एक सेल संस्कृति मशीन में D10 के 10 मिलीलीटर में ३७ ° c 5% CO2 और 5% O2 के साथ एक और 10 दिनों के लिए नियमित रूप से, लगभग हर 3 दिन की जगह के लिए कोशिकाओं में मशीन ।
    7. 10 दिनों के बाद, वार्धक्य मार्करों के लिए परीक्षण और/या बहाव अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें ।
      नोट: नियंत्रण के रूप में (विकिरण से पहले) एक ही पीडी के proliferating प्राथमिक fibroblasts का उपयोग करें ।
  3. पराबैंगनी (यूवी) विकिरण प्रेरित वार्धक्य
    1. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि), एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं । 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    2. बीज 1.5 – 2 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक में एक कम पीडी में एक अच्छी तरह से प्लेट (1.5-2.0 x 104 कोशिकाओं/सेमी2), D10 मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर 5% CO2 और 5% O2 के साथ कोशिकाओं प्लेस और उंहें कम से कम 5 ज के लिए प्लास्टिक का पालन करने की अनुमति ।
    4. कोशिकाओं से मध्यम निकाल लें । यूवी विकिरण चैंबर के बीच में 6 अच्छी तरह से थाली प्लेस और प्लास्टिक के ढक्कन से दूर ले । UVB के साथ विकीर्ण, 20 – 30 माइकल/
    5. अच्छी तरह से प्रति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. एक सेल संस्कृति मशीन में D10 के 2 मिलीलीटर में ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन 5% CO2 और 5% O2 के साथ एक और 7 दिनों के लिए नियमित रूप से, लगभग हर 3 दिन की जगह ।
      नोट: 7 दिनों के बाद, कोशिकाओं वार्धक्य मार्करों के लिए परीक्षण किया जा सकता है और बहाव अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया । नियंत्रण के रूप में एक ही पीडी (विकिरण से पहले) के proliferating प्राथमिक fibroblasts का प्रयोग करें ।
  4. डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित वार्धक्य
    1. 1 तैयार, 000x डॉक्सोरूबिसिन शेयर समाधान: 1x पंजाब में डॉक्सोरूबिसिन की एक २५० µ एम शेयर करें, फिल्टर-बंध्याकरण समाधान और aliquot में ५०० µ एल प्रति बाँझ ट्यूब. -८० डिग्री सेल्सियस पर डॉक्सोरूबिसिन शेयर स्टोर ।
    2. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि), एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं । 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    3. बीज 7 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक T75 कुप्पी में एक कम पीडी में (~ ९.३ एक्स 103 कोशिकाओं/सेमी2) युक्त D10 के 10 मिलीलीटर.
    4. 5% सह2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में रात भर कोशिकाओं को मशीन ।
    5. 1 के 11 µ l पतला, 000x डॉक्सोरूबिसिन स्टॉक समाधान 11 D10 के मिलीलीटर में २५० एनएमके अंतिम एकाग्रता के लिए।
    6. महाप्राण कोशिकाओं से मध्यम और D10 + डॉक्सोरूबिसिन के 10 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    7. एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c 5% CO2 और 5% O2के साथ में ठीक 24 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    8. कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण और सावधानी से एक बार धो 10 मिलीलीटर D10 के साथ ।
    9. एक और 6 दिनों के माध्यम से नियमित रूप से, लगभग हर 3 दिन की जगह के लिए D10 के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं मशीन ।
    10. 7 दिन में, वार्धक्य मार्करों के लिए परीक्षण और बहाव अनुप्रयोगों के लिए/
      नोट: नियंत्रण के रूप में उपयोग proliferating प्राथमिक fibroblasts एक ही पीडी के लिए इलाज के साथ 24 एच के लिए वाहन (पंजाब) 1:1000 D10 में.
  5. ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित वार्धक्य
    1. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि) एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं । 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    2. बीज 7 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक T75 कुप्पी में एक कम पीडी में (~ ९.३ एक्स 103 कोशिकाओं/सेमी2) युक्त D10 के 10 मिलीलीटर.
    3. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल मशीन में रात भर कोशिकाओं को गर्मी ।
    4. D10 के 11 मिलीलीटर में 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के २२.६ μL जोड़कर D10 माध्यम में ~ २०० माइक्रोन हाइड्रोजन पेरोक्साइड का एक समाधान तैयार करें ।
      नोट: एक वक्र खुराक बनाने के द्वारा ब्याज की कोशिका प्रकार के लिए उपचार का अनुकूलन-विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिक्रिया.
    5. महाप्राण कोशिकाओं से मध्यम और ताजा तैयार D10 मध्यम + हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 10 मिलीलीटर जोड़ें । 5% CO 2 और 5% O2के साथ ३७ ° c पर 2 ज के लिए मशीन ।
    6. कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के बिना ताजा D10 के साथ एक बार धोने ।
    7. हाइड्रोजन पेरोक्साइड के बिना D10 के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    8. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c पर एक सेल संस्कृति मशीन में ४८ ज के लिए मशीन ।
    9. दोहराएं कदम 2.5.4-2.5.8 तीन उपचार के एक कुल के लिए दो गुना अधिक ।
    10. बहाव अनुप्रयोगों के लिए वार्धक्य मार्करों या फसल के लिए जांच करें ।
      नोट: नियंत्रण के रूप में, एक ही पीडी के proliferating कोशिकाओं का उपयोग D10 में बाँझ पानी की २२.६ µ l के साथ 2 एच के लिए इलाज किया.
  6. Epigenetically-प्रेरित वार्धक्य
    1. 1 तालिकाके अनुसार उपयोग करने के लिए छोटे अणु (ओं) के लिए शेयर और काम समाधान तैयार करें । फ़िल्टर-समाधान निष्फल । Aliquot बाँझ ट्यूबों में. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. जबकि हैंडलिंग कोशिकाओं या किसी भी सामग्री है कि उनके साथ संपर्क में होगा (pipets, कुप्पी, मीडिया, आदि) बाँझ शर्तों के तहत काम करते हैं, उदाहरण के लिए, एक लामिना फ्लो हुड, लैब कोट और दस्ताने का उपयोग करके. 20% हे2 (कमरे की स्थिति) पर कोशिकाओं को केवल संभालते हुए रखें ।
    3. बीज 7 x 105 व्यवहार्य प्राथमिक fibroblasts एक T75 कुप्पी में एक कम पीडी में (~ ९.३ एक्स 103 कोशिकाओं/सेमी2) युक्त D10 के 10 मिलीलीटर.
    4. 5% सह2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में रात भर कोशिकाओं को मशीन ।
    5. वांछित उपचार के लिए D10 मध्यम + काम समाधान के 11 मिलीलीटर तैयार करें । उपचार के प्रति सटीक कमजोर पड़ने तालिका 1में देखा जा सकता है ।
      1. D10 के 11 मिलीलीटर में 1 मिमी साहा काम समाधान के 11 µ l तैयार करें ।
      2. D10 के 11 मिलीलीटर में 1 एम सोडियम butyrate काम समाधान के ४४ µ एल तैयार करें ।
      3. 10 मिमी 5 के 11 µ एल तैयार-aza D10 के 11 मिलीलीटर में काम समाधान ।
        नोट: द्वारा ब्याज के सेल प्रकार के लिए उपचार का अनुकूलन, उदाहरण के लिए, एक वक्र खुराक बनाने-प्रतिक्रिया विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए.
    6. संस्कृति को वांछित उपचार के लिए D10 मध्यम + कार्य समाधान जोड़ें ।
    7. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c में एक सेल संस्कृति मशीन में 24 घंटे के लिए मशीन ।
    8. दोहराएं कदम 2.6.4-2.6.6 दो गुना अधिक, तीन उपचार की कुल के लिए ।
    9. दवा के बिना सरल D10 के लिए माध्यम बदलें ।
    10. 3 दिन और अधिक के बाद, कोशिकाओं वृद्ध होनेवाला और वार्धक्य मार्करों और बहाव अनुप्रयोगों के परीक्षण के लिए तैयार हो जाते हैं ।
      नोट: नियंत्रण के रूप में, D10 मध्यम + वाहन के साथ तीन दिनों के लिए इलाज एक ही पीडी के proliferating प्राथमिक fibroblasts का उपयोग करें । D10 मध्यम + वाहन उन तीन दिनों के दौरान हर 24 घंटे ताजा करने की जरूरत है । वाहन का उपयोग किया उपचार पर निर्भर करता है: 1: साहा के लिए 1000 DMSO और सोडियम Butyrate के लिए 5-aza और 1:250 बाँझ पानी ।

