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Developmental Biology

通过检测全小鼠胚胎β乳糖酶活性追踪基因表达

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们描述了检测早期全小鼠胚胎β乳糖酶活性的标准协议, 以及石蜡切片和 counterstaining 的方法。这是一个简单和快速的过程, 以监测基因表达在发展期间, 也可以应用于组织切片, 器官或培养细胞。

Abstract

大肠杆菌 LacZ基因, 编码β-乳糖酶, 主要是作为一个记者的基因表达和作为示踪剂在细胞谱系研究。经典的组织化学反应是基于基片 X-gal 与铁和铁离子的水解, 产生了一种易于可视化的不溶性蓝色沉淀。因此, β-乳糖酶活动作为发展过程中感兴趣基因表达模式的标志。在这里, 我们描述了检测早期全小鼠胚胎β-乳糖酶活性的标准协议, 以及随后的石蜡切片和 counterstaining 方法。此外, 还提供了一个澄清整个胚胎的程序, 以更好地可视化 X-gal 染色在更深的区域的胚胎。通过执行此过程获得一致的结果, 尽管需要优化反应条件以最小化背景活动。还应考虑试验中的局限性, 特别是关于整个芒染色中胚胎的大小。我们的协议为在小鼠发育过程中的β乳糖酶检测提供了一种灵敏和可靠的方法, 可进一步应用于恒温器切片以及整个器官。因此, 在整个胚胎中使用该协议可以很容易地分析整个发育过程中的动态基因表达模式, 而且在石蜡切片后可以评估细胞水平的详细表达。

Introduction

为了描述特定的基因表达模式, 使用报告基因作为标记是最重要的从果蝇到哺乳动物。在涉及转基因和击倒动物的实验中, 大肠杆菌 (大肠杆菌) 的细菌β -乳糖酶基因(LacZ) 是其中最广泛使用的1234. β-乳糖酶 (β-加仑) 催化β-galactosides (如乳糖) 的水解成其单糖 (葡萄糖和半乳糖)5。它最常用的基质是 X-加仑 (5-溴-4-氯-3-哚β D-galactopyranoside), 一种由β-乳糖酶水解而成的糖苷, 它能产生 5-溴-4-氯-3-羟基吲哚和半乳糖。第一种被氧化成二聚体, 当与费里钾和氰化物结合使用时, 产生一种特征不溶的蓝色沉淀 (图 1)6

在三十年前的7,8, LacZ基因开始被用作一个记者基因。通常, LacZ是插入在一个内源启动子下游的开放阅读框架, 所以它可以用于细菌和细胞培养可视化的细胞含有特定的插入物, 以及在转基因动物作为内源性的示踪剂基因表达模式在发展期间9。在这方面, β-乳糖酶活性的可视化在果蝇中得到了广泛的应用, 以了解从单细胞到整个组织的发育和细胞过程。果蝇遗传学倾向于稳定线的生成 , 其中一个含有报告基因LacZ的修饰 P 元素结构入到基因组的随机位置。因此, 当置于增强因子的影响下, 它可能会以组织特定的方式驱动其表达, 这使得在过去的两年中, 对许多基因的表达模式进行系统分析10。此外, 利用转基因小鼠监测LacZ基因的表达也可以通过 loxP 介导的重组来检测基因重组事件, 并在嵌合体分析中定位突变胚胎干细胞衍生物11, 促进LacZ表达的控制在特定组织并且世俗地。此外, 在整个胚胎中, β-乳糖酶活性的检测可能产生不同强度的差异染色模式, 可以在不同的发育阶段方便地观察, 以分析基因表达的时间变化。8,12

在这篇文章中, 我们提出了一个协议, 通过 X-gal 染色在小鼠胚胎发育阶段的整个组织中对基因表达进行可视化。我们提出这种组织化学的方法是一种高度敏感和廉价的技术, 有利于准确检测的标记细胞, 无论是在整个装载标本或在细胞水平后石蜡嵌入组织或胚胎。该方法可使小鼠组织中染色的直接可视化与其他方法13相比具有最小背景。

