Summary
Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og metoden for parafin snitting og counterstaining. Dette er en enkel og rask prosedyre å overvåke genuttrykk under utvikling som kan også brukes til vev deler, organer eller kulturperler celler.
Abstract
Escherichia coli LacZ genet, koding β-galactosidase, brukes hovedsakelig som en reporter for genuttrykk og en tracer i celle avstamning studier. Klassisk histochemical reaksjonen er basert på hydrolyse av underlaget X-gal i kombinasjon med ferric og jern ioner, som produserer en uløselig blå bunnfall som er lett å visualisere. Derfor fungerer β-galactosidase aktivitet som en markør for uttrykket mønsteret av genet av interesse som utviklingen fortsetter. Her beskriver vi standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet i tidlig hele mouse embryoer og påfølgende metoden for parafin snitting og counterstaining. I tillegg tilbys en prosedyre for å avklare hele embryo bedre visualisere X-gal flekker i dypere områder av fosteret. Konsekvente resultater er oppnådd ved å utføre denne prosedyren, selv om optimalisering av reaksjonen forhold er nødvendig for å minimere bakgrunn aktivitet. Begrensninger i analysen bør også vurderes, spesielt om størrelsen av embryoet i hele mount flekker. Våre protokollen gir en følsom og en pålitelig metode for påvisning av β-galactosidase under musen utvikling som kan brukes mer kryostaten deler samt hele organer. Dermed dynamisk genet uttrykk mønstre gjennom utvikling enkelt kan analyseres ved hjelp av denne protokollen i hele embryoer, men også detaljert uttrykk på cellenivå kan vurderes etter parafin snitting.
Introduction
For å beskrive spesifikke genet uttrykk mønstre, er bruk av reporteren gener som markører viktig fra Drosophila for pattedyr. Eksperimenter med transgene og knockout dyr, er bakteriell β-galactosidase genet (LacZ) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest brukte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) gir hydrolyse av β-galactosides (for eksempel laktose) i monosaccharides (glukose og galaktose)5. Det mest brukte underlaget er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycoside som er hydrolyzed av β-galactosidase gir opphav til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galaktose. Først er oksidert i således en dimer som, når kombinert med kalium ferri- og ferro-cyanid, produserer en karakteristisk uløselig, blått utløse (figur 1)6.
LacZ genet begynte å bli brukt som en reporter genet over tretti år siden7,8. Vanligvis LacZ settes nedstrøms en endogen formidler stedet åpent lesing rammen, slik at den kan brukes i bakteriell og cellen kultur visualisere cellene som inneholder en bestemt setter og transgene dyr som en tracer av endogene Gene expression mønstre under utvikling9. I denne forbindelse har visualisering av β-galactosidase aktivitet vært mye brukt i Drosophila for å forstå de utviklingsmessige og cellulære prosessene fra enkeltceller hele vev. Drosophila arvelighetsforskning favorisere generering av stabil linjer som en endret P-element konstruksjon som inneholder reporter genet LacZ er satt inn tilfeldig steder i genomet. Dermed når plassert under påvirkning av enhancer elementer kan det drive sitt uttrykk i en vev bestemt måte, som har tillatt systematisk analyse av uttrykk mønstre av mange gener i løpet av de siste to tiår10. I tillegg kan bruken av transgene mus å overvåke LacZ genuttrykk også påvisning av genet rekombinasjon hendelser etter grobunn-loxP mediert rekombinasjon, og lokalisering av mutant embryonale stamcelleforskningen derivater i chimeric analyser 11, som forenkler kontroll av LacZ uttrykk i bestemte vev også som timelig. Også i hele embryoer, kan oppdagelsen av β-galactosidase aktivitet produsere differensial flekker mønstre på forskjellige intensiteter som enkelt kan observeres over forskjellige utviklingsstadier analysere tidsmessige endringer i genuttrykk 8,12.
I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å visualisere genuttrykk gjennom X-gal flekker i hele mount vev på tidlig i utviklingen etapper av mouse embryoer. Vi presenterer denne histochemical metoden som en svært følsom og billig teknikk som favoriserer nøyaktig påvisning av merket cellene i hele mount prøver eller på cellenivå etter parafin innebygd vev eller embryoer. Metoden tillater direkte visualisering av flekker i musen vevet med minimum bakgrunnen sammenlignet med andre metoder13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimenter av CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) og Comunidad Autónoma de Madrid for å sikre minimal dyr lider.