3. वार्धक्य के मार्कर

  1. तैयारी
    1. तैयार 20 मिलीग्राम/एमएल एक्स-लड़की: भंग 20 एक्स के मिलीग्राम-dimethylformamide या DMSO के 1 मिलीलीटर में लड़की । -20 ° c प्रकाश से सुरक्षित स्टोर ।
    2. तैयार ०.१ एम साइट्रिक एसिड समाधान: पानी की १०० मिलीलीटर में साइट्रिक एसिड मोनोहाइडे के २.१ जी भंग । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    3. ०.२ मीटर सोडियम फॉस्फेट समाधान तैयार करें: सोडियम dibasic फॉस्फेट के २.८४ ग्राम या सोडियम dibasic फॉस्फेट निर्जलीकरण का १०० मिलीलीटर पानी में भंग. कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    4. तैयार ०.२ m साइट्रिक एसिड/सोडियम फॉस्फेट पीएच ६.०:०.१ एम साइट्रिक एसिड समाधान और ६३.१५ एम सोडियम फॉस्फेट की ०.२ मिलीलीटर की ३६.८५ मिलीलीटर भंग । बिल्कुल समायोजित करने के लिए पीएच ६.०। कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    5. तैयार १०० mM पोटेशियम ferrocyanide: पानी की ५० मिलीलीटर में पोटेशियम ferrocyanide के २.१ ग्राम भंग । 4 ° c प्रकाश से सुरक्षित पर स्टोर ।
    6. तैयार १०० mM पोटेशियम ferricyanide: पानी की ५० मिलीलीटर में पोटेशियम ferricyanide के १.७ ग्राम भंग । 4 ° c प्रकाश से सुरक्षित पर स्टोर ।
    7. 5 मीटर सोडियम क्लोराइड तैयार करें: ५० मिलीलीटर पानी में सोडियम क्लोराइड की १४.६ ग्राम को भंग करें । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    8. 1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड तैयार करें: ५० मिलीलीटर पानी में मैग्नीशियम क्लोराइड के ४.८ ग्राम को भंग करें । कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    9. glutaraldehyde में 2% formaldehyde + ०.२% तैयार करें: पंजाब के १०० µ में 16% formaldehyde में से 25% glutaraldehyde और १२.५ μL एल का भंग ८०० µ l कमरे के तापमान पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर ।
    10. तालिका 2 के अनुसार धुंधला समाधान ताजा तैयार करें ।
  2. वार्धक्य-संबद्ध β-galactosidase धुंधला
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, बीज 1 x 104 कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से प्लेट (५.२ x 103 कोशिकाओं/सेमी2) के ५०० µ एल युक्त D10 ताकि कोशिकाओं विरल हैं । उपचार (यदि लागू हो) सीधे इस थाली पर किया जा सकता है या, वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं का इलाज पहले से ही फिर से किया जा सकता है एक 24 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त ।
    2. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c पर रात भर कोशिकाओं की मशीन ।
    3. पंजाबियों के ५०० μL के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    4. फिक्स 3-कमरे के तापमान पर 5 मिनट ५०० μL/खैर के 2% formaldehyde + ०.२% glutaraldehyde का उपयोग कर पंजाब में ।
    5. पंजाबियों के ५०० μL के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    6. दाग के नमूनों की संख्या के अनुसार, ताजा धुंधला समाधान तैयार करते हैं ।
    7. धुंधला समाधान जोड़ें (५०० µ l/अच्छी तरह से) और वाष्पीकरण से बचने के लिए parafilm के साथ प्लेट सील ।
      नोट: वाष्पीकरण के लिए फार्म और माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन में बाधा क्रिस्टल के कारण हो सकता है ।
    8. अंधेरे में गर्मी कोशिकाओं (उदाहरण के लिए एल्यूमीनियम पंनी में शामिल) ३७ ° c में एक सूखी मशीन में (2सह के बिना) के लिए 12-16 एच ।
      नोट:2 CO पीएच को प्रभावित और इसलिए परिणाम को संशोधित कर सकते हैं । कुछ कक्ष प्रकार कम मशीन समय की आवश्यकता हो सकती है ।
    9. पंजाब के ५०० μL के साथ दो बार धो लें ।
    10. परिणामों का आकलन करें । सकारात्मक कोशिकाओं को एक सामांय प्रकाश माइक्रोस्कोप (आंकड़ा 1a) के तहत एक नीला (ज्यादातर) perinuclear धुंधला मौजूद ।
    11. ठहराव के लिए, प्रति नमूना ंयूनतम १०० कक्षों का निरीक्षण करें और धनात्मक कक्षों की संख्या की गणना करें । चूंकि वृद्ध होनेवाला कक्ष आकृति परिवर्तित करते हैं, इसलिए कक्ष सीमाओं को परिभाषित करना और कक्षों की गणना करना अक्सर कठिन होता है । DAPI के साथ Counterstain व्यक्तिगत कोशिकाओं के दृश्य और ठहराव की सुविधा के लिए (आंकड़ा 1b) । नमूनों (कोशिकाओं की कुल राशि बनाम सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत) एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1C) का उपयोग मात्रा यों । एक ही नमूना के कई चित्रों को ले ताकि अंत में आप कम से १०० एकल कोशिकाओं की गणना कर सकते हैं और उन में एसए-β-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन.
    12. इस्तेमाल किया उपचार के लिए उनके उचित नियंत्रण बनाम वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के परिणामों की तुलना करें ।
      नोट: एक ही नमूना पर EdU के साथ एक सह-धुंधला संभव है । विचार है कि कोशिकाओं को फिर coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए ।
  3. EdU निगमन परख
    1. नमूनों की संख्या के आंकलन के अनुसार 24-वेल प्लेट में एक coverslip/
    2. बीज 1 x 104 कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से एक 24 की अच्छी तरह से प्लेट (५.२ x 103 कोशिकाओं/D10 के ५०० µ एल युक्त शर्त प्रति) इतना है कि कोशिकाओं विरल हैं । उपचार (यदि लागू हो) सीधे इस थाली पर किया जा सकता है या, वैकल्पिक रूप से, पहले से ही कोशिकाओं का इलाज किया जा सकता है फिर से एक 24 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त ।
    3. 5% CO2 और 5% O2के साथ ३७ ° c पर रात भर कोशिकाओं की मशीन ।
    4. (२५० μL प्रति नमूना) का इलाज करने के लिए नमूनों की संख्या के अनुसार D10 (1:250) में EdU के 20 µ m समाधान करें ।
    5. एक अच्छी तरह से इलाज और इसे D10 + EdU समाधान है कि अभी तैयार किया गया था के साथ बदलने के माध्यम से मध्यम (२५० μL) के आधे निकालें । अंतिम EdU एकाग्रता 10 µ मी.
