Summary
ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片および counterstaining の方法について述べる。これはティッシュ セクションにも適用することができます開発における遺伝子の発現を監視する簡単かつ迅速な手続を器官または培養細胞。
Abstract
遺伝子発現のレポーター、細胞系譜研究におけるトレーサーとして、大腸菌の LacZ遺伝子、β-ガラクトシダーゼは主として使用されます。古典的な化学反応は基質 X gal が見やすい不溶性の青い沈殿物を生成する鉄と鉄イオンとの組み合わせでの加水分解に基づいています。したがって、開発が進むにつれて、β-ガラクトシダーゼ活性は興味の遺伝子の発現パターンのためのマーカーとして機能します。ここで全体のマウスの初期胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルとパラフィン切片と counterstaining の後続のメソッドについて述べる。さらに、X gal 胚の深い地域で染色を見やすくします全体の胚を明らかにするための手順が提供されます。一貫性のある結果は、反応条件の最適化がバック グラウンド アクティビティを最小限に抑える必要がこの手順を実行することによって得られます。試金の制限もに配慮すべき、特に全台紙の染色で, 胚の大きさ。我々 のプロトコルは、敏感な切片として全臓器にさらに適用できるマウス開発中に β-ガラクトシダーゼ検出のための信頼性の高い方法を提供します。したがって、開発全体を通して動的な遺伝子発現パターンを全胚で、このプロトコルを使用して、簡単に分析できますが、パラフィン切片後も細胞レベルで詳細な式を評価できます。
Introduction
特定の遺伝子発現パターンを記述するためにレポーター遺伝子マーカーとしての使用は、ショウジョウバエから哺乳類を最優先されています。トランスジェニック、ノックアウト動物を含む実験でエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 遺伝子細菌の β-ガラクトシダーゼ (LacZ) は最も広く使用されている1,2,3,のいずれか4. β-ガラクトシダーゼ (β gal) 単糖類 (ブドウ糖そしてガラクトース)5に β-ラクトースリプレッサー (乳糖) などの加水分解を触媒します。その最も一般的に使用される基質は X-ガロン (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)、β-ガラクトシダーゼを生み出してラクトースオペロンとガラクトースで加水分解する配糖体です。最初は逆に酸化二量体で使用するとカリウム フェリと組み合わせる-鉄シアン化物の生成特性不溶性、青色沈殿 (図 1)6。
LacZ遺伝子をレポーター遺伝子として 30 年以上前に使用される開始7,8。LacZの挿入、通常使用できるようにされるトランスジェニック動物、特定の挿入を含む細胞を可視化する細菌および細胞培養の内因性のトレーサーとして開いたリーディング ・ フレームの代わりに内因性プロモーターの下流開発9中遺伝子発現パターン。この点では、β-ガラクトシダーゼ活性の可視化使用されています広範囲ショウジョウバエの全体の組織を単一セルから発達と細胞のプロセスを理解します。ショウジョウバエの遺伝学はゲノム内の場所ランダムには、 LacZレポーター遺伝子を含んでいる変更された P 要素構造を挿入する安定したラインを生成を支持します。したがって、エンハンサー要素の影響下に置かれるときそれは過去二十年10の間に多くの遺伝子の発現パターンの体系的な分析を許可している組織の特定方法でその表現を駆動があります。また、 LacZ遺伝子の発現を監視するトランスジェニック マウスも使用するタゲネーシスによる遺伝子組換えイベントの検出を介した交叉およびキメラ解析の突然変異体の胚性幹細胞誘導体の局在11、一時的同様にある特定の臓器のLacZ発現の制御を容易にします。また、全胚で、β-ガラクトシダーゼ活性の検出可能性があります便利なの遺伝子発現の変化を解析するさまざまな発達段階にわたって観察できる強度の異なる差分の染色パターンを生産8,12。
この記事でマウス胚の初期の発達段階で全台紙組織染色 X gal 遺伝子発現を可視化するためのプロトコルを提案する.パラフィン埋組織や胚後標識細胞全載標本または細胞レベルでの正確な検出を支持する高感度・安価な手法としてこの組織化学的手法を提案する.メソッドは、13他の方法と比較すると最低限の背景を持つマウス組織染色の直接可視化できます。
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Protocol
すべての実験手順は、CNIC (セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares) と、マドリード ・ アウトノマ コムニダード最小限動物の苦しみを確保するための動物実験の倫理委員会によって承認されました。
1. (E12.5 に E8.5) から妊娠のマウス胚のコレクション
- 頚部転位または CO2吸入のいずれかによって妊娠マウスを犠牲に。最初の日は、膣にプラグは胚と考えられていた観察日 0.5 (E0.5)。
- 吸収パッドに仰臥位で動物を置き、70% エタノールでマウスの腹部の皮膚をきれい。
注: 次の手順では不妊は必要はありません。 - ピンチ、マウス歯の鉗子を使用して腹部の皮膚を持ち上げます。
- 皮膚と腹壁、手術用のはさみを使用して腹部の正中線に垂直に 2 に 4 cm 切開を行います。
- 腹部を公開し、母親からは子宮の内側の曲率に沿って切削血管鉗子、手術用はさみで子宮角を削除します。
- 胚の文字列を削除して、10 mL の冷たい 0.01 M リン酸バッファー生理食塩水 pH 7.4 (PBS) を含有した氷のシャーレに転送。
- 10 mL の新鮮な氷冷 PBS でシャーレに実体顕微鏡下で子宮からうち胚を慎重に分析します。羊膜の嚢を公開する時計の鉗子で筋肉壁をつかんで、囲まれた胚と卵黄嚢の鉗子の先端を使用して削除する羊膜を引き裂きます。
- (E12.5 に E8.5) から初期の段階で妊娠マウスから littermate 胚を収集 (図 2)。
- カーブタイプ鉗子を使用して 10 mL 冷 1x PBS で新鮮な料理に胚を転送または、(E8.5-E9.5) で非常に小さい胚、胚損傷することがなくサンプルを収集するプラスチック転送ピペットを使用します。
- 固定を開始、する前に胚の小片をカットまたは時計の鉗子で (E9.5、E8.5) から最小の胚羊膜由来細胞を取って、遺伝子型遠心チューブに胚サンプルを取得します。
注: LacZ 遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のプライマーによって決まります: 前方、5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´;逆に、5´ CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´。
2. マウス胚の固定
- 2 mL の遠心管に 1 mL の 1x PBS を含む丸いベースとそれぞれの胚を転送します。
注: は、ローリング シェーカーを使用する攪拌とこれらのチューブのプロトコルですべての手順を実行します。 - 残りの血液を排除するために室温で 1 分 1 × PBS で胚を洗います。チューブ内の液体を変更する使用プラスチック転送ピペット。
- 氷の上の 0.125% グルタルアルデヒドの 1 mL の胚を修正します。
注: 固定の時間によって異なります胚のサイズ: E8.5 E9.5 胚、E12.5 胚の 1 h E10.5 胚のため 30 分の 20 分。 - 固定を外し、x-gal 染色のサンプルを処理する前に、室温で 10 分間 2 回 1 × PBS で胚を洗います。
3 マウス胚の全体マウント β-ガラクトシダーゼの組織化学的研究
- 準備 X Gal リンス バッファーとの手順を開始する前に X-gal 染色液 (表 1と表の材料を参照)。ネガティブ コントロールとして酵素反応の野生型 (WT) littermate 胚を使用します。
- (図 2) 室温で 10 分間 X Gal リンス バッファー内胚孵化させなさい。
- 光から保護されている 37 ° C で一晩に 2 h から X-gal 染色液に胚を孵化させなさい。胚の背景なしブルー染色の十分な強度を観測するまでは、解剖顕微鏡を介して定期的に発色を監視します。8 と 9 全体染色時の背景を減らすために溶液の pH を保ちます。染色液は、光をオンに開始された場合は、酵素反応を拡張する新鮮な基板の解決で置き換えます。
- 室温で 10 分ずつの 2 回 1 mL 1x PBS で微量遠心チューブに胚を洗浄することにより所望の信号を取得する際は、反応を停止します。
- 一夜にして 4 ° C で 1 時間 1 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 再、それらを修正するためにステンド グラスの胚を転送します。
注: 胚は 4% に格納できる PFA/4 ° C で長い時間 PBS または区分のためすぐに処理することができます。この最終的な固定ステップは染色パターンの長期的な保全のために重要です。 - 室温で 10 分間 2 回 1 mL 1x PBS で胚を洗います。
- オプション 1: は、一連の各ソリューションに室温で 1 時間 (1 × PBS で 20%、40%、60%、80% グリセロール) グリセロールの濃度の増加とソリューション浸漬によって胚をクリアします。
注: 長い時間の 80% のグリセロールで胚を洗う、さらに日がオフになっていて、このステップ (図 2) で 4 ° C で 80% グリセロールに格納するまで。グリセロールまたは 1 倍で 4 ° C で保存胚にチモール アジ化ナトリウム又は結晶の非常に少量を追加する PBS をカビの生育を防ぐためにお勧めします。後、(手順 4) を撮影するため胚全体のマウントを使用できます。 - オプション 2: パラフィン埋め込み、ミクロトーム (図 2) を使用して区分のための胚を処理します。(手順 4 および 5) を区分する前に全体染色胚の表現パターンを文書化します。
4. マウント胚の写真
- ベースを使用したシャーレに移して、全体のマウントを区分する前に胚をステンド グラスの写真を 1x PBS で 1-2% の agarose を固めた。
- 脱水と液体を通して撮影しながら反射を防ぐために agarose コーティング料理 10 mL 1x PBS で完全に胚をカバーします。
- 鉗子を用いた 1x PBS 中に浸漬胚をオリエンテーションします。古い胚 (E10.5 E12.5)、鉗子を配置し、様々 な角度でそれの内で供試体の位置と写真の中に自由を避けるために agarose の小さな穴を作りします。
- 送信 (下ステージ) の光を使用して顕微鏡のステージに皿を置きます。'ダーク フィールド' と '明るいフィールド' 調整写真撮影中に必要な照明を設定して、サンプルの透光性を最適化するために変更します。
注: は、胚の表面での反射を避けるために後の段階の胚の繊維ファイバー照明を使用します。クリアされた胚を撮影するとき手順は同じ 100% グリセロールを含んでシャーレに移して、完全にそれらを浸します。
5. パラフィン埋め込み、X gal の区分は胚をステンド グラス
- パラフィン ワックスを埋め込む
- 4 ° C (ステップ 3.5) から胚をステンド グラス X gal を取り外して洗って 1 mL の 1x PBS で 3 回定着剤の過剰を排除します。
- 鉗子を使用して組織カセットにそれぞれの胚を転送します。
- ビーカーに胚を含むカセットを配置し、室温で傾斜エタノール シリーズを介してそれらを渡すことによって、脱水: 70% エタノール、1 回 30 分まで。96% のエタノール、それぞれ 30 分の 2 回100% エタノール、30 分の 2 回。
注: 胚は 70% のエタノールの脱水プロセスを開始するまで 4 ° C で不定時間を格納できます。 - 室温で 30 分間イソプロパノールで全体のカセットを孵化させなさい。
- 鉗子を使用して、予め温めておいたイソプロパノールを含むトラフを染色ガラスにカセットを転送し、30 分の 60 ° C のオーブンで残します。
- 新しいガラス 50% イソプロパノールの混合物を含んでいるトラフを染色でカセットを配置/50% パラフィン ワックスを溶かし、60 ° C のオーブンで 4 h のまま。
- 溶融パラフィン ワックス、各 60 ° C で 30 分間の 2 つの変更の胚でカセットを孵化させなさい。
- 最終的なパラフィン洗浄の最後に、カセットを開き、顕微鏡下でサンプルを表示する型を埋め込む別組織にそれぞれの胚を転送します。
- 60 ° C で溶融パラフィン ワックスで井戸を埋める溶融ワックスを保ち、慎重に金型で胚をオリエンテーション温水鉗子を使用します。
注: サンプルの適切な向きはさまざまな断面で胚の区分のための重要なステップです。 - パラフィンは、金型で立体化、前に、ブロックの上に蓋のないカセットを置き、溶融パラフィン ワックスでそれを埋めます。一晩常温で固化するまで、残りのワックス涼しくてをみましょう。
- パラフィンは完全に固化後、金型から純色のブロックを削除し、14断面まで室温でまたは 4 ° C でのパラフィン ブロックを格納します。
- パラフィン切片
- ミクロトームの刃の向き、5-7 μ m の厚さを設定します。5.2.2。 クールな氷の上のパラフィン ブロック、キューブまたはピラミッドを作成するそれをトリミングします。
- 溶融ワックスの少量を使用してブロックをミクロトーム ホルダーに取り付けます。
- 最適な切断用ブロックを向けます。標準的なミクロトームを使用して室温で 5-7 μ m の厚さのスライスにパラフィン ブロックのセクション。
- 細かいペイント ブラシを使用して、操作およびスライスを選択するため室温で水浴のセクションに配置します。
- 顕微鏡のスライドと風呂の水からのセクションをピックアップし、ストレッチ 42 ° C の水浴へ彼らを移します。
- 風呂の水からセクションを削除し、優しく密着顕微鏡スライド上に配置します。
- 完全に準拠するためのセクションを許可するように一晩に 37 ° C のオーブンでよくスライドを乾燥、染色中に失われる可能性があります彼らそれ以外の場合。
注: は、染色法を開始するまで 4 ° C でスライドを保存します。
- Deparaffinization と X Gal ステンド パラフィン切片の Counterstaining
- パラフィン ワックスをより流動的に少なくとも 45 分の 60 ° C のオーブンで顕微鏡スライド トレイにスライドを置きます。
- ラックにスライドを転送し、次の手順を実行するガラス皿を染色を使用: 完全なパラフィン除去と組織の水和のための濃度の減少のアルコールを含む染色瓶にラックを水没: イソプロパノールで 5 分間60 ° C;3 分; イソプロパノール100% のエタノールの 2 分;96% のエタノールの 1 分;70% エタノール室温で 1 分。
- アルコール残基がないことを確認する 2 回蒸留水のセクションをすすいでください。
- 対比染色 (3 分) の間に通常 5 分間室温 (図 2) の (例えば原子高速赤ソリューション) 染みのついたセクション。
注: この染色のセクションで全体的な組織構造を明らかにすることができます。 - 染色後、1 分の蒸留水でスライドを洗浄し、顕微鏡で染色を参照してください。
注: 必要な染色が弱すぎる場合、対比染色に長い時間の間再びセクションします。 - エタノール濃度の増加で次の一連のセクションを脱水: 2 分の 95% エタノールの 2 つの洗浄、2 つは 2 分ごとに、100% エタノールで洗浄し、青の溶解を避けるために色沈殿物、キシレン 1 つだけ簡単に洗浄します。
- スライドを 1 つずつラックから外し、一枚の紙の上に置きます。次マウントと coverslip の各メディアを合成、恒久的なマウントを使用してスライドさせます。
注: キシレン、その蒸気は刺激し、人間の健康に、水生生物に有害な可燃性製品です。それはフード内で操作する必要があり、適切な保護具の使用が必要です。
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Representative Results
(図 1および図 2) 全体のマウス胚における基板として X gal を使用して β-ガラクトシダーゼの組織化学的反応の標準的なプロトコルを適用した結果を示す.このプロトコルを使用して、我々 は胚発達段階 (E9.5、E11.5、E12.5) を別に膜型マトリックスメタロプロテアーゼ 4 (Mt4 mmp) 式を調べて、内因性の制御の下で LacZ レポーターを表す Mt4 mmp 遺伝子変異マウスを使用してMt4 mmp プロモーター (図 3図 4、および図 5)9,15。Mt4 mmp は、glycophosphatidyl イノシトール アンカー (GPI) によって細胞膜につなかているエンドペプチダーゼです。Mt4 mmp がいくつかのひとがんで検出された腫瘍の成長の進行に関係している、細胞外マトリックス成分に対するそのプロテアーゼ活性についてはこれまで非常に限られました。さらに、ほとんど何もは萌芽期の開発9,16Mt4 mmp の発現と役割に報告されています。
野生型 (WT) Mt4 mmpLacZ/+ヘテロ接合体 (HT) およびノックアウト (KO) littermate 胚 x-gal 染色プロトコル (図 2) の並列で処理されます。プロシージャの特異性を検証する染色のプロセス中に複数のコントロールを含める必要があります。したがって、WT 胚の組織化学的反応のネガティブ コントロールとして使用され、非特異的 X-gal ラベリングを監視する機能 (図 3 aDと図 4 a-Cを参照)。また、不特定の背景を避けるためには、X-gal 染色液の pH は、8 と 9 全体染色を通して保持されなければなりません。図 3 e、β gal 陽性細胞は E9.5 の段階で全体のマウント HT 胚の体節と intersomitic の血管系で視覚化されます。ただし、陽性細胞の正確な位置を報告する胚の断面が必要顕微鏡下で可視化する携帯電話の解像度で切片における遺伝子発現を報告します。この場合、LacZ 陽性細胞はティッシュ セクション (図 3F-hで矢印) で、体節、背側大動脈 intersomitic 血管、神経血管叢で発見されます。これらの結果は、これらマウス胚の段階で9、このテクニックが簡単に再現可能な信頼性の高いことを示す報告 Mt4 mmp の発現パターンと相関します。予想通り、β gal 活性レベルは LacZ レポーターの遺伝子 (図 3 iL) の 2 つのコピーが存在するため HT と比較して KO 胚で高くなっています。しかし、HT LacZ のみ/+ 遺伝子発現パターンの研究を分析し、胚と KO 組織は以来興味の対象となる遺伝子の不足のための手法の有効性を実証する概念の証明として使用されます、β gal 陽性細胞がすることができます後者に異常に位置。
(E12.5 に E10.5) から古い胚が半透明でない、このプロトコルを実行するとき、したがって、最も目に見える X gal 染色領域は、表面に近いもの。したがって、このメソッドの代替手順は、グリセロール濃度の増加とソリューションの洗浄によって胚をオフにです。図 4、明らかに E12.5 LacZ ステンド胚なった x-gal 染色を維持しながら、個人差で胚の領域を染色写真より深いことができます。この萌芽期の段階で既報の通り、ラベリングが脳や手足、vibrissa の卵胞9尾の先端の異なる領域に限局。ただし、携帯電話の解像度を取得する場合、胚後パラフィン包埋、切片、顕微鏡で観察。
図 5抗 β gal 抗体を用いた免疫組織化学は記者 LacZ 染色による観察した Mt4 mmp の発現を確認する使用されました。したがって、β gal 陽性細胞は、ここで報告されるプロトコル (図 5 a, B) の特異性を確認する両方のアプローチを使用して、E11.5 でマウスの脊髄の運動ニューロンのプールで検出されました。
図 1.エシェリヒア属大腸菌の LacZ レポーター遺伝子 β-ガラクトシダーゼとこの酵素によって触媒化学反応の模式図.伝統的な染色の β-ガラクトシダーゼは 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole に基板 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) を加水分解します。その後、二量体化と最終的な青色の製品 (5, 5'-ジブロモ-4, 4'-ジクロロ インジゴ) の形成を引き起こすこの中間体は酸化されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.Β-ガラクトシダーゼ活性の検出のための標準プロトコルの主な手順を示す図。マウス胚は収集および全体マウント x-gal 染色処理します。全台紙胚が (オプション 2) に埋め込まれているか (オプション 1) グリセロール濃度の増加とソリューションの洗浄とクリアし、その後、顕微鏡で撮影をすることができますプロトコルに従って実行組織化学的染色後パラフィン、断面し、counterstained。略語: RT、室内温度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.X gal E9.5 WT と Mt4 mmp の染色LacZ/+全体マウント胚およびティッシュ セクション。標準 X gal の組織化学的アッセイを用いた β gal 活性の Mt4 mmp プロモーターの制御下で LacZ 遺伝子組換えの胚を行った。WT (A)、HT (E) と (私) KO E9.5 全台紙の胚は、β-ガラクトシダーゼ発現の検出の処理されました。脊髄のレベルでこれらの胚から得られたパラフィン切片では、携帯電話の解像度で染色の可視化を許可します。予想通り、β gal 陽性細胞が欠席 WT のセクション (B D)、HT ティッシュ セクション (F ・ H) と比較して KO (J L) でラベル付けの強度が高かった。神経管の断面積は、発展途上の体節、背側大動脈神経血管叢 β gal 活性を明らかにします。略語: da、背側大動脈;flb、前肢芽;h は、心m、中脳;nt、脊索;otv、耳胞;ov、光小胞;PNVP、神経血管叢。s、体節;t、終。スケール バー: 500 μ m (E、私);100 μ m (B、F、J);50 μ m (C、G、K);20 μ m (D、H、L)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.ステンド グラスの WT と HT x-gal の顕微鏡写真 (A, D) 前に、E12.5 でマウス胚 (B、C、E、F) 前後増加グリセロールで洗浄とクリアします。予想通り、WT 胚ない記者 LacZ 式 (A ~ C) 中表示ラベルが検出されました (白い矢印)、vibrissa (白い矢印) の卵胞の尾 (黒矢印) の先端と Mt4 mmp の脳原基の手足のLacZ/+この胚の段階 (D F)9。(E, F)グリセロールでは、クリア後半透明になった胚と胚の深い地域でより簡単に可視化することができますラベル、中脳と終脳 (F の白い矢印) のようです。スケール バー: 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.Β-ガラクトシダーゼの組織化学および免疫組織化学的検出。(A) X-gal (青) で染色 E11.5 胚ステージでパラフィン切片の脊髄運動ニューロンのプールで Mt4 mmp の発現を明らかにします。(赤) は抗 β gal 抗体 (B) の免疫組織化学は、クライオスタット切片 Mt4 mmp の脊髄運動ニューロンの同じ胚ステージでの発現を確認しました。略語: fp、フロア プレート;ミネソタ、運動ニューロン;スケール バー: 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
テーブル 1。レシピとこのプロトコルに必要なソリューションです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
エシェリヒア属大腸菌の LacZ の遺伝子は、その高い感度と検出の容易さのため記者として遺伝子発現パターンの研究に広く使用されています。この議定書では、簡単かつ迅速に安価なだけでなく、実行する酵素反応に基づく β gal 式を検出するための古典的な方法について説明します。このメソッドは、全台紙胚、そのまま臓器、組織切片や培養細胞での大幅な変更なしも適用できます。
このメソッドの正確なアプリケーションは堅牢で解釈し染色の結果します。ただし、同時コントロールと検証手順は強く推奨します。この点で、この議定書は非特異的 x-gal 染色を監視に役立つネガティブ コントロールとして使用される野生型 littermate 胚における並列で行われます。また、発現データ取得西部のしみ方および量的な PCR (Q PCR) によって確認する β gal 染色を使用して解析 β gal による他の抗体併用免疫組織化学 (図 5) ができますの同定やLacZ9を表現する特定の細胞型。固定の手順は、β-ガラクトシダーゼの酵素活性を維持するために、染色中に背景を最小限に抑えることを考慮する必要があります。したがって、胚はパラホルムアルデヒド固定17と比較して最も一貫性と信頼性の高い結果を与えるグルタルアルデヒドで固定する必要があります。その上、固定時間は、過剰固定は β ガラクトシダーゼの活動を減らすことができるのでそれぞれの萌芽期の段階の経験的確定すべきは欠かせません。浸漬または萌芽期の段階、サイズはです。によって灌流による全台紙胚を固定ことができますこの点では、したがって、transcardial 血流を胚 E14.5 より古いと生後標本サンプルのすべての地域を固定液に届くようにお勧め。(E12.5 まで E8.5) から小さい胚を浸漬によって固定し、トトでX gal のために直接処理できる (図 2) を染色します。特筆すべきはその X gal E14.5 は全体のマウントとして実行できますより若いマウス胚の染色します。この場合、表面近くに陽性細胞は容易に β gal 染色による検出します。そうであっても、ぼやけて表示されます深いラベルまたはも色素がより古い胚を中心に、ティッシュを浸透していないことがあります。この場合、いずれかの臓器や成体組織を解剖することができます、X gal、染色し顕微鏡下で可視化します。それにもかかわらず、興味のステンド グラスの組織区分および顕微鏡診はより適切な (図 2) です。
プロトコルの効率にもかかわらず染色胚と検出が面倒なことができます。インスタンス、腎臓、精巣、分泌腺、精巣上体および消化管大量内因性酸性 β-ガラクトシダーゼ18背景活動による結果の解釈を妨げるに含まれて。そのため、組織化学的反応は、弱アルカリ性の pH 条件 (8-9 の pH) 染色、エシェリヒア属大腸菌の β-ガラクトシダーゼは、7.3 の最適 pH を持っているので全体の下で行わなければなりません。これは背景を大幅に削減し、細菌の β-ガラクトシダーゼ活性19,20,21,22に賛成を助けます。また、長い時間を染色染色液、増加の背景を好む X gal の酸性化可能性がありますに注意する必要があります。また、β-ガラクトシダーゼ活性は培養温度は 42 ° c. 以下が、50 ° c の下で失われました。私たちの手で X gal 基板と孵化うまく 37 ° C で一晩を去ったとき染色後、ポスト固定ステップの前に、慎重とティッシュ セクションに置かすることができます組織化学的反応から沈殿物を除去するためにできるだけ早くすべて X ギャル反応物質を洗い落とすことが重要です。
ここで示すように、グリセリンの胚をクリアを作るため組織半透明 X gal を維持しながら染色およびティッシュの組織学重要です。したがって、胚が明らかになって、ラベリング、顕微鏡の下でより深い地域で可視化できます。しかし、ステンド グラスのセルの正確な場所を分析するサンプルの断面が必要と、したがって、クリアは必須ではありません。この場合はメソッドで示されている次の推薦によってサンプルすることがでく慎重にパラフィン埋め込まれ、断面。埋め込み処理中にエタノールの脱水組織イソプロパノール パラフィンの混合物に浸漬する必要があります。イソプロパノールは、サンプル中のエタノールの交換を支持する組織をパラフィン23への埋め込みを容易にするために使用されます。いくつかのプロトコルでは、同じ目的のためイソプロパノールではなくキシレンをされます。それにもかかわらず、キシレンの使用、イソプロパノール、収縮など可燃性と刺激性の製品25として組織脂質24とその毒性の除去によるサンプルの硬化と不都合な。オレンジ オイル ベース クリア エージェントは、急速な優れた組織構造保全26と同様、キシレンの毒性なしクリアできるためキシレンに最も安全な選択肢の一つです。また、キシレンを使用している場合、プロトコルのこの部分は、X-GAL 染色拡散し、19が失われるので、最大短縮する必要があります。染料で counterstaining 後断面 (例えば核高速赤) 発現細胞の組織学的識別を容易することもお勧めします。この汚損プロシージャは急速に 1 つだけのステップを必要とする、そのピンクの外観が青色の X gal 沈殿と良好なコントラストを提供しています。この counterstaining は、のみ非水溶液マウント メディア (すなわちDPX) での使用に適しています。
この古典的な方法は組み合わせてカリウム鉄-X gal から β-ガラクトシダーゼ活性の検出に適しておりフェリシアンは簡単にフェードしない独特の青色沈殿物または漂白剤を生成してときに、しっかりした造りにすることができます。解剖顕微鏡下でも検出されました。元のプロトコルの他の変更があります。サーモン gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)、マゼンタ gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 黄色 gal (5-ブロモ-3-インドリル β-D-ガラクトピラノシド)13,19 など利用可能な基板を用いた、テトラゾリウム塩が検出13,19の感度を向上するために古典的な X-gal/FeCN を代用します。タンパクと mRNA の材料の低い発現レベルの高感度検出が可能これを特にお勧めします。しかし、長時間使用すると、これらの手順のいずれかは高いバック グラウンド レベルにつながる可能性があります、条件の慎重な管理をお勧め常にので特に考慮し、長期間の加温期間を促進するかもしれないによる非特異的染色内因性 β-ガラクトシダーゼ活性13,27。後者に関しては、手法の信頼性を最適化し、落とし穴を回避するために鉄カリウム塩を使用することをお勧めです常に。
このメソッドの重要な制限事項は古典的な x-gal 染色プロシージャが光学顕微鏡検査によって容易に検出することができますが、組織で蛍光灯や共焦点顕微鏡での共局在の研究は許可されません不溶性の青い沈殿を生成します。セクション。Β gal に対する抗体を使用してこの制限を克服する方法の 1 つになる特定のセルタイプのバイオアセッテイと組み合わせる (図 5参照)。ただし、表現のレベルが低または高の背景には、反応が難しくを検出する場合はかどうかレポーターの遺伝子が特定のセルで表現されます。特に、X gal 沈殿物28によって生成される蛍光性の放出に基づく高品質共焦点画像を取得する手法が報告されています。また、このメソッドは、蛍光抗体法と互換性のある、X gal 陽性細胞28を明確に識別することができます。LacZ 遺伝子など酵素の記者は、注目されるときにラベル付け、表現のレベルが特に低い場合蛍光物よりも敏感であることの利点を提供しています。この点で、本手法は、マイクロ Rna の29、両方の表現パターンの質的評価と発現量の定量化を可能にしたがって検出に最適な実証されています。その場で交配の技術サンプルでは同じ β gal 活性を監視しながら内在性の遺伝子の発現パターンを検証する非常に有用な情報を提供できるを介して β gal 活性と mRNA の存在を検出するために使用二重染色30. それにもかかわらず、両方 β gal 染色とその場でハイブリダイゼーション検出反応の二重染色時に色の非互換性を表示ことがあります。特に最適化されたメソッド30では、S-ギャルより適した基質を選択することをお勧めします。
この汎用性の高い方法は、発生生物学における遺伝子機能の研究に広く使用されています。したがって、LacZ の遺伝子で採用されている遺伝子発現パターンの解析の萌芽期の開発中に対象となる遺伝子座にノックします。LacZ、胚の制限された領域に遺伝子発現を誘導に関連するシスエレメント規制要素 (エンハンサー) を研究するための一般的なレポーターの遺伝子情報を提供し関心31 のプロモーターの転写活性、32,33。また、多用される遺伝子組換えイベントの検出に loxP サイトの Cre を介する組み換えによる細胞運命マッピング実験や細胞移植胚性幹細胞の誘導体の検出に特に有用であります。胚性幹細胞遺伝子トラップ突然変異は、生理的条件34プロモーター活性を評価できる β gal に溶ける切り捨てられた蛋白質を生成します。これらのすべてのアプローチのトランスジェニック動物ラット3536,,で生成された LacZ を運ぶと細菌の β-ガラクトシダーゼを表現するチキン37,38,アフリカツメガエル39またはゼブラフィッシュ40。この手法を誘引可能な遺伝子発現系および組織細胞特異 p LacZ マーカー ライン41 の空室状況による空間的そして一時的に遺伝子発現可視化を改善するためにショウジョウバエで使用されています、これまで ,10。それにより、これらから離れて、トランスジェニック、ノックアウト動物を含む多くのアプリケーション LacZ レポーター遺伝子が使用されたこと全体の組織では注目に値するは、細胞の生物医学研究における疾患における遺伝子の役割を予測します。後者の一例に関連する開発や腫瘍の抑制、ストレス応答に関する老化の過程の研究であります。老化細胞が上皮内と生体内でその特徴的な過剰発現とリソソームの内因性 β-ガラクトシダーゼ42,43の蓄積のための両方を検出しやすい。したがって、老化マーカー定量アッセイ培養がん細胞44β-ガラクトシダーゼが使用されます。
要約すると、マウス胚性組織における β-ガラクトシド活動の簡単な検出が容易に実現可能な最適化された手順をについて説明します。本法では、選択した組織と基板の使用に基づいて変更をことができます。したがって、適切なコントロールと雇われるこの汎用性とコスト効果の高い方法は薄い組織切片だけでなく、全体のマウス胚での使用に特に適して。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する財務持分を有してないことを宣言します。
Acknowledgments
セントロ ナシオナル デ研究 Cardiovasculares (CNIC) でその技術支援の病理組織学的サービスに感謝したいと思います。我々 はまた私たちのプロジェクトを支援するためと原稿の彼女の重要な読書の親切の提供する Mt4 mmpLacZマウスの清木元治博士と博士アリシア G. アロヨを感謝します。我々 はこの記事を校正のピーター ・ ボニーを感謝したいと思います。この作品は、C.S.C. に与えられる助成金 (# 2017UEM01) によるエウロペア デ マドリッドによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
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