Summary
大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632 を使用して従来の手順を簡素化します。
Abstract
新鮮な皮膚組織とその拡大培養から分離されたプライマリ ヒト角は実験室の研究および臨床応用、広く使用されています。ヒト角化従来の分離方法は、低細胞回収率、減らされた細胞による成体組織から細胞を生成する効率的に証明されている 2 つの連続酵素消化手順生存率。我々 は最近、媒体の Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632 を活用した皮膚組織中の人間の主な表皮の前駆細胞を分離する高度な方法を報告しました。従来のプロトコルと比較して、この新しいメソッドは、単純な簡単に、そして少ない時間のかかる、上皮幹細胞収量が増加し、その幹細胞の特性が向上します。さらに、新しい方法論は真皮から表皮の分離を必要としないし、したがって、異なったタイプの大人のティッシュからの細胞を隔離するために適しています。この新規分離培養手法は従来の方法の主な欠点を克服、高能室と臨床応用の両方表皮細胞の大量生産に適しています。ここでは、詳細に新しい手法について述べる。
Introduction
目標は、臨床応用の特に成体からプライマリ人間ケラチノ サイト (HKCs) を分離する簡単で効率的なプロトコルを開発することでした。皮膚表皮幹細胞、皮膚の基底層に局在を持って増殖し区別するため、皮膚1,2,3,の機能を維持するケラチノ サイトを提供する可能性の高い4. HKCs 組織は皮膚組織工学と再生のために特に痛んだ肌の修復と遺伝子治療臨床応用5,6広く皮膚から分離しました。HKC ベースのアプリケーションにとって重要な問題は、効率的に分離し、高い潜在的な体外7,8で HKCs の大きな数字を展開することです。これらのメソッドは時々 時間がかかり、実行および低細胞収率と皮膚標本の種類によって限定されているなど、その他の制限に関して複雑なさまざまな研究グループは、幹のような HKCs の文化を生産する方法を開発しているが、9を使用します。例えば、皮膚組織中の HKCs を分離する従来の方法は、6真皮から表皮の分離と 2 段階の酵素消化を含まれます。そのメソッドは通常新生児の組織のためによく働くが、成体組織から細胞を分離するために使用するとき非常に困難します。
Y-27632、Rho 関連キナーゼ (ロック) の阻害剤は、表皮幹細胞の分離と植民地成長10、11,12の効率を大きく向上する報告されています。以前の研究では、我々 は Y-27632 は表皮細胞のクローナルな増殖が容易になりますが、特異的接着分子13式を制御することによって皮膚細胞の収量が減少を発見しました。また、G の中、成長と一次表皮細胞の収量をサポートすると呼ばれる新しいエアコン接種媒体を確立しました。Y-27632 を G の中を組み合わせることによりこの手法自発的に表皮真皮分離13,14のステップを除去する酵素の消化力の後表皮及び真皮細胞を区切ることができます。大人の皮膚組織から HKCs を分離するこの新しい方法の詳細な手順を述べる今以前の報告に基づき、.
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Protocol
このプロトコルで使用される人間の組織は、金融機関の人間研究倫理委員会のガイドラインによると処理されている (NO.2015120401、日: 2015 年 5 月 12 日)。
1. 準備
- 冷たいダルベッコの 10 mL と 50 mL のチューブの病院で整形手術から破棄収集新鮮な大人の腹部皮膚組織のイーグル培地 (DMEM)、変更されました。供試体は、細胞生存率を大きく影響せず 72 h まで 4 ° C で保存できます。
- 下記のとおり、試薬、培地を準備します。
- (100 U/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (100 mg/L) の 1 mL を 50 mL のリン酸緩衝液 (PBS) 洗濯ソリューションを準備するのに追加します。
- 酵素消化液の 2 つのセットを準備: (1) 当期 (DMEM で 2.5 mg/mL) の 50 mL を準備し、50 mL のタイプ I はコラゲナーゼ (DMEM で 2.5 mg/mL) 別に従来法;(2) 当期の混合物の 50 mL を準備し、コラゲナーゼをタイプ I (ディゾルブ 125 mg 当期粉末、125 mg の I 型コラゲナーゼ粉 DMEM の 50 mL の) 新しいメソッドの。
注: すべての酵素のソリューション必要がありますフィルタ リング 0.22 μ m ストレーナー付けや at4 ° C を保持 - 両方のメソッドに対して消化ソリューションを準備: 0.05% トリプシンと 0.25% トリプシンに商業的に購入しました。10 mg/ml DNase 私私粉末の 5 mL の PBS、DNase の 50 mg を溶解することによりソリューション 0.22 μ m ストレーナーとフィルター、-20 ° C で保存
- 酵素の消化力を中和するために媒体の 500 mL を準備: 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン DMEM 培。
- 500 ml 接種培地 (成長因子を含む中、G の中と呼ばれる) の: 40 ng/mL の線維芽細胞成長因子 2 (FGF2) 20 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、40 μ g/mL fungizone 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM/F12 (3:1) 培地と2 %b27 を補足します。
- 100 mm 細胞培養を前処理料理型を含むコーティング マトリックスの 2 mL の私部屋の温度で 30 分のコラーゲン。
2. 従来の方法
-
皮膚組織の前処理方法
- 皮膚組織の 1.5 cm2を取るし、それを洗って 1 x 10 の mL の PBS。30 の 70% エタノール 10 mL 洗い流し、s それを孵化と 10 ml の洗浄ソリューション (PBS 2% ペニシリンとストレプトマイシンを含む)、5 分の 2 倍。
注: すべての洗浄は、層流フードの内部 100 mm 細胞培養皿で行われます。 - 100 mm 細胞培養ディッシュで皮下脂肪層を削除し、(重量はこのプロトコルでは 1 g) 皮膚組織を推し量る滅菌はさみで組織をトリミングします。
注: 十分なトリミングは真皮から表皮の効率的な分離のため非常に重要です。黄色の脂肪層は、視覚的に簡単に区別できます。 - ダウン組織を別 100 mm 滅菌皿真皮側に転送、その後、皮膚組織をメス刃を使用して 3-4 mm 幅の短冊状にカットします。
注: 脂肪層と真皮側が視覚的に認識されます簡単に。 - 100 mm ディッシュの皮膚組織に 2.5 mg/mL 当期溶液 10 mL を追加し、その後、4 ° C (20 h 以上) で一晩中皿をインキュベートします。
注: 当期溶液の量は、組織の各グラムの消化のため当期溶液 10 mL を使用して計算できます。
- 皮膚組織の 1.5 cm2を取るし、それを洗って 1 x 10 の mL の PBS。30 の 70% エタノール 10 mL 洗い流し、s それを孵化と 10 ml の洗浄ソリューション (PBS 2% ペニシリンとストレプトマイシンを含む)、5 分の 2 倍。
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皮膚組織からの表皮の分離
- 2 日目、良いピンセットを使用して真皮から表皮をはがします。
注: 表皮を剥がしにくい場合は、当期の消化が足りなかった、ティッシュの不十分なトリミングのため通常であります。この場合、組織より長い培養時間を必要があります。 - メス刃; を使用して組織液に細胞培養液 500 μ L で皮をむいた表皮をミンチします。10 mL を 50 mL チューブに 0.25% トリプシンとそれを再懸濁し、それの揺れで、37 ° c の水浴中 20 分を孵化させなさい。
- 2 日目、良いピンセットを使用して真皮から表皮をはがします。
-
コレクション、初代培養細胞の培養
- トリプシン活性を中和する中和液 (このプロトコルでは 10 mL) の等しい量を追加することによって。
- 20 x 上下ソリューションを 10 mL の血清ピペットでピペッティングによる表皮細胞を分離し、残存組織の残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー携帯ソリューションを渡します。
- ろ過の後 200 x gで 5 分で細胞液を遠心分離します。洗浄用中和培地で細胞ペレットを再懸濁します、その後、細胞ペレットを取得する 200 x gで再度遠心。
- 低カルシウム、無血清ケラチノ サイト媒体 (SFM) の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。このソリューション総細胞数をカウントし、コーティングのマトリックスで前処理した 100 mm 細胞培養皿に SFM の 10 mL で約 2 x 10 の6セルをプレートの 10 μ L を取る (を含むタイプ I コラーゲン)。
注: コーティングは、従来の方法に必要なステップです。 - 培養培地ごとの 2 d を変更します。
注: は前に、と培養液を変更した後、顕微鏡の下で細胞粘着をチェックします。 - 通路、細胞の約 80% に達すると合流。
注: すべての培養皿はコーティング行列で前処理しました。
3 新しい方法
-
皮膚組織の前処理方法
- 組織に従って上記 (ステップ 2.1) 従来の方法を収集します。
- 皮膚組織 1 を洗って 10 ml の PBS の x (重量はこのプロトコルでは 1 g 程度) 電子スケールで滅菌したプラスチック容器の重さと。
注: このプロトコルに必要な組織の最小重量は 0.1 g 使用組織標本が小さすぎる場合、十分な細胞数を得ることが困難だからです。オペレーターの処理能力に依存する最終的にこのプロトコルのための組織の最大重量はありません。 - 鉗子を使用して、30 の 70% エタノール 10 mL で皮膚組織を洗浄する s。
- 2 組織をインキュベート洗浄ソリューション (2.1.1 の手順で準備)、5 分の各時間の 10 ml x。
注: 上記すべての洗浄手順は、100 mm 細胞培養皿 (ティッシュ文化フード) の層流フードの内部で実行されます。 - 滅菌 100 mm セル ディッシュを別組織に転送します。
- メスのブレードを使用すると、すると、組織は組織スラリーに徹底的にミンチします。
- 濡れている組織を維持する 200 μ L の PBS 5 分ごとを追加します。
注: は、手順 3.1.5 - 3.1.7 約 15 分かかります。上記のすべての手順は、部屋の温度で行われます。
-
皮膚組織の消化
- 50 mL チューブに均質化組織ソリューションを転送します。皮膚組織のすべての 1 g の酵素の混合物の 10 mL を追加します。均質化組織に酵素を徹底的にミックスします。
- 1 h の 37 ° C の水浴の揺れとの混合物を孵化させなさい。
- 37 ° C の水浴中で 30 分間別消化混合物に 1/5 量 0.25% トリプシン (このプロトコルで 2.5 mL) を追加します。
- DNase を追加私ソリューション 1: 100 (v/v) 比率 (このプロトコルで 250 μ L) で酵素の混合し、室温で 5 分間インキュベートします。
-
コレクション、初代培養細胞の培養
- 1:1 の比率で中和中 12.5 mL を追加することによって消化力プロセスを停止します。約 20 x、10 mL の血清ピペットを使用してセルを分離するソリューションを上下にピペットします。
- ティッシュの残骸を削除する 100 μ m セル ストレーナー解離細胞をフィルターします。200 x gで 5 分間観察チューブの下部にペレットで上清を遠心します。
- 上澄みを廃棄し、200 x g細胞を収集するために 5 分間で 10 mL、中和中、遠心力で細胞ペレットをもう一度洗浄します。
- 10 mL 接種培地 (G ステップ 1.2.5 から媒体) の Y-27632 の 10 μ m で細胞ペレットを再懸濁します。
- 総セル数をカウントし、100 mm 細胞培養ディッシュに G の中の 10 mL で約 2 x 10 の6セルをプレートに溶液 10 μ L を取る。
注: プリコートのステップは新しいメソッドに必要ななく、真皮層の除去は不要ですか。 - 3 d の後、接種培地を低カルシウム SFM 媒体に置き換えます。培養培地ごとの 2 d を変更します。
注: は前に、と媒体を変更した後に細胞接着をチェックします。 - 通路、細胞の約 80% に達すると合流。
注: 必要に応じて、2 分の 0.05% トリプシンで細胞を前処理し、表皮細胞をトリプシン前に皮膚細胞を汚染する PBS のセルを洗浄します。
4. 細胞の継
- メディアを取り出して、洗浄、pbs セルと、(各 100 mm 皿) あたり 0.05% トリプシンの 2 mL を加えます。
- 5 分のためのインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) のセルを孵化させなさい。
- すべての細胞が培養皿から切り離されるかどうかを確認する顕微鏡を使用しているセルを確認します。
- 10 %dmem の 8 mL を加えて酵素反応を中和し、15 mL チューブに細胞を収集し、FBS。
- 200 x g細胞ペレットを取得する 5 分間の遠心分離機します。
- ゆっくりと上澄みを除去、その後、SFM 培地 10 ml 細胞ペレットを再懸濁し、セルの数をカウントします。
- 1 x 10 の6セルは、各セル 100 mm 皿に SFM の 10 mL でプレートします。
- 媒体ごとの 2 d を変更します。
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Representative Results
(図 1 b) の従来の方法と新しい方法 (図 1 a) の回路図は図 1に示した。従来は、2 日目の手順を必要とする 2 段階の消化です。対照的に、新しいメソッドは、実行に約 3 時間かかりますワンステップ消化です。重要なは、ワンステップの新しいメソッドは接種培地に Y-27632 の存在に依存する同時に 2 つの集団 (表皮および真皮細胞) を取得できます。また、初期文化時間約 80% に到達する表皮細胞に、同じ数のセルは分離後接種した場合に合流で最低 3 日間より少なく従来の方法よりも通常かかります。
新しいメソッドは、コロニー形態で育つ他の主の表皮細胞を生成します。G の中で組織が接種された人間の皮膚から分離された HKCs Y-27632 を含みます。同じ数のセルは、コントロールとして従来の方法メッキだった。図 2 aは、最初の接種後 3 と 5 日間で表皮細胞の代表的なイメージを示しています。コロニーの形態として成長する傾向が新しいメソッドから得られる細胞。接種は、カウント キット 8 (CCK-8) を接種 (図 2 b)、異なる時点でセルを使用して査定された、新しい法により作製したセルの約 3-4 日の倍加時間でがの約 6 〜 8 日後の成長曲線、従来の方法。7 日で細胞の利回りを算出しました。結果は、図 2、新しいメソッドが初期接種後少なくとも 3 日間少ない (図 2 D) 合流点に到達するために必要な時間従来より 3 倍以上のセルを得られたことを示すに表示されます。7 日では、表皮細胞は、新しい方法ではなく、従来法 (図 2 D) に合流を達した。
新しいメソッドは、一次電池によって α6-インテグリン発現を強化しました。Α6-インテグリンは表皮幹細胞15によって表現される高度示されています。新しい法により分離した細胞では、いくつかの通路後皮膚基底細胞の特性が維持されます。コロニーの成長は、皮膚の基底層から派生した表皮の幹細胞の特性の 1 つ、α6 インテグリン発現の高いこれらの表皮幹細胞のもう一つの特徴。Y-27632 添加増大 α6 - 3 (図 3 aB) の通路で表皮細胞のインテグリン発現と通路 3、新しいメソッドを使用して分離された表皮細胞は皮膚細胞による汚染表示なし13.体外の展開時に、いくつかの通路の後基底細胞機能を維持するために非常に重要です。3 継代後これらの細胞と基底細胞マーカー ケラチン 5 の分化マーカー loricrin16 , 蛍光抗体法 (IF) 解析を行ったすべてのセルの 90 %k5 陽性であったが、それらの 10% 未満は loricrin (図 3 - 3 D) 表現が分かった。分離されたプライマリ HKCs 新しいメソッドを使用して表皮幹細胞の人口が含まれてし、基底細胞の特徴を維持することができますが示唆されました。もはや HKCs は継代より彼らは、区別するために開始します。新しいメソッドによって、表皮細胞培養、培養8 の通路まで増殖能力を維持できるとわかった。最後に、我々 は、表皮及び真皮細胞の混合物は分離の直後に接種したので、新しいメソッドを使用して分離された表皮細胞の純度をテストしました。初期の文化を汚染のいくつかの皮膚細胞を削除するトリプシン短時間 (2-3 分) 治療と表皮細胞の比較的純粋な人口が 1 つの通路 (図 4) の後得られました。
図 1: 新規および従来の分離のプロシージャの比較。(A) このパネル、新規分離培養手法の概略を示しています。1 日で解離皮膚細胞は G の中で再接種 Y-27632 の有無。2 日間の Y-27632 の存在下で表皮細胞を選択的に展開します。6 日目の周り細胞継は十分な密度に達する。(B) このパネルは、従来の分離法の概略を示しています。表皮が真皮から分離されているし、2 日目で表皮細胞を分離、電池が約 10 日間で継は十分な密度に達する通常。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 新しい分離法が主な表皮細胞の収穫量を増加します。初期接種後 3 と 5 日で新しいメソッド (上の行)、(下の行) の従来の方法を準備する表皮細胞のこのパネル ショー代表 (A) 画像。スケール バー = 200 μ m。 (B) 主 HKCs、新規および従来の作製方法はキット-8 (CCK-8) を数えるセルを使用して実行可能な細胞の解析のため示された時間ポイントで収集されました。(C) 細胞の総数は新しい法により作製したし、従来法による接種後 7 日目で数えられました。(D) 新しい分離法と従来法の両方のプライマリ表皮細胞 (通過 0) の合流点に到達する平均時間が表示されます。パネルB - D: スチューデントのt-テストは使用された;誤差範囲を示す標準偏差;n = 4;< 0.01、 p * p < 0.05 従来の方法と新しい方法を比較するとき。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 新しいメソッドによって得られる主な表皮細胞が基底細胞の間に機能を維持することが体外拡張します。(A) このパネルを示します Y-27632 (Y-27632、赤) で扱われる α6 インテグリン発現通路 3 表皮細胞の FACS 解析または Y-27632 (コントロール、灰色) 48, (B) のないこのパネル表示高細胞の定量解析α6- Aのパネルからインテグリンの発現レベル信号 > 103、高 α6 インテグリン発現を定義 * * p < 0.01。(C) このパネル (赤); K5 (赤) と loricrin の免疫蛍光染色の代表的なイメージを示しています。DAPI (青) は、核を染色に使用されました。スケールバー = 100 μ m。 このパネル (D) K5 と loricrin 陽性細胞の定量分析を示しています。400 のセルの合計は、各グループを定量化する数えられたし、K5 と loricrin 陽性細胞の平均数が表示されます。また、実験独立していない 4 回で繰り返されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 新しいメソッドを使用して最初の通過後比較的純粋な表皮細胞が得られた。(A) このパネル ショー蛍光染色ビメンチンの (赤) 0 (P0) と 3 (P3) の通路で表皮細胞の代表的な画像DAPI (青) は、核を染色に使用されました。スケールバー = 50 μ m。 このパネル (B) 0 (P0) と 1 (P1) の通路でビメンチン陽性細胞の定量分析を示しています。400 のセルの合計は、各グループを定量化する数えられたし、ビメンチン陽性細胞数の平均が表示されます。また、実験独立していない 4 回で繰り返されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
培養主 HKCs は、3 年以上の診療所で傷を治療するために広く利用されているし、その時間以来常にタイムリーで効率的に臨床応用のための細胞の十分な数を取得することが重要です。したがって、実習では、真皮から表皮の分離を必要とする従来の分離法が難しく細胞と成体細胞を通過する低能力の低収量のためのこれらの要求を満たすために。ここでは、効率的に研究室と臨床応用の両方より適している前レポート13,14、に基づいて成体組織から HKCs を取得するため開発した新しい手法について述べる.
新しい方法で最良の結果を達成するために次の重要な手順に注意を支払わなければなりません。まず、均質化の手順は重要な手順です。破砕不足は明らかに解離細胞の低収量で酵素消化の効率に影響を与えます。第二に、トリプシン消化手順は、; 30 分以上を服用してはいけませんそうでなければ、解離細胞の生存率が低下します。第三に、解離細胞を効率的に収集するには、ろ過用セル ストレーナーの細孔径が 100 μ m にする必要があります、セル溶液 20 mL 以上のフィルターに単一ストレーナーを使用する必要があります。第四に、初期めっきの密度は、高細胞密度が皮膚細胞に Y-27632 の抑制効果を削減皮膚細胞の混入を最小限に抑えるための重要な要因です。したがって、メッキ前に、の分離のプロシージャの終わりに解離細胞の総数を正確にカウントすることが重要です。
最初に、新しいメソッドは分離手順を簡素化: 2 つの従来の分離手順通常行うには、2 日間がかかり、トリミングの手順は特に成体 (のため、皮膚から脂肪組織を完全に削除することが重要図 1);それ以外の場合、当期に一晩消化後真皮から表皮の非効率的な分離があります。接種13後皮膚細胞の成長を阻害する、Y-27632 を利用して新しいメソッドが真皮から表皮を分離する必要はありません。 し、したがって、脂肪組織を削除するトリミングの手順は新しいのため必要ではありません。メソッドは、実行する半日のみを必要とします。第二に、新しいメソッドも簡素文化以来、伝統的なメソッドを持つ解離細胞は通常に 10% を添加した培地で照射マウス線維芽細胞の送り装置の層で培養した FBS またはコラーゲン プレコート皿に。動物由来成分は、常に臨床応用は避けるべきリスク要因です。エアコン接種の無血清培地 (G 中)、培養皿のプリコートのステップは必要ありません、また G 中 Y-27632 併用の付着を促進するためプライマリ ケラチノ サイト13の収量を高める開発を行った文化に表皮細胞は、13,17,18 を皿します。したがって、新しい方法は培養法を容易に、動物由来成分の添加せず臨床応用のための比較的安全なプロシージャではまた。第三に、新しいメソッドは主な表皮細胞の収穫を改良し、合流点に到達するために必要な初期培養時間を短縮します。従来の方法と比較して、新しいメソッドによって生成された細胞の収量は約 3 倍も高いと表皮細胞の初期の通路に達する合流、少なくとも 3 日前 (図 2)。最後に、新しいメソッドは、毛頭皮皮膚と以前報告13でテストされている厚い脂肪層を持つ成人の皮膚組織などの皮膚標本のすべてのタイプから表皮細胞を分離するため利用できます。
実験室の研究および臨床応用、高電位主 HKCs は広く使用されています。この新しいメソッドは、表皮幹細胞13の特性と培養細胞の潜在性を向上させます。Y-27632 強化 HKCs と 3 つの通路より培養表皮細胞の 90% は、基底細胞マーカー ケラチン 5 を表現し、10% 未満の細胞表現分化マーカー Loricrin、ことを示す後 α6-インテグリン発現これらの細胞は、いくつかの通路の後皮膚基底細胞の特性を保ちます。文化拡大の表皮細胞は、移植13、文化拡大後潜在的な再生を所有していることを示唆した後体内の皮膚再構築できます。特に、新しいメソッドは、上述の通り成体組織から細胞を分離するために理想的です。したがって、この法により作製した表皮細胞が体外に使えます、体内皮膚の病気を研究するためのモデルし皮膚傷の治療など臨床応用の自家細胞ベースの製品を開発することができます。
要約すると、新しいプロトコルを分離し、成人の皮膚組織から主な表皮細胞に簡便で効果的な手順について説明します。この方法を高度なはより高電位表皮細胞研究所と臨床応用の両方の大量生産に適しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、キー研究と開発中国プログラム (2017YFA0104604)、国家自然科学基金の中国 (NSFC、81772093)、一般的なプログラムによって支持された科学および技術開発プログラムの蘇 (ZXL2015128)江蘇省 (BK20161241) の自然科学財団と山東省泰山学者賞 (tshw201502065)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
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