Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og metoden til paraffin skæring og counterstaining. Dette er en nem og hurtig procedure til overvågning af genekspression under udvikling, som også kan anvendes til væv dele, organer eller dyrkede celler.

Abstract

Escherichia coli LacZ gen, kodning β-galactosidase, er i vid udstrækning brugt som reporter for genekspression og som røbestof i celle lineage undersøgelser. Den klassiske histokemiske reaktion er baseret på hydrolyse af substrat X-gal i kombination med jern og jern ioner, som producerer en uopløselig blå bundfald, der er let at visualisere. Derfor, β-galactosidase aktivitet fungerer som en markør for gen af interesse udtryk mønster efterhånden som udviklingen skrider frem. Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og den efterfølgende metode til paraffin skæring og counterstaining. Derudover fastsættes en procedure for afklaring hele embryoner til bedre visualisere X-gal farvning i dybere områder af embryoet. Ensartede resultater er opnået ved at udføre denne procedure, selv om optimering af reaktionsbetingelser er nødvendig for at minimere baggrund aktivitet. Begrænsninger i analysen bør overvejes også, især med hensyn til størrelsen af embryo i hele mount farvning. Vores protokol giver en følsom og en pålidelig metode til registrering af β-galactosidase under musen udvikling, der kan anvendes yderligere frysemikrotomsnit samt hele organer. Således dynamisk gen expression mønstre i hele udvikling kan let analyseres ved hjælp af denne protokol i hele embryoner, men også detaljeret udtryk på cellulært niveau kan vurderes efter paraffin skæring.

Introduction

For at beskrive bestemte gen expression mønstre, har brug af reporter gener som markører været altafgørende fra Drosophila til pattedyr. Forsøg med transgene og knockout dyr, er den bakterielle β-galactosidase gen (LacZ) af Escherichia coli (E. coli) en af de mest udbredte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyserer hydrolyse af β-galactosides (såsom lactose) i sin monosakkarider (glucose og galactose)5. Dens mest almindeligt anvendte substrat er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycosid, der er hydrolyseret af β-galactosidase giver anledning til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galactose. Først oxideres i en dimer, når de anvendes kombineret med kalium ferri- og ferro-cyanid, producerer en karakteristisk uopløseligt, blå farve bundfald (figur 1)6.

LacZ gen begyndt at blive brugt som en reporter gen over tredive år siden7,8. Normalt, LacZ er indsat neden for en endogen promotor stedet åbne læsning rammen, så det kan bruges i bakteriel og celle kultur at visualisere celler, der indeholder en bestemt indsætte samt i transgene dyr som røbestof af endogene gen expression mønstre under udvikling9. I denne henseende har visualisering af β-galactosidase aktivitet været flittigt brugt i Drosophila for at forstå de udviklingsmæssige og cellulære processer fra enkelt celler til hele væv. Drosophila genetik favorisere generation af stabil linjer som en modificeret P-element konstruktion indeholdende reporter gen LacZ er indsat på tilfældige steder i genomet. Således, når de placeres under indflydelse af enhancer elementer kan det køre sit udtryk på en bestemt måde, væv, der har tilladt en systematisk analyse af udtryk mønstre af mange gener i løbet af de sidste to årtier10. Desuden giver brug af Transgene mus til at overvåge LacZ genekspression også påvisning af gen rekombination begivenheder af Cre-loxP medieret rekombination og lokalisering af mutant embryonale stamceller derivater i kimære analyser 11, som muliggør kontrol af LacZ udtryk i specifikke væv såvel som tidsmæssigt. Også, i hele embryoner, påvisning af β-galactosidase aktivitet kan producere differential farvning mønstre på forskellige intensiteter, der bekvemt kan iagttages på tværs af forskellige udviklingsstadier analysere tidsmæssige ændringer i genekspression 8,12.

I denne artikel præsenterer vi en protokol for at visualisere genekspression gennem X-gal farvning i hele mount væv på tidlige udviklingsstadier af musen embryoner. Vi præsenterer denne histokemiske metode som en yderst følsom og billig teknik, der favoriserer nøjagtig registrering af mærket celler i hele mount prøver eller på cellulært niveau efter paraffin indlejret væv eller embryoner. Metoden giver mulighed for direkte visualisering af farvning i mus væv med minimum baggrunden sammenlignet med andre metoder13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Udvalget om etik af dyr eksperimenter af CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) og Comunidad Autónoma de Madrid for at sikre minimal dyrelidelser.

