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Developmental Biology

पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति अनुरेखण

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2,3
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल अनुभागिंग और counterstaining के लिए विधि. यह एक आसान और त्वरित प्रक्रिया है कि विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति पर नजर रखने के लिए भी ऊतक वर्गों, अंगों या प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है.

Abstract

ई कोलाई LacZ जीन, β-galactosidase, मोटे तौर पर जीन अभिव्यक्ति के लिए एक रिपोर्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है और कोशिका वंश अध्ययन में एक अनुरेखक के रूप में. शास्त्रीय histochemical प्रतिक्रिया सब्सट्रेट एक्स के hydrolysis पर आधारित है, घाट और लौह आयनों के साथ संयोजन में लड़की है, जो एक अघुलनशील नीले वेग है कि कल्पना करने के लिए आसान है पैदा करता है । इसलिए, β-galactosidase गतिविधि विकास आय के रूप में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल खोदी और counterstaining के लिए बाद में विधि. इसके अतिरिक्त, पूरे भ्रूण स्पष्ट करने के लिए एक प्रक्रिया को बेहतर एक्स-भ्रूण के गहरे क्षेत्रों में लड़की धुंधला कल्पना प्रदान की जाती है । इस कार्यविधि को निष्पादित करने से सुसंगत परिणाम प्राप्त होते हैं, हालांकि पृष्ठभूमि गतिविधि को कम करने के लिए प्रतिक्रिया शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है । परख में सीमाएं भी विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पूरे माउंट धुंधला में भ्रूण के आकार के बारे में । हमारा प्रोटोकॉल माउस के विकास के दौरान β-galactosidase डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है जिसे आगे cryostat वर्गों के साथ-साथ पूरे अंगों पर लागू किया जा सकता है । इस प्रकार, गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विकास में आसानी से पूरे भ्रूण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन यह भी सेलुलर स्तर पर विस्तृत अभिव्यक्ति तेल खोदी के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है ।

Introduction

आदेश में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए, मार्करों के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग Drosophila से स्तनधारियों के लिए सर्वोपरि है । ट्रांसजेनिक और नॉकआउट जानवरों को शामिल प्रयोगों में, बैक्टीरियल β-galactosidase जीन (LacZ) ई कोलाई (ई. कोलाई) में से एक है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalyzes के hydrolysis में β-galactosides (जैसे लैक्टोज) को अपनी monosaccharides (ग्लूकोज और गैलेक्टोज)5. इसके सबसे अधिक इस्तेमाल किया सब्सट्रेट एक्स-लड़की है (5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), एक ग्लाइकोसाइड है कि β-hydrolyzed दे वृद्धि करने के लिए 5-galactosidase-4-ब्रोमो-3-क्लोरोफ्लूरोकार्बन और hydroxyindole के द्वारा गैलेक्टोज है । पहले एक डिमर में ऑक्सीकरण हो जाता है कि, जब पोटेशियम फेरी के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया-और लोह-साइनाइड, एक विशेषता अघुलनशील पैदा करता है, नीला रंग हाला (चित्रा 1)6.

LacZ जीन तीस साल पहले7,8पर एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया जाना शुरू कर दिया । आमतौर पर, LacZ खुले पढ़ने के फ्रेम के स्थान पर एक अंतर्जात प्रमोटर के बहाव डाला है, तो यह बैक्टीरियल और कोशिका संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष डालने वाले कोशिकाओं कल्पना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात के एक अनुरेखक के रूप में ट्रांसजेनिक जानवरों में विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न9. इस संबंध में, β-galactosidase गतिविधि के दृश्य बड़े पैमाने पर पूरे ऊतकों के लिए एकल कोशिकाओं से विकास और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए Drosophila में इस्तेमाल किया गया है. Drosophila आनुवंशिकी स्थिर लाइनों में एक संशोधित पी-तत्व रिपोर्टर जीन LacZ युक्त का निर्माण करने के जीनोम में यादृच्छिक स्थानों पर डाला जाता है की पीढ़ी एहसान । इस प्रकार, जब बढ़ाने के तत्वों के प्रभाव के तहत रखा यह एक ऊतक विशिष्ट तरीके से अपनी अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं, जो पिछले दो दशकों के दौरान10कई जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति दी है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए LacZ जीन अभिव्यक्ति की निगरानी भी Cre-loxP मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा जीन पुनर्संयोजन की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और उत्परिवर्ती भ्रूण स्टेम सेल डेरिवेटिव के स्थानीयकरण chimeric विश्लेषण में 11, जो विशिष्ट ऊतकों में LacZ अभिव्यक्ति के नियंत्रण के साथ ही लौकिक की सुविधा । इसके अलावा, पूरे भ्रूण में, β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने विभिंन तीव्रता है कि आसानी से विभिंन विकास चरणों में मनाया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति में लौकिक परिवर्तन का विश्लेषण में धुंधला पैटर्न का उत्पादन कर सकते है 8,12.

इस अनुच्छेद में, हम एक के लिए एक्स के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति कल्पना प्रोटोकॉल वर्तमान माउस भ्रूण के प्रारंभिक विकास चरणों में पूरे पर्वत ऊतक में धुंधला लड़की । हम एक अति संवेदनशील और सस्ती तकनीक है कि या तो पूरे माउंट नमूनों में या तेल एंबेडेड ऊतकों या भ्रूण के बाद सेलुलर स्तर पर लेबल कोशिकाओं का सही पता लगाने के पक्ष के रूप में इस histochemical विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि ंयूनतम पृष्ठभूमि के साथ माउस के ऊतकों में धुंधला के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है जब अंय13तरीकों के साथ तुलना में ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं CNIC (Centro Nacional de Investigaciones हृदय) और कोमुनिदाद Autónoma de मैड्रिड के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ंयूनतम पशु दुख सुनिश्चित करने के लिए ।

1. गर्भवती चूहों से भ्रूण का संग्रह (ई 8.5 से e 12.5)

  1. या तो ग्रीवा अव्यवस्था या सह2 साँस लेना द्वारा गर्भवती चूहों की बलि । पहले मनाया योनि प्लग के दिन भ्रूण ०.५ (ई 0.5) दिन माना जाता था ।
  2. शोषक पैड पर लापरवाह स्थिति में पशु रखना और ७०% इथेनॉल के साथ माउस के उदर त्वचा साफ ।
    नोट: बांझपन निम्न चरणों में आवश्यक नहीं है ।
  3. चुटकी और पेट की त्वचा उठा माउस का उपयोग-टूथ संदंश ।
  4. त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से एक चीरा बनाओ, 2 से 4 सेमी खड़ी शल्य कैंची का उपयोग कर पेट के midline भर में ।
  5. पेट बेनकाब और शल्य कैंची के साथ गर्भाशय के भीतरी वक्रता के साथ रक्त वाहिकाओं काटने संदंश के साथ मां से गर्भाशय के सींग निकाल दें ।
  6. भ्रूण के स्ट्रिंग निकालें और यह 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड ०.०१ एम फॉस्फेट बफर खारा पीएच ७.४ (पंजाब) युक्त बर्फ पर एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण ।
  7. ध्यान से भ्रूण को गर्भाशय से बाहर काटना एक stereomicroscope के तहत एक पेट्री डिश में 10 मिलीलीटर ताजा बर्फ के साथ ठंडे पंजाबियों । watchmakers ' संदंश के साथ मांसपेशी दीवार समझ एमनियोटिक थैली बेनकाब करने के लिए, और फिर एमनियोटिक झिल्ली आंसू संलग्न भ्रूण और जर्दी को हटाने के लिए संदंश के सुझावों का उपयोग कर थैली ।
  8. प्रारंभिक अवस्था में गर्भवती चूहों से littermate भ्रूण ले लीजिए (ई 8.5 से e 12.5) (चित्रा 2) ।
  9. 10 मिलीलीटर ठंड 1x पंजाबियों के साथ एक ताजा पकवान के लिए स्थानांतरण संदंश घुमावदार या, बहुत छोटे भ्रूण के लिए (ई 8.5-e 9.5), उपयोग प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट भ्रूण क्षति के बिना नमूनों को इकट्ठा करने के लिए ।
  10. निर्धारण शुरू करने से पहले, genotyping के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में भ्रूण का एक छोटा सा टुकड़ा काटने या सबसे छोटे भ्रूण में एमनियोटिक झिल्ली लेने के द्वारा एक भ्रूण का नमूना ले (ई 8.5 से ई 9.5 के लिए) watchmakers ' संदंश के साथ ।
    नोट: LacZ genotyping पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्राइमरों से निर्धारित होता है: फॉरवर्ड, 5 ´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3 ´; उलट, ५ ´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-३ ´.

2. माउस भ्रूण का निर्धारण

  1. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक भ्रूण 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों युक्त एक गोल आधार के साथ स्थानांतरण ।
    नोट: एक रोलिंग शेखर का उपयोग कर आंदोलन के साथ इन ट्यूबों में प्रोटोकॉल में सभी चरणों का प्रदर्शन ।
  2. शेष रक्त को खत्म करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 1x पंजाब में भ्रूण धो लो । उपयोग प्लास्टिक स्थानांतरण पिपेट ट्यूबों में तरल पदार्थ बदलने के लिए ।
  3. ०.१२५% glutaraldehyde की बर्फ पर 1 मिलीलीटर में भ्रूण को ठीक करें ।
    नोट: निर्धारण के समय भ्रूण के आकार पर निर्भर करता है: 8.5 ई ई के लिए 20 मिनट 9.5 भ्रूण, ई 10.5 भ्रूण और ई के लिए 1 h के लिए 30 मिनट 12.5 भ्रूण ।
  4. निर्धारण निकालें और एक्स-लड़की धुंधला के लिए नमूना प्रसंस्करण से पहले कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए दो बार 1x पंजाब में भ्रूण धोने ।

3. पूरे माउंट β-galactosidase माउस भ्रूण के Histochemistry

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले एक्स-लड़की कुल्ला बफर और एक्स-लड़की धुंधला समाधान तैयार ( तालिका 1 और सामग्री की तालिकादेखें) । एंजाइमी प्रतिक्रिया के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक जंगली प्रकार (WT) littermate भ्रूण का प्रयोग करें ।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक्स-लड़की कुल्ला बफर में भ्रूण मशीन (चित्रा 2) ।
  3. 2 ज से ३७ ° c प्रकाश से सुरक्षित पर रात भर के लिए एक्स में भ्रूण मशीन-लड़की धुंधला समाधान । रंग की प्रतिक्रिया की निगरानी एक विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से जब तक नीले दाग की पर्याप्त तीव्रता भ्रूण में पृष्ठभूमि के बिना मनाया जाता है । 8 और 9 के बीच समाधान का पीएच रखें पूरे धुंधला के दौरान पृष्ठभूमि को कम करने के लिए । अगर धुंधला समाधान के लिए प्रकाश बारी शुरू होता है, यह ताजा सब्सट्रेट समाधान के साथ बदलने के लिए एंजाइमी प्रतिक्रिया का विस्तार ।
  4. जब वांछित संकेत 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में दो बार 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रत्येक में धोने भ्रूण द्वारा प्राप्त की प्रतिक्रिया बंद करो ।
  5. 1 मिलीलीटर के लिए दाग भ्रूण स्थानांतरण 4% paraformaldehyde (पीएफए) फिर से उन्हें ठीक करने के लिए, 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए.
    नोट: भ्रूण 4% पीएफए/पंजाबियों में जमा किया जा सकता है लंबे समय के लिए ४ डिग्री सेल्सियस या तुरंत अनुभागीकरण के लिए संसाधित किया जा सकता है । इस अंतिम निर्धारण कदम धुंधला पैटर्न के दीर्घकालिक संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है ।
  6. 1 मिलीलीटर 1x पंजाब में दो बार कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए भ्रूण धो लो ।
  7. विकल्प 1: ग्लिसरॉल की सांद्रता में वृद्धि के साथ समाधान की एक श्रृंखला में विसर्जन द्वारा स्पष्ट भ्रूण (20%, ४०%, ६०% और ८०% 1x पंजाब में ग्लिसरॉल) प्रत्येक समाधान में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
    नोट: ८०% ग्लिसरॉल में अब समय के लिए भ्रूण धो, यहां तक कि दिन, जब तक वे खाली कर रहे हैं, और फिर उंहें इस कदम पर ८०% ग्लिसरॉल में 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर (चित्रा 2) । सोडियम azide ora क्रिस्टल की एक बहुत छोटी राशि थाइमॉल के 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत भ्रूण के लिए या तो ग्लिसरॉल या 1x पंजाबियों में जोड़ने के लिए मोल्ड विकास को रोकने की सिफारिश की है । समाशोधन के बाद, पूरे माउंट भ्रूण (4 कदम) फोटो खिंचवाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  8. विकल्प 2: आयल embedding और एक microtome (चित्रा 2) का उपयोग कर अनुभाग के लिए भ्रूण प्रक्रिया । (चरण 4 और 5) अनुभाग से पहले पूरे सना हुआ भ्रूण में अभिव्यक्ति पैटर्न दस्तावेज़ ।

4. पूरे माउंट भ्रूण की फोटोग्राफी

  1. तस्वीर पूरे माउंट दाग भ्रूण को खोदी से पहले, उंहें एक पेट्री 1x पंजाब में जम 1-2% agarose के आधार के साथ तैयार पकवान को हस्तांतरण ।
  2. agarose-लेपित व्यंजन में 10 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ भ्रूण को पूरी तरह से कवर करने के लिए निर्जलीकरण और प्रतिबिंब को रोकने के जबकि तरल के माध्यम से फोटो खिंचवाने ।
  3. मालूम 1x पंजाब में डूबे भ्रूण का इस्तेमाल संदंश. पुराने भ्रूण के लिए (ई 10.5-e 12.5), संदंश के साथ agarose में एक छोटा सा छेद करने के लिए जगह है और यह भीतर अलग कोणों पर स्थिति नमूना और मुफ्त फोटोग्राफी के दौरान अस्थाई से बचने के लिए ।
  4. stereomicroscope मंच पर पकवान, संचारित (के तहत चरण) प्रकाश का उपयोग कर रखें । ' अंधेरे क्षेत्र ' और ' उज्ज्वल क्षेत्र समायोजन फोटोग्राफी के दौरान वांछित रोशनी स्थापित करने के लिए और नमूने के translucency का अनुकूलन करने के लिए के बीच बदलें ।
    नोट: भ्रूण की सतह पर प्रतिबिंब से बचने के लिए बाद में चरण भ्रूण के लिए फाइबर ऑप्टिक रोशनी का प्रयोग करें । जब फोटो भ्रूण मंजूरी दे दी, एक ही प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन उंहें एक पेट्री १००% ग्लिसरॉल युक्त पकवान को हस्तांतरण और पूरी तरह से उंहें विसर्जित कर दिया ।

5. आयल embedding और एक्स के अनुभाग-लड़की सना हुआ भ्रूण

  1. आयल मोम embedding
    1. 4 डिग्री सेल्सियस (चरण ३.५) से एक्स-लड़की दाग भ्रूण निकालें और 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ तीन बार निर्धारण की अधिकता को खत्म करने के लिए उन्हें धो लें ।
    2. संदंश का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल कैसेट के लिए प्रत्येक भ्रूण हस्तांतरण ।
    3. एक चोंच में भ्रूण युक्त कैसेट प्लेस और फिर उंहें कमरे के तापमान पर एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से गुजर द्वारा निर्जलीकरण: ७०% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए एक बार; ९६% इथेनॉल, दो बार 30 मिनट के लिए प्रत्येक; १००% इथेनॉल, दो बार 30 मिनट के लिए प्रत्येक ।
      नोट: भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अनिर्धारित समय के लिए ७०% इथेनॉल में जमा किया जा सकता है निर्जलीकरण की प्रक्रिया शुरू करने तक ।
    4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए isopropanol में पूरे कैसेट की मशीन ।
    5. संदंश का उपयोग करके, एक गिलास धुंधला पूर्व गर्म isopropanol युक्त गर्त और 30 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में छोड़ने के लिए कैसेट स्थानांतरण ।
    6. एक नया गिलास में कैसेट प्लेस ५०% isopropanol/५०% पिघला आयल मोम का एक मिश्रण युक्त गर्त और एक ६० डिग्री सेल्सियस ओवन में 4 घंटे के लिए छोड़ दें ।
    7. पिघला हुआ आयल मोम के दो परिवर्तन, ६० डिग्री सेल्सियस प्रत्येक पर 30 मिनट के साथ भ्रूण के साथ मशीन ।
    8. अंतिम तेल धोने के अंत में, कैसेट खोलने और एक अलग ऊतक एक stereomicroscope के तहत नमूना देखने के लिए ढालना embedding के लिए प्रत्येक भ्रूण हस्तांतरण ।
    9. ६० डिग्री सेल्सियस पर पिघला हुआ आयल मोम के साथ अच्छी तरह से भरें । मोम पिघला हुआ रखने के लिए गर्म संदंश का प्रयोग करें और ध्यान से मोल्ड में भ्रूण मालूम ।
      नोट: नमूने के उचित अभिविन्यास वांछित विमान में भ्रूण की धारा के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
    10. इससे पहले कि तेल मोल्ड में जम, ब्लॉक के शीर्ष पर ढक्कन के बिना एक कैसेट जगह है और यह पिघला हुआ तेल मोम के साथ भरें । शेष मोम ठंडा जब तक कमरे के तापमान पर रात भर जम करते हैं ।
    11. एक बार तेल पूरी तरह से जम गया है, मोल्ड से ठोस ब्लॉक को हटा दें और तेल ब्लॉकों की दुकान या तो कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर धारा14तक ।
  2. आयल खोदी
    1. microtome पर ब्लेड ओरिएंट और मोटाई के 5-7 µm की स्थापना की । 5.2.2. बर्फ पर आयल ब्लॉक ठंडा और यह एक घन या एक पिरामिड का उत्पादन करने के लिए ट्रिम कर दीजिए ।
    2. पिघला हुआ मोम की एक छोटी राशि का उपयोग करके microtome धारक को ब्लॉक संलग्न ।
    3. इष्टतम काटने के लिए ब्लॉक ओरिएंट । धारा 5-7 µm में आयल ब्लाकों मानक microtome का उपयोग कर कमरे के तापमान पर मोटी स्लाइसें ।
    4. एक ठीक तूलिका का प्रयोग, कमरे के तापमान पर एक पानी में स्नान में वर्गों को जोड़ तोड़ और स्लाइस का चयन के लिए जगह है ।
    5. एक खुर्दबीन स्लाइड के साथ पानी स्नान से वर्गों उठाओ और खींच के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में उन्हें हस्तांतरण ।
    6. जल स्नान से वर्गों को हटाने और धीरे उन्हें आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह है ।
    7. वर्गों को पूरी तरह से पालन करने की अनुमति देने के लिए रातोंरात ३७ ° c पर एक ओवन में स्लाइड अच्छी तरह सुखाएं, अंयथा, वे धुंधला होने के दौरान खो सकते हैं ।
      नोट: धुंधला प्रक्रियाओं शुरू होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर ।
  3. Deparaffinization और एक्स के Counterstaining-लड़की सना हुआ आयल वर्गों
    1. ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में एक माइक्रोस्कोप स्लाइड ट्रे पर डाल करने के लिए तेल मोम अधिक तरल पदार्थ बनाने के लिए कम से ४५ मिनट ।
    2. एक रैक पर स्लाइड स्थानांतरण और कांच धुंधला व्यंजन का उपयोग करने के लिए निंनलिखित चरणों का प्रदर्शन: पूरा तेल हटाने और ऊतकों के जलयोजन के लिए कम सांद्रता के अल्कोहल युक्त जार में रैक डूब: isopropanol 5 मिनट के लिए पर ६० ° c; 3 मिनट के लिए isopropanol; 2 मिनट के लिए १००% इथेनॉल; 1 मिनट के लिए ९६% इथेनॉल; ७०% कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इथेनॉल ।
    3. आसुत जल में वर्गों कुल्ला दो बार यकीन है कि वहां कोई शराब अवशेषों कर रहे हैं ।
    4. एक दाग के साथ Counterstain वर्गों (जैसे परमाणु तेज लाल समाधान) के लिए 5 मिनट (आमतौर पर 3-8 मिनट के बीच) कमरे के तापमान पर (चित्रा 2) ।
      नोट: यह दाग वर्गों में समग्र ऊतक संरचना प्रकट करने में मदद करता है ।
    5. दाग के बाद, 1 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड धोने और माइक्रोस्कोप में दाग की जांच अनुभाग ।
      नोट: यदि वांछित धुंधला भी कमजोर है, counterstain वर्गों फिर से एक लंबे समय के लिए ।
    6. इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने के साथ निम्नलिखित श्रृंखला में निर्जलीकरण वर्गों: 2 मिनट प्रत्येक के लिए ९५% इथेनॉल में दो बहाकर, 2 मिनट प्रत्येक के लिए १००% इथेनॉल में दो बहाकर, और, नीले रंग को भंग करने से बचने के लिए हाला, xylene में बस एक त्वरित धोने.
    7. एक के बाद एक रैक से स्लाइड निकालें और उंहें कागज के एक टुकड़े पर जगह है । फिर माउंट और एक सिंथेटिक, स्थायी बढ़ते माध्यम का उपयोग कर प्रत्येक स्लाइड coverslip ।
      नोट: Xylene एक ज्वलनशील उत्पाद है, जिसकी भाप मानव स्वास्थ्य के लिए और जलीय जीवों को परेशान और हानिकारक है । यह एक हुड के भीतर हेरफेर करने की जरूरत है और उचित सुरक्षात्मक उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता है ।

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Representative Results

यहाँ हम β-galactosidase histochemical प्रतिक्रिया एक्स का उपयोग कर के लिए मानक प्रोटोकॉल लागू करने से परिणाम दिखाने के पूरे माउस भ्रूण में सब्सट्रेट के रूप में लड़की (चित्रा 1 और चित्रा 2). इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम झिल्ली प्रकार 4-मैट्रिक्स metalloproteinase (Mt4-एमएमपी) अभिव्यक्ति अलग भ्रूण विकास चरणों में (e 9.5, e 11.5, और ई 12.5) Mt4-एमएमपी उत्परिवर्ती चूहों का उपयोग कर कि एक्सप्रेस LacZ के नियंत्रण के तहत रिपोर्टर अंतर्जात Mt4-एमएमपी प्रमोटर (चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5)9,15। Mt4-एमएमपी एक endopeptidase है जो कोशिका झिल्ली को glycophosphatidyl inositol एंकर (जीपीआई) के माध्यम से सीमित कर जाता है । हालांकि Mt4-एमएमपी कई मानव कैंसर में पाया गया है और ट्यूमर के विकास की प्रगति से संबंधित किया गया है, extracellular मैट्रिक्स घटकों के खिलाफ अपनी proteolytic गतिविधि के बारे में जानकारी बहुत तारीख तक ही सीमित है । इसके अतिरिक्त, लगभग कुछ भी नहीं भूमिका और Mt4-एमएमपी की अभिव्यक्ति पर भ्रूण के विकास के दौरान सूचना दी गई है9,16।

जंगली प्रकार (WT), Mt4-एमएमपीLacZ/+ heterozygous (एचटी) और पीटा (KO) littermate भ्रूण समानांतर में एक्स-लड़की धुंधला प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के लिए संसाधित कर रहे हैं । कई नियंत्रणों को प्रक्रिया की विशिष्टता को प्रमाणित करने के लिए धुंधला करने की प्रक्रिया के दौरान शामिल किया जाना चाहिए । इस प्रकार, WT भ्रूण histochemical प्रतिक्रिया के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है और गैर विशेष की निगरानी की सेवा-लड़की लेबलिंग ( चित्र 3डी और चित्रा 4a-सी) देखें । इसके अलावा, विशिष्ट पृष्ठभूमि से बचने के लिए, एक्स के पीएच-लड़की धुंधला समाधान 8 और 9 के बीच पूरे धुंधला भर में बनाए रखा जाना चाहिए । चित्रा 3Eमें, β-लड़की-सकारात्मक कोशिकाओं somites में पूरे माउंट एचटी भ्रूण में कल्पना कर रहे हैं और ई 9.5 मंच पर intersomitic vasculature. हालांकि, दाग कोशिकाओं के सटीक स्थान की रिपोर्ट करने के लिए, भ्रूण खंड सेलुलर संकल्प पर ऊतक वर्गों में जीन अभिव्यक्ति की रिपोर्ट माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करने के लिए आवश्यक है । इस मामले में, LacZ-सकारात्मक कोशिकाओं somites में पाया जाता है, पृष्ठीय महाधमनी, intersomitic vasculature के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक वर्गों में पेरिनेरियल संवहनी जाल ( चित्रा 3Fमें तीर-एच). ये परिणाम इन माउस भ्रूण चरणों9में Mt4-एमएमपी के लिए रिपोर्ट की अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ सहसंबंधी बनाना, यह दर्शाता है कि इस तकनीक को आसानी से reproducible और विश्वसनीय है । के रूप में की उंमीद है, β-लड़की गतिविधि के स्तर को KO भ्रूण में उच्च रहे है LacZ रिपोर्टर जीन (चित्रा 3I-एल) की दो प्रतियां की उपस्थिति के कारण एचटी के साथ तुलना में । हालांकि, केवल एचटी LacZ/+ भ्रूण जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और KO ऊतक के अध्ययन में विश्लेषण किया जाना चाहिए अवधारणा का सबूत के लिए ब्याज की लक्षित जीन की कमी के कारण के बाद से विधि की व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, β-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं हो सकता है असामान्य रूप से उत्तरार्द्ध में स्थित है ।

जब इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन, पुराने भ्रूण (ई 10.5 से ई 12.5 के लिए) पारदर्शी नहीं हैं, और इसलिए, सबसे दिखाई एक्स-लड़की दाग क्षेत्रों सतह के करीब उन हैं । इस प्रकार, इस विधि के लिए एक वैकल्पिक कदम ग्लिसरॉल सांद्रता बढ़ाने के साथ समाधान में बहाकर द्वारा भ्रूण स्पष्ट है । चित्रा 4में, e 12.5 LacZ-दाग भ्रूण स्पष्ट हो गया, जबकि एक्स बनाए रखने लड़की धुंधला, हमें stereomicroscope में भ्रूण के गहरे दाग क्षेत्रों तस्वीर के लिए अनुमति दी । के रूप में पहले इस भ्रूण स्तर पर रिपोर्ट, लेबल मस्तिष्क के विभिंन क्षेत्रों में स्थानीयकृत था, अंग, vibrissa के कूप, और पूंछ9की नोक । हालांकि, अगर एक के लिए एक सेलुलर संकल्प प्राप्त इच्छाओं, भ्रूण तेल में एंबेड किया जाना चाहिए, खोदी और microscopically की जांच की ।

चित्रा 5में, विरोधी के साथ immunohistochemistry-β-लड़की एंटीबॉडी के लिए Mt4 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था-एमएमपी रिपोर्टर LacZ धुंधला के माध्यम से मनाया । इस प्रकार, β-gal-सकारात्मक कोशिकाओं ई 11.5 में माउस रीढ़ की हड्डी के motoneurons के पूल में पाया गया दोनों दृष्टिकोण है, जो प्रोटोकॉल की विशिष्टता की पुष्टि करता है का उपयोग करके यहां (चित्र 5, बी) की सूचना दी ।

Figure 1
चित्रा 1 . इस एंजाइम द्वारा β-galactosidase और histochemical प्रतिक्रिया catalyzed के लिए ई. कोलाई LacZ रिपोर्टर जीन एंकोडिंग का योजनाबद्ध चित्रण । पारंपरिक धुंधला में, β-galactosidase hydrolyzes सब्सट्रेट 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (एक्स-gal) करने के लिए 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-hydroxyindole. बाद में, इस मध्यवर्ती ऑक्सीकरण हो जाता है, जो dimerization और अंतिम नीले रंग के उत्पाद के गठन का कारण बनता है (5, 5 '-dibromo-4, 4 '-dichloro इंडिगो) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का मुख्य चरण दिखा आरेख । माउस भ्रूण एकत्र और पूरे माउंट एक्स-लड़की धुंधला के लिए संसाधित कर रहे हैं । के बाद histochemical प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन दाग, पूरे माउंट भ्रूण हो सकता है (1 विकल्प) ग्लिसरॉल सांद्रता बढ़ाने और बाद में एक stereomicroscope में फोटो खिंचवाने के साथ समाधान में धोया के साथ मंजूरी दे दी है, या (2 विकल्प) में एंबेडेड आयल, खोदी र counterstained । संक्षिप्त: आरटी, कमरे के तापमान । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . एक्स ई 9.5 WT और Mt4-एमएमपीLacZ/+ पूरे-माउंट भ्रूण और ऊतक वर्गों की लड़की धुंधला । मानक एक्स का उपयोग करके-लड़की histochemical परख, ट्रांसजेनिक Mt4-एमएमपी प्रमोटर के नियंत्रण में LacZ जीन ले भ्रूण β-लड़की गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया । WT (ए), एचटी (ई) और KO (I) ई 9.5 पूरे माउंट भ्रूण β-galactosidase अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए कार्रवाई की गई । आयल रीढ़ की हड्डी के स्तर पर इन भ्रूण से प्राप्त वर्गों सेलुलर संकल्प पर दाग के दृश्य की अनुमति । की अपेक्षा के रूप में, β-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं WT वर्गों में अनुपस्थित थे (बी डी), जबकि लेबल की तीव्रता को KO (J-L) में एचटी ऊतक वर्गों (एफ एच) के साथ तुलना में अधिक था. तंत्रिका ट्यूब के माध्यम से क्रॉस वर्गों β-gal गतिविधि विकासशील somites, पृष्ठीय महाधमनी, और पेरिनेरियल संवहनी जाल में पता चलता है । संक्षिप्त: दा, पृष्ठीय महाधमनी; flb, forelimb कली; h, दिल; मी, mesencephalon; nt, notochord; otv, भड़काऊ और पुटिका; ov, ऑप्टिक पुटिका; PNVP, पेरिनेरियल संवहनी जाल; एस, somite; टी, telencephalon. स्केल बार्स: ५०० माइक्रोन (ए, ई, आई); १०० माइक्रोन (बी, एफ, जे); ५० माइक्रोन (सी, जी, के); 20 माइक्रोन (डी, एच, एल) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . WT और एचटी एक्स के Photomicrographs-लड़की सना हुआ माउस भ्रूण पर 12.5 ई से पहले (ए, डी) और (बी, सी, ई, एफ) के बाद बढ़ा ग्लिसरॉल में धोने के साथ समाशोधन । जैसी की उम्मीद थी, WT भ्रूण कोई रिपोर्टर LacZ अभिव्यक्ति (A-C) दिखाते हैं जबकि लेबल के अंगों में पाया गया (white ऐरोहेड), vibrissa के कूप का primordium (सफ़ेद तीर), पूंछ की नोक (काला तीर) और दिमाग Mt4 का-एमएमपीLacZ/ इस स्तर पर भ्रूण (डी एफ)9. (ङ, च) ग्लिसरॉल में समाशोधन के बाद, भ्रूण पारदर्शी और लेबल हो गया है और अधिक आसानी से भ्रूण के गहरे क्षेत्रों में visualized हो सकता है, के रूप में mesencephalon में दिखाया गया है और telencephalon (F में सफेद तीर) । स्केल बार: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 . β-galactosidase का Histochemical और immunohistochemical पता लगाना । (एक) एक्स-लड़की धुंधला (नीले रंग में) Mt4 की अभिव्यक्ति का पता चलता है motoneurons के पूल में रीढ़ की हड्डी के एक तेल अनुभाग में ई 11.5 भ्रूण मंच पर एमएमपी । (ख) विरोधी के साथ Immunohistochemistry-β-लड़की एंटीबॉडी (लाल में) cryostat वर्गों में एक ही भ्रूण चरण में रीढ़ की हड्डी motoneurons में Mt4-एमएमपी की अभिव्यक्ति की पुष्टि की । संक्षिप्त: एफ पी, फर्श प्लेट; MN, motoneurons; स्केल बार: १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1. व्यंजनों और इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समाधान । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

ई. कोलाई LacZ जीन व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता और पता लगाने में आसानी की वजह से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन में एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक एंजाइमी प्रतिक्रिया है कि आसान है और साथ ही सस्ती प्रदर्शन करने के लिए जल्दी है पर आधारित β-gal अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक क्लासिक विधि का वर्णन करता है । इस विधि भी पूरे माउंट भ्रूण, बरकरार अंगों, cryostat ऊतक वर्गों या प्रसंस्कृत कोशिकाओं में बड़े संशोधनों के बिना लागू किया जा सकता है ।

इस विधि के सटीक आवेदन एक मजबूत और व्याख्यात्मक धुंधला में परिणाम है । हालांकि, एक साथ नियंत्रण और क्रमिक पुष्टि चरणों अत्यधिक अनुशंसित हैं । इस संबंध में, वर्तमान प्रोटोकॉल में समानांतर में किया जाता है जंगली प्रकार littermate नकारात्मक नियंत्रण है कि गैर विशिष्ट एक्स-लड़की धुंधला की निगरानी की सेवा के रूप में इस्तेमाल भ्रूण । इसके अलावा, अभिव्यक्ति डेटा प्राप्त जब β-लड़की धुंधला का उपयोग पश्चिमी दाग और मात्रात्मक द्वारा पुष्टि की है-पीसीआर (क्यू-पीसीआर) विश्लेषण या β के माध्यम से-लड़की immunohistochemistry (चित्रा 5), जो अंय एंटीबॉडी के साथ संयुक्त भी की पहचान की अनुमति देता है विशिष्ट कक्ष प्रकार LacZ9व्यक्त । निर्धारण कदम को ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि β-galactosidase के एंजाइमी गतिविधि को संरक्षित करने के लिए और धुंधला के दौरान पृष्ठभूमि को कम करने के लिए । इस प्रकार, भ्रूण glutaraldehyde, जो paraformaldehyde निर्धारण17के साथ तुलना में सबसे सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम देता है में तय किया जाना चाहिए । इसके अलावा, निर्धारण समय महत्वपूर्ण है और प्रत्येक भ्रूण चरण के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए, के बाद से अधिक निर्धारण β-galactosidase गतिविधि को कम कर सकते हैं । इस संबंध में, पूरे माउंट भ्रूण भ्रूण चरण और आकार के आधार पर विसर्जन या छिड़काव द्वारा तय किया जा सकता है। इस प्रकार, transcardial छिड़काव भ्रूण के लिए सिफारिश की है कि ई 14.5 से अधिक और जन्मोत्तर नमूनों के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि निर्धारण नमूने के सभी क्षेत्रों तक पहुंचता है । छोटे भ्रूण (8.5 ई से ई तक 12.5) विसर्जन द्वारा तय किया जा सकता है और सीधे के लिए संसाधित में पूर्ण एक्स-लड़की धुंधला (चित्रा 2) । यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि एक्स-माउस के दाग से छोटा लड़की e 14.5 पूरे पर्वत के रूप में किया जा सकता है । इस मामले में, सतह के करीब दाग कोशिकाओं को आसानी से β-लड़की धुंधला के माध्यम से पता चला रहे हैं । फिर भी, यह हो सकता है कि गहरा लेबल धुंधला दिखाई देता है या भी डाई ऊतक घुसना नहीं है, विशेष रूप से पुराने भ्रूण में । इस मामले में, या तो अंगों या वयस्क चूहों ऊतक विच्छेदित किया जा सकता है, एक्स-लड़की दाग, और एक stereomicroscope के तहत visualized । फिर भी, अनुभाग और ब्याज की सना हुआ ऊतक के सूक्ष्म परीक्षा अधिक उपयुक्त है (चित्रा 2) ।

प्रोटोकॉल की दक्षता के बावजूद, पूरे भ्रूण और पता लगाने के दाग परेशानी हो सकती है । उदाहरण के लिए, गुर्दे, वृषण, स्रावी ग्रंथियों, अधिवृषण और जठरांत्र संबंधी मार्ग अंतर्जात अम्लीय β-galactosidase18 की उच्च मात्रा में होते हैं जो पृष्ठभूमि गतिविधि के कारण परिणामों की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. कि कारण के लिए, histochemical प्रतिक्रिया धुंधला भर में थोड़ा alkaline पीएच शर्तों (पीएच 8-9) के तहत प्रदर्शन किया जाना चाहिए, ई. कोलाई β-galactosidase के बाद से ७.३ के एक इष्टतम पीएच है । यह काफी पृष्ठभूमि को कम करने के लिए और बैक्टीरियल β-galactosidase गतिविधि19,20,21,22एहसान करने में मदद मिलेगी । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि लंबे समय से दाग एक्स के अंलीकरण में परिणाम हो सकता है-लड़की धुंधला समाधान, एक वृद्धि की पृष्ठभूमि एहसान । इसके अलावा, β-galactosidase गतिविधि ५० डिग्री सेल्सियस से ऊपर मशीन तापमान के तहत खो दिया है, लेकिन नहीं ४२ डिग्री सेल्सियस से नीचे । हमारे हाथ में, एक्स के साथ मशीन-लड़की सब्सट्रेट बेहतर काम करता है जब ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दिया है । धुंधला और बाद के बाद निर्धारण कदम से पहले, यह महत्वपूर्ण है के रूप में ध्यान से और जितनी जल्दी संभव के रूप में histochemical प्रतिक्रिया है कि ऊतक अनुभाग में जमा किया जा सकता से हाला को समाप्त करने के लिए सभी एक्स-लड़की प्रतिक्रिया सामग्री को धोने के लिए ।

के रूप में यहां दिखाया गया है, ग्लिसरॉल में समाशोधन भ्रूण ऊतक पारदर्शी बनाने के लिए महत्वपूर्ण है जबकि एक्स-लड़की धुंधला और ऊतक प्रोटोकॉल के संरक्षण । इस प्रकार, भ्रूण स्पष्ट हो जाते है और लेबलिंग stereomicroscope के तहत गहरे क्षेत्रों में visualized किया जा सकता है । हालांकि, दाग कोशिकाओं के सटीक स्थान का विश्लेषण करने के लिए, नमूने के अनुभाग की आवश्यकता है और इसलिए, समाशोधन आवश्यक नहीं है । इस मामले में, विधि में संकेत दिया सिफारिशों का पालन करके, नमूनों ध्यान से तेल एंबेडेड और खोदी जा सकता है । embedding प्रक्रिया के दौरान, इथेनॉल निर्जलित ऊतक isopropanol-आयल के मिश्रण में डूबे रहने की जरूरत है । Isopropanol नमूना में इथेनॉल के प्रतिस्थापन के पक्ष और तेल में embedding ऊतक की सुविधा के लिए किया जाता है23. कुछ प्रोटोकॉल में, xylene isopropanol के बजाय एक ही उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है । फिर भी, xylene के उपयोग के रूप में isopropanol बनाम नुकसान, इस तरह के सिकुड़ना और ऊतक को हटाने के कारण नमूने के सख्त के रूप में लिपिड24 और एक ज्वलनशील और अड़चन उत्पाद25के रूप में अपनी विषाक्तता प्रोफ़ाइल प्रस्तुत करता है । ऑरेंज तेल आधारित समाशोधन एजेंटों xylene के लिए सबसे सुरक्षित विकल्प में से एक है क्योंकि वे xylene की विषाक्तता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्कृष्ट ऊतक संरचना संरक्षण26के बिना तेजी से समाशोधन की अनुमति है । इसके अलावा, यदि xylene का उपयोग कर, प्रोटोकॉल के इस भाग में अधिकतम कम किया जाना चाहिए, के बाद से एक्स-लड़की धुंधला फैलाना और19खो सकता है । खंड के बाद, रंजक के साथ counterstaining (जैसे परमाणु तेज लाल) व्यक्त कोशिकाओं की ऊतकवैज्ञानिक पहचान की सुविधा के लिए सिफारिश की है. यह धुंधला प्रक्रिया तेजी से है, केवल एक कदम की आवश्यकता होती है, और इसके गुलाबी उपस्थिति नीले रंग की एक्स लड़की हाला के साथ अच्छा इसके विपरीत प्रदान करता है । हालांकि, इस counterstaining केवल गैर जलीय बढ़ते मीडिया (यानी DPX) के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है ।

यह शास्त्रीय विधि β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयुक्त है, एक्स-पोटेशियम एलॉय के साथ संयोजन में लड़की के बाद से-और ferricyanide एक विशेषता नीली हाला कि फीका या ब्लीच आसानी से नहीं करता है और, जब अच्छी तरह से बनाया, हो सकता है पैदा विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भी पता लगाया । वहां मूल प्रोटोकॉल के अंय संशोधनों हैं । सामन-लड़की (6-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-डी-galactopyranoside) जैसे उपलब्ध सब्सट्रेट का उपयोग करना, रानी-लड़की (5-ब्रोमो-6-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) या Bluo-gal (5-ब्रोमो-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , या Tetrazolium साल्ट के लिए क्लासिक एक्स-gal/FeCN प्रतिस्थापन बहुत पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने कर सकते हैं13,19. यह विशेष रूप से प्रोटीन और mRNA सामग्री के कम अभिव्यक्ति स्तर की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने की अनुमति देने के लिए सिफारिश की है । हालांकि, जब भी लंबे समय के लिए इस्तेमाल किया, इन प्रक्रियाओं के किसी भी उच्च पृष्ठभूमि के स्तर पर ले जा सकता है और शर्तों के इतने सावधान प्रबंधन हमेशा की सिफारिश की है, विशेष रूप से विचार है कि लंबे समय तक मशीन अवधि के कारण विशिष्ट धुंधला की सुविधा हो सकती है अंतर्जात β-galactosidase हालचाली१३,२७. बाद के बारे में, यह हमेशा के लिए घाट पोटेशियम लवण का उपयोग करने के लिए तकनीक की विश्वसनीयता का अनुकूलन और नुकसान से बचने के लिए सलाह दी जाती है ।

इस विधि का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि शास्त्रीय एक्स-लड़की धुंधला प्रक्रिया एक अघुलनशील नीला वेग है कि आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है, लेकिन अनुमति नहीं देता सह-ऊतक में फ्लोरोसेंट या फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा स्थानीयकरण अध्ययन अनुभागों. इस सीमा को दूर करने के लिए एक संभव तरीका β-gal के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए होगा ( चित्रा 5देखें) एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के लिए immunodetection के साथ संयुक्त. हालांकि, यदि अभिव्यक्ति स्तर कम है या पृष्ठभूमि उच्च, immunolabeling यह मुश्किल है कि रिपोर्टर जीन एक विशेष सेल में व्यक्त किया जाता है का पता लगाने के लिए कर सकते हैं । विशेष रूप से, एक नई तकनीक के लिए उच्च गुणवत्ता फोकल छवियों एक्स द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पर आधारित प्राप्त करने के लिए सूचित किया गया है-लड़की हाला28। इसके अलावा, इस विधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संगत है और स्पष्ट रूप से एक्स-लड़की सकारात्मक कोशिकाओं28की पहचान कर सकते हैं । ऐसे LacZ जीन के रूप में एंजाइमी संवाददाताओं से अधिक फ्लोरोसेंट है, जो ध्यान देने योग्य है, जब लेबलिंग, यदि अभिव्यक्ति का स्तर विशेष रूप से कम कर रहे है संवेदनशील होने का लाभ प्रदान करते हैं । इस संबंध में, वर्तमान तकनीक microRNA29का पता लगाने के लिए आदर्श सिद्ध किया गया है, इसलिए अभिव्यक्ति पैटर्न और अभिव्यक्ति के स्तर के ठहराव के दोनों गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति । डबल दाग β-gal गतिविधि और mRNA उपस्थिति के माध्यम से सीटू संकरण तकनीकों में , जो बहुत ही उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है अंतर्जात जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करते समय एक ही नमूना में β-gal गतिविधि की निगरानी 30. फिर भी, दोनों β-लड़की दाग और सीटू संकरण खोज प्रतिक्रियाओं में डबल धुंधला के दौरान रंग असंगति प्रदर्शित कर सकते हैं । ऐसे एस के रूप में एक अधिक उपयुक्त सब्सट्रेट, चुनना लड़की, विशेष रूप से अनुकूलित30तरीकों में सिफारिश की है ।

इस बहुमुखी विधि का बड़े पैमाने पर विकास जीवविज्ञान के सन्दर्भ में जीन समारोह का अध्ययन किया गया है. इस प्रकार, LacZ जीन भ्रूण विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण के लिए यह एक लक्षित जीन लोकस में दस्तक द्वारा अपनाया गया है । LacZ का अध्ययन करने के लिए एक आम रिपोर्टर जीन है सीआईएस-अभिनय विनियामक तत्वों (बढ़ाने) भ्रूण के प्रतिबंधित क्षेत्रों में जीन अभिव्यक्ति निर्देशन में शामिल, ब्याज के प्रमोटर की प्रतिलेखन गतिविधि के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के31 ,३२,३३. इसके अलावा, यह अक्सर Cre द्वारा आनुवंशिक पुनर्संयोजन की घटनाओं का पता लगाने में प्रयोग किया जाता है loxP साइटों, जो विशेष रूप से भ्रूण स्टेम सेल डेरिवेटिव में सेल भाग्य मानचित्रण प्रयोगों में या कोशिका प्रत्यारोपण में का पता लगाने के लिए उपयोगी है की मध्यस्थता पुनर्संयोजन । जीन-ट्रैप mutagenesis भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में कटा हुआ प्रोटीन का उत्पादन β-लड़की है कि शारीरिक स्थितियों३४के तहत प्रमोटर गतिविधि के मूल्यांकन परमिट । इन सभी दृष्टिकोणों के लिए, ट्रांसजेनिक पशुओं को LacZ ले जाने और बैक्टीरियल β-galactosidase में चूहे३५,३६, चिकन३७,३८, Xenopus३९ उत्पन्न किया गया है या zebrafish४०. अब तक, इस तकनीक का इस्तेमाल किया गया है Drosophila में जीन अभिव्यक्ति के दृश्य में सुधार करने के लिए विशेष रूप से और अस्थाई inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की उपलब्धता के कारण, और ऊतक और कोशिका विशेष पी-LacZ मार्कर लाइनों४१ ,10. यह ध्यान देने योग्य बात है कि इन कई ट्रांसजेनिक और पीटा जानवरों को शामिल अनुप्रयोगों से अलग है, LacZ रिपोर्टर जीन पूरे ऊतकों में इस्तेमाल किया गया है और साथ ही प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान में रोग में जीन की भूमिका की भविष्यवाणी लायक है । बाद के एक प्रासंगिक उदाहरण उंर बढ़ने की प्रक्रिया का अध्ययन है तनाव, ट्यूमर दमन, या विकास के लिए प्रतिक्रियाओं के बारे में । वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं को सीटू में और अंतर्जात lysosomal बीटा-galactosidase४२,४३के उनके विशेषता अधिकता और संचय के कारण vivo में दोनों का पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं । इसलिए, β-galactosidase कैंसर प्रसंस्कृत कोशिकाओं४४में मात्रात्मक परख में एक वृद्ध होनेवाला के निशान के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

सारांश में, हम एक व्यवहार्य और अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए आसान पता लगाने की सुविधा β-galactoside गतिविधि में माउस भ्रूण ऊतक. वर्तमान विधि चयनित ऊतक और इस्तेमाल सब्सट्रेट के आधार पर संशोधनों की अनुमति देता है । इसलिए, इस बहुमुखी और लागत प्रभावी उचित नियंत्रण के साथ कार्यरत विधि पूरे माउस भ्रूण के साथ उपयोग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है और साथ ही पतली ऊतकवैज्ञानिक वर्गों पर ।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास वित्तीय हित की कोई होड़ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Centro Nacional de Investigaciones हृदयों (CNIC) में उनकी तकनीकी सहायता के लिए Histopathological सेवा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी कृपया Mt4-एमएमपीLacZ चूहों प्रदान करने के लिए dr. Motoharu Seiki धन्यवाद, और हमारी परियोजना के समर्थन के लिए और पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एलिसिया जी अर्रोयो. हम इस लेख को ठीक करने के लिए पीटर Bonney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । यह काम एक अनुदान के माध्यम से Universidad Europea de मैड्रिड द्वारा समर्थित किया गया था (# 2017UEM01) C.S.C. को संमानित किया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३६ LacZ β-galactosidase आयल सेक्शनिंग माउस विकास भ्रूण स्पष्टीकरण जीन एक्सप्रेशन
पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति अनुरेखण
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Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,… More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

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