Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57782

Summary

Здесь мы обсуждаем ряд протоколов для индукции и проверки клеточного старения в культивируемых клеток. Мы ориентируемся на различных раздражителей, вызывающие старение и описать количественного определения общего старения ассоциированных маркеров. Мы предоставляем технические детали, используя фибробластов в качестве модели, но протоколы могут быть адаптированы к различным сотовой модели.

Abstract

Клеточного старения является состояние постоянного клеточного цикла арест активирована в ответ на различные стимулы, повреждения. Активация клеточного старения является отличительной чертой различных патофизиологические условий, включая опухоли подавления, тканей ремоделирования и старения. По-прежнему плохо характеризуются индукторов сотовой старение в естественных условиях . Однако ряд стимулов может использоваться для содействия клеточного старения ex vivo. Среди них наиболее распространенные старение индукторов, репликативной истощения, ионизирующего и неионизирующего излучения, Генотоксичные препараты, оксидативный стресс и demethylating и ацетилировать агентов. Здесь мы предоставим детальные инструкции о том, как использовать эти стимулы, чтобы побудить фибробластов в старение. Этот протокол может быть легко адаптирована для различных типов начальных клеток и клеточных линий, включая раковые клетки. Мы также описывают различные методы для проверки старения индукции. В частности мы сосредоточены на измерение активности лизосомальных ферментов старения-связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК с помощью 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) включение анализа уровней экспрессии клеточного цикла Ингибиторы p16 и p21 и выражение и секрецию членов Senescence-Associated секреторной фенотип (SASP). Наконец мы предоставляем пример результаты и обсудить дальнейшие применения этих протоколов.

Introduction

В 1961 году Хейфлик и Moorhead сообщили, что первичный фибробластов в культуре потерять их пролиферативный потенциал после последовательных проходов1. Этот процесс является причиной последовательных укорочение теломер после каждого деления клеток. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они признаются в повреждения ДНК ответ (РДР), который активирует необратимым арест распространения — также определен как репликативной старение. Репликативной старения в настоящее время является одним из многих раздражителей, которые известны побудить государство ареста постоянного клеточного цикла, что делает клетки нечувствительны митогены и apoptotic сигналы2,3. Программа старения обычно характеризуются дополнительными функциями, включая высокую активность лизосомальных, митохондриальной дисфункции, ядерные изменения, перераспределений chromatin, эндоплазматического ретикулума стресс, повреждение ДНК и старение связанных секреторный фенотип (SASP)3,4. Стареющей клетки имеют несколько функций в организме: развития, ранение исцеления и опухоли подавления2. Кроме того они известны играть важную роль в старения и, как ни парадоксально, в прогрессии опухоли5. Отрицательный и частично противоречивой, эффекты старения часто приписывают SASP6.

Недавно было показано, что ликвидация стареющей клетки от мышей приводит к продлению жизни и ликвидации многих старения функции7,8,9,10,11, 12. в то же время, несколько препаратов были разработаны для либо устранить стареющей клетки (senolytics) или целевой SASP13,14. Антивозрастной лечебный потенциал недавно привлекло больше внимания к полю.

Изучение механизмов, связанных с сотовой старение и показы для фармакологического вмешательства сильно полагаться на ex vivo модели, особенно на первичной фибробластов. Хотя есть некоторые общие черты, активируются различные старение индукторов, большой изменчивости в старение фенотип наблюдаемыми и зависит от различных факторов, включая ячейки типа, стимулов и времени точки3,15, 16,17. Это необходимо учитывать гетерогенность для изучения и ориентации стареющей клетки. Таким образом этот протокол направлен на обеспечение ряда методов, используемых для вызывают старение в первичной фибробластов с помощью различных методов лечения. Как это будет объяснено, методы может быть легко адаптирована для других типов клеток.

Помимо репликативной старение, мы опишем пять других вызывающих старение лечения: ионизирующего излучения, ультрафиолетовые (УФ) излучения, доксорубицин, оксидативный стресс и эпигеномные изменения (а именно, поощрение ацетилирование гистона или деметилирования ДНК) . Ионизирующего излучения и УФ излучения вызывают прямого повреждения ДНК и, в соответствующих дозах вызывают старение18,19. Доксорубицин также вызывает старение главным образом через повреждения ДНК, интеркалирующие в ДНК и нарушая функцию топоизомеразы II и таким образом остановить ДНК ремонт механизмов20. Экспрессии генов, необходимых для старения обычно контролируется ацетилирование гистона и метилирования дна. Как следствие Ингибиторы гистоновых деацетилаз (например, натрия бутират и Саха) и ДНК-demethylating агентов (например, 5-Аза) вызывают старение в противном случае нормальных клеток21,22.