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Protocol

所有实验程序都得到了 CNIC 动物实验伦理学委员会 (Investigaciones Cardiovasculares) 和马德里 Comunidad 国立的批准, 以确保最小的动物痛苦。

1. 从怀孕小鼠中采集胚胎 (从 E8.5 到 E12.5)

  1. 通过宫颈脱位或一氧化碳2吸入来牺牲怀孕的老鼠。第一个被观察的阴道插头的天被考虑了胚胎天 0.5 (E0.5)。
  2. 将动物放在吸水垫的仰卧位上, 用70% 乙醇清洁老鼠的腹部皮肤。
    注意: 以下步骤不要求不育。
  3. 用小鼠牙钳捏起腹部皮肤。
  4. 切口通过皮肤和腹壁, 2 到4厘米垂直横跨中线的腹部使用手术剪刀。
  5. 用手术剪刀将子宫内弯曲的血管切开, 从母亲身上取出子宫角。
  6. 去掉胚胎的字符串, 将其转移到含有10毫升冰冷0.01 米磷酸盐缓冲盐水 pH 值 7.4 (PBS) 的冰上的培养皿中。
  7. 仔细解剖胚胎从子宫下的显微镜在一个培养皿与10毫升新鲜冰冷 PBS。用制表钳抓住肌壁以暴露羊膜囊, 然后用镊子的提示撕去羊膜以除去封闭的胚胎和蛋黄囊。
  8. 从怀孕小鼠早期 (从 E8.5 到 E12.5) 收集 littermate 胚胎 (图 2)。
  9. 用弯曲钳将胚胎移植到10毫升冷 1x PBS 的新鲜菜肴上, 或者, 对于非常小的胚胎 (E8.5-E9.5), 使用塑料转移吸管收集没有胚胎损伤的样品。
  10. 在开始固定之前, 在离心管中取一个胚胎样本进行基因分型, 方法是切割一小部分胚胎, 或将最小胚胎中的羊膜 (从 E8.5 到 E9.5) 与制表钳结合。
    注: LacZ 基因分型由聚合酶链反应 (PCR) 引物确定: 向前, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG 3´;反转, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´。

2. 小鼠胚胎的固定

  1. 将每个胚胎移植到一个2毫升的离心管中, 其中包含1毫升 1x PBS 的圆形底座。
    注意: 使用滚动振动筛在这些管道中执行所有步骤。
  2. 在室温下将 1x PBS 中的胚胎洗净1分钟, 以消除剩余的血液。使用塑料转移吸管改变管中的液体。
  3. 在冰上固定1毫升0.125% 戊二醛的胚胎。
    注: 固定时间取决于胚的大小: E8.5 E9.5 胚20分钟, E10.5 胚30分钟, E12.5 胚1小时。
  4. 在处理 X-加仑染色样品前, 取出固定剂并在 1x PBS 中清洗两次, 室温为10分钟。

3. 小鼠胚胎全芒乳糖酶组织化学研究

  1. 在开始操作之前, 准备好 x-加仑冲洗缓冲液和 x-gal 染色溶液 (见表 1材料表)。使用野生型 (littermate) 胚胎作为对酶反应的阴性对照。
  2. 在室温下以10分钟的温度 (图 2) 在 X-加仑中孵化胚胎。
  3. 在 X-加仑染色溶液中孵化胚胎, 从2小时到隔夜, 在37摄氏度保护免受光照。通过解剖显微镜定期监测颜色反应, 直到在没有胚胎背景的情况下观察到足够的蓝色染色强度。保持溶液 pH 值介于8和9之间, 以减少整个染色过程中的背景。如果染色溶液开始变亮, 用新鲜的基质溶液取代, 以延长酶的反应。
  4. 当所需信号通过在室温下每两次1毫升 1x PBS 的离心管中的10分钟内洗涤时, 停止反应。
  5. 将染色的胚胎转移到1毫升4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 重新修复, 1 小时至一夜4摄氏度。
    注: 胚胎可贮存在4% 粉煤灰/PBS 中, 较长时间为4摄氏度, 或可立即加工切片。这一最后的固定步骤是长期保存染色模式的关键。
  6. 在室温下, 将1毫升 1x PBS 中的胚胎清洗两次, 10 分钟。
  7. 备选方案 1: 通过浸泡在一系列解决方案中, 清除胚胎, 增加甘油浓度 (20%、40%、60% 和80% 甘油 1x PBS), 每种溶液室温下为1小时。
    注: 在80% 甘油中洗涤胚胎, 时间长, 甚至数天, 直到清除, 然后在80% 甘油4摄氏度储存在这个步骤 (图 2)。建议在甘油或 1x PBS 中添加极少量的叠氮化钠麝香晶体, 以防止霉菌生长。清除后, 全芒胚可用于拍照 (步骤 4)。
  8. 选项 2: 使用切片进行石蜡嵌入和切片的加工胚 (图 2)。在切片前记录整个染色胚的表达模式 (步骤4和 5)。

4. 全芒胚摄影

  1. 要在切片前拍摄全芒染色的胚胎, 将其转移到一个培养皿中, 并在 1x PBS 中固化1-2% 琼脂糖。
  2. 完全覆盖胚胎与10毫升 1x PBS 在琼脂糖涂层的菜肴, 以防止脱水和反射, 而在拍摄的液体。
  3. 用镊子将胚胎浸入 1x PBS 中。对于年长的胚胎 (E10.5-E12.5), 用镊子在琼脂糖中做一个小孔, 以不同的角度放置和放置标本, 避免摄影过程中的自由漂浮。
  4. 将盘子放在显微镜台上, 使用透射 (下) 光。改变 "黑暗场" 和 "光明场" 的调整, 以设定在摄影过程中所需的照明和优化样品的半透明性。
    注: 对后期胚胎使用光纤照明, 以避免胚胎表面的反射。当拍摄被清除的胚胎, 遵循相同的程序, 但转移到一个含有100% 甘油的培养皿, 并充分浸泡他们。