1. innsamling av embryoer fra gravid mus (fra E8.5 til E12.5)
- Ofre gravid mus cervical forvridning eller CO2 innånding. Dagen i først observert vaginal plug ble ansett som embryonale dag 0,5 (E0.5).
- Lå dyr i supine posisjon på den absorberende puten og rengjøre mage huden av musen med 70% etanol.
Merk: Sterilitet er ikke nødvendig i fremgangsmåten. - Knip og løft abdominal huden ved hjelp av musen-tann tang.
- Gjør et snitt gjennom huden og bukveggen, 2 til 4 cm loddrett over midtlinjen av magen med kirurgisk saks.
- Avdekke magen og fjerne livmor hornene fra mor med tang kutte blodkar langs indre kurvatur av livmoren med kirurgisk saks.
- Fjerne snoren av embryo og overføre den til en Petriskål på is som inneholder 10 mL iskald 0,01 M fosfat buffer saltvann pH 7.4 (PBS).
- Nøye analysere embryoene ut fra livmoren under en stereomicroscope i en Petriskål med 10 mL frisk iskald PBS. Forstå muskel veggen med urmakere tang å avsløre amniotic sac, og deretter rive amniotic membranen fjerne vedlagte embryoet og plommesekken ved hjelp av tips av pinsett.
- Innhente littermate embryoer fra gravid mus i tidlige stadier (fra E8.5 til E12.5) (figur 2).
- Overføre embryoene til en frisk rett med 10 mL kaldt 1 x PBS med buet tang eller for lite embryo (E8.5-E9.5), bruke plast overføring Pipetter for å samle eksempler uten embryoet skade.
- Før du starter fiksering, ta en embryonale prøve i et microcentrifuge rør for genotyperingteknologi ved å kutte en liten bit av embryoet eller tar amniotic membranen i de minste embryoene (fra E8.5 til E9.5) med urmakere tang.
Merk: LacZ genotyperingteknologi bestemmes av polymerase kjedereaksjon (PCR) primer: fremover, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; omvendt, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2. fiksering av musen embryo
- Overfør hver embryoet til en 2 mL microcentrifuge tube med avrundede base som inneholder 1 mL 1 x PBS.
Merk: Utføre alle skritt i protokollen disse rør med omrøring med en rullende shaker. - Legg embryoene i 1 x PBS for 1 min ved romtemperatur å fjerne resterende blod. Bruk plast overføring Pipetter endre væsker i rørene.
- Fix embryoet i 1 mL av 0,125% glutaraldehyde på is.
Merk: Tiden av fiksering er avhengig av størrelsen på fosteret: 20 min for E8.5-E9.5 embryoer, 30 min E10.5 embryoer og 1t for E12.5 embryoer. - Fjerne bindemiddel og vask embryoene i 1 x PBS to ganger for 10 min ved romtemperatur før behandling utvalget for X-gal flekker.
3. hele Mount β-galactosidase Histochemistry av musen embryo
- Forbered X-Gal skyll buffer og X-Gal flekker løsning før du starter prosedyren (se tabell 1 og Tabell for materiale). Bruk en vill-type (WT) littermate embryo som negative kontroller for den enzymatiske reaksjonen.
- Inkuber embryo i X-Gal skyll buffer for 10 min ved romtemperatur (figur 2).
- Inkuber embryoer i X-Gal flekker løsning fra 2t overnight på 37 ° C beskyttet mot lyset. Overvåke farge reaksjonen periodisk via dissecting mikroskop til tilstrekkelig intensiteten av blå flekker observert uten bakgrunnen i fosteret. Holde pH av løsningen mellom 8 og 9 å redusere bakgrunn under hele flekker. Dersom flekker løsningen begynner å slå lyset, erstatte den med ferske substratløsningen utvide den enzymatiske reaksjonen.
- Stoppe reaksjonen når ønsket signal oppnås ved å vaske embryo i et microcentrifuge rør med 1 mL 1 x PBS to ganger for 10 min hver ved romtemperatur.
- Overføre farget embryo til 1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) å fikse dem, 1t overnight på 4 ° C.
Merk: Embryo kan lagres i 4% PFA/PBS over lengre tid på 4 ° C eller kan behandles umiddelbart for snitting. Dette siste fiksering er avgjørende for langsiktig bevaring av flekker mønster. - Legg embryoene i 1 mL 1 x PBS to ganger for 10 min ved romtemperatur.
- Alternativ 1: Fjern embryo ved nedsenkning i en rekke løsninger med økende konsentrasjoner av glyserol (20%, 40%, 60% og 80% glyserol i 1 x PBS) 1t ved romtemperatur i hver løsning.
Merk: Vask embryo i 80% glyserol over lengre tid, dager, før de fjernes og deretter lagre dem i 80% glyserol på 4 ° C på dette trinnet (figur 2). Legge en liten mengde natrium azide ora krystall av thymol til embryoene lagret på 4 ° C i glyserol eller 1 x anbefales PBS å hindre muggvekst. Etter clearing, kan hele mount embryo brukes for fotografering (trinn 4). - Alternativ 2: Behandle embryo for parafin innebygging og snitting ved bruk av en mikrotom (figur 2). Dokumentere uttrykksmønster i hele farget embryoer før snitting (trinn 4 og 5).
4. fotografering av hele Mount embryo
- Fotografere hele mount farget embryo før snitting, overføre dem til en Petriskål forberedt med en base av styrket 1-2% agarose i 1 x PBS.
- Dekk embryoet helt med 10 mL 1 x PBS i agarose-belagt retter å hindre dehydrering og refleksjon mens fotografere gjennom væsken.
- Orientere embryoet i 1 x PBS ved hjelp av pinsett. For eldre embryo (E10.5-E12.5), gjør et lite hull i agarose med tang plasserer og plasser prøven i den i forskjellige vinkler og unngå fri flyt under fotografering.
- Plass rett på stereomicroscope scenen, ved hjelp av overførte (under scenen) lys. Endre mellom 'mørket-feltet' og 'lyse felt' justeringer til å angi ønsket belysning under fotografering og optimalisere gjennomskinnelighet av utvalget.
Merk: Bruk fiber Fiberoptisk belysning for senere-scenen embryo for å unngå refleksjon på overflaten av fosteret. Når fotografere ryddet embryo, følger du samme fremgangsmåte, men overføre dem til en Petriskål som inneholder 100% glyserol og fordype seg.
5. parafin innebygging og snitting av X-gal farget embryo
- Parafinvoks innebygging
- Fjerne X-gal farget embryoer fra 4 ° C (trinn 3,5) og vask dem med 1 mL 1 x PBS tre ganger for å eliminere overskytende av bindemiddel.
- Overføre hver embryoet til kassetteninn histology ved hjelp av pinsett.
- Plasser kassettene som inneholder embryoene i et beaker og deretter mister passerer dem gjennom en gradert etanol serie ved romtemperatur: 70% etanol, én gang for 30 min; 96% etanol, to ganger for 30 min hver; 100% etanol, to ganger for 30 min.
Merk: Embryo kan lagres i 70% etanol i en ubestemt tid på 4 ° C før starter dehydrering prosessen. - Inkuber hele kassetten i isopropanol i 30 min ved romtemperatur.
- Ved hjelp av pinsett, overføre kassettene til et glass flekker trau som inneholder forvarmes isopropanol og la i en ovn ved 60 ° C i 30 min.
- Legg kassettene i et nytt glass flekker trau som inneholder en blanding av 50% isopropanol / 50% smeltet parafinvoks og la 4 h i 60 ° C ovn.
- Inkuber kassettene med embryoene med to endringer av flytende parafin voks, 30 min på 60 ° C hver.
- På slutten av siste parafin vask, åpne kassetten og overføre hver embryoet til en separat vev innebygging mold for å vise eksemplet under en stereomicroscope.
- Fylle brønnen med flytende parafin voks på 60 ° C. Bruk oppvarmet tang for å holde voks smeltet og nøye orientere embryoet i mold.
Merk: Den riktige retningen av utvalget er et kritisk punkt for snitting embryoet i ønsket flyet. - Før parafinen stivner i mold, Plasser en kassett uten lokket på blokken og fyll den med flytende parafin voks. La gjenværende voksen kjøle inntil befestet over natten i romtemperatur.
- Når parafinen er helt styrket, fjerne det solide tekstblokk fra formen og lagre parafinblokkene enten på rommet eller på 4 ° C før snitting14.
- Parafin snitting
- Orientere blad på mikrotomen og satt opp 5-7 µm av tykkelse. 5.2.2. cool parafin blokken på isen og trim å produsere en kube eller en pyramide.
- Fest blokken til mikrotomen abonnenten ved hjelp av en liten mengde flytende voks.
- Plasser blokken for optimal skjæring. Avsnitt parafinblokkene i 5-7 µm tykke skiver ved hjelp av standard mikrotomen.
- Bruker en fin pensel, plasser delene i et vannbad ved romtemperatur for å manipulere og velge skiver.
- Plukk opp inndelinger fra vannbad med et mikroskop lysbilde og overføre dem i et vannbad på 42 ° C for å strekke.
- Fjern inndelinger vannbad og forsiktig plassere dem på vedheft objektglass.
- Tørr lysbildene i en ovn ved 37 ° C over natten slik at delene helt følge, ellers kan de få tapt under den flekker.
Merk: Oppbevar skliene i 4 ° C før starter flekker prosedyrer.
- Deparaffinization og Counterstaining av X-Gal-farget parafinsnitt
- Satt lysbilder på et mikroskop lysbilde brett i en ovn ved 60 ° C i minst 45 min å gjøre du parafinvoks mer væske.
- Overføre lysbildene på en reol og bruke glass flekker retter til å utføre følgende trinn: dukke racket på flekker glassene som inneholder alkoholer av avtagende konsentrasjoner for komplett parafin fjerning og hydrering av vev: isopropanol i 5 min på 60 ° C; isopropanol for 3 min; 100% etanol i 2 minutter; 96% etanol for 1 min; 70% etanol i 1 min i romtemperatur.
- Skyll inndelinger i destillert vann to ganger for å sikre at det er ingen alkohol rester.
- Counterstain deler med en flekk (f.eks kjernefysiske-Fast rødt løsning) i 5 min (vanligvis mellom 3-8 min) ved romtemperatur (figur 2).
Merk: Denne flekker hjelper for å avsløre overordnede vev strukturen i delene. - Etter vask lysbildene i destillert vann til 1 min og se delen farging i mikroskopet.
Merk: Hvis den ønskede flekker er for svakt, counterstain delene igjen for en lengre tid. - Tørke inndelinger i følgende serie med økende konsentrasjoner av etanol: to vasker i 95% etanol i 2 minutter hver, to vasker i 100% etanol i 2 minutter hver, og for å unngå oppløsende blå farge precipitates, bare en rask vask i xylen.
- Fjern lysbildene ut en etter en og legg dem på et stykke papir. Montere og dekkglassvæske hver Skyv ved hjelp av en syntetisk, fast montering medium.
Merk: Xylen er en brennbar produkt som damp er irriterende og skadelig for menneskers helse og for vannlevende organismer. Det må manipuleres i hette og krever bruk av egnet verneutstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi resultatene av å bruke standardprotokollen for av β-galactosidase histochemical reaksjon med X-gal som underlaget i hele mouse embryoer (figur 1 og figur 2). Bruker denne protokollen, vi undersøke membran type 4-matrise metalloproteinase (Mt4-mmp) uttrykk på ulike embryonale utviklingsstadier (E9.5, E11.5 og E12.5) bruker Mt4-mmp mutant mus som uttrykker LacZ reporteren under kontroll av den endogene Mt4-mmp promoter (Figur 3, Figur 4og figur 5)9,15. Mt4-mmp er en endopeptidase som er bundet til cellemembranen gjennom en glycophosphatidyl inositol anker (GPI). Selv om Mt4-mmp påvist i flere kreft hos mennesker og har vært knyttet til utviklingen av tumor vekst, er informasjon om sin proteolytiske mot ekstracellulær matrix komponenter svært begrenset til dato. I tillegg har nesten ingenting blitt rapportert på rolle og uttrykk for Mt4-mmp under embryonale utviklingen9,16.
Wild type (WT), Mt4-mmpLacZ / + heterozygote (HT) og knockout (KO) littermate embryoer behandles parallelt for X-gal fargeprotokoll (figur 2). Flere kontroller skal inkluderes under farging prosessen med å validere spesifisiteten av prosedyren. Dermed WT embryo brukes som negative kontroller for histochemical reaksjonen og tjene til å overvåke uspesifisert X-gal merking (se figur 3A-D og figur 4A-C). Også for å unngå uspesifikke bakgrunn, må pH i X-Gal flekker løsningen opprettholdes mellom 8 og 9 i hele den hele flekker. I figur 3E, er β-gal-positiv celler visualisert i hele mount HT embryoer på somites og er intersomitic blodkar på E9.5 scenen. Rapportere det akkurat plasseringen av farget celler, fosteret snitting er imidlertid nødvendig å visualisere under mikroskopet rapportert genuttrykk i vev seksjoner mobilnettet oppløsning. I dette tilfellet er LacZ-positive celler funnet i somites, den aorta dorsalis, er intersomitic blodkar samt perineural vaskulær plexus i vev deler (piler i figur 3F-H). Disse resultatene korrelerer med uttrykksmønster rapportert for Mt4-mmp i disse mus embryonale stadier9, som betyr at denne teknikken er enkelt reproduserbare og pålitelig. Som forventet, er β-gal aktivitet høyere i KO embryoer sammenlignet med HT av to kopier av LacZ reporter genet (figur 3I-L). Imidlertid bare HT LacZ / + embryo bør analyseres i studier av genet uttrykk mønstre og KO vev brukes som et bevis på konseptet for å demonstrere gjennomførbarheten av metoden siden på grunn av manglende målrettet genet av interesse, β-gal positiv celler kan være unormalt ligger i det siste.
Når du utfører denne protokollen, eldre embryo (fra E10.5 til E12.5) er ikke gjennomsiktig, og derfor den mest synlige X-gal farget regioner er de nær overflaten. Dermed er et alternativ skritt til denne metoden å fjerne embryo ved vasker i løsninger med økende glyserol konsentrasjoner. I Figur 4, E12.5 LacZ-farget embryo ble klart samtidig som X-gal flekker, tillater oss å fotografere dypere farget regioner av embryoet i stereomicroscope. Som tidligere rapportert på denne gryende scenen, var merking lokalisert i forskjellige regioner i hjernen, lemmer, hårsekken av vibrissa og spissen av halen9. Hvis man ønsker å finne en mobil løsning, bør embryo være innebygd i parafin, delt og mikroskopisk undersøkt.
I figur 5, ble immunohistochemistry med anti-β-gal antistoffer brukt til å bekrefte uttrykk for Mt4-mmp observert ved hjelp av reporteren LacZ flekker. Dermed ble β-gal-positiv celler oppdaget i utvalget av motoneurons i ryggmargen musen på E11.5 ved hjelp av begge tilnærminger, som bekrefter spesifisiteten av protokollen rapporterte her (figur 5A, B).
Figur 1 . Skjematisk illustrasjon av E. coli LacZ reporter genet koding for av β-galactosidase og histochemical reaksjonen katalysert av dette enzymet. I den tradisjonelle flekker hydrolyzes β-galactosidase underlaget 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Deretter er denne mellomliggende oksidert, som forårsaker dimerization og dannelse av sluttproduktet blå-farget (5, 5-dibromo-4, 4'-dichloro indigo). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Diagram som viser de viktigste trinnene i standardprotokollen for påvisning av β-galactosidase aktivitet. Mouse embryoer er samlet inn og behandlet for hele mount X-gal flekker. Når den histochemical flekker utført i henhold til protokollen, kan hele mount embryo være (alternativ 1) klarert med fjær i løsninger med økende glyserol konsentrasjoner og deretter fotografert i en stereomicroscope eller (alternativ 2) innebygd i parafin, delt og counterstained. Forkortelser: RT, romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . X-gal flekker E9.5 WT og Mt4-mmpLacZ / + hele-mount vev delene og embryo. Ved å bruke standard X-gal histochemical analysen, ble transgene embryo bærer LacZ genet under kontroll av Mt4-mmp promoter analysert β-gal aktivitet. WT (A), HT (E) og KO (jeg) E9.5 hele mount embryo ble behandlet for påvisning av β-galactosidase uttrykket. Parafinsnitt fra disse Foster på nivået av ryggmargen tillate visualisering av den flekker på mobilnettet oppløsning. Som forventet, β-gal positiv celler var fraværende i WT deler (B-D), mens intensiteten av merking var høyere i KO (J-L) sammenlignet med HT vev delene (F-H). Tverrsnitt gjennom medfødte avsløre β-gal aktivitet i de utvikle somites og dorsalis perineural vaskulær plexus. Forkortelser: da, dorsalis; FLB, forlemen bud; h, hjerte. m, mesencephalon; NT, notochord; OTV, otic vesicle; OV, optikk vesicle; PNVP, perineural vaskulær plexus; s, somite; t, telencephalon. Skalere barer: 500 μm (A, E, jeg); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Photomicrographs av WT og HT X-gal farget mouse embryoer på E12.5 før (A, D) og etter (B, C, E, F) fjerne med fjær i økt glyserol. Som forventet, WT embryo viser ingen reporter LacZ uttrykk (Vekselstrøm) mens merking ble oppdaget i beina (hvit pilspisser) primordium av hårsekken av vibrissa (hvit pil), spissen av halen (svart pil) og hjerne Mt4-mmpLacZ / + embryo på dette Stadium (D-F)9. (E, F) Etter lysning i glyserol, embryo ble gjennomsiktig og merking kan være lettere visualisert i dypere områder av embryoet, som vist i mesencephalon og telencephalon (hvite pilene i F). Skala bar: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Histochemical og immunohistochemical gjenkjenning av β-galactosidase. (A) X-gal flekker (i blått) avslører uttrykk for Mt4-mmp i bassenget av motoneurons i en parafin del av ryggmargen på E11.5 embryonale scenen. (B) Immunohistochemistry med anti-β-gal antistoffer (i rødt) bekreftet uttrykk for Mt4-mmp i ryggmargen motoneurons på samme embryonale scenen i kryostaten deler. Forkortelser: fp, gulvplaten; MN, motoneurons; Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Oppskrifter og løsninger som kreves for denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
E. coli LacZ genet har vært mye brukt som reporter i studier av genet uttrykk mønstre på grunn av dens høy følsomhet og enkel oppdagelsen. Nåværende protokollen beskriver en klassisk metode for å oppdage β-gal uttrykk basert på en enzymatisk reaksjon som er raskt og enkelt å utføre og billig. Denne metoden kan brukes også uten store endringer i hele mount embryo, intakt organer, kryostaten vev deler eller kulturperler celler.
Nøyaktig anvendelse av denne metoden resulterer i en robust og interpretable flekker. Men er samtidig kontroller og bekreftende fremgangsmåten sterkt anbefalt. I denne forbindelse er stede protokollen gjennomført parallelt i wild type littermate embryo som negative kontroller som tjener til å overvåke uspesifisert X-gal flekker. Videre uttrykk data oppnådd ved hjelp av β-gal flekker er bekreftet ved western blot og kvantitative PCR (Q-PCR) analyse eller ved hjelp av β-gal immunohistochemistry (figur 5), som kombinert med andre antistoffer kan også identifikasjon av spesifikke celletyper uttrykke LacZ9. Fiksering skritt må tas i betraktning for å bevare den enzymatiske aktiviteten av β-galactosidase og minimere bakgrunn under den flekker. Dermed være embryo faste i glutaraldehyde, som gir de mest konsekvente og pålitelige resultatene sammenlignet med paraformaldehyde fiksering17. Dessuten fiksering tid er viktig og bør fastsettes empirisk for hver gryende scenen, siden over fiksering kan redusere β-galactosidase aktivitet. I denne forbindelse kan hele mount embryo løses ved nedsenkning eller perfusjon avhengig av gryende scenen og størrelse. Dermed anbefales transcardial perfusjon for embryoer eldre enn E14.5 og postnatal prøver å sikre at bindemiddel når alle regioner av prøven. Mindre embryo (fra E8.5 til E12.5) kan være fast ved nedsenkning og behandles direkte for i toto X-gal flekker (figur 2). Det bør nevnes at X-gal farging av musen embryo yngre enn E14.5 kan utføres som hele fjellet. I dette tilfellet er farget celler nær overflaten lett oppdages ved hjelp av β-gal flekker. Likevel kan det oppstå at dypere merking vises uklare eller selv fargestoff ikke trenge vevet, særlig i eldre embryoer. I dette tilfellet enten organer eller voksen mus vev kan være dissekert, X-gal farget, og visualisert under en stereomicroscope. Likevel er snitting og mikroskopisk undersøkelse av farget vevet rundt mer egnet (figur 2).
Til tross for protokollen effektivitet, kan farging hele embryoer og oppdagelsen være plagsom. For eksempel, nyre, testikkel, sekretoriske kjertler inneholder bitestikkel og fordøyelsessystemet store mengder av endogene surt β-galactosidase18 som kan forstyrre tolkning av resultatene skyldes bakgrunn aktivitet. Derfor bør histochemical reaksjonen utføres under litt alkaliske pH forhold (pH 8-9) gjennom farging, siden E. coli β-galactosidase har en optimal pH av 7.3. Dette vil hjelpe å redusere bakgrunnen og å favorisere bakteriell β-galactosidase aktivitet19,20,21,22. Det bør også bemerkes at lenge flekker ganger kan resultere i forsuring av X-gal flekk løsning, favoriserer en økt bakgrunn. Videre er β-galactosidase aktiviteten tapt under inkubasjon temperaturer over 50 ° C, men ikke under 42 ° C. I våre hender, inkubasjon med X-gal substrat fungerer bedre når igjen over natten på 37 ° C. Etter farging og før etter fiksering trinnet er det viktig å vaske alle X-gal reaksjon materiale som nøye og så raskt som mulig å eliminere precipitates histochemical reaksjonen som kan settes i delen vev.
Som vist her, er clearing embryo i glyserol viktig for å lage vevet gjennomskinnelig samtidig som X-gal flekker og vev histology. Dermed embryoene tydelige og merking kan visualiseres i dypere områder under stereomicroscope. Men for å analysere den nøyaktige plasseringen av farget cellene, skjæring i prøven er nødvendig, og derfor fjerne er ikke avgjørende. I dette tilfellet kan av følgende anbefalinger i metoden eksempler være nøye parafinen er innebygd og delt. Under innebygging prosessen, etanol dehydrert vev må dyppes i en blanding av isopropanol-parafin. Isopropanol brukes å favorisere utskifting av etanol i utvalget og å lette vevet innebygging i parafin23. I enkelte protokoller brukes xylen isopropanol for samme formål. Likevel presenterer bruk av xylen ulemper versus isopropanol, som krymping og herding av prøven på grunn av fjerning av vev lipider24 og den toksikologiske profilen som en brannfarlige og irriterende produktet25. Oransje oljebasert clearing agenter er en av de sikreste alternativene til xylen siden de kan raskt fjerne uten toksisitet av xylen samt utmerket vevet struktur bevaring26. Også, hvis bruker xylen, denne delen av protokollen skal reduseres med maksimum, siden X-gal flekker kan diffus og tapt19. Etter skjæring, counterstaining med fargestoffer (f.eks kjernefysiske Fast rødt) anbefales å lette histologiske identifikasjon av uttrykke celler. Denne flekker prosedyren er rask, krever bare ett trinn, og utseendet rosa gir god kontrast med den blå-farget X-gal utløse. Men er denne counterstaining kun egnet for bruk med ikke-vandig montering media (i.e. DPX).
Denne klassiske metoden egner seg til påvisning av β-galactosidase aktivitet, siden X-gal i kombinasjon med kalium ferro - og ferricyanide gir et karakteristisk blå bunnfall som ikke blir nedtonet eller blekemiddel lett og når velbygde, kan være oppdaget selv under dissecting mikroskopet. Det finnes andre varianter av den originale protokollen. Bruke tilgjengelig underlag som laks-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) eller Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , eller erstatter den klassiske X-gal/FeCN for Tetrazolium salter forbedrer sensitiviteten av gjenkjenning13,19. Dette anbefales spesielt å tillate høy følsomhet gjenkjenning av lav uttrykk protein og mRNA materiale. Men når brukt for lenge, noen av disse fremgangsmåtene fører til høye nivåer og så forsiktig håndtering av betingelsene er alltid anbefalt, spesielt med tanke på at langvarig inkubasjon perioder kan lette uspesifikke flekker grunn endogene β-galactosidase aktivitet13,27. Når det gjelder sistnevnte er det alltid tilrådelig å bruke ferric kalium salter for å optimalisere påliteligheten av teknikken og unngå fallgruvene.
En viktig begrensning av denne metoden er at den klassiske X-gal flekker prosedyren gir en uløselig blå bunnfall som lett kan oppdages av * lys, men tillater ikke co lokalisering studier av fluorescent eller AC confocal mikroskopi i vev inndelinger. En mulig måte å overkomme denne begrensningen vil være å bruke antistoffer mot β-gal (se figur 5) kombinert med immunodetection for en bestemt celle. Men hvis uttrykk er lav eller bakgrunnen høy, immunolabeling kan gjøre det vanskelig å oppdage om reporter genet er uttrykt i en bestemt celle. Spesielt har en ny teknikk som blitt rapportert å få høy kvalitet AC confocal bilder basert på fluorescens utslipp produsert av X-gal bunnfall28. Dessuten, denne metoden er kompatibel med immunofluorescence og kan identifisere X-gal positiv celler28. Enzymatisk journalister som LacZ genet har fordelen av å være mer følsom enn lysstoffrør, som er bemerkelsesverdig når merking, hvis uttrykket er spesielt lavt. I denne forbindelse har stede teknikken blitt bevist ideelt for påvisning av microRNA29, derfor tillater både kvalitativ vurdering av uttrykket mønstre og kvantifisering av uttrykk. Dobbel flekker brukes til å oppdage β-gal aktivitet og mRNA tilstedeværelse via i situ hybridisering teknikker, som gir svært nyttig informasjon for å undersøke uttrykksmønster av endogene gener mens overvåking β-gal aktivitet i samme utvalget 30. likevel begge β-gal flekken og i situ hybridisering oppdagelsen reaksjoner kan vise farge uforlikelighet under dobbel flekker. Velge et mer passende substrat som S-gal, anbefales i spesielt optimalisert metoder30.
Denne allsidige metoden er mye brukt til å studere gen funksjon i sammenheng med utviklingsbiologi. Dermed er LacZ genet vedtatt for analyse av genet uttrykk mønstre under embryonale utviklingen av banket det inn et målrettet genet locus. LacZ er en vanlig reporter genet for å studere cis-fungerende regulatoriske elementer (enhancers) involvert i regi genuttrykk i begrensede områder av embryoet, gir informasjon om transkripsjon aktiviteten til arrangøren av interesse31 ,32,33. Også er det ofte brukt i registreringen av rekombinasjon hendelser av grobunn-mediert rekombinasjon loxP nettsteder, som er spesielt nyttig for påvisning av embryonale stamcelleforskningen derivater i cellen skjebne kartlegging eksperimenter eller cellen transplants. Gene-trap mutagenese i embryonale stamceller produserer avkortet proteiner del β-gal som tillater evaluering av arrangøren aktivitet under fysiologiske forhold34. For alle disse tilnærmingene, transgene dyr bære LacZ og uttrykke bakteriell β-galactosidase har blitt generert på rotte35,36, kylling37,38, Xenopus39 eller sebrafisk40. Hittil, denne teknikken har vært brukt i Drosophila for å forbedre effekten av genuttrykk romlig og timelig grunn av tilgjengelighet av induserbart gene expression systemer, og vev og celle-spesifikke p-LacZ merke linjer41 ,10. Det er verdt å merke seg at bortsett fra disse mange programmer som involverer transgene og knockout dyr, LacZ reporter genet er brukt i hele vev samt kultivert celler å forutsi rolle genene i sykdom i biomedisinsk forskning. Et aktuelle eksempel på sistnevnte er studiet av den aldrende prosessen om Svar å stress, svulst undertrykkelse eller utvikling. Det er lett å oppdage både i situ og i vivo sine karakteristiske overuttrykte og akkumulering av endogene lysosomale beta-galactosidase42,43senescent celler. Derfor brukt β-galactosidase som en senescent biomarkør i kvantitative analyser i kreft kultivert celler44.
I sammendraget beskriver vi en mulig og optimalisert prosedyre for å lette lett oppdagelsen av β-galactoside aktivitet i mus embryonale vev. Den nåværende tillater endringer basert på vevet valgt og underlaget brukes. Derfor er denne allsidige og kostnadseffektiv metode ansatt med egnede kontroller spesielt egnet for bruk med hele mouse embryoer og histologiske av tynne snitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Histopathological tjenesten for deres kundestøtte på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for vennlige gi Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo for å støtte vårt prosjekt og hennes kritisk lesning av manuskriptet. Vi ønsker å takke Peter Bonney for korrekturlesing av denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av Universidad Europea de Madrid med stipend (# 2017UEM01) til C.S.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