1. samling af embryoner fra gravide mus (fra E8.5 til E12.5)

  1. Ofre gravide mus enten cervikal dislokation eller CO2 indånding. Først dag observeret vaginal plug blev betragtet som embryonale dag 0,5 (E0.5).
  2. Lå dyret i den liggende stilling på absorberende puden og rense abdominal huden af mus med 70% ethanol.
    Bemærk: Sterilitet er ikke påkrævet i følgende trin.
  3. Knivspids og løfte abdominal huden ved hjælp af musen-tand pincet.
  4. Gøre et snit gennem huden og bugvæggen, 2-4 cm lodret over midterlinjen af maven ved hjælp af kirurgiske saks.
  5. Afsløre maven og fjerne de uterine horn fra mor med pincet skæring blodkar langs den indre krumning af livmoderen med kirurgisk saks.
  6. Fjerne streng af embryoner og overføre det til en petriskål på isen indeholdende 10 mL iskold 0,01 M fosfat buffer saltvand pH 7,4 (PBS).
  7. Omhyggeligt dissekere embryoner ud fra livmoderen under et stereomikroskop i en petriskål med 10 mL frisk iskold PBS. Forstå muskel væg med urmagere pincet til at eksponere fosterhinden, og så rive den fostervand membran for at fjerne de lukkede embryo og blommesækken ved hjælp af spidsen af pincet.
  8. Indsamle littermate embryonerne fra gravide mus i tidlige faser (fra E8.5 til E12.5) (figur 2).
  9. Overførsel af embryoner til en frisk skål med 10 mL koldt 1 x PBS ved hjælp af buet pincet, eller for meget små embryoner (E8.5-E9.5), bruge plast overførsel pipetter til at indsamle prøver uden embryo skader.
  10. Før du starter optagelsen, tage en embryonale prøve i et microcentrifuge rør til genotypebestemmelse af skærer et lille stykke af embryoet eller tage den fostervand membran i de mindste embryoner (fra E8.5 til E9.5) med urmagere pincet.
    Bemærk: LacZ genotypebestemmelse bestemmes ved polymerase kæde reaktion (PCR) primere: fremad, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; omvendt, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fiksering af musen embryoner

  1. Overføre hvert embryon ind i et 2 mL microcentrifuge rør med en afrundet base, som indeholder 1 mL 1 x PBS.
    Bemærk: Udfør alle trin i protokollen i disse rør med agitation ved hjælp af en rullende shaker.
  2. Vask af embryoner i 1 x PBS i 1 minut ved stuetemperatur til at fjerne de resterende blod. Brug plastik overførsel pipetter til at ændre væsker i rør.
  3. Fix embryo i 1 mL 0,125% glutaraldehyd på is.
    NOTE: Tid af fiksering afhænger af størrelsen af fosteret: 20 min til E8.5-E9.5 embryoner, 30 min for E10.5 fostre og 1 h for E12.5 fostre.
  4. Fjerne fiksativ og vaske embryoner i 1 x PBS to gange i 10 min. ved stuetemperatur før forarbejdning prøven for X-gal farvning.

3. hele Mount β-galactosidase histokemi mus embryoner

  1. Forbered X-Gal skyl buffer og X-Gal farvning løsning inden du begynder proceduren (Se tabel 1 og Tabel af materialer). Bruge en wild-type (WT) littermate embryoner som negative kontroller for enzymatisk reaktion.
  2. Inkuber embryoner i X-Gal skyl buffer i 10 min. ved stuetemperatur (figur 2).
  3. Inkuber embryoner i X-Gal farvning løsning fra 2 h til natten over ved 37 ° C beskyttet mod lys. Overvåge farve reaktion periodisk via et dissekere mikroskop, indtil tilstrækkeligt intensiteten af blå farvning er observeret uden baggrund i embryo. Holde pH af løsningen mellem 8 og 9 for at reducere baggrund under den hele farvning. Hvis Farvningsopløsningen begynder at tænde lys, erstatte det med friske substratopløsning at udvide enzymatisk reaktion.
  4. Reaktionen standses, når det ønskede signal er opnået ved at vaske embryoner i et microcentrifuge rør med 1 mL 1 x PBS to gange i 10 min ved stuetemperatur.
  5. Overføre farves embryoner til 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) hen til re lave dem for 1 time til natten over ved 4 ° C.
    Bemærk: Embryoner kan opbevares i 4% PFA/PBS for længere tid ved 4 ° C eller umiddelbart kan behandles for skæring. Denne endelige fiksering skridt er afgørende for den langsigtede bevarelse af det farvning mønster.
  6. Vask af embryoner i 1 mL 1 x PBS to gange i 10 min ved stuetemperatur.
  7. Valgmulighed 1: Ryd embryoner ved nedsænkning i en serie af løsninger med stigende koncentrationer af glycerol (20%, 40%, 60% og 80% glycerol i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur i hver løsning.
    Bemærk: Vask embryoner i 80% glycerol for længere tid, endda dage, indtil de er fjernet, og derefter gemme dem i 80% glycerol ved 4 ° C på dette trin (figur 2). Tilføje en meget lille mængde af natrium indeholder ora krystal af thymol at embryonerne opbevares ved 4 ° C i glycerol eller 1 x anbefales PBS at forhindre skimmelvækst. Efter clearing, kan hele mount embryoner bruges til at fotografere (trin 4).
  8. Valgmulighed 2: Proces embryoner til paraffin indlejring og skæring ved hjælp af en mikrotom (figur 2). Dokumentere udtryk mønster i hele farves embryoner før skæring (trin 4 og 5).