5. X-加仑染色胚的石蜡嵌入和切片

  1. 石蜡嵌入
    1. 从4°c (步骤 3.5) 中取出 X-加仑染色的胚胎, 并用1毫升 1x PBS 清洗它们, 以消除多余的固定剂。
    2. 用镊子将每个胚胎移植到组织学盒中。
    3. 将含有胚胎的卡带放入烧杯中, 然后在室温下通过分级乙醇系列将其脱水: 70% 乙醇, 一次为30分钟;96% 乙醇, 每两次30分钟;100% 乙醇, 每两次30分钟。
      注: 胚胎可以储存在70% 乙醇的不确定时间在4摄氏度, 直到开始脱水过程。
    4. 在室温下, 在异丙醇上孵化整盒30分钟。
    5. 使用镊子, 将盒式磁带转移到含有预热异丙醇的玻璃染色槽中, 并在烤箱中留出60摄氏度, 30 分钟。
    6. 将卡带放在一个新的玻璃染色槽中, 其中含有50% 异丙醇/50% 熔融石蜡, 并在60摄氏度烤箱中离开4小时。
    7. 用两个熔融石蜡变化的胚胎孵化盒, 每30分钟60摄氏度。
    8. 最后石蜡冲洗结束后, 打开卡带, 将每个胚转移到一个单独的组织嵌入模具中, 以查看显微镜下的样品。
    9. 用60摄氏度的熔融石蜡填充井。使用加热钳保持蜡熔化, 并仔细定位在模具的胚胎。
      注意: 样品的正确方向是在所需平面切片胚胎的关键步骤。
    10. 在霉菌凝固之前, 放置一个没有盖子的盒式卡带, 用熔融石蜡填充。让剩余的蜡冷却, 直到一夜之间室温凝固。
    11. 石蜡完全固化后, 从模具中取出实心块, 在室温或4摄氏度前将石蜡块贮存至切片14
  2. 石蜡切片
    1. 将刀片定向到切片上, 并设置5-7 µm 的厚度。5.2.2. 冷却冰上的石蜡块, 修剪它以产生立方体或金字塔。
    2. 使用少量的熔融蜡将块连接到切片的支架上。
    3. 将块定向到最佳切割。用标准切片在室温下将石蜡块分成5-7 µm 厚片。
    4. 使用精美的画笔, 将部分放置在室温下的水浴中, 用于操作和选择切片。
    5. 从水浴中拿起显微镜滑动的部分, 并将它们转移到42摄氏度的水浴中伸展。
    6. 从水浴中移除部分, 然后轻轻地将它们放到粘附显微镜幻灯片上。
    7. 干燥的幻灯片在一个烤箱在37°c 过夜, 使各部分完全坚持, 否则, 他们可能会在染色过程中丢失。
      注: 将幻灯片保存在4摄氏度, 直到开始染色程序。
  3. Deparaffinization 和 Counterstaining 染色石蜡切片的研究
    1. 将幻灯片放在显微镜下, 在60摄氏度的烤箱中, 至少45分钟, 使石蜡蜡更流畅。
    2. 将幻灯片转移到机架上, 并使用玻璃染色碟执行以下步骤: 将机架浸入含有减少浓度醇的染色罐中, 以完成石蜡去除和组织水化: 5 分钟的异丙醇60°c;异丙醇3分钟;100% 乙醇2分钟;96% 乙醇1分钟;70% 乙醇在室温下1分钟。
    3. 将蒸馏水中的部分冲洗两次, 以确保没有酒精残留物。
    4. Counterstain 部分与污点 (例如核快速的红色解答) 为5分钟 (通常在3-8 分钟之间) 在室温 (图 2)。
      注意: 这种染色有助于揭示切片的整体组织结构。
    5. 染色后, 将蒸馏水中的滑梯清洗1分钟, 并在显微镜下检查切片染色。
      注: 如果所需染色太弱, counterstain 节再长一段时间。
    6. 脱水部分在以下系列以增加的乙醇的浓度: 二洗涤在95% 乙醇为2分钟每, 二洗涤在100% 乙醇为2分钟每, 并且, 为了避免溶化蓝色沉淀, 仅一个快速洗涤在二甲苯。
    7. 将幻灯片从机架中一个一个地取出, 然后放在一张纸上。然后安装和盖玻片每张幻灯片使用合成, 永久安装介质。
      注: 二甲苯是一种易燃产品, 其蒸气对人体健康和水生生物有害。它需要在引擎盖内操作, 并需要使用适当的保护设备。

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Representative Results

在这里, 我们显示了应用标准协议的β-乳糖酶组织化学反应使用 X-gal 作为基质在整个小鼠胚胎 (图 1图 2)。利用该协议, 在不同胚胎发育阶段 (E9.5、E11.5 和 E12.5) 上, 利用 Mt4-mmp 突变小鼠, 在内源性控制下, 对膜型 4-基质金属蛋白酶 (Mt4-mmp) 的表达进行了研究。Mt4-mmp 启动子 (图 3,图 4,图 5)9,15。Mt4-mmp 是通过 glycophosphatidyl 肌醇锚 (GPI) 拴在细胞膜上的内肽酶。虽然 Mt4-mmp 已经被发现在一些人类癌症, 并与肿瘤生长的进展有关, 关于其蛋白水解活性的信息, 对细胞外基质成分是非常有限的迄今。此外, 几乎没有报告的作用和表达 Mt4-mmp 在胚胎发育9,16