Наконец, четыре из наиболее распространенных маркеров, связанные для стареющей клетки будет объяснено: активность старение связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК, EdU включения анализа, гиперэкспрессия регуляторов клеточного цикла и p16 ингибиторы Циклин зависимая киназа p21, гиперэкспрессия и и секрецию членов SASP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Общая подготовка

  1. Подготовка среднего D10. Дополнить DMEM средне Glutamax с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (конечная концентрация: 100 ед/мл).
  2. Подготовьте стерильные PBS. Растворите таблетки в воде в соответствии с инструкциями производителя. Стерилизуйте в автоклаве.
  3. Подготовка 1 x трипсина. Развести 5 мл трипсина-Versene ЭДТА/10 x 1:10 в 45 мл стерильного PBS.
    Примечание: В протоколе, мы используем условия культуры клеток, которые находятся ближе к физиологические условия для первичного фибробластов. Это означает, что мы инкубации клеток при 37 ° C и 5% CO2 , как это обычно делается, но использование 5% O2 вместо «стандарт» 20% O2.
  4. Обрабатывать все образцы в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.

2. индукция старение

  1. Репликативной старение
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой численности населения, удвоение T75 колбу (~9.3 x 103 клеток/см2), содержащие 10 мл D10 (PD).
    3. Рост клеток в инкубаторе ячейки при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 до тех пор, пока они достигают 70 – 80% слияния (3 – 4 дня для пролиферирующих культур в низкой PD).
    4. Отсоединить ячейки, используя 3 мл 1 x трипсина и инкубации за ~ 5-7 мин в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2. Регулярно контролировать клетки с микроскопом культуры клеток, чтобы проверить отсоединение процесса.
    5. Когда клетки являются сферические, остановите трипсина реакции путем добавления 9 мл D10. Не инкубировать более чем на 10 мин.
    6. Вращайте клетки на 300 x g для 5 минут клетки будет форма гранул в нижней части трубки, в то время как мусор и мелкие частицы останется в надосадке.
    7. Удалить супернатант и растворяют гранулы клеток в 1 мл D10 и выполняют число ячеек, используя автоматизированные ячейки счетчик согласно инструкции производителя или Нойбауэр камеры для ручной подсчет. Во время подсчета голосов, включают assay проверить жизнеспособность клеток (например, исключение Трипановый синий23).
    8. Рассчитайте совокупный PD, используя эту формулу:
      PDНовый = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (мобильный номер семенами)) + PDold
      Мобильный телефон всего = все ячейки учитываются: живые и мертвые.
      Мобильный телефон посеян = количество жизнеспособных клеток семенами (8 x 105 ).
      PDстарый = населения, удвоение в момент заполнения.
      PDНовый = населения, удвоение в данный момент подсчета (после инкубации).
      Примечание: Если 7 x 105 первичных фибробластов (35,2 PD) были посеяны на T-75 колбу и, после 4 дней они достигают 80% слияния и разделены снова, считая теперь 1.3 x 106 клеток всего (мертвых + жив).
      PDНовый = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDНовый = 36,1
    9. Повторное заполнение 8 x 105 клеток в новом T75, повторяя шаги 2.1.2–2.1.8.
      Примечание: После нескольких последовательных проходов, культура займет больше времени, чтобы получить вырожденная, пока клетки остановки деления на всех. После того, как клетки остановки деления, тест для старения маркеров или урожай для нисходящие приложения.
    10. Считают, что больше размер стареющей клетки может вызвать культуры появляются полностью и еще имеют низкий клеток счетчик. Таким образом, старение можно предположить при ПД является стабильным и другие маркеры старения появляются в культуре (см. протоколы 3.1-3.5).
      Примечание: Используйте пролиферирующих первичной фибробластов как элемент управления.
  2. Ионизирующего излучения индуцированного старения
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    3. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Разоблачить клетки 10 серый гамма-облучения в соответствии с инструкциями машину в использовании.
    5. Аспирационная среднего из клеток и заменить с 10 мл D10.
    6. Инкубируйте клетки в 10 мл D10 в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 еще 10 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
    7. После 10 дней тест на старение маркеры и/или использовать клетки для нисходящие приложения.
      Примечание: Используйте пролиферирующих первичной фибробластов же PD (до облучения) как элемент управления.
  3. Ультрафиолетового (УФ) радиации старение
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 1,5 – 2 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в одной скважине 6-ну плиты (1,5 – 2,0 x 104 клетки/см2), добавить 2 мл среды D10.
    3. Место клетки в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 и позволяют им придерживаться пластика для по крайней мере 5 ч.
    4. Возьмите средних от клетки. Место пластину 6-Ну в середине камеры УФ излучения и снять пластиковую крышку. Облучать с UVB, 20 – 30 МДж/см2.
    5. Добавьте 2 мл среды в колодец.
    6. Инкубируйте клетки в 2 мл D10 в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2 еще 7 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
      Примечание: После 7 дней, клетки могут быть проверены на старение маркеры и используется для приложений, ниже по течению. Использование пролиферирующих первичной фибробластов же PD (до облучения) в качестве управления.
  4. Доксорубицин индуцированного старения
    1. Подготовка 1000 x доксорубицин Стоковый раствор: сделать запас 250 мкм доксорубицин в однократном ПБС, фильтр стерилизуйте решение и Алиготе в 500 мкл в стерильную пробирку. Хранить запас доксорубицин-80 ° c.
    2. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.), работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    3. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    4. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    5. Разбавить 11 мкл 1000 x доксорубицин Стоковый раствор в 11 мл D10 до конечной концентрации 250 Нм.
    6. Аспирационная среднего из клеток и заменить 10 мл D10 + доксорубицин.
    7. Инкубируйте клетки для точно 24 h в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    8. Аспирационная среднего из клеток и тщательно мыть раз с 10 мл D10.
    9. Инкубируйте клетки в 10 мл D10 еще 6 дней, заменив носитель регулярно, примерно каждые 3 дня.
    10. На 7 день тест на старение маркеры и/или использовать нисходящие приложения.
      Примечание: как управления, использования пролиферирующих первичной фибробластов же PD, лечение за 24 ч с транспортного средства (PBS) 1:1,000 в D10.
  5. Окислительный стресс индуцированного старения
    1. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, используя Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    2. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    3. Инкубируйте клетки на ночь в инкубаторе ячейки при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Приготовляют раствор перекиси водорода ~ 200 мкм в среде D10, добавив 22.6 мкл 30% перекиси водорода в 11 мл D10.
      Примечание: Оптимизация лечения для ячейки тип интереса, сделав кривая доза ответ для оценки токсичности.
    5. Аспирационная среднего из клеток и добавляют 10 мл свежеприготовленные D10 средний + перекись водорода. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    6. Аспирационная среднего из клеток и один раз промойте свежие D10 без перекиси водорода.
    7. Добавьте 10 мл D10 без пероксида водорода.
    8. Проинкубируйте 48 ч в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    9. Повторите шаги 2.5.4–2.5.8 в два раза больше для в общей сложности три лечения.
    10. Проверка старения маркеров или урожай для нисходящие приложения.
      Примечание: Как контролировать, использовать пролиферирующих клеток же PD, относились с 22,6 мкл стерильной воды на 2 ч в D10.
  6. Эпигеномно индуцированного старения
    1. Подготовка запасов и рабочие решения для малого molecule(s) для использования согласно таблице 1. Фильтр стерилизуйте решения. Алиготе стерильные пробирки. Хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Во время обработки клеток или любой материал, который будет находиться в контакте с их (пипец, фляги, СМИ и т.д.) работают в стерильных условиях, например, с помощью Ламинарный шкаф, лабораторный халат и перчатки. Держите клетки на 20% O2 (номер условия) только во время обработки.
    3. Семя 7 x 105 жизнеспособных первичных фибробластов в низкой PD в колбе T75 (~9.3 x 103 клеток/см2) содержащие 10 мл D10.
    4. Инкубируйте клетки на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    5. Подготовка 11 мл D10 средний + рабочее решение для желаемого лечения. Точное разведение за лечение можно увидеть в таблице 1.
      1. Подготовка 11 мкл 1 мм Саха рабочего раствора в 11 мл D10.
      2. Подготовьте 44 мкл 1 М натрия бутират рабочего раствора в 11 мл D10.
      3. Подготовка 11 мкл 10 мм 5-Аза рабочего раствора в 11 мл D10.
        Примечание: Оптимизация лечения для ячейки тип интереса, например, делая кривая доза ответ для оценки токсичности.
    6. Добавьте D10 средний + рабочий раствор для желаемого лечения в культуре.
    7. Проинкубируйте 24 ч в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    8. Повторите шаги 2.6.4–2.6.6 в два раза больше, в общей сложности три лечения.
    9. Изменение среднего для простых D10 без наркотиков.
    10. После 3 дней клетки становятся стареющей и готов для тестирования старения маркеров и нисходящие приложения.
      Примечание: как управления, использования пролиферирующих первичной фибробластов же PD, лечение за три дня с D10 средний + транспортного средства. D10 средний + транспортное средство необходимо обновлять каждые 24 ч в течение этих трех дней. Транспортного средства зависит от лечения используются: 1:1,000 ДМСО на Саха и 5-аза и 1: 250 стерильную воду для натрия бутират.

3. маркеры старение

  1. Подготовка
    1. Подготовка 20 мг/мл X-Гал: растворяют 20 мг в 1 мл диметилформамиде или ДМСО X-Гал. Хранить при-20 ° C, защищать от света.
    2. Подготовить раствор лимонной кислоты 0,1 М: растворить 2,1 г, лимонной кислоты моногидрат в 100 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    3. Приготовляют раствор натрия фосфат 0,2 М: растворить 2,84 г двуосновной фосфат натрия или 3.56 g двуосновной фосфат натрия дигидрат в 100 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    4. Подготовить 0,2 М лимонной кислоты/натрия фосфат pH 6.0: растворить 36.85 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и 63.15 мл фосфат натрия 0,2 М. Отрегулируйте точно до pH 6.0. Хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовка 100 мм Ферроцианид калия: растворить 2.1 g Ферроцианид калия в 50 мл воды. Хранить при 4 ° C, защищать от света.
    6. Подготовка 100 мм калия Гексацианоферрат: растворить 1,7 г калия Гексацианоферрат в 50 мл воды. Хранить при 4 ° C, защищать от света.
    7. Подготовить 5 M натрия хлорида: растворить 14,6 г хлорида натрия в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    8. Подготовить 1 М магния хлорид: растворить 4,8 г, магния хлорида в 50 мл воды. Хранить при комнатной температуре.
    9. Готовить 2% формальдегида + 0,2% глютаральдегид в PBS: растворить 800 мкл глютаральдегид 25% и 12,5 мкл 16% формальдегида в 100 мкл PBS. Хранить при комнатной температуре в защищенном от света.
    10. Приготовляют раствор окрашивание свежие согласно Таблица 2.
  2. Связанные старения β-галактозидазы пятнать
    1. Для каждого образца семян 1 х 104 клетки в по крайней мере один хорошо 24-ну пластины (5.2 x 103 клеток/см2) содержащий 500 мкл D10, так что клетки являются редкими. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, клетки, лечение уже может быть вновь посеяны в 24-ну плиту.
    2. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    3. Вымойте клетки два раза с 500 мкл PBS.
    4. Исправление 3 – 5 мин при комнатной температуре с помощью 500 мкл/хорошо 2% формальдегида + 0,2% глютаральдегид в PBS.
    5. Вымойте клетки два раза с 500 мкл PBS.
    6. Подготовьте свежие пятнать решения, по данным количество образцов пятно.
    7. Добавьте окрашивание раствора (500 мкл/а) и печать пластины с парафина, чтобы избежать испарения.
      Примечание: Испарение может вызвать кристаллы формы и препятствовать наблюдению под микроскопом.
    8. Инкубируйте клетки в темноте (например в алюминиевой фольги) при 37 ° C в сухой инкубатора (без CO2) для 12 – 16 ч.
      Примечание: CO2 может повлиять на рН и таким образом изменить результаты. Некоторые типы клеток может потребовать короче инкубационного раз.
    9. Мыть два раза с 500 мкл PBS.
    10. Оценить результаты. Позитивные клетки представляют голубой (главным образом) perinuclear окрашивание под микроскопом нормального света (рис. 1A).
    11. Для количественной оценки соблюдать по меньшей мере 100 клеток на сэмпл и подсчитать количество положительных клеток. Так как стареющей клетки изменить форму, часто бывает трудно определить границы ячейки и подсчитать количество ячеек. Изображение с DAPI для облегчения визуализации и количественная оценка отдельных клеток (рис. 1B). Количественно образцы (процент положительных клеток против общее количество клеток) с помощью флуоресцентный микроскоп (рис. 1 c). Принять несколько фотографий того же образца, так что в конце вы можете рассчитывать по крайней мере 100 сингл клетки и оценить процент положительных клеток SA-β-гал в них.
    12. Сравните результаты стареющей клетки против их соответствующего элемента управления для лечения используются.
      Примечание: Совместное окрашивание с EdU на том же образце Возможен экспорт. Рассмотрим, что клетки затем должна быть заполнена на coverslips.
  3. Включение анализа EdU
    1. Поставьте coverslip/колодец в пластине 24-Ну согласно количество образцов для оценки.
    2. 4 клетки семян 1 x 10 в по крайней мере один хорошо 24-ну плиты (5.2 x 103 клеток/см2) за состояние, содержащий 500 мкл D10, так что клетки являются редкими. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, уже обработанные клетки могут быть вновь посеяны в 24-ну плиту.
    3. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2.
    4. Сделайте раствор 20 мкм EdU в D10 (1: 250) согласно количество выборок для лечения (250 мкл на сэмпл).
    5. Удаление половины среднего (250 мкл) из каждой скважины для лечения и заменить его с D10 + EdU решение, которое было только что приготовленный. Конечная концентрация EdU-10 мкм.
