Summary
Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Si tratta di una procedura facile e veloce per monitorare l'espressione genica durante lo sviluppo che può essere applicato anche a sezioni di tessuto, organi o cellule coltivate.
Abstract
L'Escherichia coli LacZ gene che codifica per β-galattosidasi, è in gran parte utilizzato come reporter per l'espressione genica e come tracciante negli studi di lignaggio cellulare. La classica reazione istochimica si basa sull'idrolisi del substrato X-gal in combinazione con gli ioni ferrici e ferrosi, che produce un precipitato insolubile blu che è facile da visualizzare. Di conseguenza, attività della β-galattosidasi serve come indicatore per il modello di espressione del gene di interesse lo sviluppo procede. Qui descriviamo il protocollo standard per la rilevazione di attività di β-galattosidasi in primi embrioni di topo intero e il conseguente metodo per paraffina sezionamento e colorazione di contrasto. Inoltre, è disponibile una procedura per chiarire interi embrioni per visualizzare meglio il X-gal macchiatura in regioni più profonde dell'embrione. Risultati costanti ottenuti eseguendo questa procedura, anche se l'ottimizzazione delle condizioni di reazione è necessaria per ridurre l'attività di sfondo. Limitazioni nel dosaggio dovrebbero essere considerati anche, specialmente per quanto riguarda le dimensioni dell'embrione intero supporto della colorazione. Il nostro protocollo prevede un sensibile e un metodo affidabile per la rilevazione di β-galattosidasi durante lo sviluppo del mouse che possa essere applicato alle sezioni al criostato, nonché di organi interi. Così, la dinamica espressione genica durante lo sviluppo possa essere facilmente analizzati utilizzando questo protocollo in interi embrioni, ma anche espressione dettagliata a livello cellulare può essere valutato dopo il sezionamento della paraffina.
Introduction
Al fine di descrivere il pattern di espressione genica specifici, l'uso di geni reporter come marcatori è stato fondamentale dalla drosofila ai mammiferi. Negli esperimenti che coinvolgono gli animali transgenici e knockoui, il gene batterico β-galattosidasi (LacZ) di Escherichia coli (Escherichia coli) è uno dei più ampiamente usato1,2,3, 4. β-galattosidasi (β-gallone) catalizza l'idrolisi di β-galactosides (come il lattosio) in monosaccaridi (glucosio e galattosio)5. Il substrato più comunemente usato è il X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glicoside che viene idrolizzato dalla β-galattosidasi, generando 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galattosio. Il primo è ossidato in un dimero che, quando utilizzato combinato con potassio ferri- e ferro-cianuro, produce un caratteristico insolubile, colore blu precipitare (Figura 1)6.
Il gene LacZ iniziò ad essere usato come un gene reporter più di trenta anni fa7,8. Solitamente, LacZ viene inserito a valle di un promotore endogeno nel luogo l'open reading frame, quindi può essere utilizzato nella cultura batterica e cella per visualizzare le celle che contengono un inserto particolare, così come negli animali transgenici come tracciante di endogeno pattern di espressione genica durante lo sviluppo9. A questo proposito, la visualizzazione dell'attività della β-galattosidasi è stato ampiamente utilizzata in drosofila per comprendere i processi cellulari e dello sviluppo da singole cellule ai tessuti tutta. Genetica della drosofila favorisce la generazione di linee stabili in cui un costrutto di P-elemento modificato contenente il gene reporter che lacZ è inserito in modo casuale posizioni nel genoma. Così, quando posto sotto l'influenza degli elementi enhancer può guidare l'espressione in modo specifico del tessuto, che ha permesso l'analisi sistematica dei modelli di espressione di molti geni negli ultimi due decenni10. Inoltre, l'uso di topi transgenici per monitorare l'espressione del gene LacZ consente inoltre di rilevazione degli eventi di ricombinazione genica di Cre-loxP mediata ricombinazione e la localizzazione dei derivati mutante cellule embrionali staminali in analisi chimerici 11, che facilita il controllo di LacZ espressione in tessuti specifici come pure temporaneamente. Inoltre, in interi embrioni, rilevamento dell'attività β-galattosidasi può produrre pattern di colorazione differenziale alle diverse intensità che si possono comodamente osservare attraverso diversi stadi di sviluppo per analizzare i cambiamenti temporali nell'espressione del gene 8,12.
In questo articolo, presentiamo un protocollo per visualizzare l'espressione genica attraverso il X-gal macchiatura nel tessuto intero supporto nelle fasi iniziali dello sviluppo degli embrioni del mouse. Vi presentiamo questo metodo istochimico come una tecnica altamente sensibile e poco costoso che favorisce un rilevamento accurato delle cellule con etichettate intero supporto esemplari o al livello cellulare dopo paraffina embedded tessuti o embrioni. Il metodo consente la visualizzazione diretta di macchiatura nel tessuto del mouse con lo sfondo minimo se confrontato con altri metodi13.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per l'etica di animale esperimenti di CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) e la Comunidad Autónoma de Madrid per garantire la minimo sofferenza degli animali.