4. fotografering af hele Mount embryoner

  1. At fotografere hele mount farves embryoner før skæring, overføre dem til en petriskål, tilberedt med en base af størknede 1-2% Agarosen i 1 x PBS.
  2. Dække embryo helt med 10 mL 1 x PBS i Agarosen-belagt retter at forhindre dehydrering og refleksion mens fotografere gennem væsken.
  3. Orientere embryonet nedsænket i 1 x PBS ved hjælp af pincet. For ældre embryoner (E10.5-E12.5), lave et lille hul i Agarosen med pincet til at placere og placere modellen inden for det i forskellige vinkler og at undgå den frit svævende i fotografering.
  4. Placer skålen på stereomikroskopet scene, ved hjælp af den overførte (under fase) lys. Skifte mellem 'dark-felt' og 'lysfelt' justeringer at indstille den ønskede belysning under fotografering og optimere gennemskinnelighed af prøven.
    Bemærk: Brug fiber fiberoptisk belysning til senere embryoner for at undgå refleksion på overfladen af embryoet. Når man fotograferer ryddet embryoner, Følg den samme procedure, men overføre dem til en petriskål, som indeholder 100% glycerol og Fordyb dem.

5. paraffin indlejring og skæring af X-gal farves embryoner

  1. Paraffinvoks indlejring
    1. Fjern X-gal farves embryoner fra 4 ° C (trin 3,5) og vaske dem med 1 mL 1 x PBS tre gange for at fjerne overskydende af fiksativ.
    2. Overføre hver embryo til en histologi kassette med pincet.
    3. Placer de kassetter, der indeholder embryoner i et bægerglas og derefter dehydrere ved at passere dem gennem en gradueret ethanol serie ved stuetemperatur: 70% ethanol, en gang for 30 min. 96% ethanol, to gange for 30 min hver; 100% ethanol, to gange i 30 min.
      Bemærk: Embryoner kan opbevares i 70% ethanol i en ubestemt tid ved 4 ° C indtil starten af dehydrering processen.
    4. Inkuber hele kassetten i isopropanol i 30 min. ved stuetemperatur.
    5. Ved at bruge pincet, overføre kassetter til et glas farvning lavpunktet indeholdende pre varmede isopropanol og efterlade i en ovn ved 60 ° C i 30 min.
    6. Placere kassetter i en ny glas farvning lavpunktet indeholdende en blanding af 50% isopropanol / 50% smeltet paraffin voks og henstår i 4 h i en 60 ° C-ovn.
    7. Inkuber kassetter med embryoner med to ændringer af smeltet paraffin, 30 min. ved 60 ° C hver.
    8. For enden af den endelige paraffin vask åbne kassetten og overføre hver embryo til en separat væv indlejring mug for at se prøve under et stereomikroskop.
    9. Fyld godt med smeltet paraffin voks ved 60 ° C. Bruge opvarmet pincet til at holde voks smeltet og nøje orientere embryo i formen.
      Bemærk: Den korrekte orientering af prøven er et afgørende skridt for skæring embryo i det ønskede fly.
    10. Før paraffin størkner i formen, placere en kassette uden låg på toppen af blokken og fyld den med smeltet paraffin voks. Lad den resterende voks cool indtil størknede natten over ved stuetemperatur.
    11. Når paraffinen er helt stivnet, fjerne den massiv blok fra formen og gemme paraffinblokke enten ved stuetemperatur eller ved 4 ° C indtil skæring14.
  2. Paraffin skæring
    1. Orientere blad på mikrotomen og nedsat 5-7 µm tykkelse. 5.2.2. cool paraffin blok på isen og trim det til at producere en kube eller en pyramide.
    2. Vedhæfte blokken til indehaveren af mikrotomen ved hjælp af en lille mængde af smeltet voks.
    3. Orientere blok for optimal skæring. Afsnit paraffinblokke i 5-7 µm tykke skiver ved stuetemperatur ved hjælp af standard mikrotomen.
    4. Brug en fin pensel, placere afsnittene i et vandbad ved stuetemperatur for at manipulere og vælge udsnit.
    5. Afhente sektioner fra vandbad med et objektglas og overføre dem til et vandbad på 42 ° C for at strække.
    6. Fjerne afsnit fra vandbadet og anbring dem forsigtigt på vedhæftning objektglas.
    7. Tørre dias godt i en ovn ved 37 ° C natten over at tillade sektioner helt overholder, ellers, de kan få tabt under farvning.
      Bemærk: Opbevar dias ved 4 ° C indtil begyndende farvning procedurer.
  3. Deparaffinization og Counterstaining af X-Gal-farvede paraffinsnit
    1. Sæt dias på et objektglas bakke i en ovn ved 60 ° C i mindst 45 min til at gøre paraffinvoks mere væske.
    2. Overføre slides op på et stativ og bruge glas farvning retter til at udføre følgende trin: dykke rack i farvning krukker alkoholer faldende koncentrationer for komplet paraffin fjernelse og hydrering af væv: isopropanol i 5 min på 60 ° C; isopropanol for 3 min; 100% ethanol for 2 min; 96% ethanol i 1 min; 70% ethanol i 1 minut ved stuetemperatur.
    3. Skyl sektioner i destilleret vand to gange for at sikre, at der er ingen alkohol restkoncentrationer.
    4. Kontrastfarve sektioner med en plet (f.eks. nuklear-Fast Red løsning) for 5 min (normalt mellem 3-8 min) ved stuetemperatur (figur 2).
      Bemærk: Denne farvning hjælper til at afsløre overordnede væv struktur i afsnittene.
    5. Efter farvning, vaske dias i destilleret vand i 1 min og afsnittet farvning i mikroskopet.
      Bemærk: Hvis den ønskede farvning er for svag, sektioner kontrastfarve igen i længere tid.
    6. Dehydrere sektioner i den følgende serie med stigende koncentrationer ethanol: to vasker på 95% ethanol i 2 min., to vasker i 100% ethanol i 2 min., og for at undgå at opløse blå farve udfældes, bare en hurtig vask i xylen.
    7. Fjern dias fra rack én efter én og placere dem på et stykke papir. Mount og coverslip hver skub derefter ved hjælp af en syntetisk, permanent montering medium.
      Bemærk: Xylen er et brandfarligt produkt hvis dampe er irriterende og skadelige for menneskers sundhed og vandorganismer. Det skal blive manipuleret inden for en hætte og kræver brug af passende beskyttelsesudstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi resultaterne fra at anvende standard-protokol til β-galactosidase histokemiske reaktion ved hjælp af X-gal som substrat i hele musen embryoner (figur 1 og figur 2). Ved hjælp af denne protokol, vi undersøger membran type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) udtryk på forskellige embryonale udviklingsstadier (E9.5, E11.5 og E12.5) ved hjælp af Mt4-mmp mutant-mus, der udtrykker LacZ reporter under kontrol af den endogene MT4-mmp promoter (figur 3, figur 4og figur 5)9,15. MT4-mmp er en endopeptidase, der er bundet til cellemembranen gennem en glycophosphatidyl inositol anker (GPI). Selvom Mt4-mmp er blevet påvist i flere menneskelige kræftformer og har været relateret til progression af tumorvækst, er oplysninger om dens proteolytiske aktivitet mod ekstracellulære matrix komponenter meget begrænset til dato. Derudover er næsten intet blevet rapporteret om rolle og udtryk for Mt4-mmp under fosterudviklingen9,16.

Vildtype (WT), Mt4-mmpLacZ / + heterozygous (HT) og knockout (KO) littermate embryoner behandles parallelt til X-gal farvnings-protokollen (figur 2). Flere kontrolelementer skal medtages under farvning processen med at validere specificiteten af proceduren. Således WT embryoner bruges som negative kontroller til de histokemiske reaktion og tjene til at overvåge ikke-specifikke X-gal mærkning (Se figur 3A-D og figur 4A-C). Også, for at undgå uspecifik baggrund, pH-værdien af X-Gal Farvningsopløsningen skal opretholdes mellem 8 og 9 i hele den hele farvning. I figur 3E, er β-gal-positive celler visualiseret i hele mount HT embryoner i somites og den intersomitic Vaskulaturen i E9.5 fase. Men, for at rapportere den præcise placering af de farvede celler, embryo skæring er påkrævet at visualisere under mikroskop rapporteret genekspression i væv sektioner på cellulære opløsning. I dette tilfælde findes LacZ-positive celler i somites, den dorsale aorta, intersomitic Vaskulaturen samt perineural vaskulære plexus i væv sektioner (pile i fig. 3F-H). Disse resultater korrelerer med udtryk mønster rapporteret til Mt4-mmp i disse mus vorden9, angiver, at denne teknik er let gengivelig og pålidelige. Som forventet, er niveauer af β-gal aktivitet højere i KO embryoner sammenlignet med HT på grund af tilstedeværelsen af to kopier af LacZ reporter gen (figur 3I-L). Dog kun HT LacZ / + embryoner skal analyseres i undersøgelser af gen expression mønstre og KO væv bruges som en proof of concept til at demonstrere muligheden for metoden siden på grund af den målrettede gen af interesse, β-gal positive celler kan være unormalt beliggende i sidstnævnte.

Når du udfører denne protokol, ældre embryoner (fra E10.5 til E12.5) er ikke gennemsigtig, og derfor den mest synlige X-gal farves regioner er dem tæt på overfladen. Således, en alternative trin til denne metode er at rydde embryoner af vasker i løsninger med stigende glycerol koncentrationer. I figur 4, E12.5 LacZ-farvede embryoner blev klart samtidig med at den X-gal farvning, at lade os fotografere dybere farves regioner af embryo i stereomikroskopet. Som tidligere rapporteret på denne embryostadiet, var mærkning lokaliseret i forskellige regioner af hjernen, lemmerne, follikel af vibrissa og spidsen af halen9. Men hvis man ønsker at få en cellulær opløsning, embryoner skal være indlejret i paraffin, sectioned og mikroskopisk undersøgt.

I figur 5, blev Immunhistokemi med anti-β-gal antistoffer brugt til at bekræfte udtryk af Mt4-mmp observeret gennem reporter LacZ farvning. Således, β-gal-positive celler blev opdaget i puljen af motoneurons af mus rygmarven på E11.5 ved hjælp af begge tilgange, der bekræfter specificitet i protokollen rapporteret her (figur 5A, B).

Figure 1
Figur 1 . Skematisk illustration af E. coli LacZ reporter gen kodning for β-galactosidase og de histokemiske reaktion katalyseret af dette enzym. I den traditionelle farvning hydrolyserer β-galactosidase substratet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Efterfølgende oxideres denne mellemliggende, som forårsager dimerization og dannelsen af den endelige blå-farvet produkt (5, 5'-Dibrom-4, 4'-dichlor indigo). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Diagram, der viser de vigtigste trin i standard-protokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet. Musen embryoner er indsamlet og behandlet for hele mount X-gal farvning. Efter de histokemiske farvning udført i henhold til protokollen, kan hele mount embryoner være (mulighed 1) ryddet med vasker i løsninger med stigende glycerol koncentrationer og efterfølgende fotograferet i et stereomikroskop, eller (mulighed 2) indlejret i paraffin, snit og counterstained. Forkortelser: RT, stuetemperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . X-gal farvning af E9.5 WT og Mt4-mmpLacZ / + hele-mount fostre og væv sektioner. Ved hjælp af de standard X-gal histokemiske assay, blev transgene embryoner med LacZ gen under kontrol af Mt4-mmp promotor analyseret for β-gal aktivitet. WT (A), HT (E) og KO (jeg) E9.5 hele mount embryoner blev forarbejdet til påvisning af β-galactosidase udtryk. Paraffinsnit fremstillet af disse embryoner på niveauet af rygmarven tillade visualisering af farvning med cellulære opløsning. Som forventet, β-gal positive celler var fraværende i WT sektioner (B-D), mens intensiteten af mærkning var højere i KO (J-L) sammenlignet med HT væv sektioner (F-H). Tværsnit gennem neuralrøret afsløre β-gal aktivitet i de tredje somites, dorsal aorta og perineural vaskulære plexus. Forkortelser: da, dorsal aorta; FLB, forelimb bud; h, hjertet; m, mesencephalon; NT, notochord; OTV, eksotiske vesikel; OV, optik vesikel; PNVP, perineural vaskulære plexus; Sørensen, somite; t, telencephalon. Skalere barer: 500 μm (A, E, jeg); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Mikrofotografier i WT og HT X-gal farves mus embryoner på E12.5 før (A, D) og efter (B, C, E, F) clearing med vasker i øget glycerol. Som forventet, WT embryoner vise ingen reporter LacZ udtryk (A-C) mens mærkning blev opdaget i lemmer (hvid pilespidser), primordium follikel af vibrissa (hvid pil), spidsen af halen (sort pil) og hjerne af Mt4-mmpLacZ / + embryoner på dette stadium (D-F)9. (E, F) Efter clearing i glycerol, embryoner blev gennemskinnelig og mærkning kan være mere let visualiseret i dybere områder af embryonet, som vist i mesencephalon og telencephalon (hvide pile i F). Skalalinjen: 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Histokemiske og immunhistokemisk påvisning af β-galactosidase. (A) X-gal farvning (i blåt) afslører udtryk af Mt4-mmp i puljen af motoneurons i en paraffin afsnit af rygmarven på embryostadiet E11.5. (B) Immunhistokemi med anti-β-gal antistoffer (i rødt) bekræftede udtryk af Mt4-mmp i rygmarven motoneurons på samme embryostadiet i frysemikrotomsnit. Forkortelser: fp, gulvet plade; MN, motoneurons; Skalalinjen: 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1. Opskrifter og løsninger kræves for denne protokol. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

E. coli LacZ gen har været meget anvendt som reporter i undersøgelser af gen expression mønstre på grund af sin høje følsomhed og lethed af påvisning. Denne protokol beskriver en klassisk metode til påvisning af β-gal udtryk baseret på en enzymatisk reaktion, der er let og hurtig at udføre og billig. Denne metode kan også anvendes uden større ændringer i hele mount embryoner, intakt organer, væv frysemikrotomsnit eller dyrkede celler.

Korrekt anvendelse af denne metode resulterer i en robust og fortolkelige farvning. Men samtidig kontrol og efterfølgende bekræftende skridt er stærkt anbefales. I denne henseende udføres denne protokol parallelt med vildtype littermate embryoner bruges som negative kontroller, der tjener til at overvåge ikke-specifikke X-gal farvning. Derudover udtryk data opnået ved hjælp af β-gal farvning er bekræftet af western-skamplet og kvantitativ PCR (Q-PCR) analyse eller ved hjælp af β-gal Immunhistokemi (figur 5), som kombineret med andre antistoffer også tillader identifikation af specifikke celletyper udtrykker LacZ9. Fiksering skridt der skal tages i betragtning for at bevare den enzymatiske aktivitet af β-galactosidase og minimere baggrund under farvning. Embryoner skal således fastsættes i glutaraldehyd, som giver de mest konsekvente og pålidelige resultater sammenlignet med PARAFORMALDEHYD fiksering17. Derudover fiksering tid er afgørende og bør fastsættes empirisk for hver embryostadiet, da overdrevne fiksering kan reducere β-galactosidase aktivitet. I denne forbindelse kan hele mount embryoner fastsættes af fordybelse eller perfusion afhængigt af fosterstadiet og størrelse. Således anbefales transcardial perfusion for embryoner ældre end E14.5 og postnatal prøver at sikre, at fiksativ når alle regioner af prøven. Mindre embryoner (fra E8.5 op til E12.5) kan blive fast ved nedsænkning og forarbejdet direkte til i toto X-gal farvning (figur 2). Det bør nævnes, at X-gal farvning af musen embryoner yngre end E14.5 kan udføres som hele bjerget. I dette tilfælde farvede celler tæt på overfladen som nemt kan opdages ved hjælp af β-gal farvning. Alligevel kan det forekomme at dybere mærkning vises sløret eller endda farvestof ikke trænge ind i væv, især i ældre embryoner. I dette tilfælde enten organer eller væv, voksne mus kan blive dissekeret, X-gal farves, og visualiseret under et stereomikroskop. Skæring og mikroskopisk undersøgelse af bejdset væv af interesse er dog mere egnet (figur 2).

Trods den protokol effektivitet, kan farvning hele embryoner og opdagelse være generende. For eksempel, nyre, testiklerne, Sekretorisk Kirtler indeholder epididymis og mave-tarmkanalen store mængder af endogene sure β-galactosidase18 der kan forstyrre fortolkning af resultaterne på grund af baggrunden aktivitet. Derfor bør de histokemiske reaktion udføres betingelser svagt basisk pH (pH 8-9) i hele farvning, da E. coli β-galactosidase har en optimal pH i 7.3. Dette vil medvirke til at reducere baggrund og favorisere bakteriel β-galactosidase aktivitet19,20,21,22. Det skal også bemærkes, at lange farvning gange kan medføre forsuring af X-gal farvning løsning, fremmer en øget baggrund. Endvidere er β-galactosidase aktivitet tabt under inkubation temperaturer over 50 ° C, men ikke under 42 ° C. I vores hænder, inkubation med X-gal substrat fungerer bedre da forlod natten over ved 37 ° C. Efter farvning og før trinnet efter fiksering er det vigtigt at vaske alle X-gal reaktion materiale som omhyggeligt og så hurtigt som muligt at fjerne bundfald fra de histokemiske reaktion, der kan deponeres i afsnittet væv.

Som vist her, er clearing embryoner i glycerol vigtigt, at vævet gennemskinnelige samtidig bevare X-gal, farvning og væv histologi. Således, at embryonerne blevet klart og mærkning kan visualiseres i dybere regioner under stereomikroskopet. Men for at analysere den nøjagtige placering af de farvede celler, skæring af prøven er påkrævet, og clearing er derfor ikke afgørende. I dette tilfælde, kan med følgende anbefalinger fremgår af metoden, prøver være omhyggeligt paraffin integrerede og sektioneret. Under indlejring bliver dehydreret ethanol væv skal være nedsænket i en blanding af isopropanol-paraffin. Isopropanol anvendes til at favorisere udskiftning af ethanol i prøven og lette væv indlejring i paraffin23. I nogle protokoller bruges xylen i stedet for isopropanol til samme formål. Ikke desto mindre præsenterer brug af xylen ulemper versus isopropanol, såsom svind og hærdning af prøven på grund af fjernelse af væv lipider24 og dets toksikologiske profil som en brandfarlig og lokalirriterende produkt25. Orange olie-baserede clearing agenter er en af de sikreste alternativer til xylen, da de tillader hurtig clearing uden toksicitet af xylen samt fremragende væv struktur bevarelse26. Også, hvis du bruger xylen, denne del af protokollen bør reduceres på maksimum, da X-gal farvning kan diffuse og gå tabt19. Efter skæring, counterstaining med farvestoffer (f.eks. nukleare hurtigt røde) anbefales at lette histologiske identifikation at udtrykke celler. Denne farvning procedure er hurtig, som kræver kun et skridt, og dens pink udseende giver god kontrast til det blå-farve X-gal bundfald. Men denne counterstaining er kun egnet til brug med ikke-vandige montering medier (i.e. DPX).

Denne klassiske metode er egnet til påvisning af β-galactosidase aktivitet, siden X-gal i kombination med kalium ferro - og Ferricyanid producerer en karakteristisk blå bundfald, der ikke falmer eller blegemiddel nemt og når velbygget, kan være opdaget selv under dissekere mikroskop. Der er andre ændringer af den oprindelige protokol. Ved hjælp af tilgængelige substrater såsom laks-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) eller Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , eller erstatte den klassiske X-gal/FeCN for Tetrazolium salte kan i høj grad øge følsomheden af påvisning13,19. Dette er især anbefales at høj følsomhed påvisning af lav udtryk niveauer af protein og mRNA materiale. Men når det bruges i for lang tid, nogen af disse procedurer kan føre til høje baggrundsværdier og så omhyggelig forvaltning af betingelserne, der er altid anbefalet, især i betragtning af at længere tids inkubation perioder kan lette uspecifik farvning grund endogene β-galactosidase aktivitet13,27. Med hensyn til sidstnævnte er det altid tilrådeligt at bruge jern kaliumsalte for at optimere pålideligheden af teknikken og undgå faldgruber.

En vigtig begrænsning af denne metode er, at den klassiske X-gal farvning procedure producerer en uopløselig blå bundfald, der let kan påvises ved lysmikroskopi, men tillader ikke Co lokalisering undersøgelser af fluorescerende eller Konfokal mikroskopi i væv sektioner. En mulig måde at overvinde denne begrænsning ville være at bruge antistoffer mod β-gal (Se figur 5) kombineret med immunodetection for en bestemt celletype. Men hvis de udtryk er lavt eller baggrunden høj immunolabeling kan gøre det vanskeligt at opdage om reporter gen er udtrykt i en bestemt celle. Især, er en ny teknik blevet rapporteret til at opnå høj kvalitet Konfokal billeder baseret på fluorescens emission produceret af X-gal bundfald28. Desuden, denne metode er kompatibel med immunofluorescens og tydeligt kan identificere X-gal positive celler28. Enzymatisk journalister som LacZ gen giver den fordel at være mere følsomme end lysstofrør, som er værd at bemærke, når mærkning, hvis udtryk er især lavt. I denne forbindelse har den nuværende teknik vist sig ideel til påvisning af mikroRNA29, derfor tillader både kvalitativ evaluering af udtryk mønstre og kvantificering af udtryk niveauer. Dobbelt farvning bruges til at påvise β-gal aktivitet og mRNA tilstedeværelse via i situ hybridisering teknikker, som kan give meget nyttige oplysninger for at undersøge udtryk mønster af endogene gener samtidig overvågning af β-gal aktivitet i den samme prøve 30. dog begge β-gal pletten og i situ hybridisering påvisning reaktioner kan vise farve uforenelighed under dobbelt farvning. At vælge en mere egnet substrat, såsom S-gal, anbefales i specielt optimerede metoder30.

Denne alsidige metode har været flittigt brugt til at studere genfunktion i forbindelse med udviklingsmæssige biologi. Således er LacZ genet blevet vedtaget til analyse af gen expression mønstre under fosterudviklingen af banke det ind i en målrettet gen locus. LacZ er et fælles reporter gen for at studere cis virkende regulerende elementer (smagsforstærkere) involveret i ledelsen genekspression i begrænsede områder af fosteret, med oplysninger om transskription aktivitet af promotor af interesse31 ,32,33. Også, det bruges ofte i påvisning af genetiske rekombination begivenheder af Cre-medieret rekombination af loxP websteder, hvilket er særligt nyttigt til påvisning af embryonale stamceller derivater i celle skæbne kortlægning eksperimenter eller i celle transplantationer. Gen-fælde mutagenese i embryonale stamceller producerer afkortet proteiner smeltet til β-gal, der tillader evaluering af promotor aktivitet under fysiologiske tilstande34. Alle disse strategier, kylling transgene dyr transporterer LacZ og udtrykke bakteriel β-galactosidase er blevet genereret i rotte35,36,37,38, Xenopus39 eller zebrafisk40. Hidtil har er denne teknik blevet brugt i Drosophila for at forbedre visualiseringen af genekspression rumligt og tidsligt på grund af tilgængeligheden af inducerbar gen expression systemer, og væv og celle-specifikke p-LacZ markør linjer41 ,10. Det er værd at bemærke, at bortset fra disse mange ansøgninger, der involverer transgene og knockout dyr, LacZ reporter gen er blevet brugt i hele væv samt kulturperler celler til at forudsige rollen af gener i sygdom i biomedicinsk forskning. Et relevant eksempel på sidstnævnte er studiet af aldringsprocessen med hensyn til Reaktionerne på stress, tumor undertrykkelse eller udvikling. Senescent celler er let at opdage både på stedet og i vivo på grund af deres karakteristiske overekspression og ophobning af endogene lysosomale beta-galactosidase42,43. Derfor bruges β-galactosidase som en senescent biomarkør i kvantitative analyser i kræft kulturperler celler44.

I Resumé beskriver vi en realistisk og optimeret procedure for at lette let påvisning af β-galactoside aktivitet i mus embryonale væv. Den nuværende metode giver mulighed for ændringer baseret på væv valgt og substrat anvendes. Denne alsidige og omkostningseffektive metode med passende kontrol er derfor specielt velegnet til brug med hele musen embryoner og histologiske tyndslib.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansiel interesse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke den histopatologiske Service for deres tekniske bistand på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for venligt giver Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo, for at støtte vores projekt og for hendes kritiske læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Peter Bonney til korrekturlæsning af denne artikel. Dette arbejde blev støttet af Universidad Europea de Madrid ved hjælp af tilskud (# 2017UEM01) til C.S.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 136 LacZ β-galactosidase paraffin skæring mus udvikling embryonale afklaring genekspression
Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter