Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57782

Summary

Her diskuterer vi en rekke protokoller for induksjon og validering av mobilnettet senescence i kulturperler celler. Vi fokuserer på ulike senescence-inducing stimuli og beskrive kvantifisering av vanlige senescence-assosiert markører. Vi tilbyr tekniske detaljer med fibroblaster som modell, men protokollene kan tilpasses ulike mobilnettet modeller.

Abstract

Mobilnettet senescence er en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon aktivert svar på ulike skadelige stimuli. Aktivering av mobilnettet senescence er et kjennetegn på ulike patofysiologiske forhold inkludert svulst undertrykkelse, vev remodeling og aldring. Indusere av mobilnettet senescence i vivo kjennetegnes fortsatt dårlig. En rekke stimuli kan imidlertid brukes til å fremme mobilnettet senescence ex vivo. Blant dem er de vanligste senescence-indusere replicative utmattelse, ioniserende og ikke-ioniserende stråling, gentoksisk narkotika, oksidativt stress, demethylating og acetylerende agenter. Her vil vi gi detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker disse stimuli for å indusere fibroblaster til senescence. Denne protokollen kan lett tilpasses for ulike typer primære celler og linjer, inkludert kreftceller. Vi har også beskriver forskjellige metoder for validering av senescence induksjon. Spesielt fokusere vi på å måle aktiviteten til lysosomale enzymet Senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-gal,) frekvensen av DNA-syntese med 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) inkorporering analysen, nivåer av uttrykket av cellen syklus hemmere p16 og p21, og uttrykket og sekresjon av medlemmene av Senescence-Associated sekretoriske fenotypen (SASP). Endelig vi gi eksempel resultater og diskutere videre programmer av disse protokollene.

Introduction

I 1961 rapportert Hayflick og Moorhead at primære fibroblaster i kultur miste sitt proliferativ potensial etter påfølgende avsnitt1. Denne prosessen er forårsaket av den sekvensielle forkortelsen av telomeres etter hver celledeling. Når telomeres når en kritisk kort lengde, gjenkjennes de av DNA-skade svar (DDR) som aktiverer en irreversibel arrest spredning-også definert som replicative senescence. Replicative senescence er en av mange stimuli som er kjent for å indusere en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon som gjengir cellene ufølsomt både mitogens og apoptotisk signaler2,3. Senescence programmet er vanligvis preget av tilleggsfunksjoner inkludert høy lysosomale aktivitet, mitokondrie dysfunksjon, kjernefysiske endringer, chromatin rearrangements, endoplasmatiske retikulum stress, DNA skade og en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP)3,4. Senescent celler har flere funksjoner i kroppen: utvikling, sår helbredelse og tumor undertrykkelse2. Like, de er kjent for å spille en viktig rolle i aldring og paradoksalt nok i svulst progresjon5. Negativ, og delvis motstridende, effekten av senescence er ofte knyttet til SASP6.

Nylig ble det vist at eliminering av senescent celler fra mus fører livslengden utvidelse og eliminering av mange av aldring funksjoner7,8,9,10,11, 12. er utviklet flere medikamenter på samme måte, å enten fjerne senescent celler (senolytics) eller å målrette de SASP13,14. Anti-aging terapeutiske potensialet har nylig fått mer oppmerksomhet til feltet.

Studiet av mekanismer knyttet til mobilnettet senescence og visninger for farmakologiske intervensjoner avhengig tungt av ex vivo modeller, spesielt på menneskelig primære fibroblaster. Mens det er noen fellestrekk aktivert ved ulike senescence indusere, er en stor variasjon i senescence fenotypen observert og avhengig av forskjellige faktorer, inkludert celle type, stimulans og tid punkt3,15, 16,17. Det er viktig å vurdere heterogenitet for å studere og målretting senescent celler. Derfor mål denne protokollen å gi en rekke metoder for å indusere senescence i primære fibroblaster ved hjelp av ulike behandlinger. Som det vil bli forklart, kan metodene lett tilpasses andre celletyper.

Bortsett fra replicative senescence, beskriver vi fem andre senescence-inducing behandlinger: ioniserende stråling, ultrafiolett (UV) stråling, doksorubicin, oksidativt stress og epigenetic endringer (nemlig markedsføringen av histone acetylation eller DNA demethylation) . Både ioniserende stråling og UV-stråling direkte DNA skade og på riktig dose, utløse senescence18,19. Doksorubicin fører også til senescence hovedsakelig gjennom DNA skade av intercalating i DNA og forstyrre topoisomerase II funksjon og dermed stoppe DNA reparasjon mekanismer20. Uttrykket av gener som er avgjørende for senescence er vanligvis styrt av histone acetylation og DNA metylering. Som en konsekvens, utløse histone deacetylase hemmere (f.eks, natrium butyrate og SAHA) og DNA demethylating (f.eks 5-aza) agenter senescence i andre normale celler21,22.

Til slutt, fire av de vanligste markørene knyttet til senescent celler vil bli forklart: aktiviteten til den senescence tilknyttet-β-galactosidase (SA-β-gal), rate av DNA-syntese av EdU innlemmelse analysen, overuttrykte celle syklus regulatorer og cyclin-avhengige kinase hemmere p16 og p21, og overuttrykte og sekresjon av medlemmene av SASP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generelle forberedelser

  1. Forberede D10 medium. Supplere DMEM medium-Glutamax med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin (siste konsentrasjon: 100 U/mL).
  2. Forberede sterilt PBS. Oppløse tabletter i vann etter produsentens instruksjoner. Sterilisere av autoclave.
  3. Forberede 1 x trypsin. Fortynne 5 mL av Trypsin-Versene EDTA/10 x 1:10 i 45 mL steril PBS.
    Merk: Gjennom protokollen, vi bruker celle kultur forhold som er nærmere den fysiologiske forhold for primære fibroblaster. Dette betyr at vi ruge cellene på 37 ° C og 5% CO2 som er normalt gjort, men bruker 5% O2 i stedet for "standard" 20% O2.
  4. Håndtere alle prøvene i sterile forhold ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.

2. induksjon av Senescence

  1. Replicative Senescence
    1. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.) fungerer under sterile forhold, ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    2. Frø 7 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav befolkning dobling (PD) i en MT75 bolle (~9.3 x 103 celler/cm2) som inneholder 10 mL D10.
    3. Vokse cellene i en celle inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 til de når 70 – 80% samløpet (3-4 dager for voksende kulturer i en lav PD).
    4. Koble celler med 3 mL 1 x trypsin og rugende for ~ 5-7 min i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2. Overvåke cellene regelmessig med celle kultur mikroskop sjekke detaching prosessen.
    5. Når cellene er sfærisk, stoppe trypsin reaksjonen ved å legge til 9 mL D10. Ikke ruge lenger enn 10 min.
    6. Spinne cellene på 300 x g for 5 min. celler vil danne pellets nederst på røret, mens rusk og mindre partikler vil forbli i nedbryting.
    7. Fjerne nedbryting og oppløse celle pellet i 1 mL av D10 og utføre en celletall bruker en automatisert celle teller i henhold til produsentens instruksjoner eller en Neubauer kammer for manuell opptelling. Mens teller, Inkluder en analyse for å sjekke levedyktigheten til cellene (f.eks, Trypan Blue utelukkelse23).
    8. Beregne kumulative PD bruker denne formelen:
      PDnye = 3.32* (LOG(cell number total)-(Logg (celle nummer seeded)) + PDold
      Celle nummer totale = alle celler som telles: døde og levende.
      Celle nummer seeded = antall levedyktige cellers seeded (8 x 105 celler).
      PDgamle = befolkningen dobling i øyeblikket av frø.
      PDnye = befolkningen dobling i øyeblikket av telle (etter inkubasjon).
      Merk: Hvis 7 x 105 primære fibroblaster (PD 35,2) var frø på en T-75 kolbe og, etter 4 dager de nå 80% samløpet og deles igjen, teller nå 1,3 x 106 totalt celler (død + levende).
      PDnye = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDnye = 36,1
    9. Reseed 8 x 105 celler i en ny MT75, Gjenta trinn 2.1.2–2.1.8.
      Merk: Etter flere påfølgende passasjer, kulturen ta lengre tid å få confluent til celler slutter å dele hele. Når celler slutter å dele, test for senescence markører og/eller høste for nedstrøms programmer.
    10. Vurdere at større størrelsen på senescent celler kan forårsake kulturen full og ennå har en lav celletall. Dermed senescence kan antas når PD er stabil og andre senescence markører i kultur (se protokoller 3.1-3,5).
      Merk: Bruk voksende primære fibroblaster som kontroll.
  2. Ioniserende stråling-indusert Senescence
    1. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.), arbeid under sterile forhold ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    2. Frø 7 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav PD i en MT75 bolle (~9.3 x 103 celler/cm2) som inneholder 10 mL D10.
    3. Inkuber cellene over natten i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    4. Utsett cellene til 10 grå av gamma bestråling i henhold til instruksjonene av maskinen i bruk.
    5. Sug opp mediet cellene og erstatte med 10 mL D10.
    6. Inkuber cellene i 10 mL D10 i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 for en annen 10 dager erstatte mediet regelmessig, omtrent hver tredje dag.
    7. Etter 10 dager, test for senescence markører og/eller bruke cellene for nedstrøms programmer.
      Merk: Bruk voksende primære fibroblaster av samme PD (før bestråling) som kontroll.
  3. Ultrafiolett (UV) indusert stråling-Senescence
    1. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.), arbeid under sterile forhold ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    2. Frø 1,5-2 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav PD i en godt av en 6-vel plate (1.5-2.0 x 104 celler/cm2), legge til 2 mL D10 medium.
    3. Plasserer cellene i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 og tillate dem å overholde plast minst 5 h.
    4. Ta av mediet fra cellene. Plasser 6-vel platen i UV-stråling kammeret og ta av plast lokket. Irradiate med UVB, 20-30 mJ/cm2.
    5. Legg 2 mL medium per brønn.
    6. Inkuber cellene i 2 mL D10 i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2 for en annen 7 dager erstatte mediet regelmessig, omtrent hver tredje dag.
      Merk: Etter 7 dager, celler kan være testet for senescence markører og brukt til nedstrøms. Bruke voksende primære fibroblaster av samme PD (før bestråling) som kontroll.
  4. Doksorubicin-indusert Senescence
    1. Forberede 1000 x doksorubicin lagerløsning: gjøre en 250 µM lager av doksorubicin i 1 x PBS, filter-sterilisere løsningen og aliquot i 500 µL per sterilt rør. Lagre doksorubicin aksjen på-80 ° C.
    2. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.), arbeid under sterile forhold ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    3. Frø 7 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav PD i en MT75 bolle (~9.3 x 103 celler/cm2) som inneholder 10 mL D10.
    4. Inkuber cellene over natten i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    5. Fortynne 11 µL 1000 x doksorubicin lagerløsning i 11 mL D10 til en siste konsentrasjon av 250 nM.
    6. Sug opp mediet cellene og erstatte med 10 mL D10 + doksorubicin.
    7. Inkuber celler for nøyaktig 24 timer i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    8. Sug opp mediet cellene og nøye vask en gang med 10 mL D10.
    9. Inkuber cellene i 10 mL D10 for en annen 6 dager erstatte mediet regelmessig, omtrent hver tredje dag.
    10. På dag 7 test for senescence markører og/eller bruke for nedstrøms programmer.
      Merk: som kontroll, bruk proliferating primære fibroblaster av samme PD behandlet for 24 timer med bil (PBS) 1:1,000 i D10.
  5. Oksidativt Stress-indusert Senescence
    1. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.) fungerer under sterile forhold ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    2. Frø 7 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav PD i en MT75 bolle (~9.3 x 103 celler/cm2) som inneholder 10 mL D10.
    3. Inkuber cellene over natten i en celle inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    4. Forberede en løsning av ~ 200 μM Hydrogenperoksid i D10 medium ved å legge 22.6 μL 30% Hydrogenperoksid i 11 mL D10.
      Merk: Optimalisere behandling for celle type interesse ved å gjøre en kurve dose-respons å vurdere toksisitet.
    5. Sug opp mediet cellene og tilsett 10 mL av nylagde D10 medium + hydrogenperoksid. Inkuber 2 h på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    6. Sug opp mediet cellene og vaskes en gang med fersk D10 uten hydrogenperoksid.
    7. Legge til 10 mL D10 uten hydrogenperoksid.
    8. Inkuber 48 h i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    9. Gjenta trinn 2.5.4–2.5.8 to ganger mer for totalt 3 behandlinger.
    10. Kontroller senescence markører eller harvest for nedstrøms programmer.
      Merk: Som kontroll, bruk voksende celler av samme PD behandlet med 22.6 µL sterilt vann i D10 2 h.
  6. Epigenetically-indusert Senescence
    1. Klargjør lager og arbeider løsninger for de små molecule(s) i tabell 1. Filter-sterilisere løsninger. Aliquot i sterilt rør. Butikken på 20 ° C.
    2. Under behandling av celler eller materiale som vil være i kontakt med dem (Pipetter for flergangsbruk, flasker, media, etc.) fungerer under sterile forhold, for eksempel ved hjelp av laminær strømning hette, laboratoriefrakk og hansker. Hold celler på 20% O2 (rom betingelser) bare mens håndteres.
    3. Frø 7 x 105 levedyktig primære fibroblaster i en lav PD i en MT75 bolle (~9.3 x 103 celler/cm2) som inneholder 10 mL D10.
    4. Inkuber cellene over natten i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    5. Forberede 11 mL D10 medium + fungerende løsning for ønskede behandling. Den eksakte fortynning per behandling kan sees i tabell 1.
      1. Forberede 11 µL av 1 mM SAHA fungerende løsning i 11 mL D10.
      2. Forberede 44 µL av 1 M natrium butyrate fungerende løsning i 11 mL D10.
      3. Forberede 11 µL av 10 mM 5-aza fungerende løsning i 11 mL D10.
        Merk: Optimalisere behandlingene for celle type interesse, for eksempel å lage en kurve dose-respons å vurdere toksisitet.
    6. Legg D10 medium + fungerende løsning for ønsket behandling til kultur.
    7. Inkuber 24 h i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    8. Gjenta trinn 2.6.4–2.6.6 to ganger mer, for totalt 3 behandlinger.
    9. Endre medium for enkel D10 uten narkotika.
    10. Etter 3 dager mer blir celler senescent og klar for testing av senescence markører og nedstrøms programmer.
      Merk: som kontroll, bruk proliferating primære fibroblaster av samme PD behandlet i tre dager med D10 medium + kjøretøy. D10 medium + bilen må oppdateres hver 24 h i de tre dagene. Bilen avhenger behandlingen brukes: 1:1,000 DMSO for SAHA og 5-aza og 1:250 sterilt vann for natrium Butyrate.