野生类型 (Mt4-mmpLacZ/+异型 (HT) 和挖空 (高) littermate 胚胎是并行处理的 X-gal 染色协议 (图 2)。在染色过程中必须包括几个控制, 以验证程序的特殊性。因此, 小波胚胎被用作组织化学反应的阴性对照, 用于监测非特异的 X-gal 标记 (见图 3AD图 4A-C)。此外, 为了避免不特异的背景, X-Gal 染色溶液的 pH 值必须保持在8和9之间整个染色。在图 3E中, β-gal 阳性细胞在胚胎背部和 intersomitic 血管 E9.5 阶段的全 HT 胚胎中可视化。然而, 为了报告染色细胞的准确位置, 胚胎切片是需要在显微镜报告的组织切片的基因表达的细胞分辨率。在这种情况下, LacZ 阳性细胞在胚胎背部、背主动脉、intersomitic 血管以及组织切片神经血管丛中发现 (图 3F-H中的箭头)。这些结果与报告的 Mt4-mmp 在这些小鼠胚胎阶段9的表达模式, 表明该技术是容易重现和可靠的。正如预期的那样, 在高胚胎的β-加仑活性水平高于 HT, 因为存在两个拷贝的 LacZ 报告基因 (图 3IL)。然而, 只有 HT LacZ 胚胎应该分析在基因表达模式的研究和高组织被用作证明的概念, 以证明该方法的可行性, 因为由于缺乏目标基因的兴趣, β-gal 阳性细胞可以不正常的位于后者。

在执行此协议时, 较旧的胚胎 (从 E10.5 到 E12.5) 不是半透明的, 因此, 最明显的 X-gal 染色区域是靠近表面的。因此, 这个方法的另一个步骤是通过洗涤溶液中的甘油浓度增加来清除胚胎。在图 4中, E12.5 LacZ 染色的胚胎在保持 X 半乳糖染色时变得清晰, 使我们能够拍摄到显微镜的胚胎更深的染色区域。如前所述, 在这个胚胎阶段, 标记被本地化在大脑的不同区域, 四肢, 触须的卵泡和尾部9的尖端。然而, 如果你希望获得细胞分辨率, 胚胎应嵌入石蜡切片和显微镜检查。

图 5中, 用抗β-gal 抗体免疫组化方法证实了 LacZ 染色 Mt4-mmp 的表达。因此, 使用这两种方法, 在 E11.5 鼠脊髓运动神经元池中检测到β-gal 阳性细胞, 这证实了此处报告的协议的特殊性 (图 5A, B)。

Figure 1
图 1.大肠杆菌LacZ 报告的图解说明β-乳糖酶的基因编码和这种酶催化的组织化学反应.在传统染色中, β-乳糖酶水解基板 5-溴-4 氯 3-哚β d-galactopyranoside (X-加仑) 到 5-溴-4-氯-3 羟基吲哚。随后, 这种中间体被氧化, 导致二聚化和形成最后的蓝色产品 (55 '-二溴-44 '-二氯靛蓝)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.图中显示了用于检测β乳糖酶活动的标准协议的主要步骤.对小鼠胚胎进行全装 X-gal 染色处理。根据该协议进行的组织化学染色后, 整个芒胚可以 (选项 1) 清除与洗涤溶液中增加甘油浓度, 随后拍摄的显微镜, 或 (选项 2) 嵌入石蜡切片和复染。缩写: RT, 室温。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.E9.5 和 Mt4-mmpLacZ/+全芒胚和组织切片的 X-gal 染色.采用标准的 X-gal 组织化学分析方法, 对 LacZ 基因在 Mt4-mmp 启动子控制下的转基因胚胎进行了β-加仑活性的测定。(A), HT (E) 和高 (I) E9.5 整个芒胚被处理, 以检测β-乳糖酶表达。从这些胚胎在脊髓的水平获得石蜡切片允许可视化染色的细胞分辨率。正如预期的, β-gal 阳性细胞没有在小波切片 (B D), 而标记强度较高的高 (J L) 与 HT 组织切片 (F H)。通过神经管的横断面揭示了发育胚胎背部、背主动脉和神经血管丛中β-加仑的活性。缩写: 大, 背主动脉;flb, 前肢芽;h, 心脏;m, 中脑;nt, 脊索;otv, 耳囊泡;光泡;PNVP, 神经血管丛;s, somite;t, 前脑。鳞片杆: 500 微米 (A, E, I);100微米 (B, F, J);50微米 (C, G, K);20微米 (D, H, L)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.显微照片在 E12.5 前 (A、D) 和后 (B、C、E、F) 清除与洗涤甘油增加的小鼠胚胎的重量和 HT.如预期的那样, 在四肢 (白色箭头)、触须卵泡的普利摩顿 (白色箭头)、尾部尖端 (黑色箭头) 和 Mt4-mmpLacZ/+的大脑中, LacZ 的胚胎显示没有任何记者的表达 (-c)。胚胎在这个阶段 (d-F)9。(E、F)在甘油清除后, 胚胎变得半透明, 标记可以更容易地在胚胎的更深区域形象化, 如中脑和前脑 (F 中的白色箭头) 所示。刻度条: 1 毫米.请点击这里查看这个数字的大版本.

Figure 5
图 5.β-乳糖酶的组织化学和免疫组化检测。(A) X-gal 染色 (蓝色) 揭示了 E11.5 胚胎期脊髓石蜡切片中 Mt4-mmp 在运动神经元池中的表达。(B) 免疫组化与抗β-gal 抗体 (红色) 证实了 Mt4-mmp 在脊髓运动神经元的表达在同一胚胎阶段在恒温器节。缩写: fp, 地板板;锰, 运动神经元;刻度条: 100 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

表1。本协议所需的食谱和解决方案.请单击此处下载此文件.

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Discussion

大肠杆菌LacZ 基因因其灵敏度高、检测方便, 在基因表达模式研究中得到了广泛的应用。本议定书描述了一种基于酶反应的检测β-gal 的经典方法, 它既简单又快速, 而且价格低廉。这种方法也可以应用在整个芒胚, 完整的器官, 恒温器组织切片或培养细胞没有重大的修改。

这种方法的准确应用导致了解释染色的鲁棒性。但是, 强烈建议同时控制和随后的验证步骤。在这方面, 本议定书是以野生型 littermate 胚胎平行进行的, 用作用于监测非特异性 X-gal 染色的阴性对照。此外, 用印迹和定量 pcr (pcr) 分析或β-gal 免疫组化 (图 5) 证实了使用β-gal 染色时获得的表达数据, 该方法与其他抗体结合, 也可以识别表达 LacZ9的特定细胞类型。为了保持β乳糖酶的酶活性, 并在染色过程中尽量减少背景, 需要考虑固定步骤。因此, 胚胎必须固定在戊二醛, 这给出了最一致和可靠的结果相比, 多聚甲醛固定17。此外, 固定时间是至关重要的, 应该为每个胚胎阶段的经验确定, 因为过度固定可以减少β乳糖酶活动。在这方面, 整个芒胚可以通过浸泡或灌注固定, 取决于胚胎的阶段和大小.因此, 建议 transcardial 灌注的胚胎比 E14.5 和产后标本, 以确保固定达到所有区域的样本。较小的胚胎 (从 E8.5 到 E12.5) 可以通过浸泡和处理直接为托托X-加仑染色 (图 2)。应指出的是, 小鼠胚胎的 X-半乳糖染色可以作为整个坐骑进行 E14.5。在这种情况下, 接近表面的染色细胞通过β-gal 染色很容易检测到。即使如此, 它可能会出现更深的标签似乎模糊, 甚至染料不穿透组织, 特别是在老年胚胎。在这种情况下, 任何器官或成年小鼠组织可以解剖, X-gal 染色, 并可视化的显微镜。然而, 切片和显微检查的染色组织的兴趣更适合 (图 2)。

尽管该协议的效率, 染色整个胚胎和检测可能是麻烦。例如, 肾脏, 睾丸, 分泌腺体, 附睾和胃肠道含有大量的内源性酸性β-乳糖酶18 , 可以干扰的解释, 由于背景活动的结果。因此, 在整个染色过程中, 应在轻度碱性 ph 值 (ph 为 8-9) 的情况下进行组织化学反应, 因为大肠杆菌β-乳糖酶具有7.3 的最佳 ph 值。这将有助于大大减少背景和有利于细菌β-乳糖酶活动19,20,21,22。还应注意的是, 长时间的染色时间可能导致 X-gal 染色溶液酸化, 有利于增加的背景。此外, β-乳糖酶活性在50摄氏度以上的孵化温度下丢失, 但不低于42摄氏度。在我们的手, 与 X-加仑基质的孵化工作更好时, 晚上在37摄氏度。染色后和固定后的步骤, 重要的是清洗所有的 X-加仑反应材料, 尽可能小心, 尽快消除沉淀的组织化学反应, 可以存放在纸巾部分。

如下所示, 清除甘油中的胚胎对于使组织半透明, 同时保持 X-加仑染色和组织组织学是很重要的。因此, 胚胎变得清晰, 标记可以可视化在更深的地区下的显微镜。然而, 为了分析染色细胞的确切位置, 需要对样品进行切片, 因此, 清除并不重要。在这种情况下, 通过遵循该方法所示的建议, 样品可以仔细石蜡嵌入和切片。在嵌入过程中, 乙醇脱水组织需要浸泡在异丙醇石蜡混合物中。异丙醇是用来支持在样品中替代乙醇和促进组织嵌入石蜡23。在某些协议中, 用二甲苯代替异丙醇进行相同用途。然而, 二甲苯的使用带来的缺点与异丙醇, 如样品的收缩和硬化, 由于去除组织脂质24和它的毒理学剖面作为易燃和刺激性产品25。基于橙油的清洁剂是对二甲苯最安全的替代品之一, 因为它们允许快速清除而不需要二甲苯的毒性以及优良的组织结构保存26。此外, 如果使用二甲苯, 该部分的协议应减少最大, 因为 X-gal 染色可以扩散和损失19。切片后, 建议 counterstaining 与染料 (核快红色), 以促进组织学鉴定表达细胞。这种染色程序是快速的, 只需要一步, 其粉红色的外观提供了良好的对比与蓝色的 X 加仑沉淀。然而, 这种 counterstaining 只适用于非水性安装介质 (DPX) 的使用。

这种经典方法适用于β-乳糖酶活性的检测, 因为 X-加仑结合钾铁-和氰化钾产生一个特征的蓝色沉淀, 不褪色或漂白容易, 当精心建设, 可以甚至在解剖显微镜下检测到。原始协议还有其他修改。利用可用的基质, 如鲑鱼-加仑 (6-氯-3-哚β D-galactopyranoside), 洋红-加仑 (5-溴-6-氯-3-哚β D-galactopyranoside) 或 Bluo-加仑 (5-溴-3-哚β D-galactopyranoside)13,19, 或代以经典的 X-加仑/FeCN 四氮唑盐可以大大提高检测灵敏度13,19。这是特别推荐允许高灵敏度检测低表达水平的蛋白质和 mRNA 材料。但是, 当使用时间过长时, 这些过程中的任何一个都可能导致较高的背景水平, 因此总是建议对条件进行仔细的管理, 特别是考虑到长时间潜伏期可能有助于不特异的染色, 因为内源β-乳糖酶活动13,27。对于后者, 最好使用铁钾盐, 以优化技术的可靠性和避免陷阱。

这种方法的一个重要局限性是, 经典的 x-gal 染色程序产生一种不溶性的蓝色沉淀, 可以很容易地检测到光镜, 但不允许共同定位研究的荧光或共聚焦显微组织部分。克服这一限制的一个可能的方法是使用抗体对β-gal (见图 5) 结合 immunodetection 的特定细胞类型。但是, 如果表达式水平低或背景高, immunolabeling 就很难检测出是否在特定细胞中表达了报告基因。值得注意的是, 在 X-加仑沉淀28产生的荧光发射的基础上, 提出了一种新的技术来获得高质量的共焦图像。此外, 该方法与免疫荧光兼容, 可以清楚地识别 X-gal 阳性细胞28。酶的记者, 如 LacZ 基因提供比荧光更敏感的优势, 这是值得注意的标记时, 如果表达水平特别低。在这方面, 目前的技术已被证明是理想的检测 microRNA29, 因此, 既允许定性评价的表达模式和量化的表达水平。双染色法通过原位杂交技术检测β-gal 的活性和 mRNA 存在, 为在同一样品中监测β-加仑活性, 提供非常有用的信息来检验内源基因的表达模式。30. 然而, β-gal 染色和原位杂交检测反应在双染色过程中可能显示颜色不相容性。选择一个更合适的基质, 如 s-gal, 建议在具体的优化方法30

该方法广泛应用于发育生物学背景下的基因功能研究。因此, 采用 LacZ 基因对胚胎发育过程中的基因表达模式进行了分析, 并将其转化为靶向基因轨迹。LacZ 是一种常见的报告基因, 用于研究将基因表达定向到胚胎受限区域的顺式作用调控因子 (促进剂), 提供有关31 兴趣启动子转录活性的信息。,32,33。此外, 它经常用于检测基因重组事件的 loxP 网站重组, 这是特别有用的检测胚胎干细胞衍生物的细胞命运制图实验或细胞移植。基因陷阱突变的胚胎干细胞产生的截断蛋白融合到β-加仑, 允许评价启动子活动在生理条件下34。对于所有这些方法, 携带 LacZ 和表达细菌β-乳糖酶的转基因动物已经在大鼠35,36, 鸡37,38,爪蟾39或斑马鱼40。迄今为止, 由于可诱导基因表达系统的可用性, 以及组织和细胞特异的 p-LacZ 标记线 41,果蝇已将这种技术用于改善空间和世俗基因表达的可视化. ,10。值得注意的是, 除了这些涉及转基因和击倒动物的许多应用, LacZ 报告基因已被用于整个组织和培养细胞, 以预测疾病的基因在生物医学研究中的作用。后者的一个相关例子是研究衰老过程中对压力、肿瘤抑制或发展的反应。衰老细胞在原位体内都很容易被发现, 因为它们的特征表达和积累的内源溶酶β-乳糖酶42,43。因此, β-乳糖酶在肿瘤培养细胞的定量检测中被用作衰老的生物标志物44

总之, 我们描述了一个可行的和优化的程序, 以便于检测的β-半乳糖苷活动的小鼠胚胎组织。本方法允许根据所选的组织和所使用的基底进行修改。因此, 这种多功能和经济高效的方法, 适用于适当的控制, 特别适合使用与整个小鼠胚胎, 以及薄组织学切片。

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Disclosures

提交人宣布, 他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们要感谢病理学服务在 Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) 中心的技术援助。我们还感谢 Motoharu 博士精机为 Mt4-mmpLacZ小鼠和阿罗约博士提供支持我们的项目和她对手稿的批判性阅读。我们要感谢彼得邦尼对这篇文章的校对。这项工作得到马德里大学欧洲大学的支持, 2017UEM01 授予 C.S.C。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

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References

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

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发育生物学 问题 136 LacZ β乳糖酶 石蜡切片 小鼠发育 胚胎澄清 基因表达
通过检测全小鼠胚胎β乳糖酶活性追踪基因表达
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Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

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