    6. एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c 5% CO2 और 5% O2 के साथ 18-20 मशीन । नियंत्रण और वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं में एक ही मशीन समय का उपयोग करें ।
    7. पंजाब के ५०० μL के साथ 2x धो लो ।
    8. पंजाबियों में 4% formaldehyde के ५०० μL के साथ 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें ।
    9. १०० mM Tris (पीएच ७.६) के ५०० μL में 5 मिनट की मशीन ।
    10. Permeabilize में 10 मिनट के लिए सेल ५०० μL में ०.१% ट्राइटन X-१०० के लिए पंजाब में ।
    11. पंजाबियों के साथ 3x धो लें ।
    12. प्रत्येक coverslip के लिए लेबल मिश्रण के ५० μL तैयार करें, घटकों को निम्न क्रम में जोड़ना: ४४.४५ µ पंजाब के एल, ०.५ घन के µ एल (II) सू4, ०.०५ µ l की sulfo-Cy3-azide, सोडियम की 5 µ l-ascorbate.
    13. parafilm के एक टुकड़े पर लैबल मिश्रण के ५० μL रखो. चिमटी और एक सुई की एक जोड़ी की सहायता से coverslip लिफ्ट और यह लेबल मिश्रण के शीर्ष पर आराम करते हैं, नीचे की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं युक्त सतह के साथ । सुनिश्चित करें कि वहां कोई बुलबुले रहे है और कि coverslip की पूरी सतह लेबल मिश्रण को छू रही है । अंधेरे में 30 मिनट के लिए मशीन ।
    14. 24 चहेतों की थाली के कुंए में कोशिकाओं को वापस रखें और पंजाबियों के साथ उन्हें तीन बार धोएं ।
    15. माउंट मीडिया (DAPI सहित नाभिक कल्पना करने के लिए) कांच स्लाइड पर और उंहें रात भर सूख जाने के साथ ।
    16. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर EdU निगमन कल्पना । Cy3 (उत्तेजना/उत्सर्जन: 552/570 एनएम) के लिए उपयुक्त फ़िल्टर का उपयोग करें ।
    17. बाद में ठहराव के लिए कक्षों की एक से अधिक चित्र लें प्रति शर्त (Cy3 और DAPI) में कम से १०० कक्ष ।
    18. निंन सूत्र का उपयोग करके EdU को शामिल करने वाले कक्षों का प्रतिशत बढ़ाता है:
      EdU धनात्मक कक्ष (%) = (edu धनात्मक कक्ष गणना (Cy3)/total कक्ष गणना (DAPI)) * १००
    19. इस्तेमाल किया उपचार के लिए उनके उचित नियंत्रण बनाम वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के परिणामों की तुलना करें ।
      नोट: एक सह-सा के साथ धुंधला-β-एक ही नमूना पर लड़की संभव है । विचार है कि कोशिकाओं को अभी भी coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए ।
  4. p16, p21 और SASP की जीन अभिव्यक्ति
    1. तैयार प्राइमर-ब्याज की जीन के सेट (५० µ एम प्रत्येक प्राइमर) ।
      नोट: p16, p21 और कुछ प्रासंगिक SASP कारकों की एक qPCR वार्धक्य स्थिति की जानकारीपूर्ण है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित यूनिवर्सल जांच पुस्तकालय (UPL) के सापेक्ष ठहराव एक वास्तविक समय का उपयोग कर-पीसीआर के लिए प्रणाली का उपयोग करता है । तालिका 3 CDK अवरोधकों p16 और p21 और सबसे अधिक प्रासंगिक SASP के सदस्यों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों के एक सिंहावलोकन से पता चलता है, साथ ही साथ Tubulin और Actin, जो परख के लिए संदर्भ जीन के रूप में सेवा के लिए । तालिका 3 के अंतिम कॉलम में प्रत्येक परख के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए विशेष UPL जांच को सूचीबद्ध करता है ।
    2. वांछित परख के लिए अलग qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । हमेशा संदर्भ जीन के रूप में अच्छी तरह से तालिका 4के अनुसार शामिल हैं ।
    3. डुप्लिकेट या तपसिल में सभी नमूने चलाएं ।
    4. लोड ७.५ µ एल qPCR रिएक्शन मिक्स एक ३८४-वेल प्लेट पर ।
    5. जोड़ें ~ 5 RNase के २.५ µ एल में भंग सीडीएनए के एनजी-मुक्त पानी ।
      नोट: यह सभी नमूनों की तुलना में किया जा करने के लिए सीडीएनए के समान मात्रा में बेहतर है । यह रिवर्स प्रतिलेखन के लिए आरएनए के बराबर मात्रा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है ।
    6. एक सील के साथ प्लेट को कवर और सुनिश्चित करें कि यह सही ढंग से प्लेट पर समान रूप से सभी कुओं को कवर चिपक जाती है ।
    7. 1 मिनट के लिए २,००० x g पर थाली स्पिन ।
    8. निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग ४० चक्र के लिए Lightcycler में थाली भागो:
      7 मिनट के लिए ९५ ° c
      5 एस के लिए ९५ ° c के ४० चक्र और 30 एस के लिए ६० ° c
      1 मिनट के लिए ३७ ° c
    9. परिणामों के विश्लेषण के लिए, qPCR डेटा24का विश्लेषण करने के लिए Livak और सहकर्मियों के लिए प्रस्तावित विधि का उपयोग करें । ΔCt मान की गणना करने के लिए संदर्भ जीन के रूप में या तो Tubulin या Actin का उपयोग करें और विशिष्ट वार्धक्य-उत्प्रेरण उपचार के लिए ΔΔCt मान के लिए परिकलित करने के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग करें.
  5. प्रोटीन एक्सप्रेशन और IL6 का स्राव
    1. बीज 5-10 x 104 कोशिकाओं में से एक अच्छी तरह से एक 6-खैर प्लेट (5.2-10.5 x 103 कोशिकाओं/D10के 2 मिलीलीटर युक्त शर्त के अनुसार 1 । उपचार (यदि लागू हो) सीधे इस थाली पर किया जा सकता है या, वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं का इलाज पहले से ही फिर से किया जा सकता है एक 24 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त । इसे बोने के बाद रात भर खड़े रहने दें ।
    2. मध्यम निकालें और FBS बिनाDMEM मध्यम के 2 मिलीलीटर के लिए प्रतिस्थापित करें । 24 एच के लिए सामांय परिस्थितियों में मशीन ।
    3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम लीजिए ।
    4. 5 min. मध्यम के लिए ३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक संसाधित जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    5. एलिसा करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    6. विशिष्ट वार्धक्य-उत्प्रेरण उपचार के लिए उपयुक्त नियंत्रण बनाम वृद्ध होनेवाला कक्षों के परिणामों की तुलना करें