3. markører for Senescence

  1. Forberedelse
    1. Forberede 20 mg/mL X-gal: oppløse 20 mg X-gal i 1 mL av vannistedenfor eller DMSO. Lagre på 20 ° C beskyttet mot lyset.
    2. Forberede 0.1 M sitronsyre løsning: oppløse 2.1 g sitronsyre monohydrat i 100 mL vann. Lagre ved romtemperatur.
    3. Forberede 0,2 M natrium fosfat løsning: oppløse 2.84 g av natrium dibasic fosfat eller 3.56 g av natrium dibasic fosfat tørke i 100 mL vann. Lagre ved romtemperatur.
    4. Forberede 0,2 M sitronsyre/natrium fosfat pH 6.0: oppløse 36.85 mL 0.1 M sitronsyre løsning og 63.15 mL 0,2 M natrium fosfat. Juster nøyaktig til pH 6.0. Lagre ved romtemperatur.
    5. Forberede 100 mM kalium ferrocyanide: oppløse 2.1 g av kalium ferrocyanide i 50 mL vann. Lagre på 4 ° C beskyttet mot lyset.
    6. Forberede 100 mM kalium ferricyanide: oppløse 1,7 g av kalium ferricyanide i 50 mL vann. Lagre på 4 ° C beskyttet mot lyset.
    7. Forberede 5 M natriumklorid: oppløse 14,6 g natriumklorid i 50 mL vann. Lagre ved romtemperatur.
    8. Forberede 1 M magnesiumklorid: oppløse 4.8 g magnesiumklorid i 50 mL vann. Lagre ved romtemperatur.
    9. Forberede 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyde i PBS: oppløse 800 µL av 25% glutaraldehyde og 12,5 µL av 16% formaldehyd i 100 μL PBS. Lagre ved romtemperatur beskyttet mot lyset.
    10. Forberede flekker løsning frisk ifølge tabell 2.
  2. Senescence-assosiert β-galactosidase flekker
    1. For hver prøve, frø 1 x 104 celler i minst ett godt av en 24-vel plate (5.2 x 103 celler/cm2) inneholder 500 µL av D10 slik at cellene er sparsom. Behandlinger (hvis aktuelt) kan utføres direkte på denne platen, eller eventuelt cellene behandlet allerede kan være nytt frø i en 24-vel plate.
    2. Inkuber cellene overnatting på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    3. Vask celler to ganger med 500 μL PBS.
    4. Fastsette 3-5 minutter ved romtemperatur med 500 μL/brønn 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyde i PBS.
    5. Vask celler to ganger med 500 μL PBS.
    6. Forberede frisk flekker løsning, av antall prøver stain.
    7. Legge til farging løsning (500 µL/vel) og forsegle platen med parafilm å unngå fordampning.
      Merk: Fordampning kan forårsake krystaller form og hindre observasjon under mikroskopet.
    8. Inkuber celler i mørket (f.eks dekket i aluminiumsfolie) på 37 ° C i en tørr inkubator (uten CO2) for 12-16 h.
      Merk: CO2 kan påvirke pH og derfor endre resultatene. Noen celletyper krever kortere inkubasjon ganger.
    9. Vask to ganger med 500 μL PBS.
    10. Vurdere resultatene. Positiv celler presentere en blå (mest) perinuclear flekker under vanlig lys mikroskop (figur 1A).
    11. For kvantifisering, observere minst 100 celler per prøve og telle antall positive celler. Siden senescent celler endre form, er det ofte vanskelig å definere grenselinjene for cellene og telle celler. Counterstain med DAPI å lette visualisering og kvantifisering av individuelle celler (figur 1B). Kvantifisere prøvene (prosentandel av positive celler mot antall celler) med et fluorescerende mikroskop (figur 1 c). Ta flere bilder av samme utvalget slik at på slutten kan du telle minst 100 enkelt-celler og evaluere prosentandelen av SA-β-gal positiv celler.
    12. Sammenligne resultatene for senescent celler mot deres aktuelle kontrollen for behandling brukes.
      Merk: En co flekker med EdU på samme prøven er mulig. Vurdere at celler skal deretter bli sådd på coverslips.
  3. EdU innlemmelse analysen
    1. Sette et dekkglassvæske/godt i en 24-vel plate av antall prøver å vurdere.
    2. Frø 1 x 104 celler i minst ett godt av en 24-vel plate (5.2 x 103 celler/cm2) per betingelse som inneholder 500 µL av D10 slik at cellene er sparsom. Behandlinger (hvis aktuelt) kan utføres direkte på denne platen, eller alternativt allerede behandlet celler kan være nytt frø i en 24-vel plate.
    3. Inkuber cellene overnatting på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2.
    4. Lage en 20 µM løsning av EdU i D10 (1:250) av antall prøver å behandle (250 μL per prøve).
    5. Ta halvparten av mediet (250 μL) fra hver brønn å behandle og erstatte den med D10 + EdU løsning som var bare forberedt. Siste EdU konsentrasjonen er 10 µM.
    6. Inkuber 18 – 24 h i en celle kultur inkubator på 37 ° C med 5% CO2 og 5% O2. Bruk inkubasjon samtidig i kontroll og senescent celler.
    7. Vask 2 x med 500 μL PBS.
    8. Fastsette celler for 10 min med 500 μL 4% formaldehyd i PBS.
    9. Inkuber 5 min med 500 μL av 100 mM Tris (pH 7.6).
    10. Permeabilize celler for 10 min i 500 μL på 0,1% Triton X-100 i PBS.
    11. Vask 3 x med PBS.
    12. Forberede 50 μL av etikett for hver dekkglassvæske, legge til komponenter i følgende rekkefølge: 44.45 µL av PBS, 0,5 µL av Cu (II) SO4, 0,05 µL av sulfo-Cy3-azide, 5 µL av natrium-askorbat.
    13. Sette 50 μL av etiketten miksen på et stykke parafilm. Løft dekkglassvæske ved hjelp av et par pinsett og en nål og la den hvile over etiketten miksen, med overflaten cellene vendt nedover. Kontroller at det ikke er noen bobler og at hele overflaten av dekkglassvæske berører etiketten mix. Inkuber i 30 min i mørket.
    14. Sett cellene tilbake i brønnene av 24-vel plate og vask dem tre ganger med PBS.
    15. Montere med montering medier (inkludert DAPI for å visualisere kjerner) på glass lysbilder og la dem tørke over natten.
    16. Visualisere EdU inkorporering med fluorescerende mikroskop. Bruk et filter passer for Cy3 (eksitasjon/utslipp: 552/570 nm).
    17. Ta flere bilder av celler for senere kvantifisering av minst 100 celler per betingelse (Cy3 og DAPI).
    18. Kvantifisere prosentandelen av celler som EdU ved hjelp av følgende formel:
      EdU positiv celler (%) = (EdU positiv celletall (Cy3) / totalt celletall (DAPI)) * 100
    19. Sammenligne resultatene for senescent celler mot deres aktuelle kontrollen for behandling brukes.
      Merk: En co farging med SA-β-gal på samme prøven er mulig. Vurdere at celler skal fortsatt være seeded på coverslips.
  4. Genuttrykk p16, p21 og SASP
    1. Forberede primer-sett av gener av interesse (50 µM primer).
      Merk: En qPCR p16, p21 og noen relevante SASP faktorer er informativ senescence status. Protokollen beskrevet her gjør bruk av Universal undersøke biblioteket (UPL) for relativ kvantifisering bruker en sanntid PCR. Tabell 3 viser en oversikt over primere brukt for påvisning av CDK hemmere p16 og p21 og mest relevante SASP medlemmer og Tubulin og begrepsordbok, som fungerer som referanse gener for analysen. Den siste kolonnen tabell 3 får bestemt UPL sonden skal brukes for hver analysen.
    2. Forbered separat qPCR reaksjonen blanding for de ønskede analyser. Alltid inkludere referanse genet også etter Tabell 4.
    3. Kjør alle prøvene i to og tre eksemplarer.
    4. Last 7.5 µL/vel av qPCR reaksjonen blanding på en 384-vel plate.
    5. Legge til ~ 5 ng av cDNA oppløst i 2,5 µL RNase uten vann.
      Merk: Det anbefales å ha lignende mengder cDNA for alle prøvene skal sammenlignes. Dette kan oppnås ved å bruke like mengder av for omvendt transkripsjon.
    6. Dekk platen med en forsegling og sørge for at det stikker riktig dekker jevnt alle brønnene på tallerkenen.
    7. Snurre tallerken 2000 x g for 1 min.
    8. Kjøre platen i Lightcycler for 40 sykluser med følgende protokollen:
      95 ° C i 7 min
      40 sykluser av 95 ° C for 5 s og 60 ° C for 30 s
      37 ° C i 1 min
    9. For analyse av resultatene, bruker du metoden foreslått for Livak og kolleger til å analysere qPCR data24. Bruk enten Tubulin eller utgangen som referanse gener beregne ΔCt verdien og bruk den aktuelle kontrollen til å beregne den for ΔΔCt-verdien for den spesifikke senescence-inducing behandlingen.
  5. Protein uttrykk og sekresjon av IL6
    1. Ætt 5-10 x 104 celler i minst ett godt av en 6-vel plate (5.2-10.5 x 103 celler/cm2) per betingelse som inneholder 2 mL D10. Behandlinger (hvis aktuelt) kan utføres direkte på denne platen, eller eventuelt cellene behandlet allerede kan være nytt frø i en 24-vel plate. La den stå over natten etter seeding.
    2. Fjerne mediet og erstatte for 2 mL DMEM medium uten FBS. Inkuber i normale forhold i 24 timer.
    3. Samle inn mediet i en 15 mL tube.
    4. Sentrifuge prøven på 300 x g for 5 min. Medium kan lagres ved-80 ° C til behandlet.
    5. Følg produsentens instruksjoner for å utføre ELISA.
    6. Sammenligne resultatene for senescent celler mot den aktuelle kontrollen for bestemte senescence-inducing behandling

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anriking av SA-β-gal farging i senescent fibroblaster

Β-galactosidase (β-gal) er en lysosomale enzym som er uttrykt i alle celler og som har en optimal pH 4.025,26. Men under senescence, lysosomer øke i størrelse, og følgelig senescent celler akkumulere β-gal. De økte mengder Dette enzymet gjør det mulig å oppdage sin virksomhet på en suboptimal pH 6.025,27. Figur 1A viser representant bilder av SA-β-gal farging i voksende versus senescent primære fibroblaster. Cellene også se forstørret og med en uregelmessig celle kroppen. Som nevnt, kan det være vanskelig å skille individuelle celler, slik at en co farging med DAPI forenkler visualisering og celle teller (figur 1B). Det er nødvendig å ta bilder i en fluorescens mikroskop for å se den DAPI flekker. Dette betyr at bildene for lyse feltet kanalen vil bli tatt i svart/hvitt, slik at den "blå" flekker av SA-β-gal vises svarte på bildene. Av notatet er ikke alle cellene i et utvalg positivt for β-gal. Effektiviteten av senescence induksjon er svært avhengig av stimulus- og celle type/påkjenningen brukes. Protokollene beskrevet her gitt > 50% β-gal positiv celler i primære fibroblaster (BJ og WI-38) i våre hender.

Færre celler innlemme EdU etter innledningen av senescence

EdU er en analog av nukleosid thymidine at under aktiv DNA-syntese, vil bli innarbeidet i DNA28. Inkorporering av EdU DNA kan visualiseres etter utføre Copper-Catalyzed Azide-Alkyne cycloaddition (CuAAC) for EdU, reaksjon som ikke kan utføres i vanlige thymidine fordi den mangler alkyne gruppe28. I dette bestemte protokollen brukes en Sulfo-Cy3-azide. Hvis koblingen av azide til alkyne har funnet sted, vises celler fluorescens under et Cy3-filter (figur 2A). Det er viktig å ta hensyn til at ved å utføre EdU innlemmelse analysen, kan celler som er proliferating skilles fra ikke-voksende celler. Ikke-voksende cellene kan være enten quiescent eller senescent, betyr at EdU innlemmelse analysen ikke diskriminerer mellom disse to typer celle syklus arrestasjon.

Senescent fibroblaster upregulate Innholdsutviklingssettet hemmere p16 og p21

Senescent celler gjøre bruk av hemmere av CDKs for å stoppe celle syklus29. Spesielt p16 og p21 måles ofte som markører senescent celler3. Enten en eller begge markører er normalt upregulated i senescent celler, og oppregulering måles ofte på transcriptional nivå. Det oppfordres til å bruke merkene samtidig siden noen celler ikke upregulate p16 på transcriptional nivå og p21 er en universell men ikke spesifikk markør for senescence15,17,30. Figur 3 viser representant relative quantifications av p16 og p21 mRNA i fibroblaster overtalt til å senescence. Andre teknikker som immunostai-og/eller vestlige blotting å oppdage protein nivå finnes også.

Senescent fibroblaster vise en SASP

Mest senescent celler transcriptionally upregulate flere gener som koder utskilles proteiner, et fenomen som kalles SASP6. SASP inkluderer faktorer involvert i betennelser, f.eks, interleukins og chemokines, eller ekstracellulær matrix (EFM) fornedrelse, f.eks, MMPs, men det er svært heterogen. Induksjon av SASP faktorer kan evalueres ved å måle enten mRNA uttrykk nivåer via qPCR eller nivåer av utskilles protein via Enzyme-Linked Immuno absorberende analysen (ELISA). Figur 4 viser et representativt bilde viser oppregulering av IL6 både på transcriptional og utskilles. Vi brukte IL6 bare som en representasjon; men er det oppmuntret å måle flere medlemmer av SASP fra listen foreslo protokollen 3.4.

Figure 1
Figur 1: anriking av SA-β-gal farging i senescent primære fibroblaster. BJ primære foreskin fibroblaster (PD 34,1) ble indusert til senescence ved å utsette dem til ioniserende stråling (10 Gy). Cellene ble farget for SA-βgal ti dager etter bestråling. (A) representant resultater for SA-βgal farging i BJ primære fibroblaster ubehandlet (opp) eller utsatt for ioniserende stråling (ned). Siste forstørrelse: 100 X. (B) representant figuren av SA-β-gal co farget med DAPI for BJ primære fibroblaster enten ubehandlet (tre venstre panel) eller utsatt for ioniserende stråling (tre høyre panel). DAPI flekker (blå) bidrar til å visualisere enkeltceller tilrettelegge kvantifiseringen. Bilder tatt på lyse-feltet vises i hvitt. Derfor i disse bestemt bildene SA-β-gal vil flekker se ut svart perinuclear flekker. Siste forstørrelse: 100 X. (C) kvantifisering av SA-β-gal positiv celler i voksende (Prol., hvit) BJ fibroblaster versus ioniserende bestrålt behandlet kolleger (Senator, blå). Kvantifisering ble utført ved hjelp av tre biologiske gjentak feilfelt viser standard feil av gjsnitt. Statistisk betydning ble bestemt av en kort tosidige Student t-test på deltaet-CT verdier. (n = 3, ± SEM, *** = p verdien < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: færre celler innlemme EdU etter innledningen av senescence. (A) representativt bilde av EdU innlemmelse analysen i voksende WI-38 fibroblaster PD 43.86 (venstre) og deres ionisert bestrålt kolleger (høyre). Siste forstørrelse: 100 X. (B) kvantifisering av EdU positiv celler i voksende (Prol., hvit) BJ fibroblaster (PD 38,7) versus papirformat bestrålt (Senator, blå). Kvantifisering ble utført ved hjelp av tre biologiske gjentak feilfelt viser standard feil av gjsnitt. Statistisk betydning ble bestemt av en kort tosidige Student t-test på deltaet-CT verdier (n = 3, ± SEM, *** = p verdien < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Senescent fibroblaster upregulate Innholdsutviklingssettet hemmere p16 og p21. (A) kvantifisering av p16 mRNA uttrykk i voksende (Prol., hvit, PD 35,3) eller 5-aza-behandlet BJ celler (Senator, blå). (B) kvantifisering av p21 mRNA uttrykk i voksende (Prol., hvit, PD 35,3) eller 5-aza-behandlet BJ celler (Senator, blå). Kvantifisering ble utført ved hjelp av tre biologiske replikat (hver med to tekniske replikerer) med feilfelt viser standard feil av gjsnitt. Statistisk betydning ble bestemt av en kort tosidige Student t-test på deltaet-CT verdier (n = 3, ± SEM, *** = p verdien < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Senescent fibroblaster vise en sekretoriske fenotypen (SASP). (A) kvantifisering av IL6 mRNA uttrykk i BJ fibroblaster enten proliferating (Prol., hvit, PD 38,7) eller indusert til senescence av ioniserende stråling (Senator, blå). (B) kvantifisering av IL6 protein uttrykk i voksende PD 38,6 (Prol., hvit) eller ioniserende stråling-behandlet WI38 fibroblaster (Senator, blå). Kvantifisering ble utført ved hjelp av tre biologiske gjentak feilfelt viser standard feil av gjsnitt. I tilfelle av qPCR data hadde hver biologiske replikere to tekniske duplikater. Statistisk betydning ble bestemt av en kort tosidige Student t-test på deltaet-CT verdier (n = 3, ± SEM, *** =p verdien < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fortynner Lagerløsning Fungerende løsning Fortynning for behandling Siste konsentrasjon
SAHA DMSO 100 mM 1 mM 1:1,000 1 ΜM
Natrium butyrate Sterilt vann --- 1 M 1:250 4 mM
5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza) DMSO 100 mM 10 mM 1:1,000 10 ΜM

Tabell 1: Lager og arbeider løsninger for de ulike behandlinger som brukes for Epigenetically-indusert Senescence.

Komponent Volum Siste konsentrasjon
20 mg/mL X-gal 1 mL 1 mg/mL
0,2 M sitronsyre/natrium fosfat buffer ph 6.0 4 mL 40 mM
100 mM kalium ferrocyanide 1 mL 5 mM
100 mM kalium ferricyanide 1 mL 5 mM
5 M natriumklorid 0,6 mL 150 mM
1 M magnesiumklorid 0.04 mL 2 mM
Vann 12.4 mL -
Totalt 20 mL

Tabell 2: Sammensetning av flekker løsningen brukes for Senescence forbundet (SA) - β - gal flekker.

Mål Videresende Primer (5'--> 3) Omvendt Primer (5'--> 3) UPL sonde
Tubulin CTTCGTCTCCGCCATCAG CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC #40
Utgangen B ccaaccgcgagaagatga ccagaggcgtacagggatag #64
P16 GAGCAGCATGGAGCCTTC CGTAACTATTCGGTGCGTTG #67
P21 tcactgtcttgtacccttgtgc ggcgtttggagtggtagaaa #32
IL6 CAGGAGCCCAGCTATGAACT GAAGGCAGCAGGCAACAC #45
IL8 GAGCACTCCATAAGGCACAAA ATGGTTCCTTCCGGTGGT #72
IL1a GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA TGCTGACCTAGGCTTGATGA #6
CXCL1 CATCGAAAAGATGCTGAACAGT ATAAGGGCAGGGCCTCCT #83
CXCL10 GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA #34
CCL2 AGTCTCTGCCGCCCTTCT GTGACTGGGGCATTGATTG #40
CCL20 GCTGCTTTGATGTCAGTGCT GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG #39
PAI1 AAGGCACCTCTGAGAACTTCA CCCAGGACTAGGCAGGTG #19
MMP1 GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA TTTGTGCGCATGTAGAATCTG #7
MMP3 CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT CATCTTTTGGCAAATCTGGTG #72
MMP9 GAACCAATCTCACCGACAGG GCCACCCGAGTGTAACCATA #53

Tabell 3: Primer sekvenser og deres tilsvarende UPL probe for å oppdage mRNA av Senescence markører i prøver av menneskets opprinnelse.

Komponent Volum/sample
Sensifast undersøke Lo-Rox blanding 5 ΜL
Primer-sett (50 µM) 0,1 ΜL
UPL sonde 0,1 ΜL
Nuclease-fritt vann 2.3 ΜL
cDNA (~ 4 ng) 2,5 ΜL
Totalt 7.5 ΜL

Tabell 4: Sammensetning av qPCR reaksjonen blanding for UPL systemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollene forklart her var optimalisert for menneskelig primære fibroblaster, spesielt BJ og WI-38 celler. Protokollene for replicative senescence, ioniserende stråling og doksorubicin, har blitt aktivert for andre typer fibroblaster (HCA2 og IMR90) og i andre celletyper (nemlig neonatal melanocytter og keratinocytter eller iPSC-avledet cardiomyocytes) i vårt laboratorium. Imidlertid kan tilpasninger for flere celletyper optimaliseres ved å justere noen detaljer som antall seeded celler, metoder og kjemikalier som hjelper celler for feste/koble til plast støtter og dosering av behandling for å unngå toksisitet.

Med bruk av primære fibroblaster utgjør en rekke utfordringer. Senescent celler er vanligvis vanskeligere å ta enn sine voksende kolleger, og de er ofte mer sensitiv til trypsinization eller annen type frakobling metoden, betyr at levedyktigheten etter frakobling er litt lavere enn en av voksende celler. Valg av den aktuelle kontrollen for forskjellige senescence-inducing metoder er vanskelig. For eksempel for narkotika-baserte behandlinger som doksorubicin, foreslår vi en kort behandling med bilen: PBS 24 h i kontroll prøver for doksorubicin-behandlet celler etterfulgt av umiddelbar høsting/behandling. Det kan hevdes at celler overtalt til å senescence går gjennom en utvidet kultur tid etter behandling ble brukt (seks ekstra dager kultur for doksorubicin-behandlet celler) og at kontroll celler skal kulturperler lik mengde tid etter fjerning av PBS. Men slik lang kultur ville at cellene å dele videre, å bli over confluent eller å kreve ytterligere passaging og øke PD. over samløpet kan forårsake senescence markører, som SA-β-gal vises tross celler opprettholde deres voksende potensielle31. Økt PD ville få dem nærmere å Replikasjons begrense (og replicative senescence) og gjøre dem mindre sammenlignbare doksorubicin-behandlet i papirformat. En lignende situasjon vil gjelde for andre behandlinger. Vi har foreslått kontrollene som vi vurdere mer passende for hvert enkelt tilfelle.