1. raccolta di embrioni da topi incinto (da E8.5 a 12.5)
- Sacrificare incinto topi da dislocazione cervicale o inalazione di CO2 . Il giorno del primo osservato plug vaginale è stato considerato embrionali giorno 0.5 (0.5).
- Posare l'animale in posizione supina il tampone assorbente e pulire la pelle dell'addome del mouse con etanolo al 70%.
Nota: La sterilità non è necessaria nei passaggi seguenti. - Stringere e sollevare la pelle addominale usando il forcipe del mouse-dente.
- Fare un'incisione attraverso la pelle e la parete addominale, 2-4 cm in verticale attraverso la linea mediana dell'addome utilizzando forbici chirurgiche.
- Esporre l'addome e rimuovere i corni uterini dalla madre con forcipe taglio vasi sanguigni lungo la curvatura interna dell'utero con forbici chirurgiche.
- Rimuovere la stringa di embrioni e trasferirlo in una capsula Petri su ghiaccio contenente 10 mL ghiacciata 0,01 M tampone fosfato salino pH 7,4 (PBS).
- Accuratamente sezionare gli embrioni fuori dall'utero sotto un microscopio stereoscopico in una capsula di Petri con 10 mL di PBS freddo fresco. Afferrare la parete muscolare con la pinzetta orologiai per esporre il sacco amniotico e poi strappare la membrana amniotic per rimuovere l'embrione recintato e il sacco vitellino con le punte della pinza.
- Raccogliere gli embrioni littermate dai topi incinto nelle fasi iniziali (da E8.5 a 12.5) (Figura 2).
- Trasferire gli embrioni per un piatto fresco con 10 mL di PBS 1X freddo usando il forcipe curvo o, per molto piccoli embrioni (E8.5-E9.5), utilizzare pipette di plastica per raccogliere i campioni senza danni di embrione.
- Prima di iniziare la fissazione, prelevare un campione embrionale in una microcentrifuga per la genotipizzazione di tagliare un piccolo pezzo dell'embrione o prendendo la membrana amniotic negli embrioni più piccoli (da E8.5 a E9.5) con il forcipe di orologiai.
Nota: LacZ genotipizzazione è determinata da iniettori di reazione a catena (PCR) della polimerasi: in avanti, a 5 minuti-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3 ´; invertire, a 5 minuti-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3 ´.
2. fissazione degli embrioni del Mouse
- Trasferire ogni embrione in un tubo del microcentrifuge da 2 mL con una base arrotondata, contenente 1 mL di PBS 1X.
Nota: Eseguire tutti i passaggi nel protocollo in questi tubi con agitazione utilizzando un agitatore per rotolamento. - Lavare gli embrioni in PBS 1X per 1 min a temperatura ambiente per eliminare il sangue rimanente. Pipette di trasferimento in plastica di uso per cambiare liquidi nei tubi.
- Difficoltà l'embrione in 1 mL di 0,125% glutaraldeide sul ghiaccio.
Nota: Al momento della fissazione dipende dalla dimensione dell'embrione: 20 min per embrioni E8.5-E9.5, 30 min per gli embrioni e 10.5 e 1h per gli embrioni 12.5. - Rimuovere il fissativo e lavare gli embrioni in PBS 1X due volte per 10 min a temperatura ambiente prima di elaborare il campione per il X-gal macchiatura.
3. l'intero Monte β-galattosidasi istochimica degli embrioni del Mouse
- Preparare il X-Gal risciacquo buffer e il X-Gal macchiatura soluzione prima di iniziare la procedura (Vedi tabella 1 e Tabella materiali). Utilizzare un embrioni di littermate wild type (WT) come controllo negativo per la reazione enzimatica.
- Incubare gli embrioni nel buffer di X-Gal risciacquo per 10 min a temperatura ambiente (Figura 2).
- Incubare gli embrioni in soluzione di macchiatura di X-Gal da 2 h a tutta la notte a 37 ° C al riparo dalla luce. Monitorare la reazione al colore periodicamente tramite un microscopio per dissezione fino a sufficiente intensità di colorazione blu è osservata senza lo sfondo nell'embrione. Mantenere il pH della soluzione tra 8 e 9 per ridurre di fondo durante l'intera colorazione. Se la soluzione colorante comincia a girare a luce, è possibile sostituirlo con soluzione di substrato fresco per estendere la reazione enzimatica.
- Fermare la reazione quando il segnale desiderato è ottenuto lavando gli embrioni in un tubo del microcentrifuge con 1 mL di PBS 1X due volte per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente.
- Trasferire gli embrioni macchiati in paraformaldeide al 4% a 1 mL (PFA) ri-risolverli, per 1 h a tutta la notte a 4 ° C.
Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati nel 4% PFA/PBS per tempi più lunghi a 4 ° C o possono essere trattati immediatamente per il sezionamento. Questa fase di fissazione finale è fondamentale per la conservazione a lungo termine di pattern di colorazione. - Lavare gli embrioni in 1 mL di PBS 1X due volte per 10 min a temperatura ambiente.
- Opzione 1: Cancellare gli embrioni mediante immersione in una serie di soluzioni con aumento delle concentrazioni di glicerolo (glicerolo 20%, 40%, 60% e 80% in PBS 1X) per 1 h a temperatura ambiente in ogni soluzione.
Nota: Lavare gli embrioni in 80% glicerolo per tempi più lunghi, anche giorni, finché vengono cancellati e poi salvarli in 80% glicerolo a 4 ° C in questa fase (Figura 2). Aggiungendo una piccola quantità di cristallo ora azoturo di sodio del timolo agli embrioni conservati a 4 ° C in glicerolo o 1X PBS è raccomandato per prevenire la crescita di muffe. Dopo schiarimento, interi embrioni del supporto possono essere utilizzati per fotografare (passaggio 4). - Opzione 2: Processo di embrioni per paraffina incorporamento e sezionamento mediante un microtomo (Figura 2). Documentare il modello di espressione in tutto macchiati embrioni prima di sezionamento (passaggi 4 e 5).
4. fotografia di intero Monte embrioni
- A fotografare l'intero supporto macchiato gli embrioni prima del sezionamento, trasferiscili su una piastra Petri preparate con una base di solidificato dell'agarosi di 1-2% in PBS 1X.
- Coprire l'embrione completamente con 10 mL di PBS 1X nei piatti dell'agarosi-rivestito per prevenire la disidratazione e riflessione mentre fotografare attraverso il liquido.
- Orientare l'embrione immerso in 1X PBS usando il forcipe. Per vecchi embrioni (e 10.5-12.5), fare un piccolo buco in agarosio con il forcipe per inserire e posizionare il preparato all'interno di esso le inclinazioni e per evitare il libero di fluttuare durante la fotografia.
- Mettere la teglia sul palco stereomicroscopio, utilizzando la luce trasmessa (sotto-fase). Cambiare tra le regolazioni di 'luminoso-campo' per impostare l'illuminazione desiderata durante la fotografia e per ottimizzare la traslucenza del campione e 'scuro-campo'.
Nota: Utilizzare illuminazione a fibra ottica per la fase successiva embrioni per evitare la riflessione sulla superficie dell'embrione. Quando si fotografa gli embrioni deselezionati, seguire la stessa procedura ma trasferirli in una piastra Petri contenente glicerolo al 100% e completamente immergerli.
5. paraffina incorporamento e sezionamento del X-gal macchiato embrioni
- Incorporamento di cera di paraffina
- Rimuovere il X-gal macchiato embrioni da 4 ° C (punto 3.5) e lavarli con 1 mL di PBS 1X tre volte per eliminare l'eccesso di fissativo.
- Trasferire ogni embrione su una videocassetta di istologia usando il forcipe.
- Posizionare le cassette contenenti gli embrioni in un becher e poi disidratare passandoli attraverso una serie di graduali etanolo a temperatura ambiente: etanolo al 70%, una volta per 30 min; etanolo 96%, due volte per 30 minuti ciascuno; etanolo al 100%, due volte per 30 minuti ciascuno.
Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in etanolo al 70% per un tempo indeterminato a 4 ° C fino a partire il processo di disidratazione. - Incubare la cassetta tutta in isopropanolo a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Usando il forcipe, trasferire le cassette a un vetro colorazione recipiente contenente isopropanolo pre-riscaldato e lasciare in forno a 60 ° C per 30 min.
- Posizionare le cassette in un nuovo vetro colorazione recipiente contenente una miscela di isopropanolo 50% / 50% paraffina cera fusa e lasciare per 4 ore in forno a 60 ° C.
- Incubare le cassette con gli embrioni con due cambi di paraffina fusa, 30 min a 60 ° C.
- Alla fine del lavaggio finale paraffina, aprire la cassetta e trasferire ogni embrione ad un tessuto separato l'incorporamento di stampo per visualizzare l'esempio sotto un microscopio stereoscopico.
- Riempire il pozzetto con cera di paraffina fusa a 60 ° C. Utilizzare pinze riscaldate per mantenere la cera fusa e orientare attentamente l'embrione nello stampo.
Nota: Il corretto orientamento del campione è un passo fondamentale per il sezionamento dell'embrione nel piano desiderato. - Prima paraffina si solidifica nello stampo, inserire un nastro senza il coperchio sulla parte superiore del blocco e riempirlo con cera di paraffina fusa. Lasciare raffreddare la cera rimanente fino solidificato durante la notte a temperatura ambiente.
- Una volta che la paraffina è completamente solidificata, rimuovere il blocco solido dallo stampo e memorizzare i blocchi di paraffina o a temperatura ambiente o a 4 ° C fino a14di sezionamento.
- Sezionamento di paraffina
- Orientare la lama del microtomo e impostare 5-7 µm di spessore. 5.2.2. raffreddare il blocco di paraffina sul ghiaccio e trim per produrre un cubo o una piramide.
- Collegare il blocco al titolare del microtomo utilizzando una piccola quantità di cera fusa.
- Orientare il blocco per il taglio ottima. Sezione i blocchi di paraffina a fette spesse di 5-7 µm a temperatura ambiente mediante microtomo standard.
- Usando un pennello fine, inserire le sezioni in un bagno di acqua a temperatura ambiente per manipolare e selezionando fette.
- Pick up sezioni dal bagno di acqua con un vetrino da microscopio e trasferirli in un bagno di acqua a 42 ° C, per lo stretching.
- Rimuovere le sezioni dal bagno di acqua e metterli delicatamente sui vetrini microscopio adesione.
- Asciugare i vetrini bene in un forno a 37 ° C durante la notte per consentire le sezioni di aderire completamente, in caso contrario, essi possono perdersi durante la colorazione.
Nota: Conservare i vetrini a 4 ° C fino a partire le procedure di colorazione.
- Sparaffinatura e colorazione di contrasto delle sezioni di paraffina X-Gal-macchiato
- Mettere le diapositive su un vassoio di vetrini per microscopio in un forno a 60 ° C per almeno 45 min rendere più fluida la cera di paraffina.
- Trasferire i vetrini in un rack e utilizzare vetro colorazione piatti per effettuare le seguenti operazioni: immergere il rack in vaschette per la colorazione contengono alcoli di diminuire le concentrazioni per la rimozione completa di paraffina e idratazione dei tessuti: isopropanolo per 5 min a 60 ° C; isopropanolo per 3 min; etanolo al 100% per 2 min; etanolo al 96% per 1 min; etanolo al 70% per 1 min a temperatura ambiente.
- Risciacquare le sezioni in acqua distillata due volte per assicurarsi che non vi siano residui di alcol.
- Colorante di contrasto sezioni con una macchia (ad es. soluzione nucleare-Fast Red) per 5 min (di solito tra 3-8 min) a temperatura ambiente (Figura 2).
Nota: Questa colorazione aiuta a svelare la struttura complessiva del tessuto nelle sezioni. - Dopo la colorazione, lavare i vetrini in acqua distillata per 1 min e controllare sezione colorazione nel microscopio.
Nota: Se la colorazione desiderata è troppo debole, controcolorazione sezioni nuovamente per un tempo più lungo. - Disidratare sezioni nelle seguenti serie con aumento delle concentrazioni di etanolo: due lavaggi in etanolo al 95% per 2 minuti ciascuno, due lavaggi in etanolo al 100% per 2 minuti ciascuno, e, per evitare di sciogliere il blu colore precipita, solo un rapido lavaggio in xilene.
- Rimuovere le diapositive dal rack uno ad uno e metterli su un pezzo di carta. Quindi Monte e coprioggetto ogni slide utilizzando un mezzo di montaggio sintetico, permanente.
Nota: Xilene è un prodotto infiammabile cui vapori sono irritanti e dannosi per la salute umana e per gli organismi acquatici. Ha bisogno di essere manipolato all'interno di un cappuccio e richiede l'uso di dispositivi di protezione appropriati.
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Representative Results
Qui vi mostriamo i risultati di applicare il protocollo standard per la reazione istochimica di β-galattosidasi usando X-gal come il substrato in embrioni di topo intero (Figura 1 e Figura 2). Utilizzando questo protocollo, esaminiamo l'espressione di membrana tipo 4-metalloproteinasi (mmp-Mt4) a diversi stadi di sviluppo embrionale (E9.5, E11.5 e 12.5) utilizzando topi mutanti Mt4-mmp che esprimono il reporter LacZ sotto il controllo dell'endogena MT4-mmp promotore (Figura 3, Figura 4e Figura 5)9,15. MT4-mmp è un'endopeptidasi che è legato alla membrana delle cellule attraverso un ancoraggio di inositolo (GPI) di glycophosphatidyl. Anche se Mt4-mmp è stato rilevato in molti tumori umani ed è stato collegato con la progressione della crescita del tumore, informazioni sulla sua attività proteolitica contro componenti della matrice extracellulare sono molto limitati fino ad oggi. Inoltre, quasi nulla è stato segnalato sul ruolo e sulla espressione di Mt4-mmp durante lo sviluppo embrionale9,16.
Wild type (WT), Mt4-mmpLacZ / + eterozigoti (HT) e knockout (KO) littermate gli embrioni vengono elaborati in parallelo per il protocollo di colorazione di X-gal (Figura 2). Diversi controlli devono essere inclusi durante il processo di colorazione per convalidare la specificità della procedura. Così, WT embrioni sono utilizzati come controlli negativi per la reazione istochimica e servono a monitorare non specifico X-gal etichettatura (Vedi Figura 3A-D e Figura 4A-C). Inoltre, per evitare di sfondo non specifico, il pH della soluzione colorante X-Gal deve essere mantenuto tra 8 e 9 in tutta l'intera colorazione. In Figura 3E, cellule β-gal-positive sono visualizzate in embrioni di intero Monte HT in somiti e del vasculature intersomitic nella fase di E9.5. Tuttavia, per segnalare la posizione precisa di cellule marcate, embrione di sezionamento è richiesto per visualizzare al microscopio segnalato l'espressione genica in sezioni di tessuto al cellulare ad alta risoluzione. In questo caso, le cellule positive LacZ sono trovate dei metameri, aorta dorsale, il vasculature intersomitic così come il plesso vascolare perineural in sezioni di tessuto (frecce in Figura 3F-H). Questi risultati correlano con il modello di espressione segnalato per Mt4-mmp in questi mouse fasi embrionali9, che indica che questa tecnica è facilmente riproducibili e affidabili. Come previsto, i livelli di attività β-gallone sono più alti negli embrioni KO rispetto l'HT a causa della presenza di due copie del gene reporter LacZ (Figura 3I-L). Tuttavia, solo HT LacZ / + embrioni dovrebbero essere analizzati in studi di espressione genica e KO tessuto viene utilizzato come un proof of concept per dimostrare la fattibilità del metodo poiché a causa della mancanza del gene target di interesse, le cellule positive di β-gallone possono essere anormalmente situato in quest'ultimo.
Durante l'esecuzione di questo protocollo, vecchi embrioni (da e 10.5 a 12.5) non sono traslucidi, e, di conseguenza, il più visibile il X-gal macchiato regioni sono quelle vicino alla superficie. Così, un passo alternativo a questo metodo è di eliminare embrioni da lavaggi in soluzioni con aumento della concentrazione di glicerolo. Nella Figura 4, gli embrioni di tinto LacZ 12.5 divennero chiari pur mantenendo il X-gal macchiatura, permettendoci di fotografare più profondo macchiato regioni dell'embrione nello stereomicroscopio. Come precedentemente segnalato in questa fase embrionale, etichettatura è stata localizzata in regioni distinte del cervello, le membra, il follicolo della vibrissa e la punta della coda9. Tuttavia, se si vuole ottenere una cellulare ad alta risoluzione, embrioni dovrebbero essere inclusi in paraffina, sezionati ed esaminati microscopicamente.
In Figura 5, immunohistochemistry con gli anticorpi anti-β-gallone è stato usato per confermare che l'espressione di mmp-Mt4 osservato per mezzo di reporter LacZ macchiatura. Così, le cellule β-gal-positive sono state rilevate nella piscina dei motoneuroni del midollo spinale del mouse alle E11.5 utilizzando entrambi gli approcci, che conferma la specificità del protocollo segnalato qui (Figura 5A, B).
Figura 1 . Illustrazione schematica dell'Escherichia coli LacZ reporter gene codificante per la β-galattosidasi e la reazione istochimica catalizzata da questo enzima. Nella macchiatura tradizionale, β-galattosidasi idrolizza il substrato 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) a 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Successivamente, questo intermedio è ossidato, che causa la dimerizzazione e la formazione del prodotto finale di colore blu (5, 5'-dibromo-4, 4'-dicloro indaco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Diagramma che mostra i passaggi principali del protocollo standard per il rilevamento dell'attività della β-galattosidasi. Embrioni di topo sono raccolti e trattati per la colorazione di tutta Monte X-gal. Dopo la colorazione istochimica eseguita secondo il protocollo, interi embrioni del supporto possono essere (opzione 1) eliminato con lavaggi in soluzioni con aumento della concentrazione di glicerolo e successivamente fotografato in un microscopio stereoscopico, o (opzione 2) incorporati in paraffina, sezionati e controcolorati. Abbreviazioni: RT, temperatura ambiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . X-gal macchiatura di E9.5 WT e Mt4-mmpLacZ / + intero-monta gli embrioni e sezioni di tessuto. Utilizzando l'analisi istochimica standard X-gal, embrioni transgenici portatori del gene LacZ sotto il controllo del promotore di Mt4-mmp sono stati analizzati per attività β-gallone. WT (A), HT (E) e KO (io) E9.5 intero supporto gli embrioni sono stati elaborati per la rilevazione dell'espressione della β-galattosidasi. Sezioni di paraffina ottenute da questi embrioni a livello del midollo spinale permettono la visualizzazione della colorazione al cellulare ad alta risoluzione. Come previsto, le cellule positive di β-gallone erano assenti nelle sezioni WT (B-D), mentre l'intensità di etichettatura era più alta in KO (J-L) rispetto le sezioni di tessuto HT (F-H). Sezioni trasversali attraverso il tubo neurale rivelano attività β-gallone in somiti in via di sviluppo, aorta dorsale e il plesso vascolare perineurale. Abbreviazioni: da, aorta dorsale; FLB, germoglio di zampa anteriore; h, cuore; m, mesencefalo; NT, notocorda; OTV, vescicola otica; OV, vescicola ottica; PNVP, perineural plesso vascolare; s, somite; t, telencefalo. Scala bar: 500 μm (A, E, I); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Microfotografie di WT e HT X-gal macchiato embrioni di topo a 12.5 prima (A, D) e dopo (B, C, E, F) compensazione con lavaggi in glicerolo aumentata. Come previsto, gli embrioni WT non mostrano nessun reporter LacZ espressione (A-C) mentre etichettatura è stata rilevata nelle membra (frecce bianche), il primordio del follicolo della vibrissa (freccia bianca), la punta della coda (freccia nera) e il cervello di Mt4-mmpLacZ / + embrioni in questo stadio (D-F)9. (E, F) Dopo compensazione in glicerolo, embrioni è diventato traslucidi ed etichettatura può essere più facilmente visualizzato nelle regioni più profonde dell'embrione, come mostrato nel mesencefalo e il telencefalo (frecce bianche in F). Barra della scala: 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Rilevamento di istochimiche e immunohistochemical della β-galattosidasi. (A) X-gal colorazione (in blu) rivela l'espressione di Mt4-mmp nella piscina dei motoneuroni in una sezione del midollo spinale nella fase embrionale del E11.5. (B) Immunohistochemistry con gli anticorpi anti-β-gallone (in rosso) ha confermato l'espressione di Mt4-mmp in motoneuroni del midollo spinale nella stessa fase embrionale in sezioni al criostato. Abbreviazioni: fp, piastra da pavimento; MN, motoneuroni; Barra della scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Ricette e soluzioni necessarie per questo protocollo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il gene LacZ di e. coli è stato ampiamente usato come un reporter in studi di espressione genica a causa della sua alta sensibilità e la facilità di rilevazione. Il presente protocollo descrive un metodo classico per la rilevazione di β-gallone espressione basata su una reazione enzimatica che è facile e veloce da eseguire e poco costoso. Questo metodo può essere applicato anche senza grosse modifiche nell'intero supporto embrioni, organi intatti, sezioni di tessuto criostato o cellule coltivate.
Accurata applicazione di questo metodo provoca una colorazione robusto e interpretabile. Tuttavia, i controlli simultanei e successivi passaggi confermativi sono altamente raccomandati. A questo proposito, il presente protocollo è condotto in parallelo in embrioni di tipo selvaggio littermate utilizzati come controlli negativi che servono a monitorare non specifico X-gal macchiatura. Inoltre, i dati di espressione ottenuti quando usando la macchiatura β-gallone è confermata dalla western-blot e PCR quantitativa (Q-PCR) analisi o mediante β-gallone immunohistochemistry (Figura 5), che combinato con altri anticorpi consente inoltre l'identificazione di tipi cellulari specifici esprimendo LacZ9. Passaggi di fissaggio devono essere presi in considerazione al fine di preservare l'attività enzimatica della β-galattosidasi e minimizzare sfondo durante la colorazione. Così, gli embrioni devono essere fissati in glutaraldeide, che dà i risultati più coerenti e affidabili rispetto con paraformaldeide fissazione17. Inoltre, tempo di fissazione è fondamentale e deve essere determinato empiricamente per ogni stadio embrionale, poiché sovra-fissazione può ridurre l'attività della β-galattosidasi. A questo proposito, interi embrioni del supporto possono essere fissati da immersione o aspersione a seconda della fase embrionale e dimensione. Quindi, perfusione perfusione è raccomandato per gli embrioni più vecchi di e 14.5 e postnatali esemplari assicurare che il fissativo raggiunge tutte le regioni del campione. Più piccoli embrioni (da E8.5 fino a 12.5) possono essere risolto tramite l'immersione e trattati direttamente per in toto il X-gal macchiatura (Figura 2). Va ricordato che il X-gal colorazione degli embrioni del mouse più giovane di e 14.5 può essere eseguita come l'intero supporto. In questo caso, cellule marcate vicino alla superficie sono facilmente rilevabili mediante colorazione di β-gallone. Anche così, può accadere che più profondo etichettatura appare sfocato o anche colorante non penetra il tessuto, specialmente negli embrioni di età superiore. In questo caso, sia gli organi o tessuti di topi adulti possono essere sezionato, X-gal macchiato e visualizzati sotto un microscopio stereoscopico. Tuttavia, l'esame sezionamento e al microscopio del tessuto macchiato di interesse è più adatto (Figura 2).
Nonostante l'efficienza del protocollo, la macchiatura interi embrioni e rilevamento può essere fastidiosa. Per esempio, il rene, testicolo, ghiandole secretive, epididimo e del tratto gastrointestinale contengono elevate quantità di β-galattosidasi acida endogena18 che possono interferire con l'interpretazione dei risultati a causa di attività in background. Per questo motivo, la reazione istochimica deve essere eseguita in condizioni di pH leggermente alcalino (pH 8-9) durante la colorazione, dal momento che e. coli β-galattosidasi ha un pH ottimale 7.3. Questo contribuirà a ridurre significativamente sfondo e a favorire attività batterica β-galattosidasi19,20,21,22. Si deve anche osservare che lungo i tempi di trattamento possono provocare l'acidificazione del X-gal macchiando soluzione, favorendo una maggiore priorità bassa. Inoltre, l'attività di β-galattosidasi è perso sotto temperature d'incubazione sopra 50 ° C, ma non inferiore a 42 ° C. Nelle nostre mani, incubazione con il X-gal substrato funziona meglio quando lasciato durante la notte a 37 ° C. Dopo la colorazione e prima del passaggio di post-fissazione, è importante lavare tutto il materiale X-gal reazione come attentamente e nel minor tempo possibile eliminare precipitati dalla reazione istochimica che possono essere depositati nella sezione del tessuto.
Come mostrato qui, embrioni in glicerolo di compensazione è importante per rendere il tessuto traslucido, preservando il X-gal istologia colorazione e tessuto. Così, gli embrioni diventano chiari, e l'etichettatura possa essere visualizzato in regioni più profonde sotto lo stereomicroscopio. Tuttavia, per analizzare la posizione esatta delle cellule macchiate, sezionamento del campione è necessario e, pertanto, la compensazione non è essenziale. In questo caso, dalle seguenti raccomandazioni indicate nel metodo, campioni possono essere accuratamente paraffina embedded e sezionato. Durante il processo di incorporamento, etanolo disidratato del tessuto ha bisogno di essere immersi in una miscela di isopropanolo-paraffina. Isopropanolo viene utilizzato per favorire la sostituzione di etanolo nel campione e facilitare il tessuto incorporamento in paraffina23. In alcuni protocolli, xilene è usato invece di isopropanolo per lo stesso scopo. Tuttavia, l'uso di xilene presenta svantaggi contro isopropanolo, quali il restringimento e l'indurimento del campione a causa della rimozione di tessuto lipidi24 e il suo profilo tossicologico come un prodotto infiammabile e irritante25. Agenti di schiarimento arancione a base di olio sono una delle alternative più sicure a xilene in quanto consentono rapide compensazione senza la tossicità di xilene, nonché eccellente tessuto struttura conservazione26. Inoltre, se utilizza xilene, questa parte del protocollo dovrebbe essere ridotto al massimo, dato che il X-gal macchiatura può diffondere ed essere persi19. Dopo sezionamento, colorazione di contrasto con coloranti (ad es. Nuclear Fast Red) è consigliato per facilitare l'identificazione istologica delle cellule che esprimono. Questa procedura di macchiatura è rapida, che richiede un solo passaggio, e il suo aspetto rosa fornisce buon contrasto con il colore blu X-gal precipitato. Tuttavia, questa colorazione di contrasto è adatto solo per l'utilizzo con mezzi di montaggio non acquoso (cioè DPX).
Questo metodo classico è adatto per la rilevazione di attività di β-galattosidasi, dal X-gal in combinazione con potassio ferro - e ferricianuro produce un caratteristico precipitato blu che non svanisce o candeggina facilmente e, quando ben costruito, può essere rilevato anche sotto il microscopio per dissezione. Ci sono altre modifiche del protocollo originale. Utilizzando substrati disponibili quali salmone-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) o Bluo-gal (5-Bromo-3-indolil-β-D-galattopiranoside)13,19 , o sostituendo il classico X-gal/FeCN per sali di tetrazolio possono notevolmente migliorare la sensibilità di rilevazione13,19. Questo è specialmente consigliato per consentire la rilevazione di alta sensibilità dei livelli di bassa espressione di mRNA e proteina materiale. Tuttavia, quando utilizzato per troppo tempo, ognuna di queste procedure può portare a livelli di alta priorità bassa e quindi un'attenta gestione delle condizioni è sempre consigliata, soprattutto se si considera che l'incubazione prolungata periodi possono facilitare colorazione aspecifica dovuta a endogena di β-galattosidasi attività13,27. Per quanto riguarda quest'ultimo, si consiglia sempre di utilizzare sali di potassio ferrico al fine di ottimizzare l'affidabilità della tecnica ed evitare trabocchetti.
Una limitazione importante di questo metodo è che la classica procedura di colorazione X-gal produce un precipitato insolubile blu che possa essere facilmente individuato da microscopia chiara, ma non consente studi di co-localizzazione mediante microscopia confocale o fluorescente in tessuto sezioni. Un possibile modo per superare questa limitazione sarebbe quella di utilizzare anticorpi diretti contro β-gallone (Vedi Figura 5) combinato con immunodetection per uno specifico tipo cellulare. Tuttavia, se i livelli di espressione sono bassi o lo sfondo alto, immunolabeling può rendere difficile rilevare se il gene reporter è espressa in una determinata cella. In particolare, è stata segnalata una nuova tecnica per ottenere immagini confocal di alta qualità basate sull'emissione di fluorescenza prodotta dal X-gal precipitato28. Inoltre, questo metodo è compatibile con l'immunofluorescenza e può identificare chiaramente il X-gal cellule positive28. Enzimatico reporter come il gene LacZ offrono il vantaggio di essere più sensibili di quelle fluorescenti, che è degno di nota, quando etichettatura, se i livelli di espressione sono particolarmente bassi. A questo proposito, la tecnica attuale è stata dimostrata ideale per la rilevazione di microRNA29, permettendo sia la valutazione qualitativa dei modelli di espressione e quantificazione dei livelli di espressione. Doppia colorazione viene utilizzata per rilevare la presenza di mRNA e attività β-gallone via in situ tecniche di ibridazione, che possono fornire informazioni molto utili per esaminare il pattern di espressione di geni endogeni durante il monitoraggio attività β-gallone nello stesso campione 30. Tuttavia, entrambe reazioni rilevamento di macchia ed in situ ibridazione a β-gallone potrebbero visualizzare incompatibilità di colore durante la doppia colorazione. In particolare metodi ottimizzati30è consigliabile scegliere un substrato più adatto, ad esempio S-gal.
Questo metodo versatile è stato ampiamente utilizzato per studiare la funzione del gene nel contesto della biologia dello sviluppo. Così, il gene LacZ è stato adottato per l'analisi di espressione genica durante lo sviluppo embrionale di urtarlo in un locus genico mirati. LacZ è un gene reporter comuni per lo studio di elementi regolatori cis-acting (esaltatori) coinvolti nel dirigere l'espressione genica in regioni ristrette dell'embrione, che fornisce informazioni sull'attività di trascrizione del promotore di interesse31 ,32,33. Inoltre, è frequentemente usato nella rilevazione di eventi di ricombinazione genetica di ricombinazione Cre-mediata dei siti loxP, che è particolarmente utile per la rilevazione di cellule embrionali staminali derivati negli esperimenti di mappatura del destino cellulare o in trapianti di cellule. Mutagenesi di gene-trappola in cellule staminali embrionali produce proteine tronche fuse a β-gallone che permette di valutare l'attività del promotore sotto condizioni fisiologiche34. Per tutti questi approcci, animali transgenici che trasportano LacZ ed esprimendo la β-galattosidasi batterica sono stati generati nel ratto35,36, pollo37,38, Xenopus39 o zebrafish40. Finora, questa tecnica è stata utilizzata in drosofila per migliorare la visualizzazione dell'espressione genica spazialmente e temporalmente grazie alla disponibilità di sistemi di espressione genica viscoelastica e tessuto e cellula-specifico p-LacZ marcatore linee41 ,10. Vale la pena notare che oltre a queste molte applicazioni che coinvolgono gli animali transgenici e knockoui, LacZ gene reporter è stato utilizzato nei tessuti interi come pure coltivato le cellule per predire il ruolo dei geni nella malattia nella ricerca biomedica. Un esempio rilevante di quest'ultimo è lo studio del processo di invecchiamento per quanto riguarda le risposte di stress, di soppressione del tumore o di sviluppo. Le cellule senescenti sono facili da rilevare sia in situ che in vivo a causa della loro caratteristica sovraespressione e accumulo di endogeno lysosomal beta-galattosidasi42,43. Quindi, β-galattosidasi è usata come biomarcatore senescente in analisi quantitative nel cancro coltivate cellule44.
In breve, descriviamo una procedura fattibile e ottimizzata per facilitare l'individuazione dell'attività β-Galattoside nei tessuti embrionali del mouse. Il presente metodo consente modifiche basate sul tessuto selezionato che il substrato utilizzato. Quindi, questo versatile e conveniente metodo impiegato con opportuni controlli è particolarmente adatto per l'uso con embrioni di topo intero così come su sezioni istologiche sottili.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non hanno alcun interesse finanziario concorrenti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il servizio istopatologico per la loro assistenza tecnica presso il Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Ringraziamo anche Dr. Motoharu Seiki per gentilmente fornendo Mt4-mmpLacZ topi e Dr. Alicia G. Arroyo per sostenere il nostro progetto e per la sua lettura critica del manoscritto. Desideriamo ringraziare Peter Bonney per la correzione di questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da Universidad Europea de Madrid tramite una sovvenzione (# 2017UEM01) assegnata al c.s.c.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
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