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Representative Results

सा के संवर्धन-β-वृद्ध होनेवाला fibroblasts में लड़की धुंधला

β-galactosidase (β-gal) एक lysosomal एंजाइम है कि सभी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और कि ४.०25,26का एक इष्टतम पीएच है । हालांकि, वार्धक्य के दौरान, आकार में वृद्धि lysosomes और, फलस्वरूप, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं β-gal संचित । इस एंजाइम की वृद्धि हुई मात्रा में यह भी एक इष्टतम पीएच ६.०25,27पर अपनी गतिविधि का पता लगाने के लिए संभव बनाते हैं । चित्र 1a एसए के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है-β-proliferating बनाम वृद्ध होनेवाला प्राथमिक fibroblasts में धुंधला लड़की । कोशिकाओं को भी बढ़े और एक अनियमित कोशिका शरीर के साथ देखो । के रूप में उल्लेख किया है, यह व्यक्तिगत कोशिकाओं भेद कठिन हो सकता है, ताकि एक सह DAPI के साथ धुंधला दृश्य और सेल गिनती (आंकड़ा 1b) की सुविधा । यह एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में तस्वीरें लेने के लिए DAPI धुंधला का पालन करने में सक्षम होना आवश्यक है । इसका मतलब यह है कि चमकीले क्षेत्र चैनल पर चित्रों को काले/सफेद में लिया जाएगा, ताकि "नीले" एसए के धुंधला-β-लड़की काले चित्रों पर दिखाई देगा । ध्यान दें, नहीं सभी कोशिकाओं को एक नमूने के भीतर β-gal के लिए सकारात्मक हैं । वार्धक्य प्रेरण की दक्षता उत्तेजना पर अत्यधिक निर्भर है-और सेल प्रकार/ प्रोटोकॉल यहां वर्णित > 50% β-प्राथमिक fibroblasts में लड़की सकारात्मक कोशिकाओं (बीजे और WI-३८) हमारे हाथ में ।

कम कक्ष वार्धक्य की प्रेरण के बाद EdU शामिल

EdU nucleoside thymidine के एक एनालॉग है कि, सक्रिय डीएनए संश्लेषण के दौरान,28डीएनए में शामिल किया जाएगा । Catalyzed Azide-Alkyne cycloaddition (CuAAC) edu, प्रतिक्रिया है कि नियमित रूप से thymidine में नहीं किया जा सकता क्योंकि यह Alkyne समूह28का अभाव है प्रदर्शन करने के बाद डीएनए में EdU के शामिल होने की कल्पना कर सकते हैं । इस विशेष प्रोटोकॉल में, एक Sulfo-Cy3-azide का उपयोग किया जा रहा है । यदि युग्मन azide के लिए alkyne जगह ले ली है, कोशिकाओं को एक Cy3 फ़िल्टर (चित्रा 2a) के तहत प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करेगा । यह खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण है कि EdU निगमन परख प्रदर्शन करके, proliferating है कि कोशिकाओं गैर proliferating कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । गैर proliferating कोशिकाओं या तो quiescent या वृद्ध होनेवाला हो सकता है, जिसका अर्थ है कि EdU शामिल परख सेल चक्र गिरफ्तारी के इन दो प्रकार के बीच भेदभाव नहीं कर सकते ।

वृद्ध होनेवाला Fibroblasts CDK अवरोधकों p16 और p21

वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं CDKs के अवरोधकों का उपयोग करने के लिए सेल चक्र29बंद करो । विशेष रूप से p16 और p21 अक्सर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं3के मार्कर के रूप में मापा जाता है । या तो एक या दोनों मार्करों वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं में आम तौर पर विनियमित रहे हैं, और नियमन अक्सर transcriptional स्तर पर मापा जाता है. यह एक साथ दोनों मार्करों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है के बाद से कुछ कोशिकाओं transcriptional स्तर पर p16 को विनियमित नहीं है और p2115,17,30वार्धक्य के लिए एक सार्वभौमिक लेकिन नहीं विशिष्ट मार्कर है. चित्रा 3 fibroblasts को प्रेरित वार्धक्य में p16 और p21 mRNA के प्रतिनिधि रिश्तेदार quantifications से पता चलता है. प्रोटीन के स्तर का पता लगाने के लिए immunostaining और/या वेस्टर्न सोख्ता जैसी अन्य तकनीकें भी संभव हैं ।