Mesteparten av teknikkene som brukes å indusere celler i senescence synes relativt enkel og rett fram, men mange faktorer kan påvirke utfallet av eksperimenter. For eksempel, er normal glukose konsentrasjonen av konvensjonelle celle kultur medier for fibroblaster 4,5 finans Men for noen celletyper som stamceller utvide lave konsentrasjoner av glukose deres proliferativ potensielle32, mens andre høyere konsentrasjoner kan føre til tidlig senescence33. Videre senescent celler er svært metabolsk og bruke store mengder energi for å produsere utskilles faktorer34, kan andre senescence-assosiert fenotyper bli påvirket av svingninger i glukose konsentrasjoner.

En annen potensiell variabel i celle kultur medium er serum. Sammensetningen av serum er normalt ikke definert og varierer etter dyr kilden og satsvis. Spesielt, kan mengden av vekstfaktorer og pro-inflammatoriske proteiner påvirke senescence35. Vi anbefaler at den samme gruppen av serum brukes for hele eksperimentet for å unngå unødvendig og forvirrende variasjon. Likevel, noen uunngåelige tekniske forhold som bruk av serum-free medium brukes for noen ELISA protokoller kan redusere SASP uttrykk.

Oksygen spenningen er viktig for komplett senescence induksjon. Hypoksi kan hemme geroconversion, slik at cellene ikke sprer ikke men er irreversibelt arrestert36. Imidlertid er det vanligste problemet i eksperimentell oppsettet ikke hypoksi men hyperoxia. Faktisk standard oppdrettsforholdene bruke ofte 20% oksygen som "normoxia", men fysiologiske forhold for de fleste celletyper er lavere. Mus blastocysts presentere markører for senescence (SA-βgal og DNA skade) når kultivert på 20% oksygen, i motsetning til sine i vivo-avledet kolleger eller de samme cellene kultivert på 5% oksygen37. Videre kultivert musen fibroblaster på flere fysiologiske forhold (3% oksygen) og ikke på tradisjonell de (20% oksygen) utfoldelse en SASP38. Her vi brukte 5% oksygen for alle kulturer og eksperimenter, og vi oppfordrer forskere revurdere Oksygenkonsentrasjoner brukes for bestemt celle type interesse.

Endelig, er en annen faktor å vurdere den iboende heterogeniteten senescent celler. På den ene siden viser ulike celletyper og selv cellen stammer forskjeller i senescence-assosiert fenotyper. For eksempel, gjøre noen stammer av fibroblaster ikke upregulate p16 på transcriptional nivå på senescence induksjon15,16,17, som det også vist i figur 3A, der til tross for å se en oppregulering av P16, dette var ikke statistisk signifikant. P16 kontrolleres også på translasjonsforskning og post-translasjonell, så måle protein nivået kan i noen tilfeller vise en økt aktivitet av denne CDK inhibitor. Imidlertid kan det være at noen celler bare stole på andre CDK-hemmere som p21. Vi anbefaler måle transcriptional nivåer av begge. Nøyaktig sammensetningen av SASP er også avhengig av cellen som produserer den3. Videre uttrykke noen celler constitutively høye nivåer av β-galactosidase, gir et positivt resultat for SA-β-gal flekker som ikke er nødvendigvis indikativ av senescence3. I noen tilfeller kan dette problemet overvinnes ved reduserer inkubasjon flekker løsning under SA-β-gal fargeprotokoll. Som nevnt, kan over confluent celler også flekker med SA-β-gal uten dem blir senescent31, så vi oppfordrer forskere på kultur celler tynt for å utføre denne flekker. På den annen side, er senescence fenotypen selv ikke stabil39. Sammensetningen av SASP og utseendet til andre markører av senescence er tidsavhengige17,40. Her har vi foreslått tidspunkt etter hver behandling i celleområdet anses fullt senescent og som rutinemessig brukes i vårt laboratorium. Viktigere, gjengi måle markører på en kortere tidspunkt negative resultater på grunn av ufullstendige senescence40. Videre, siden de fleste av behandlingene prosent av celler ikke blir senescent, bruke en lengre tidspunkt kan gi nok tid for noen ikke-senescent celler å utvide og innhente kultur, redusere uttrykk for senescent markører. Utsikten over heterogenitet senescent celler og de flere begrensningene på ulike markørene oppfordrer vi forskere å bruke flere senescence markører i samme utvalget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

I/T

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av The lab for fruktbart diskusjoner og Thijmen van Vliet for deling av data og protokollen på UV-indusert senescence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Media - GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Tags

Utviklingsbiologi problemet 136 mobilnettet senescence aldring kreft svulst undertrykkelse reparasjon av vev sekresjon genekspresjon gentoksisk stress kjemoterapi bestråling epigenetics
Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez-Segura, A., Brandenburg,More

Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter