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Developmental Biology

वयस्क त्वचा ऊतक से प्राथमिक मानव Keratinocytes को अलग करने के लिए एक सरलीकृत और कुशल विधि

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57784
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

यहां हम कुशलतापूर्वक वयस्क त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मानव keratinocytes को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि से पारंपरिक प्रक्रिया सरल टीका माध्यम में रॉक अवरोधक Y-२७६३२ का उपयोग करने के लिए सहज चमड़े की कोशिकाओं से एपिडर्मल कोशिकाओं को अलग ।

Abstract

प्राथमिक मानव ताजा त्वचा के ऊतकों और इन विट्रो में विस्तार से अलग keratinocytes व्यापक रूप से प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । मानव keratinocytes के पारंपरिक अलगाव विधि एक दो कदम अनुक्रमिक एंजाइमी पाचन प्रक्रिया है, जो कम सेल वसूली दर और कम सेल के कारण वयस्क ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाओं पैदा करने में अक्षम साबित किया गया है शामिल व्यवहार्यता. हम हाल ही में एक उंनत विधि की सूचना के लिए मानव प्राथमिक एपिडर्मल जनक कोशिकाओं को अलग त्वचा के ऊतकों कि Rho कळेनासे अवरोधक वाई-२७६३२ माध्यम में इस्तेमाल से । पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, इस नई विधि सरल, आसान है, और कम समय लेने वाली, और बढ़ाता है उपकला स्टेम सेल उपज और उनके स्टेम सेल विशेषताओं को बढ़ाता है । इसके अलावा, नई पद्धति dermis से एपिडर्मिस की जुदाई की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए, वयस्क ऊतकों के विभिंन प्रकार से कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त है । इस नए अलगाव विधि पारंपरिक तरीकों की प्रमुख कमियों पर काबू पाता है और अधिक दोनों प्रयोगशाला के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उच्च शक्ति के साथ एपिडर्मल कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए उपयुक्त है । यहां, हम विस्तार में नई विधि का वर्णन ।

Introduction

लक्ष्य के लिए विशेष रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए, वयस्क ऊतकों से प्राथमिक मानव keratinocytes (HKCs) को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया गया था । त्वचा एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं, त्वचा की बेसल परत में स्थानीयकृत, पैदा करना और अंतर करने के लिए एक उच्च क्षमता के अधिकारी और त्वचा के कार्यों को बनाए रखने के लिए keratinocytes प्रदान1,2,3, 4. त्वचा के ऊतकों से अलग HKCs व्यापक रूप से त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्जनन प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जाता है, विशेष रूप से क्षतिग्रस्त त्वचा की मरंमत में और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए जीन थेरेपी में5,6। HKC-आधारित अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण समस्या को कुशलतापूर्वक अलग और बड़ी संख्या में HKCs की उच्च क्षमता के साथ इन विट्रो7,8का विस्तार करने के लिए है । हालांकि विभिंन अनुसंधान समूहों के तरीकों को विकसित किया है HKCs की तरह स्टेम की संस्कृतियों का उत्पादन, इन तरीकों को कई बार कर रहे है और प्रदर्शन करने के लिए जटिल और कम सेल पैदावार के रूप में अंय सीमाएं हैं, और त्वचा के नमूने के प्रकार द्वारा सीमित किया जा रहा है 9का इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए, पारंपरिक विधि त्वचा के ऊतकों से HKCs को अलग करने के लिए dermis6से एपिडर्मिस की जुदाई के साथ एक दो कदम एंजाइमी पाचन शामिल है । यह विधि आमतौर पर नवजात ऊतकों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन यह बहुत मुश्किल हो जाता है जब वयस्क ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया ।

Y-२७६३२, Rho के एक अवरोधक-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (रॉक), के लिए काफी एपिडर्मल स्टेम सेल अलगाव और कॉलोनी विकास की क्षमता बढ़ाने की सूचना दी गई है10,11,12। पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला कि Y-२७६३२ एपिडर्मल कोशिकाओं के क्लोनल विकास की सुविधा है, लेकिन अंतर से आसंजन13अणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के द्वारा चमड़े की कोशिकाओं की उपज को कम कर देता है । हमने एक नए वातानुकूलित टीका माध्यम की भी स्थापना की, जिसे जी-माध्यम कहा जाता है, जो प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं के विकास और उपज का समर्थन करता है । जी के संयोजन के माध्यम से वाई-२७६३२ के साथ मध्यम, इस उपंयास विधि सहज एंजाइम पाचन के बाद एपिडर्मल और चमड़े की कोशिकाओं को अलग कर सकते हैं, इस प्रकार एपिडर्मिस के कदम-dermis जुदाई13,14को हटाने । पिछले रिपोर्ट के आधार पर, अब हम इस नई विधि की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए वयस्क त्वचा ऊतक से HKCs अलग ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मानव ऊतकों को संस्था के मानव अनुसंधान आचार समिति (सं. 2015120401, दिनांक: 12 मई, २०१५) के दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला गया है ।

1. तैयारी

  1. ताजा वयस्क उदर त्वचा के ऊतकों लीजिए एक ५० में अस्पताल में प्लास्टिक सर्जरी से खारिज-मिलीलीटर ट्यूब बर्फ ठंडा है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर के साथ । नमूना 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक के लिए ७२ घंटे के लिए रखा जा सकता है काफी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना ।
  2. नीचे बताए गए अनुसार रिएजेंट्स और कल्चरल मीडियम तैयार करें ।
    1. धोने समाधान तैयार करने के लिए फॉस्फेट के 1 मिलीलीटर (१०० U/एमएल) और streptomycin (१०० mg/L) को ५० मिलीलीटर फास्फेट-बफ़र्ड समाधान (पंजाब) में जोड़ें ।
    2. एंजाइम पाचन समाधान के दो सेट तैयार: (1) dispase के ५० मिलीलीटर तैयार (२.५ mg/DMEM में एमएल) और ५० मिलीलीटर प्रकार की मैं collagenase (२.५ मिलीग्राम/एमएल DMEM में) अलग से पारंपरिक विधि के लिए; और (2) dispase और प्रकार मैं collagenase के एक मिश्रण के ५० मिलीलीटर तैयार (भंग १२५ मिलीग्राम dispase पाउडर और १२५ प्रकार के मिलीग्राम मैं DMEM के ५० मिलीलीटर में collagenase पाउडर) नई विधि के लिए ।
      नोट: सभी एंजाइम समाधान एक ०.२२-µm छलनी के साथ फ़िल्टर किया जाना चाहिए और at4 ° c रखा ।
    3. दोनों पद्धतियों के लिए पाचन समाधान तैयार करें: ०.०५% trypsin और ०.२५% trypsin व्यावसायिक रूप से खरीदे गए । एक 10 मिलीग्राम/एमएल DNase भंग करके मैं समाधान ५० पंजाब के 5 मिलीलीटर में DNase मैं पाउडर की मिलीग्राम, यह एक ०.२२-µm छलनी के साथ फिल्टर, और यह दुकान पर-20 ° c ।
    4. एंजाइमी पाचन को बेअसर करने के लिए मध्यम से ५०० मिलीलीटर तैयार करें: DMEM मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक ।
    5. टीका मध्यम (विकास-कारक युक्त माध्यम से ५०० मिलीलीटर तैयार करें, कहा जाता है G-मध्यम): DMEM/F12 (3:1) मध्यम 1% पेनिसिलिन/streptomycin, ४० µ G/ml fungizone, ४० एनजी/एमएल fibroblast वृद्धि फैक्टर 2 (FGF2), 20 एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर (EGF), और 2% B27 पूरक ।
    6. इलाज १००-मिमी सेल के साथ संस्कृति व्यंजन कोटिंग मैट्रिक्स के 2 मिलीलीटर प्रकार युक्त मैं कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोलेजन ।

2. परम्परागत विधि

  1. त्वचा ऊतक उपचार
    1. लो १.५ सेमी2 त्वचा ऊतक के और यह के साथ धो 1x 10 पंजाबियों की मिलीलीटर; फिर, यह 30 एस के लिए ७०% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ कुल्ला और धोने समाधान के 10 मिलीलीटर (2% पेनिसिलिन और streptomycin युक्त पंजाबियों), 5 मिनट प्रत्येक के साथ यह 2x मशीन ।
      नोट: सभी बहाकर एक लामिना फ्लो हूड के अंदर १००-mm सेल संस्कृति व्यंजन में प्रदर्शन कर रहे हैं ।
    2. एक १०० मिमी कोशिका संस्कृति पकवान में चमड़े के नीचे वसा परत को दूर करने के लिए बाँझ कैंची के साथ ऊतक ट्रिम और, फिर, त्वचा ऊतक वजन (इस प्रोटोकॉल में 1 जी है) ।
      नोट: पर्याप्त trimming dermis से एपिडर्मिस के कुशल जुदाई के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । पीले रंग की मोटी परत आसानी से नेत्रहीन प्रतिष्ठित किया जा सकता है ।
    3. dermis पक्ष के साथ एक और १०० मिमी बाँझ पकवान के लिए ऊतक स्थानांतरण नीचे और, फिर, एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर 3-4 मिमी चौड़ा स्ट्रिप्स में त्वचा के ऊतकों में कटौती.
      नोट: फैट लेयर के साथ dermis ओर नेत्रहीनों को आसानी से पहचाना जाता है ।
    4. २.५ मिलीग्राम/एमएल dispase के 10 मिलीलीटर जोड़ें १०० मिमी संस्कृति पकवान में त्वचा के ऊतकों को समाधान और, फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पकवान (कोई अधिक से अधिक 20 एच) ।
      नोट: dispase समाधान की मात्रा ऊतक के प्रत्येक ग्राम के पाचन के लिए dispase समाधान के 10 मिलीलीटर का उपयोग करके गणना की जा सकती है ।
  2. त्वचा ऊतक से एपिडर्मिस की जुदाई
    1. दूसरे दिन, ठीक चिमटी का उपयोग कर dermis से एपिडर्मिस छील ।
      नोट: यदि यह एपिडर्मिस को छील करने के लिए मुश्किल है, dispase पाचन पर्याप्त नहीं था, जो आमतौर पर ऊतक की अपर्याप्त trimming के कारण है । इस मामले में, ऊतक एक लंबी गर्मी समय की जरूरत है ।
    2. स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर एक ऊतक घोल में सेल संस्कृति माध्यम के ५०० µ एल के साथ खुली एपिडर्मिस कीमा; फिर, यह एक ५०-एमएल ट्यूब में ०.२५% trypsin के 10 मिलीलीटर के साथ resuspend और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में यह 20 मिनट की मशीन, मिलाते के साथ ।
  3. प्राथमिक कक्षों का संग्रह और संवर्धन
    1. बेअसर समाधान (इस प्रोटोकॉल में 10 मिलीलीटर) की एक बराबर मात्रा जोड़कर trypsin गतिविधि बेअसर ।
    2. अलग कर देना एपिडर्मल कोशिकाओं के समाधान pipetting द्वारा और एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ नीचे 20x और किसी भी अवशिष्ट ऊतक मलबे को दूर करने के लिए एक १००-µm सेल छलनी के माध्यम से सेल समाधान पारित ।
    3. निस्पंदन के बाद 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेल समाधान केंद्रापसारक; धोने के लिए बेअसर माध्यम में सेल गोली resuspend और, तो, यह २०० x जी पर फिर से केंद्रापसारक सेल गोली प्राप्त करने के लिए ।
    4. कम कैल्शियम, सीरम मुक्त keratinocyte मध्यम (SFM) के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । इस समाधान के 10 µ एल लेने के लिए कुल सेल संख्या गिनती और, तो, प्लेट के बारे में 2 एक्स 10 SFM के साथ6 कोशिकाओं में १००-mm सेल संस्कृति कोटिंग मैट्रिक्स के साथ इलाज व्यंजन (युक्त प्रकार मैं कोलेजन) ।
      नोट: कोटिंग पारंपरिक विधि के लिए एक आवश्यक कदम है ।
    5. संस्कृति माध्यम को हर 2 डी में बदलें ।
      नोट: संस्कृति माध्यम बदलने से पहले और बाद में एक खुर्दबीन के नीचे सेल आसंजन की जांच करें ।
    6. जब वे के बारे में ८०% संगम तक पहुंचने कोशिकाओं बीतने ।
      नोट: सभी संस्कृति व्यंजन कोटिंग मैट्रिक्स के साथ इलाज कर रहे हैं ।

3. नई विधि

  1. त्वचा ऊतक उपचार
    1. के रूप में ऊपर वर्णित ऊतक लीजिए (कदम २.१) पारंपरिक विधि के लिए ।
    2. पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ त्वचा ऊतक 1x धो और, फिर, यह एक इलेक्ट्रॉनिक पैमाने (वजन इस प्रोटोकॉल में 1 जी के आसपास है) द्वारा एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर में वजन ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक ऊतक के ंयूनतम वजन ०.१ ग्राम है, क्योंकि यह कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त करना मुश्किल है अगर ऊतक इस्तेमाल किया नमूना बहुत छोटा है । इस प्रोटोकॉल है, जो अंततः ऑपरेटर की हैंडलिंग क्षमता पर निर्भर करता है के लिए ऊतक का कोई अधिकतम वजन है ।
    3. 30 एस के लिए ७०% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ त्वचा के ऊतकों कुल्ला करने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
    4. धोने समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक 2x मशीन (2.1.1 कदम में तैयार), 5 मिनट के लिए हर बार ।
      नोट: सभी धुलाई कदम ऊपर नोट १०० में प्रदर्शन कर रहे है मिमी सेल संस्कृति व्यंजन एक लामिना फ्लो हूड (एक ऊतक संस्कृति हूड) के अंदर ।
    5. एक और १००-mm सेल संस्कृति बाँझ पकवान ऊतक स्थानांतरण ।
    6. स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, एक ऊतक घोल में अच्छी तरह से ऊतक कीमा ।
    7. प्रत्येक 5 मिनट के ऊतकों को गीला रखने के लिए पंजाब के २०० µ एल जोड़ें ।
      नोट: कदम 3.1.5-3.1.7 के लिए 15 मिनट के आसपास ले लो । उपरोक्त सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  2. त्वचा ऊतक के पाचन
    1. एक ५०-एमएल ट्यूब में homogenized ऊतक समाधान स्थानांतरण । त्वचा ऊतक के हर 1 जी के लिए एंजाइम मिश्रण के 10 मिलीलीटर जोड़ें । homogenized ऊतकों के साथ अच्छी तरह से एंजाइमों मिश्रण ।
    2. 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में मिलाते हुए मिश्रण के साथ मशीन ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में एक और 30 मिनट के लिए पाचन मिश्रण करने के लिए इस प्रोटोकॉल में ०.२५% trypsin (२.५ मिलीलीटर) की एक 1/5 मात्रा जोड़ें ।
    4. जोड़ें DNase मैं एक 1:100 (वी/वी) अनुपात (२५० µ एल में इस प्रोटोकॉल में एंजाइम मिश्रण करने के लिए समाधान) और यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
  3. प्राथमिक कक्षों का संग्रह और संवर्धन
    1. एक 1:1 अनुपात में बेअसर माध्यम के १२.५ मिलीलीटर जोड़कर पाचन प्रक्रिया बंद करो । पिपेट के बारे में 20x के लिए समाधान ऊपर और नीचे, एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट कोशिकाओं अलग कर देना का उपयोग कर ।
    2. ऊतक के मलबे को हटाने के लिए एक १००-µm सेल छलनी के माध्यम से असंबद्ध कोशिकाओं को फिल्टर । 5 मिनट के लिए २०० x जी में supernatant केंद्रापसारक ट्यूब के तल पर गोली निरीक्षण ।
    3. supernatant त्यागें और बेअसर माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली धोने, और 5 मिनट के लिए २०० x g पर फिर से केंद्रापसारक कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
    4. टीका मध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (जी-चरण 1.2.5 से मध्यम) Y-२७६३२ के 10 µ मीटर के साथ ।
    5. कुल सेल संख्या गिनती करने के लिए समाधान के 10 µ एल ले लो और, फिर, प्लेट के बारे में 2 एक्स 106 कोशिकाओं जी के 10 मिलीलीटर के साथ एक १००-mm सेल संस्कृति डिश में ।
      नोट: कोटिंग कदम नई विधि के लिए आवश्यक नहीं है, और चमड़े का परत का कोई हटाने की आवश्यकता भी है ।
    6. 3 डी के बाद, कम कैल्शियम SFM मध्यम के साथ टीका माध्यम की जगह । संस्कृति माध्यम को हर 2 डी में बदलें ।
      नोट: सेल आसंजन से पहले और बाद में माध्यम बदलने की जांच करें ।
    7. जब वे के बारे में ८०% संगम तक पहुंचने कोशिकाओं बीतने ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, 2 मिनट के लिए ०.०५% trypsin के साथ कोशिकाओं का इलाज और एपिडर्मल कोशिकाओं trypsinizing से पहले दूषित चमड़े कोशिकाओं को हटाने के लिए पंजाब के साथ कोशिकाओं को धो लें ।

4. सेल Passaging

  1. मध्यम निकालें, पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, और, फिर, ०.०५% trypsin के 2 मिलीलीटर (प्रत्येक १०० मिमी पकवान प्रति) जोड़ें ।
  2. 5 मिनट के लिए एक मशीन (5% सह2के साथ ३७ ° c) में कोशिकाओं को मशीन ।
  3. एक खुर्दबीन का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं संस्कृति पकवान से अलग है कोशिकाओं की जांच करें ।
  4. 10% FBS के साथ DMEM के 8 मिलीलीटर जोड़ें एंजाइमी प्रतिक्रिया बेअसर और फिर, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
  5. 5 मिनट के लिए २०० x जी पर केंद्रापसारक सेल गोली प्राप्त करने के लिए ।
  6. supernatant धीरे से निकालें और, फिर, SFM मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend और कोशिकाओं की संख्या गिनती ।
  7. प्लेट 1 x 10 SFM के 10 मिलीलीटर के साथ6 कोशिकाओं में प्रत्येक १००-mm सेल डिश ।
  8. मध्यम हर 2 डी बदलें ।

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Representative Results

नई विधि (चित्र 1a) और पारंपरिक विधि (चित्र 1b) के योजनाबद्ध आरेख 1 चित्रामें प्रस्तुत कर रहे हैं । पारंपरिक विधि एक दो कदम पाचन है, जो एक 2 दिन की प्रक्रिया की आवश्यकता है । इसके विपरीत, नई विधि एक कदम पाचन, जो लगभग 3 घंटे के लिए प्रदर्शन करने के लिए लेता है । महत्वपूर्ण बात, एक कदम नई विधि एक ही समय में दो आबादी (एपिडर्मल और चमड़े की कोशिकाओं) प्राप्त कर सकते हैं, जो टीका माध्यम में Y-२७६३२ की उपस्थिति पर निर्भर करता है । इसके अलावा, एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रारंभिक संस्कृति समय के आसपास पहुंचने के लिए ८०% संगम आमतौर पर पारंपरिक विधि से कम से कम 3 दिन लगते है अगर कोशिकाओं की एक ही संख्या अलगाव के बाद inoculated है ।

नई विधि अधिक प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं है, जो एक कॉलोनी आकृति विज्ञान में विकसित पैदावार । मानव त्वचा के ऊतकों से अलग HKCs जी के साथ inoculated थे Y-२७६३२ युक्त मध्यम । कोशिकाओं की ही संख्या नियंत्रण के रूप में पारंपरिक विधि के बाद चढ़ाया गया । प्रारंभिक टीका के बाद 3 और 5 दिनों में एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 2aमें दिखाए जाते हैं. नई विधि से प्राप्त कोशिकाओं को एक कॉलोनी आकृति विज्ञान के रूप में विकसित करने के लिए खड़ा था । टीका के बाद वृद्धि वक्र एक सेल गिनती किट-8 (CCK-8) का प्रयोग अलग समय अंक पर टीका (चित्रा 2बी) के बाद, और दोहरीकरण समय के आसपास है 3-4 दिन नई विधि द्वारा तैयार की कोशिकाओं के लिए है, लेकिन के लिए 6-8 दिन के आसपास है का आकलन परम्परागत विधि । 7 दिन में, कोशिकाओं की पैदावार की गणना की गई । परिणाम चित्रा 2cमें दिखाया गया है, जो पता चलता है कि नई विधि पारंपरिक विधि से तीन गुना अधिक कोशिकाओं की उपज और है कि प्रारंभिक टीका के बाद संगम तक पहुंचने के लिए समय की जरूरत कम 3 दिन कम (चित्रा 2d) था । 7 दिन में, एपिडर्मल कोशिकाओं नई विधि के साथ संगम तक पहुंच है, लेकिन पारंपरिक विधि (चित्रा 2d) के साथ नहीं ।

नई पद्धति ने प्राथमिक कक्षों द्वारा α6-integrin की अभिव्यक्ति को बढ़ाया. α6-integrin को उच्च एपिडर्मल स्टेम सेल15द्वारा व्यक्त किया गया है दिखाया गया है । नई विधि द्वारा पृथक कोशिकाओं कई मार्ग के बाद त्वचा बेसल कोशिकाओं की विशेषताओं को बनाए रखा । कॉलोनी विकास त्वचा की बेसल परत से व्युत्पंन एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं में से एक है, और α6 के एक उच्च स्तर-integrin अभिव्यक्ति इन एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं की एक और विशेषता है । हमने पाया है कि वाई के अलावा-२७६३२ काफी α6-integrin की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई एपिडर्मल कोशिकाओं में 3 गद्यांश (चित्रए. बी.), और 3 गद्यांश में, एपिडर्मल कोशिकाओं अलग नई विधि का उपयोग करते हुए पृथक चमड़े की कोशिकाओं द्वारा कोई संक्रमण दिखाएँ 13. इन विट्रो विस्तार के दौरान कई मार्ग के बाद बेसल सेल सुविधाओं को बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) बेसल सेल मार्कर केरातिन 5 और टर्मिनल विभेद मार्कर loricrin16 के विश्लेषण तीन अंश के बाद उन कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था । हमने पाया है कि सभी कोशिकाओं के ९०% K5-सकारात्मक थे, लेकिन उनमें से 10% से भी कम loricrin व्यक्त ( 3 डीचित्रा -3d) । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्राथमिक HKCs नई पद्धति का उपयोग कर पृथक एक एपिडर्मल स्टेम सेल जनसंख्या होते है और बेसल कोशिकाओं की विशिष्ट सुविधाओं को बनाए रखने कर सकते हैं । लेकिन अब है कि HKCs से गुजर रहे हैं, और वे अंतर शुरू करते हैं । नई विधि द्वारा, हमने पाया है कि एपिडर्मल इन विट्रो में प्रसंस्कृत कोशिकाओं 8 पारित होने तक उनके प्रसार की क्षमता बनाए रख सकते हैं । अंत में, हम एपिडर्मल नई विधि का उपयोग कर अलग कोशिकाओं की पवित्रता का परीक्षण किया, एपिडर्मल और चमड़े का एक मिश्रण कोशिकाओं के बाद से inoculated सही अलगाव के बाद था । एक कम समय के साथ (2-3 मिनट) trypsin के साथ उपचार के लिए कुछ चमड़े प्रारंभिक संस्कृति, एपिडर्मल कोशिकाओं के एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी को दूषित कोशिकाओं को हटाने के एक मार्ग (4 चित्रा) के बाद प्राप्त किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 : नए और पारंपरिक अलगाव प्रक्रियाओं की तुलना । (क) इस पैनल के नए अलगाव विधि का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है । 1 दिन में, असंबद्ध त्वचा कोशिकाओं के साथ या बिना Y-२७६३२ जी में inoculated हैं । 2 दिनों के लिए Y-२७६३२ की उपस्थिति में, एपिडर्मल कक्षों को चुनिंदा रूप से विस्तृत करें । 6 दिन के आसपास, कोशिकाओं passaging के लिए पर्याप्त पर्याप्त घनत्व तक पहुंचने । (ख) इस पैनल के पारंपरिक अलगाव विधि के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है । एपिडर्मिस dermis से अलग है और एपिडर्मल कोशिकाओं को दिन 2 पर अलग कर रहे हैं, और आमतौर पर, कोशिकाओं को लगभग 10 दिनों में passaging के लिए पर्याप्त पर्याप्त घनत्व तक पहुंचने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : नई आइसोलेशन विधि प्राथमिक एपिडर्मल कक्षों की प्राप्ति बढ़ाता है । (क) यह पैनल एपिडर्मल नई विधि (शीर्ष पंक्ति) द्वारा तैयार की कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों और पारंपरिक विधि (नीचे पंक्ति) से पता चलता है 3 और 5 दिनों में प्रारंभिक टीका के बाद । स्केल पट्टियां = २०० µm । (ख) नए और पारंपरिक तरीकों द्वारा तैयार प्राथमिक HKCs एक कोशिका गिनती किट-8 (CCK-8) का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए संकेत दिया समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे । (ग) नई पद्धति द्वारा और परम्परागत विधि द्वारा तैयार की गई कोशिकाओं की कुल संख्या को टीका के बाद दिन ७ बजे गिना गया. (घ) प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं के संगम तक पहुँचने का औसत समय (गद्यांश 0) नई आइसोलेशन पद्धति और परम्परागत पद्धति दोनों के लिए दिखाया गया है. पैनलों बी डीके लिए: छात्र का टी-टेस्ट इस्तेमाल किया गया था; त्रुटि पट्टियां मानक भिंनता दिखाते हैं; n = 4; * * p < ०.०१, * p < ०.०५ जब पारंपरिक विधि के साथ नई विधि की तुलना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : नई विधि द्वारा प्राप्त प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं के दौरान बेसल कोशिका सुविधाओं को बनाए रखने में सक्षम हैं इन विट्रो में विस्तार । (क) इस पैनल के एक FACS विश्लेषण से पता चलता है α6-integrin अभिव्यक्ति की एपिडर्मल कोशिकाओं के पारित होने पर 3 y-२७६३२ (y-२७६३२, लाल) के साथ या बिना y-२७६३२ (नियंत्रण, ग्रे) के लिए ४८ h. (ख) इस पैनल के साथ कोशिकाओं के एक ठहराव विश्लेषण से पता चलता है उच्च α6 के अभिव्यक्ति स्तर-पैनल Aसे integrin; उच्च α6-integrin अभिव्यक्ति एक संकेत के रूप में परिभाषित किया गया है > 103, * * p < ०.०१ । (ग) इस पैनल K5 (लाल) और loricrin (लाल) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के प्रतिनिधि छवियों को दर्शाता है; DAPI (नीला) को दाग नाभिक का प्रयोग किया गया. स्केल बार्स = १०० µm. (D) यह पैनल K5-और loricrin-पॉजिटिव कोशिकाओं का एक ठहराव विश्लेषण दिखाता है । प्रत्येक समूह को मात्रा देने के लिए कुल ४०० कक्षों की गणना की गई, और K5-और loricrin-धनात्मक कक्षों की औसत संख्याएं दिखाई गई हैं. प्रयोग स्वतंत्र रूप से 4 बार दोहराया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रारंभिक मार्ग के बाद, अपेक्षाकृत शुद्ध एपिडर्मल कोशिकाओं नई विधि का उपयोग कर प्राप्त किया गया । (क) इस पैनल के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है vimentin के दाग इम्यूनोफ्लोरेसेंस (लाल) एपिडर्मल कोशिकाओं के लिए मार्ग 0 (P0) और 3 (पी 2) में; DAPI (नीला) को दाग नाभिक का प्रयोग किया गया. स्केल बार्स = ५० µm. (B) यह पैनल 0 (P0) और 1 (P1) पर vimentin-धनात्मक कोशिकाओं का ठहराव विश्लेषण दिखाता है । प्रत्येक समूह को मात्रा देने के लिए कुल ४०० कक्षों की गणना की गई, और vimentin-धनात्मक कक्षों की औसत संख्या दिखाई गई है. प्रयोग स्वतंत्र रूप से 4 बार दोहराया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक HKCs व्यापक रूप से अधिक से अधिक तीन दशकों के लिए क्लीनिक में घावों के इलाज के लिए उपयोग किया गया है और, उस समय के बाद से, यह हमेशा कुशलतापूर्वक एक समय पर तरीके से नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, व्यवहार में, पारंपरिक अलगाव विधि, जो dermis से एपिडर्मिस के पृथक्करण की आवश्यकता है, यह मुश्किल इन मांगों को पूरा करने के लिए, कोशिकाओं की कम उपज और वयस्क कोशिकाओं को पारित करने के लिए कम करने की क्षमता के कारण बनाता है । यहां, हम एक नई सरल तरीका हम कुशलतापूर्वक पिछले13,14, जो दोनों प्रयोगशाला के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है पर आधारित वयस्क ऊतक से HKCs प्राप्त करने के लिए विकसित का वर्णन ।

ध्यान नई विधि के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए निंनलिखित महत्वपूर्ण चरणों के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । सबसे पहले, homogenization प्रक्रिया एक महत्वपूर्ण कदम है; अपर्याप्त homogenization स्पष्ट रूप से एंजाइमी पाचन और असंबद्ध कोशिकाओं की एक कम उपज में परिणाम की क्षमता को प्रभावित करेगा । दूसरा, trypsin पाचन कदम से अधिक 30 मिनट नहीं लेना चाहिए; अंयथा, असंबद्ध कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कमी होगी । तीसरा, कुशलतापूर्वक असंबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, कोशिका निस्पंदन के लिए इस्तेमाल किया छलनी के आकार ताकना १०० µm होना चाहिए, और एक एकल छलनी सेल समाधान के कोई 20 मिलीलीटर से अधिक फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । चौथा, प्रारंभिक चढ़ाना का घनत्व चमड़े की कोशिकाओं के साथ संदूषण को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि एक उच्च कोशिका घनत्व चमड़े की कोशिकाओं पर Y-२७६३२ के निरोधात्मक प्रभाव को कम करेगा । इसलिए, यह सही है असंबद्ध कोशिकाओं की कुल संख्या को चढ़ाना से पहले अलगाव की प्रक्रिया के अंत में गिनती महत्वपूर्ण है ।

सबसे पहले, नई विधि अलगाव प्रक्रिया को सरल: दो कदम पारंपरिक अलगाव प्रक्रिया आमतौर पर 2 दिन लगते है करने के लिए प्रदर्शन, और ट्रिमिंग प्रक्रिया पूरी तरह से त्वचा से वसा ऊतक निकालने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से वयस्क ऊतकों के लिए ( चित्रा 1); अंयथा, वहां dispase के साथ रात के पाचन के बाद dermis से एपिडर्मिस की एक अकुशल जुदाई होगी । का लाभ लेने के द्वारा Y-२७६३२, जो13टीका के बाद चमड़े की कोशिकाओं के विकास को रोकता है, नई विधि dermis से एपिडर्मिस अलग करने की जरूरत नहीं है और, इसलिए, वसा ऊतक को हटाने के लिए ट्रिमिंग प्रक्रिया नए के लिए आवश्यक नहीं है विधि है, जो केवल आधे दिन की जरूरत है प्रदर्शन किया जाएगा । दूसरा, नई विधि भी संस्कृति प्रक्रिया को सरल के बाद से, पारंपरिक विधि के साथ, असंबद्ध कोशिकाओं को आम तौर पर विकिरणित माउस fibroblasts की एक फीडर परत पर 10% FBS या एक कोलेजन-कोट पकवान में युक्त मध्यम में हैं । पशु व्युत्पंन घटक हमेशा जोखिम कारक है कि नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए बचा जाना चाहिए रहे हैं । हम एक सीरम मुक्त वातानुकूलित टीका मध्यम (जी मध्यम) है, जो संस्कृति व्यंजन के लिए एक कोटिंग कदम की आवश्यकता नहीं है विकसित और भी प्राथमिक keratinocytes13 की उपज को बढ़ाता है क्योंकि जी के साथ संयुक्त मध्यम Y-२७६३२ के लगाव को बढ़ावा देता है एपिडर्मल कोशिकाओं को संस्कृति पकवान13,17,18। इसलिए, नई विधि संस्कृति प्रक्रिया की सुविधा और भी पशु व्युत्पंन घटकों के अलावा बिना नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक अपेक्षाकृत सुरक्षित प्रक्रिया है । तीसरा, नई पद्धति प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं की उपज में सुधार करती है और संगम तक पहुँचने के लिए आवश्यक आरंभिक संस्कृति समय को छोटा करती है. पारंपरिक विधि के साथ तुलना में, नई विधि द्वारा उत्पादित कोशिकाओं की उपज के आसपास है 3 गुना अधिक है, और एपिडर्मल कोशिकाओं के प्रारंभिक बीतने के कम 3 दिन पहले संगम तक पहुंच (चित्रा 2) । अंत में, नई विधि त्वचा नमूनों के सभी प्रकार से एपिडर्मल कोशिकाओं के अलगाव के लिए उपयोग किया जा सकता है, जैसे बालों खोपड़ी त्वचा और वयस्क त्वचा के ऊतकों के साथ एक मोटी मोटी परत है, जो एक पिछली रिपोर्ट13में परीक्षण किया गया है ।

उच्च क्षमता प्राथमिक HKCs व्यापक रूप से प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस नई विधि एपिडर्मल स्टेम सेल13की विशेषताओं के साथ संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं की क्षमता को बढ़ाता है । Y-२७६३२ HKCs द्वारा α6-integrin अभिव्यक्ति बढ़ाता है, और तीन अंश के बाद, अधिक से अधिक ९०% के कल्चरल एपिडर्मल कोशिकाओं बेसल सेल मार्कर केरातिन व्यक्त 5, और कम से 10% कोशिकाओं के भेदभाव मार्कर Loricrin व्यक्त की, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं को कई मार्ग के बाद त्वचा बेसल कोशिकाओं की विशेषताओं रखें । संस्कृति का विस्तार एपिडर्मल कोशिकाओं13भ्रष्टाचार के बाद vivo में त्वचा का पुनर्गठन कर सकते हैं, सुझाव है कि वे संस्कृति में विस्तार के बाद पुनर्जनन क्षमता के अधिकारी । विशेष रूप से, नई विधि वयस्क ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आदर्श है, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया । इसलिए, इस विधि द्वारा तैयार एपिडर्मल कोशिकाओं में इन विट्रो और vivo मॉडल में त्वचा रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और त्वचा के घावों के उपचार जैसे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए ऑटोलॉगस सेल-आधारित उत्पादों में विकसित किया जा सकता है ।

संक्षेप में, नया प्रोटोकॉल एक सरलीकृत और प्रभावी प्रक्रिया को अलग और वयस्क त्वचा ऊतक से प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं का विस्तार प्रदान करता है । इस उंनत विधि दोनों प्रयोगशाला के लिए और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए उच्च क्षमता एपिडर्मल कोशिकाओं की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFA0104604), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC, ८१७७२०९३), सूज़ौ (ZXL2015128) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम के सामान्य कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया था, Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20161241), और एक शेडोंग Taishan विद्वान पुरस्कार (tshw201502065) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc.  C10227 Automatic cell counting 
CO2 Incubator Thermo Scientific 51026333 For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004380 Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker Shanghai Boxun 150036 For water bath
Electronic Scale Harbin Zhonghui 1171193 For tissue weighing
Cell Culture Dish Eppendorf 30702115 For cell culture
50ml Centrifuge Tube KIRGEN 171003 For cell centrifuge
Cell Strainer Corning incorporated 431792 Cell filtration
Phosphate buffered solution Solarbio Life Science  P1020-500 Washing solution
DMEM Thermo Scientific C11995500 Component of neutralization medium
Defined K-SFM Life Technologies 10785-012 Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin Thermo Scientific 15140-122 Antibiotics
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1AC5 Component of neutralization medium
0.05% Trypsin Life Technologies 25300-062 For HKC dissociation
0.25% Trypsin  Beijing Solarbio Science & Technology T1350-100 For HKC dissociation
Coating Matrix Kit Life Technologies R-011-K For coating matrix
Dispase Gibco 17105-041 For HKC isolation
Collagenase Type I Life Technologies 17100-017 For HKC isolation
Deoxyribonuclease I Sigma 9003-98-9 For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams Life Technologies 31765035 Component of G-medium
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore Merck Biosciences 341595 Growth factor in G-medium
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503 ROCK inhibitor
Fungizone Gibco 15290026 Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein Gibco PHG0311 Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8 Thermo Scientific NC9864731 cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5 Hewlett-Packard Development Company MA-20142 For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin Covance PRB-145p For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin Cell Signaling Technology 3390 For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3) Santa Cruz  SC-19622 flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC Santa Cruz  SC-2831 negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis 

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३८ मानव keratinocytes एपिडर्मल स्टेम सेल चमड़े की कोशिकाओं प्राथमिक त्वचा कोशिका अलगाव keratinocyte संस्कृति वाई-२७६३२ Rho-संबद्ध कळेनासे अवरोधक त्वचा पुनर्जनन
वयस्क त्वचा ऊतक से प्राथमिक मानव Keratinocytes को अलग करने के लिए एक सरलीकृत और कुशल विधि
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Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou,… More

Liu, Z., Wen, J., Leng, X., Zhou, Q., Zhou, C., Zhao, H., Wu, X. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57784, doi:10.3791/57784 (2018).

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