वृद्ध होनेवाला Fibroblasts प्रदर्शन एक SASP

अधिकांश वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं transcriptionally स्रावित प्रोटीन, एक घटना SASP6बुलाया के लिए एंकोडिंग कई जीन को विनियमित । SASP सूजन में शामिल कारकों, जैसे, interleukins और chemokines, या extracellular मैट्रिक्स (ECM) गिरावट, जैसे, MMPs में शामिल हैं, लेकिन यह अत्यधिक विषम है । SASP कारकों की प्रेरण qPCR या एंजाइम से जुड़े इंयूनो Sorbent परख (एलिसा) के माध्यम से स्रावित प्रोटीन के स्तर के माध्यम से या तो mRNA अभिव्यक्ति स्तर को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 4 transcriptional और स्रावित स्तर पर दोनों IL6 के नियमन दिखा एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है. हम केवल एक प्रतिनिधित्व के रूप में IL6 इस्तेमाल किया; हालांकि, यह प्रोटोकॉल ३.४ पर सुझाए गए सूची से SASP के एकाधिक सदस्यों को मापने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एसए के संवर्धन-β-वृद्ध होनेवाला प्राथमिक fibroblasts में धुंधला लड़की । बीजे प्राथमिक चमड़ी fibroblasts (पीडी ३४.१) उंहें विकिरण (10 Gy) को उजागर करके वार्धक्य के लिए प्रेरित किया गया । कोशिकाओं एसए-βgal दस दिनों के विकिरण के बाद के लिए दाग थे । (एक) SA के लिए प्रतिनिधि परिणाम-βgal बीजे प्राथमिक fibroblasts में धुंधला या तो अनुपचारित (ऊपर) या विकिरण (नीचे) को उजागर । अंतिम आवर्धन: 100X । (ख) SA के प्रतिनिधि आंकड़ा-β-लड़की सह के साथ सना हुआ DAPI बीजे प्राथमिक fibroblasts के लिए या तो अनुपचारित (तीन बाएं पैनलों) या विकिरण (तीन सही पैनलों) को उजागर । DAPI धुंधला (नीला) ठहराव को सुविधाजनक बनाने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं को कल्पना करने में मदद करता है । उज्ज्वल पर लिया चित्र-क्षेत्र में प्रकट काले/ इसलिए, इन विशेष चित्रों में एसए-β-लड़की धुंधला काले perinuclear धब्बे की तरह दिखेगा । अंतिम आवर्धन: 100X । (ग) एसए के ठहराव-β-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं में proliferating (Prol., सफेद) बीजे fibroblasts बनाम विकिरणित इलाज समकक्षों (सेन, नीला) । ठहराव का उपयोग करके किया गया था तीन जैविक प्रतिकृति त्रुटि सलाखों के साथ मतलब के मानक त्रुटि दिखा रहा है । सांख्यिकीय महत्व एक बिगड़ा दो-डेल्टा-सीटी मूल्यों पर छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था । (n = 3, ± SEM, * * * = p मान < 0.01) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कम कोशिकाओं वार्धक्य के प्रेरण के बाद EdU शामिल । (एक) proliferating WI में EdU निगम परख के प्रतिनिधि छवि-३८ fibroblasts पीडी ४३.८६ (बाएं) और उनके विकिरणित समकक्षों (दाएं) । अंतिम आवर्धन: 100X । (ख) proliferating में EdU सकारात्मक कोशिकाओं का ठहराव (Prol., white) बीजे fibroblasts (पीडी ३८.७) बनाम उनके विकिरणित समकक्षों (सेन, नीला) । ठहराव का उपयोग करके किया गया था तीन जैविक प्रतिकृति त्रुटि सलाखों के साथ मतलब के मानक त्रुटि दिखा रहा है । सांख्यिकीय महत्व एक ख़राब दो पूंछ-डेल्टा-सीटी मूल्यों पर छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (n = 3, ± SEM, * * * = पी मान < 0.01) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वृद्ध होनेवाला fibroblasts CDK अवरोधकों p16 और p21 को विनियमित । (क) proliferating में p16 mRNA अभिव्यक्ति की ठहराव (Prol., सफेद, पीडी ३५.३) या 5-aza-उपचारित बीजे कोशिकाएं (सेन, नीला) । (ख) proliferating में p21 mRNA अभिव्यक्ति की ठहराव (Prol., सफेद, पीडी ३५.३) या 5-aza-उपचारित बीजे कोशिकाएं (सेन, नीला) । ठहराव तीन जैविक प्रतिकृति का उपयोग करके किया गया था (प्रत्येक के साथ दो तकनीकी प्रतिकृतियां) त्रुटि के साथ मानक त्रुटि दिखाने का मतलब है । सांख्यिकीय महत्व एक ख़राब दो पूंछ-डेल्टा-सीटी मूल्यों पर छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (n = 3, ± SEM, * * * = पी मान < 0.01) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: वृद्ध होनेवाला fibroblasts एक स्रावी Phenotype (SASP) प्रदर्शित करें । (क) IL6 mRNA अभिव्यक्ति की ठहराव में बीजे fibroblasts या तो proliferating (Prol., सफेद, पीडी ३८.७) या विकिरण द्वारा वार्धक्य प्रेरित (सेन, नीला) । (ख) proliferating पीडी ३८.६ में IL6 प्रोटीन अभिव्यक्ति की ठहराव (Prol., सफेद) या विकिरण-स्वास्थ्यकर्मी WI38 fibroblasts (सेन, नीला). ठहराव का उपयोग करके किया गया था तीन जैविक प्रतिकृति त्रुटि सलाखों के साथ मतलब के मानक त्रुटि दिखा रहा है । qPCR डेटा के मामले में, प्रत्येक जैविक दोहराने दो तकनीकी डुप्लिकेट था । सांख्यिकीय महत्व एक ख़राब दो पूंछ-डेल्टा-सीटी मूल्यों पर छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (n = 3, ± SEM, * * * =पी मान < 0.01) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मंदक स्टॉक समाधान काम समाधान उपचार के लिए कमजोर पड़ने अंतिम एकाग्रता
साहा DMSO १०० एमएम 1 मिमी 1:1000 1 µ m
सोडियम butyrate बाँझ पानी --- 1 मीटर 1:250 4 मिमी
5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza) DMSO १०० एमएम 10 एमएम 1:1000 १० µ मी

तालिका 1: Epigenetically-प्रेरित वार्धक्य के लिए उपयोग किए गए विभिंन उपचार के लिए स्टॉक और कार्य समाधान ।

घटक वॉल्यूम अंतिम एकाग्रता
20 मिलीग्राम/एमएल एक्स-लड़की 1 मिलीलीटर 1 मिलीग्राम/एमएल
०.२ M साइट्रिक एसिड/सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच ६.० 4 मिलीलीटर 40mm
१०० मिमी पोटेशियम ferrocyanide 1 मिलीलीटर 5 मिमी
१०० मिमी पोटेशियम ferricyanide 1 मिलीलीटर 5 मिमी
5 एम सोडियम क्लोराइड ०.६ एमएल १५० एमएम
1 एम मैग्नीशियम क्लोराइड ०.०४ एमएल 2 मिमी
पानी १२.४ एमएल -
कुल 20 मिलीलीटर

तालिका 2: वार्धक्य संबद्ध (SA) के लिए प्रयुक्त धुंधला समाधान की संरचना-β-लड़की धुंधलाना ।

लक्ष्य फॉरवर्ड प्राइमर (5 '--> 3 ') रिवर्स प्राइमर (5 '-> 3 ') UPL जांच
Tubulin CTTCGTCTCCGCCATCAG CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC #40
Actin बी ccaaccgcgagaagatga ccagaggcgtacagggatag #64
P16 GAGCAGCATGGAGCCTTC CGTAACTATTCGGTGCGTTG #67
P21 tcactgtcttgtacccttgtgc ggcgtttggagtggtagaaa #32
IL6 CAGGAGCCCAGCTATGAACT GAAGGCAGCAGGCAACAC #45
IL8 GAGCACTCCATAAGGCACAAA ATGGTTCCTTCCGGTGGT #72
IL1a GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA TGCTGACCTAGGCTTGATGA #6
CXCL1 CATCGAAAAGATGCTGAACAGT ATAAGGGCAGGGCCTCCT #83
CXCL10 GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA #34
CCL2 AGTCTCTGCCGCCCTTCT GTGACTGGGGCATTGATTG #40
CCL20 GCTGCTTTGATGTCAGTGCT GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG #39
PAI1 AAGGCACCTCTGAGAACTTCA CCCAGGACTAGGCAGGTG #19
MMP1 GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA TTTGTGCGCATGTAGAATCTG #7
MMP3 CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT CATCTTTTGGCAAATCTGGTG #72
MMP9 GAACCAATCTCACCGACAGG GCCACCCGAGTGTAACCATA #53

तालिका 3: प्राइमर दृश्यों और मानव मूल के नमूनों में वार्धक्य मार्करों के mRNA का पता लगाने के लिए उनके इसी UPL जांच ।

घटक मात्रा नमूना/
Sensifast जांच लो-Rox मिक्स 5 µ l
प्राइमर-सेट (५० µ मीटर) ०.१ µ l
UPL जांच ०.१ µ l
Nuclease-मुफ्त पानी २.३ µ l
सीडीएनए (~ 4 एनजी) २.५ µ l
कुल ७.५ µ l

तालिका 4: UPL प्रणाली के लिए qPCR रिएक्शन मिक्स की संरचना ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां समझाया मानव प्राथमिक fibroblasts, विशेष रूप से मुखमैथुन और WI-३८ कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया । प्रतिकृति वार्धक्य के लिए प्रोटोकॉल, विकिरण और डॉक्सोरूबिसिन, fibroblasts के अंय प्रकार के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है (HCA2 और IMR90) और अंय कोशिका प्रकार में (अर्थात् नवजात melanocytes और keratinocytes या iPSC-व्युत्पंन cardiomyocytes) हमारी प्रयोगशाला में । हालांकि, अतिरिक्त कोशिका प्रकारों के लिए रूपांतरों को कुछ विवरणों को समायोजित करके अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि बीज की हुई कोशिकाओं की संख्या, विधि और रसायनों को संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की मदद करने के लिए प्लास्टिक का समर्थन करता है और विषाक्तता से बचने के लिए उपचार की खुराक ।

यहां तक कि प्राथमिक fibroblasts का उपयोग चुनौतियों का एक नंबर बन गया है । वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं को आम तौर पर और अधिक अपने proliferating समकक्षों से अलग करने के लिए कठिन हैं, और वे अक्सर trypsinization या अलग विधि के किसी भी अंय प्रकार के प्रति संवेदनशील हैं, जिसका अर्थ है कि अलग करने के बाद व्यवहार्यता के एक से थोड़ा कम है proliferating कक्ष । विभिंन वार्धक्य-उत्प्रेरण विधियों के लिए उपयुक्त नियंत्रण का चुनाव कठिन है । उदाहरण के लिए, डॉक्सोरूबिसिन के रूप में दवा आधारित उपचार के लिए, हम वाहन के साथ एक छोटे से उपचार का सुझाव: पंजाबियों के लिए 24 ज के लिए नियंत्रण के नमूनों के मामले में डॉक्सोरूबिसिन-इलाज कोशिकाओं के बाद तत्काल कटाई/ यह तर्क दिया जा सकता है कि वार्धक्य को उपचार के बाद एक विस्तारित संस्कृति समय के माध्यम से जाने के लिए प्रेरित किया कोशिकाओं (छह डॉक्सोरूबिसिन के लिए संस्कृति के अतिरिक्त दिन इलाज किया कोशिकाओं) और है कि नियंत्रण कोशिकाओं के समय के बराबर राशि संस्कृतिित किया जाना चाहिए के बाद पंजाबियों को हटाने । हालांकि, इस तरह की एक लंबी संस्कृति की अनुमति होगी कोशिकाओं को आगे विभाजित करने के लिए, अधिक हो-धाराप्रवाह या आगे passaging की आवश्यकता होती है और पीडी बढ़ाने के लिए. over-संगम वार्धक्य मार्करों, जैसे SA-β-gal के रूप में प्रकट करने के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के बावजूद कारण हो सकता है उनके proliferating संभावित३१. बढ़ी हुई पीडी उंहें अपनी प्रतिकृति सीमा के करीब हो (और नकल वार्धक्य के लिए) और उंहें कम उनके डॉक्सोरूबिसिन-समकक्षों का इलाज करने के लिए तुलनीय करना होगा । एक ऐसी ही स्थिति अंय उपचार के लिए लागू होता है । हम नियंत्रण है कि हम प्रत्येक मामले के लिए और अधिक उपयुक्त विचार का सुझाव दिया है ।

वार्धक्य में कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल तकनीक के अधिकांश अपेक्षाकृत आसान और सीधे आगे लगता है, लेकिन कई कारकों प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, fibroblasts के लिए पारंपरिक कोशिका संस्कृति मीडिया के सामांय ग्लूकोज एकाग्रता ४.५ g/ हालांकि, कुछ कोशिका प्रकार के लिए जैसे स्टेम सेल, ग्लूकोज की कम सांद्रता उनके प्रफलन क्षमता३२का विस्तार, जबकि दूसरों के लिए उच्च सांद्रता समय से पहले वार्धक्य३३के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, के रूप में वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं को अत्यधिक चयापचय कर रहे है और ऊर्जा की उच्च मात्रा में खर्च को स्रावित कारकों३४उत्पादन, अंय वार्धक्य-जुड़े phenotypes ग्लूकोज सांद्रता में दोलनों से प्रभावित हो सकता है ।

कोशिका संस्कृति माध्यम में एक और संभावित चर सीरम है । सीरम की संरचना आम तौर पर परिभाषित नहीं है और पशु स्रोत और बैच के अनुसार बदलता रहता है । विशेष रूप से, वृद्धि कारकों की राशि और समर्थक भड़काऊ प्रोटीन वार्धक्य३५प्रभावित कर सकते हैं । हम अनुशंसा करते हैं कि सीरम का एक ही बैच पूरे प्रयोग के लिए अनावश्यक और विस्थापित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर भी, कुछ एलिसा आधारित प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया सीरम मुक्त माध्यम के उपयोग के रूप में कुछ अपरिहार्य तकनीकी स्थितियों SASP अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं ।

ऑक्सीजन तनाव पूर्ण वार्धक्य प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है । हाइपोक्सिया geroconversion को बाधित कर सकते हैं, ताकि कोशिकाओं पैदा करना नहीं है, लेकिन अचल३६गिरफ्तार नहीं कर रहे हैं । हालांकि, प्रयोगात्मक सेटअप में सबसे आम समस्या हाइपोक्सिया लेकिन hyperoxia नहीं है । दरअसल, मानक संस्कृति की स्थिति अक्सर "normoxia" के रूप में 20% ऑक्सीजन का उपयोग करें, लेकिन सबसे अधिक कोशिका प्रकार के लिए शारीरिक स्थितियों कम कर रहे हैं । माउस blastocysts वार्धक्य के वर्तमान मार्करों (एसए-βgal और डीएनए क्षति) जब 20% ऑक्सीजन में संस्कृति, vivo मेंउनके विपरीत-प्राप्त समकक्षों या एक ही 5% ऑक्सीजन३७में प्रसंस्कृत कोशिकाओं । इसके अलावा, माउस fibroblasts अधिक शारीरिक शर्तों (3% ऑक्सीजन) में और पारंपरिक लोगों पर नहीं (20% ऑक्सीजन) एक SASP३८प्रदर्शन । यहां, हम सभी संस्कृतियों और प्रयोगों के लिए 5% ऑक्सीजन का इस्तेमाल किया और हम शोधकर्ताओं से आग्रह करता हूं कि ब्याज की विशेष कोशिका प्रकार के लिए इस्तेमाल ऑक्सीजन सांद्रता पर पुनर्विचार ।

अंत में, एक और पहलू पर विचार करने के लिए वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के आंतरिक विविधता है । एक तरफ, विभिंन प्रकार के सेल और भी सेल उपभेदों वार्धक्य में मतभेद-एसोसिएटेड phenotypes प्रदर्शित करते हैं । उदाहरण के लिए, fibroblasts के कुछ उपभेदों वार्धक्य प्रेरण15,16,17पर transcriptional स्तर पर p16 को विनियमित नहीं है, के रूप में यह भी चित्र 3ए में दिखाया गया है, जहां के एक विनियमन देखने के बावजूद p16, यह सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था । P16 भी शोधों और पोस्ट-शोधों के स्तर पर नियंत्रित है, इसलिए प्रोटीन के स्तर को मापने के कुछ मामलों में हो सकता है इस CDK अवरोध करनेवाला की एक वृद्धि की गतिविधि प्रदर्शित करता है. हालांकि, यह हो सकता है कि कुछ कोशिकाओं को बस p21 तरह अंय CDK अवरोधकों पर निर्भर हैं । हम उन दोनों के transcriptional स्तरों को मापने की सलाह देते हैं । SASP की सटीक संरचना भी सेल है कि यह3उत्पादन पर निर्भर करता है । इसके अलावा, कुछ कोशिकाओं constitutively β-galactosidase के उच्च स्तर व्यक्त, एसए के लिए एक सकारात्मक परिणाम दे-β-लड़की धुंधला कि जरूरी संकेत नहीं है वार्धक्य3. कुछ मामलों में, इस समस्या को एसए के दौरान धुंधला समाधान के साथ गर्मी समय को कम करने से दूर हो सकता है-β-लड़की धुंधला प्रोटोकॉल । के रूप में उल्लेख किया है, पर धाराप्रवाह कोशिकाओं को भी एसए के साथ दाग सकता है-β-उंहें बिना लड़की31वृद्ध होनेवाला जा रहा है, तो हम संस्कृति कोशिकाओं को शोधकर्ताओं आग्रह विरल इस धुंधला प्रदर्शन के लिए । दूसरी ओर, वार्धक्य phenotype स्वयं स्थिर३९नहीं है । SASP की संरचना और वार्धक्य के अंय मार्करों की उपस्थिति समय निर्भर17,४०हैं । यहां, हम एक इलाज है जिसमें कोशिकाओं को पूरी तरह से वृद्ध होनेवाला माना जाता है और जो नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किया जाता है के बाद समय अंक का सुझाव दिया है । महत्वपूर्ण बात, एक छोटे समय बिंदु पर मार्करों मापने अपूर्ण वार्धक्य४०के कारण नकारात्मक परिणाम प्रदान हो सकता है । इसके अलावा, के बाद से उपचार कोशिकाओं का एक प्रतिशत वृद्ध होनेवाला नहीं बन जाते हैं, एक लंबे समय बिंदु का उपयोग कर कुछ गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय देने के लिए विस्तार और संस्कृति आगे निकल सकता है, वृद्ध होनेवाला मार्करों की अभिव्यक्ति को कम करने । वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं और विभिंन मार्करों के कई निरंतर के विविधता के विचारों में, हम अत्यधिक शोधकर्ताओं को एक ही नमूना के भीतर एकाधिक वार्धक्य मार्करों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ।

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Disclosures

न/

Acknowledgments

हम उपयोगी चर्चा के लिए मारिया लैब के सदस्यों को धंयवाद, और Thijmen वान Vliet को यूवी प्रेरित वार्धक्य पर डेटा और प्रोटोकॉल साझा करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Media - GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

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विकास जीवविज्ञान १३६ अंक सेलुलर वार्धक्य उंर बढ़ने कैंसर ट्यूमर दमन ऊतक की मरंमत स्राव जीन अभिव्यक्ति genotoxic तनाव कीमोथेरेपी विकिरण epigenetics
प्राथमिक मानव कोशिकाओं में सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण और मांयता
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Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

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