    6. Инкубируйте 18 – 24 h в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO2 и 5% O2. Используйте то же время инкубации в управления и стареющей клетки.
    7. Вымойте 2 x с 500 мкл PBS.
    8. Исправьте ячейки для 10 мин с 500 мкл 4% формальдегида в PBS.
    9. Инкубируйте 5 мин в 500 мкл, 100 мм трис (рН 7,6).
    10. Разрушения клеток для 10 мин в 500 мкл 0,1% тритон X-100 в PBS.
    11. Вымойте 3 x с PBS.
    12. Подготовка 50 мкл метки смеси для каждого coverslip, добавляя компоненты в следующем порядке: 44,45 мкл PBS, 0.5 мкл Cu (II) т4, 0,05 мкл сульфогруппу Cy3-азид, 5 мкл Аскорбат натрия.
    13. Положите 50 мкл метки смеси на кусок парафина. Снять coverslip с помощью пара пинцеты и иглы и дайте ему отдохнуть на вершине лейбл микс, с поверхностью, содержащие клетки вниз. Убедитесь, что есть никаких пузырей и что вся поверхность coverslip трогательно лейбл микс. Инкубируйте 30 мин в темноте.
    14. Положите клетки обратно в скважинах пластину 24-Ну и мыть их в три раза с PBS.
    15. Смонтировать с монтажными средствами массовой информации (включая DAPI визуализировать ядер) на стеклянных вставках и дайте им высохнуть на ночь.
    16. Визуализируйте EdU включение с помощью флуоресцентный Микроскоп. Используйте фильтр, подходящий для Cy3 (возбуждения/выбросов: 552/570 Нм).
    17. Принимать несколько фотографии клеток для более поздних количественной оценки по крайней мере 100 ячеек на условие (Cy3 и DAPI).
    18. Подсчитать процент клеток, которые включены EdU с использованием следующей формулы:
      EdU позитивных клеток (%) = (количество положительных клеток Эду (Cy3) / общее количество клеток (DAPI)) * 100
    19. Сравните результаты стареющей клетки против их соответствующего элемента управления для лечения используются.
      Примечание: Совместное окрашивание с SA-β-Гал на том же образце Возможен экспорт. Рассмотрим, что клетки по-прежнему должна быть заполнена на coverslips.
  4. Выражение гена p16, p21 и SASP
    1. Подготовьте грунт наборы генов интерес (праймер 50 мкм).
      Примечание: ПЦР p16, p21 и некоторые соответствующие факторы SASP информативный старение статуса. Протокол описанных здесь делает использование системы универсальная библиотека зонд (ЕП) для относительной количественной оценки, с помощью реального времени ПЦР. Таблица 3 показывает обзор грунты, используемые для обнаружения CDK ингибиторы p16 и p21 и наиболее актуальных SASP-членов, а также тубулин и актина, которые служат в качестве справочных генов для assay. В последней колонке таблицы 3 привлекает особое УПЛ зонд для калибровочных.
    2. Подготовка смесь реакции отдельных ПЦР для желаемого анализов. Всегда включают ссылку генов также согласно таблице 4.
    3. Выполните все образцы в двух экземплярах или в трех экземплярах.
    4. Загрузите 7,5 мкл/хорошо смеси реакции ПЦР на тарелку, 384-хорошо.
    5. Добавить ~ 5 нг cDNA растворяют в 2,5 мкл РНКазы свободной воды.
      Примечание: Желательно иметь аналогичные количество cDNA для всех образцов для сравнения. Это может быть достигнуто с помощью равного количества РНК для обратной транскрипции.
    6. Крышка с уплотнением и убедитесь, что он прилипает правильно покрытие равномерно все скважины на плите.
    7. Спиновые пластину на 2000 x g за 1 мин.
    8. Запустите пластину в Lightcycler за 40 циклов, используя следующий протокол:
      95 ° C 7 мин
      40 циклов 95 ° c за 5 s и 60 ° C за 30 s
      37 ° C за 1 мин
    9. Для анализа результатов используйте метод, предложенный для Livak и коллег для анализа ПЦР данных24. Использовать или тубулин, или актин как ссылку генов для вычисления ΔCt значение и использовать соответствующий элемент управления для вычисления значения ΔΔCt для конкретных вызывающих старение лечения.
  5. Выражение протеина и секрецию ИЛ 6
    1. Семена 5 – 10 x 104 клетки в по крайней мере один хорошо 6-ну плиты (5.2-10.5 x 103 клеток/см2) за условия, содержащие 2 мл D10. Лечение (если применимо) могут быть выполнены непосредственно на этой табличке или, альтернативно, клетки, лечение уже может быть вновь посеяны в 24-ну плиту. Пусть он стоять на ночь после посева.
    2. Удалите носитель и заменить на 2 мл DMEM средних, без FBS. Инкубируйте в нормальных условиях за 24 ч.
    3. Соберите среднего в 15 мл.
    4. Центрифуга образца на 300 x g 5 мин среднего может храниться при температуре-80 ° C до обработки.
    5. Следуйте инструкциям производителя для выполнения ELISA.
    6. Сравните результаты стареющей клетки против соответствующего элемента управления для конкретных вызывающих старение лечения

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обогащение SA-β-Гал пятнать в стареющей фибробластов

Β-галактозидазы (β-gal) является лизосомальных ферментов, которая выражается во всех клетках и который имеет оптимальный рН 4,025,26. Однако, во время старения, лизосомы увеличение размера и, следовательно, стареющей клетки накапливаются β-Гал. Увеличение количества этого фермента позволяют обнаружить свою деятельность даже в неоптимальных рН 6,025,27. Рисунок 1A показывает представитель изображения SA-β-Гал пятнать в пролиферирующих против стареющей первичной фибробластов. Клетки также выглядят расширенного и с неправильной клетки тела. Как уже упоминалось, это может быть трудно отличить отдельных ячеек, чтобы совместно окрашивание с DAPI облегчает визуализацию и клеток подсчета (рис. 1B). Это необходимо принимать фотографии в флуоресценции Микроскоп, чтобы иметь возможность наблюдать DAPI пятнать. Это означает, что фотографии на канале светлые области будет принято в черно белый, так что «синий» окрашивание SA-β-Гал появится черный на фотографии. Следует отметить не все ячейки в рамках выборки являются позитивными для β-Гал. Эффективность старение индукции сильно зависит от стимул - и ячейки типа/сорт используется. Протоколы, описанные здесь дали > 50% β-Гал позитивных клеток в первичной фибробластов (BJ и WI-38) в наших руках.

Меньшее количество ячеек включают EdU после индукции старения

EdU-это аналог тимидина нуклеозидов, что, во время активного синтез ДНК, будут включены в ДНК28. Включение EdU в ДНК могут быть визуализированы после выполнения Copper-Catalyzed азид-алкины циклоприсоединения (CuAAC) для EdU, реакции, что не может быть выполнена в регулярных тимидина, потому что ей не хватает алкины группы28. В этот конкретный протокол используется сульфогруппу-Cy3-азид. Если муфта азид к алкины имело место, клетки будут отображаться флуоресценции под Cy3 фильтр (рис. 2A). Важно учитывать, что, выполняя пробирного включение Эду, клетки, которые распространяются можно отличить от не пролиферирующих клеток. Пролиферирующих клеток может быть покоя или стареющей, означает, что проба включения EdU не дискриминацию между этими двумя типами арест клеточного цикла.

Стареющей фибробластов upregulate CDK ингибиторы p16 и p21

Стареющей клетки сделать использование ингибиторов CDKs остановить клеточный цикл29. Особенно p16 и p21 часто измеряется как маркеры стареющей клетки3. Одного или обоих маркеров, как правило, upregulated в стареющей клетки, и upregulation часто измеряется на уровне транскрипционный анализ. Рекомендуется одновременно использовать оба маркера, поскольку некоторые клетки делают не upregulate p16 на уровне транскрипционный анализ и p21 является универсальным, но не конкретных маркера для старения15,17,30. Рисунок 3 показывает представителя относительно количественной p16 и p21 мРНК в фибробласты индуцированного старения. Возможны также другие методы, такие как иммуноокрашивания или Западный blotting для выявления уровня белка.

Стареющей фибробластов отображения SASP

Наиболее стареющей клетки транскрипционно upregulate несколько генов, кодирующих для выделяется белков, явление, называемое SASP6. SASP включает факторы воспаления, например, интерлейкины и chemokines, или в деградации внеклеточного матрикса (ECM), например, равенству, но это является весьма неоднородной. Индукции SASP факторов может оцениваться путем измерения, либо уровни mRNA выражение через ПЦР или уровни белка выделяется через сорбент Assay твердофазный иммуно (ELISA). Рисунок 4 показывает представительным изображением upregulation IL6 на уровне транскрипционный анализ и выделяется. Мы использовали IL6 только как представление; Однако рекомендуется измерить несколько членов SASP из списка предлагаемых по протоколу 3.4.

Figure 1
Рисунок 1: обогащение SA-β-Гал пятнать в стареющей первичной фибробластов. BJ первичной плоть фибробластов (PD 34.1) были вызваны на старение подвергая их воздействию ионизирующего излучения (10 гр). Клетки окрашивали для SA-βgal через десять дней после облучения. (A) представитель результаты для окрашивания SA-βgal в первичной фибробластов BJ лечить (вверх) или воздействию ионизирующего излучения (вниз). Окончательное увеличение: 100 X. (B) представитель фигура SA-β-Гал совместно витражи с DAPI для BJ первичной фибробластов либо необработанные (три левой панели) или воздействию ионизирующего излучения (три правой панели). DAPI окрашивание (синий) помогает визуализировать отдельных ячеек, облегчения количественной оценки. Фотографии, сделанные на ярко поля отображаются в черно белый. Таким образом в этих конкретных фотографии SA-β-Гал окрашивание будет выглядеть как черный perinuclear пятна. Окончательное увеличение: 100 X. (C) количественная оценка позитивных клеток SA-β-гал в пролиферирующих (Prol., белый) BJ фибробластов против ионизирующего облученных лечение коллегами (сенатор, синий). Количественная оценка была проведена с помощью три биологических реплицирует показаны Среднеквадратичная ошибка среднего значения погрешностей. Статистическая значимость определяется непарных двух Стьюдента t тест на значения Дельта CT. (n = 3, ± SEM, *** = p значение < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: меньше клеток включать EdU после индукции старения. (A) представитель изображение EdU включения анализа в пролиферирующих WI-38 фибробластов PD 43.86 (слева) и их ионизирующего облученного коллегами (справа). Окончательное увеличение: 100 X. (B) количественная оценка EdU позитивных клеток в пролиферирующих (Prol., белый) BJ фибробластов (38,7 PD) по сравнению с аналогичными облученного (сенатор, синий). Количественная оценка была проведена с помощью три биологических реплицирует показаны Среднеквадратичная ошибка среднего значения погрешностей. Статистическая значимость определяется непарных двух Стьюдента t тест на значения Дельта CT (n = 3, ± SEM, *** = p значение < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: стареющей фибробластов upregulate CDK ингибиторы p16 и p21. (A) количественная оценка p16 выражение mRNA в пролиферирующих (Prol., белый, PD 35,3) или 5-Аза лечение BJ клетки (сенатор, синий). (B) количественной оценки экспрессии мРНК p21 в пролиферирующих (Prol., белый, PD 35,3) или 5-Аза лечение BJ клеток (сенатор, синий). Количественная оценка была проведена с помощью три биологических реплицирует (каждый с двумя техническими реплицирует) показаны Среднеквадратичная ошибка среднего значения погрешностей. Статистическая значимость определяется непарных двух Стьюдента t тест на значения Дельта CT (n = 3, ± SEM, *** = p значение < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: стареющей фибробластов отображения секреторной фенотип (SASP). Выражение (A) количественная оценка IL6 мРНК в BJ фибробластов либо пролиферирующих (Prol., белый, 38,7 PD) или искусственное старение ионизирующего излучения (сенатор, синий). (B) количественная оценка выражения протеина IL6 в пролиферирующих PD 38,6 (Prol., белый) или ионизирующего излучения лечение WI38 фибробластов (сенатор, синий). Количественная оценка была проведена с помощью три биологических реплицирует показаны Среднеквадратичная ошибка среднего значения погрешностей. В случае данных ПЦР каждый биологические реплицировать имел два технических дубликаты. Статистическая значимость определяется непарных двух Стьюдента t тест на значения Дельта CT (n = 3, ± SEM, *** =p значение < 0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Разбавитель Стоковый раствор Рабочий раствор Разведение для лечения Конечная концентрация
САХА ДМСО 100 мм 1 мм 1:1,000 1 МКМ
Натрия бутират Стерильная вода --- 1 M 1: 250 4 мм
5-Аза-2'-Дезоксицитидин (5-Аза) ДМСО 100 мм 10 мм 1:1,000 10 МКМ

Таблица 1: Запасы и работы решения для различных процедур, используемых для эпигеномно индуцированного старения.

Компонент Объем Конечная концентрация
20 мг/мл X-Гал 1 мл 1 мг/мл
0,2 М лимонной кислоты/натрия фосфат буфером ph 6.0 4 мл 40 мм
Ферроцианид калия 100 мм 1 мл 5 мм
Гексацианоферрат калия 100 мм 1 мл 5 мм
Хлорид натрия 5 M 0,6 мл 150 мм
Хлорид магния 1 М 0,04 мл 2 мм
Воды 12.4 мл -
Итого 20 мл

Таблица 2: Состав окрашивание раствора для старения связаны (SA) - β - Гал пятнать.

Цель Вперед грунт (5'--> 3') Обратный грунт (5'--> 3') UPL зонд
Тубулин CTTCGTCTCCGCCATCAG CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC #40
Актин B ccaaccgcgagaagatga ccagaggcgtacagggatag #64
P16 GAGCAGCATGGAGCCTTC CGTAACTATTCGGTGCGTTG #67
P21 tcactgtcttgtacccttgtgc ggcgtttggagtggtagaaa #32
IL6 CAGGAGCCCAGCTATGAACT GAAGGCAGCAGGCAACAC #45
ИЛ 8 GAGCACTCCATAAGGCACAAA ATGGTTCCTTCCGGTGGT #72
IL1a GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA TGCTGACCTAGGCTTGATGA #6
CXCL1 CATCGAAAAGATGCTGAACAGT ATAAGGGCAGGGCCTCCT #83
CXCL10 GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA #34
CCL2 AGTCTCTGCCGCCCTTCT GTGACTGGGGCATTGATTG #40
CCL20 GCTGCTTTGATGTCAGTGCT GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG #39
PAI1 AAGGCACCTCTGAGAACTTCA CCCAGGACTAGGCAGGTG #19
ММП1 GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA TTTGTGCGCATGTAGAATCTG #7
MMP3 CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT CATCTTTTGGCAAATCTGGTG #72
MMP9 GAACCAATCTCACCGACAGG GCCACCCGAGTGTAACCATA #53

Таблица 3: Грунтовка последовательностей и их соответствующие УПЛ зонд для обнаружения мРНК старения маркеров в образцы человеческого происхождения.

Компонент Объем/образец
Sensifast зонд Lo-Rox микс 5 МКЛ
Грунтовка набор (50 мкм) 0.1 МКЛ
UPL зонд 0.1 МКЛ
Нуклеаза свободной воды 2.3 МКЛ
cDNA (~ 4 нг) 2.5 МКЛ
Итого 7.5 МКЛ

Таблица 4: Состав реакции ПЦР смесь для системы УПЛ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протоколы, описанные здесь были оптимизированы для первичной фибробластов, особенно BJ и WI-38 ячеек. Протоколы для репликативной старение, ионизирующего излучения и доксорубицина, успешно применялись к другим типам фибробластов (HCA2 и IMR90) и в других типах клеток (а именно новорожденным меланоцитов и кератиноцитов или iPSC производные кардиомиоцитов) в нашей лаборатории. Однако приспособления для типов дополнительных ячеек могут быть оптимизированы, регулируя некоторые детали, такие как количество клеток в сеяный, методы и химических веществ, чтобы помочь клетки для крепления/отсоединение пластиковые подставки и дозировка лечения, чтобы избежать токсичности.

Даже использование первичных фибробластов создает целый ряд проблем. Стареющей клетки обычно более трудно отделить чем их пролиферирующих коллеги, и они часто более чувствительны к trypsinization или любой другой тип отсоединение метод, означает, что жизнеспособность после отсоединения немного меньше, чем один из пролиферирующих клеток. Выбор соответствующего элемента управления для различных методов, вызывая старение-трудно. Например, для лечения на основе наркотиков например доксорубицин, мы предлагаем краткое обращение с транспортного средства: PBS для 24 h в случае контрольные образцы для доксорубицин лечение клетки следуют немедленного сбора/обработки. Можно утверждать, что клетки, индуцированного старения пройти через расширенный культуры время после лечения была применена (шести дополнительных дней культуры для доксорубицин лечение клеток) и что клетки управления должно быть культивировали равное количество времени после удаления PBS. Однако, такой длинный культуры позволит клетки разделить дальше, чтобы стать чрезмерного притока или требуют дальнейшего пассированый и увеличить PD. чрезмерной слияния может привести к старения маркеров, такие как SA-β-Гал появляться несмотря на поддержание клетки их растет число потенциальных31. Увеличение PD будет получить их ближе к их репликации (и репликативной старения) и сделать их менее сопоставимы с их коллегами-доксорубицин лечение. Аналогичная ситуация будет применяться для других процедур. Мы предложили элементы управления, которые мы считаем более целесообразным для каждого случая.

Большинство методов, используемых для заставить клетки в старение похоже, относительно простой и прямой вперед, но многие факторы могут повлиять на результат экспериментов. Например концентрация глюкозы нормальные обычные клетки культуры средств массовой информации для фибробластов – 4,5 г/л. Однако для некоторых типов клеток, таких как стволовые клетки, более низкие концентрации глюкозы расширить их пролиферативный потенциал32, в то время как для других более высоких концентрациях может привести к преждевременной33. Кроме того как стареющей клетки высоко метаболических и тратить большое количество энергии для производства факторов выделяется34, другие связанные старение фенотипов могут быть затронуты колебания концентрации глюкозы.

Другой потенциальной переменная в среде культуры клеток — сыворотки. В состав сыворотки обычно не определен и зависит от животного происхождения и пакете. В частности количество факторов роста и про воспалительные белки могут повлиять старение35. Мы рекомендуем, что той же партии сыворотка используется для всего эксперимента чтобы избежать ненужных и накладывающееся изменчивости. Тем не менее некоторые неизбежные технических условий, например, использование сыворотки бесплатные среды, используемые для некоторых протоколов на основе ELISA может уменьшить SASP выражение.

Напряжения кислорода имеет важное значение для полного старение индукции. Гипоксия может ингибировать geroconversion, так что клетки не размножаются, но не являются необратимо арестованных36. Однако наиболее распространенной проблемой в экспериментальной установки является не гипоксии, но условиях гипероксии. Действительно условия стандартной культуры часто используют 20% кислорода, как «normoxia», но физиологические условия для большинства типов клеток ниже. Бластоцисты мыши представлять маркеры старения (повреждение ДНК и SA-βgal) когда культивированный на 20% кислорода, в отличие от их в vivo-производных партнеров или же клетки культивировали в 5% кислорода37. Кроме того фибробласты мыши культивировали в более физиологических условиях (3% кислорода), а не на обычные одни (20% кислорода) дисплей SASP38. Здесь мы использовали 5% кислорода для всех культур и экспериментов и мы настоятельно призываем исследователей пересмотреть концентрации кислорода, используемые для конкретной ячейки типа интереса.

Наконец еще один фактор, чтобы рассмотреть является внутренняя неоднородность стареющей клетки. С одной стороны различия в старение связанные фенотипов отображения различных типов клеток и даже клеток штаммов. Например некоторые штаммы фибробластов делать не upregulate p16 на уровне транскрипционный анализ на старение индукции15,16,17, как это показано на рисунке 3A, где, несмотря на видя upregulation из P16, это не было статистически значимым. P16 также контролируется на уровне поступательные и столб-поступательные, поэтому измерять уровни белка может в некоторых случаях демонстрируют увеличение активности ингибитора этого CDK. Однако это может быть, что некоторые клетки просто полагаться на другие ингибиторы CDK как p21. Мы рекомендуем измерять transcriptional уровни обоих из них. Точный состав SASP зависит также от клетка, которая производит3. Кроме того некоторые клетки конститутивно Экспресс высокий уровень β-галактозидазы, давая положительный результат для SA-β-Гал пятнать это не обязательно свидетельствует о старения3. В некоторых случаях эта проблема может быть преодолены путем сокращения время инкубации с окрашивание раствора во время окрашивания протокол SA-β-Гал. Как уже упоминалось, чрезмерного притока клетки могут также пятно с SA-β-Гал без них стареющей31, поэтому мы настоятельно призываем исследователей в культуре клеток малонаселенных для выполнения этой окраски. С другой стороны старение фенотип, сам не является стабильной39. Время зависимых17,40состав SASP и внешний вид других меток старения. Здесь мы предложили моменты времени после каждого лечения в ячейки, которые считаются полностью стареющей и регулярно используются в нашей лаборатории. Важно отметить, что измерения маркеры на короткий момент времени может отображать отрицательные результаты из-за неполной старение40. Кроме того поскольку в большинстве лечения процент клеток становится стареющей, с использованием точки длиннее время может дать достаточно времени для несколько не стареющей клетки расширить и перегнать культуры, снижение экспрессии стареющей маркеров. В представлениях неоднородность стареющей клетки и несколько предостережений различных маркеров мы настоятельно рекомендуем исследователей использовать несколько маркеров старения в рамках той же пробы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Н/Д

Acknowledgments

Мы благодарим членов Demaria лаборатории для плодотворных обсуждений и Thijmen ван Влит для совместного использования данных и протокол на УФ индуцированного старения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Media - GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Tags

Биология развития выпуск 136 сотовой старение старение рак подавления опухоли ткани ремонт секрецию экспрессии генов генотоксичных стресс химиотерапии облучения эпигенетики
Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez-Segura, A., Brandenburg,More

Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter