Summary
여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.
Abstract
Β-galactosidase, 인코딩 대장균 LacZ 유전자, 유전자 발현에 대 한 기자로 서 고 세포 계보 연구에서 추적 프로그램으로 크게 사용 된다. 클래식 조직화 학적인 반응은 쉽게 시각화 하는 불용 성 푸른 침전을 생성 하 고 철 제 2 철 이온, 함께에서 기판 X gal의 가수분해를 기반으로 합니다. 따라서, β-galactosidase 활동은 관심사의 유전자의 표현 패턴에 대 한 표식으로 개발 진행 있습니다. 여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 후속 방법 설명. 또한, 전체 배아를 명확히 하는 절차는 더 나은 X-여자 태아의 더 깊은 영역에 얼룩을 시각화 하 제공 됩니다. 반응 조건의 최적화 백그라운드 작업을 최소화 하는 데 필요한 있지만 일관 된 결과이 절차를 수행 하 여 얻을 수 있습니다. 분석 결과에 한계 고려 되어야 한다 또한, 특히 전체 마운트 얼룩에서 태아의 크기에 관한. 우리의 프로토콜 민감하고 cryostat 섹션 뿐만 아니라 모든 장기에 더 적용할 수 있는 마우스 개발 중 β-galactosidase 탐지에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 따라서, 개발에 걸쳐 동적 유전자 표현 패턴 전체 태아에서이 프로토콜을 사용 하 여 쉽게 분석 될 수 있다 그러나 또한 세포 수준에서 상세한 식 파라핀 단면 후 평가 될 수 있다.
Introduction
특정 유전자 표현 패턴을 설명 하기 위해 기자 유전자 마커로 사용 초파리 에서 포유동물에 최고 되었습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 동물 관련 된 실험, 대장균 (대장균)의 세균 β-galactosidase 유전자 (LacZ) 가장 널리 사용 되는1,2,3, 중 하나입니다. 4. β-galactosidase (β-gal)의 단 (포도 당 그리고 갈 락 토스)5에 β-galactosides (유 당) 등의 가수분해를 catalyzes. 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 X-여자 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galactosidase 주는 상승 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 그리고 갈 락 토스로 분해 glycoside 했다. 첫 번째는 이합체에 산화, 사용 하는 경우 칼륨 ferri 결합-및 페로 시안 화물 생산 특성 불용 성, 파란색 침전 (그림 1)6.
LacZ 유전자 이상 30 년 전 리포터 유전자로 사용 될 시작7,8. LacZ 삽입은 일반적으로, 그것은 내 생의 추적으로 유전자 변형 동물에서 뿐만 아니라 특정 삽입, 포함 된 셀을 시각화 하기 위해 박테리아와 세포 문화에 사용 될 수 있도록 열려있는 독서 프레임 대신 생 발기인의 하류 유전자 개발9중 식 패턴입니다. 이와 관련, β-galactosidase 활동의 시각화는 광범위 하 게 사용 되었다 초파리 에서 전체 조직에 단일 셀에서 개발 및 세포 프로세스를 이해 하. 초파리 유전학 부탁 있는 LacZ 는 취재 원 유전자를 포함 하는 수정 된 P 요소 구문 삽입 위치는 게놈에 무작위로 안정적인 라인의 세대. 따라서, 증강 요소의 영향 아래에 배치 하는 경우 그것은 수 있습니다 드라이브의 식을 조직 특정 방식으로, 지난 2 년간10동안 많은 유전자의 표현 패턴의 체계적인 분석을 허용 했다. 또한, 유전자 변형 생쥐 LacZ 유전자 발현 모니터링의 사용 또한 수 있습니다 Cre loxP 유전자 재조합 이벤트의 중재 재결합, 그리고 공상 분석 돌연변이 배아 줄기 세포 유래의 지역화 11, 용이 하 게 특정 조직에 LacZ 식의 제어 뿐만 아니라 일시적으로. 전체 배아의 β-galactosidase 활동의 일시적인 유전자 발현 에서에서 분석에 다른 발달 단계에 걸쳐 편리 하 게 관찰 될 수 있다 다른 농도에서 차동 얼룩 패턴을 생성 될 수 있습니다 또한, 8,12.
이 문서에서는, 선물이 X gal 통해 유전자 발현을 시각화 하는 프로토콜 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 전체 산 조직에 얼룩. 우리는 파라핀 조직 또는 배아를 포함 하는 후 전체 산 표본 또는 세포 수준에서 레이블이 지정 된 셀의 정확한 탐지를 호의 매우 민감하고 저렴 한 기술로이 조직화 학적인 방법 제시. 메서드를 사용 하면 다른 방법13와 비교할 때 최소 배경과 마우스 조직에 얼룩의 직접적인 시각화 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 최소한의 동물의 고통을 CNIC (센트로 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares)과 지방의 Autónoma 드 마드리드의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. (E12.5에 E8.5)에서 임신 쥐에서 배아의 수집
- 자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 흡입에 의해 임신 쥐를 희생. 첫 번째의 하루 질 플러그 배아 여겨졌다 관찰 하루 0.5 (E0.5).
- 흡수 성 패드에 부정사 위치에 동물을 70% 에탄올과 마우스의 복 부 피부를 청소.
참고: 무 균 다음 단계에는 필요 하지 않습니다. - 꼬 집 고 마우스 이빨 집게를 사용 하 여 복 부 피부.
- 피부와 복 부 벽, 수술가 위를 사용 하 여 복 부의 중간에 걸쳐 수직으로 2 ~ 4 cm을 통해 절 개를 확인 합니다.
- 복 부를 노출 하 고 수술가 위는 자 궁의 안쪽 곡률에 따라 혈관 절단 집게 어머니 로부터 자 궁 뿔 제거.
- 배아의 문자열을 제거 하 고 10 mL 차가운 0.01 M 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.4 (PBS)를 포함 하는 얼음의 페 트리 접시 전송.
- 신중 하 게 10 mL 신선한 얼음 처럼 차가운 PBS와 페 트리 접시에 stereomicroscope 아래 자 궁에서 밖으로 태아를 해 부. 다음 동봉 된 배아와 노 른 자 sac는 집게의 팁을 사용 하 여 제거 하는 양수 막 눈물을 양수 골목, 노출 시계 집게와 근육 벽을 잡고.
- (E12.5에 E8.5)에서 초기 단계에서 littermate 배아 임신 쥐에서 수집 (그림 2).
- 10 mL 감기 1 x PBS 곡선된 겸 자 사용 하 여 신선한 요리에 배아를 전송 하거나, 매우 작은 태아 (E8.5-E9.5)를 사용 하 여 플라스틱 전송 펫 태아 손상 없이 샘플을 수집.
- 시작 하기 전에 고정, 태아의 작은 조각을 절단 또는 시계 셉 (E9.5에 E8.5)에서 가장 작은 태아에서 양수 막 복용 배아 샘플 유전형 microcentrifuge 튜브에 걸릴.
참고: LacZ 유전형 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 뇌관에 의해 결정 됩니다: 앞으로, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; 반대로, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.
2입니다. 마우스 배아의 고정
- 1 mL 1 x PBS를 포함 하는 둥근된 기지와 2 mL microcentrifuge 튜브에 각 배아를 전송.
참고: 회전 통을 사용 하 여 동요와이 튜브에 프로토콜에서 모든 단계를 수행 합니다. - 나머지 혈액을 제거 하기 위해 실내 온도에서 1 분 동안 1 x PBS에 배아를 씻어. 튜브에 액체를 변경 하려면 사용 플라스틱 전송 펫.
- 얼음에 0.125% 글의 1 mL에 태아를 수정.
참고: 고정 시간 태아의 크기에 따라 달라 집니다: E8.5 E9.5 배아, E10.5 배아 및 E12.5 배아에 대 한 1 시간 30 분에 대 일 분. - 정착 액을 제거 하 고 X-여자 얼룩에 대 한 샘플을 처리 하기 전에 실 온에서 10 분 동안 두 번 1 x PBS에 배아를 세척.
3. 전체 산 β-galactosidase Histochemistry 마우스 배아의
- 준비 X Gal 린스 버퍼와 절차를 시작 하기 전에 X Gal 얼룩이 솔루션 ( 표 1 및 재료의 표참조). 야생-타입 (WT) littermate 배아를 사용 하 여 효소 반응에 대 한 부정적인 컨트롤.
- (그림 2) 실 온에서 10 분 X Gal 린스 버퍼에 태아를 품 어.
- 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 하룻밤에 2 h에서 X Gal 얼룩이 솔루션에 태아를 품 어. 블루 얼룩의 충분 한 강도 태아에서 배경 없이 관찰 될 때까지 색상 반응 해 현미경을 통해 정기적으로 모니터링 합니다. 8과 동안을 줄이기 위해 배경 전체 얼룩 9 사이의 솔루션의 산도 유지. 얼룩 솔루션 빛을 시작, 신선한 기판 솔루션 효소 반응 확장을 교체.
- 원하는 신호는 각각 실 온에서 10 분에 대 한 두 번 1 mL 1 x PBS 가진 microcentrifuge 관에서 배아를 세척 하 여 얻어진 반응 중지.
- 4 ° c.에 하룻밤 1 h 1 mL 4 %paraformaldehyde (PFA) 다시 들을 수정, 스테인드 배아 전송
참고: 배아는 4%에 저장할 수 있습니다 PFA/PBS 4 ° C에서 더 긴 시간에 대 한 단면에 대 한 즉시 처리 될 수 있습니다. 이 마지막 정착 단계 얼룩 패턴의 장기 보존을 위해 결정적 이다. - 실 온에서 10 분 동안 두 번 1 mL 1 x PBS에 배아를 씻어.
- 옵션 1: 일련의 글리세롤 (1 x PBS에 20%, 40%, 60% 및 80% 글리세롤) 각 솔루션에 실 온에서 1 h의 농도 증가 함께 해결책에 있는 침수에 의해 태아를 선택을 취소 합니다.
참고: 긴 시간 동안 80% 글리세롤에 배아를 세척도 일 때까지 그들은, 삭제 하 고이 단계 (그림 2)에서 4 ° C에서 80% 글리세롤에 그들을 저장. 글리세롤 또는 1 x 4 ° C에서 저장 된 배아에 아메리카의 나트륨 아 지 드 오 라 크리스탈의 아주 작은 금액을 추가 PBS 형 성장을 방지 하기 위해 좋습니다. 개간, 후 전체 마운트 배아 (4 단계) 촬영을 위해 사용할 수 있습니다. - 옵션 2: 파라핀 포함 하 고 톰 (그림 2)를 사용 하 여 단면에 대 한 배아를 처리 합니다. (4, 5 단계)를 구분 하기 전에 전체 스테인드 배아에 식 패턴을 문서화 합니다.
4입니다. 전체 산 태아의 사진
- 전체 산 단면 전에 태아를 얼룩이 사진, 페 트리 접시의 기초와 준비에 그들을 전송 1 x PBS에서 1-2 %agarose 경화.
- 완전히 탈수 및 액체를 통해 촬영 하는 동안 반사 방지 하기 위해 agarose 코팅 요리에 10 mL 1 x PBS 가진 배아를 커버.
- 집게를 사용 하 여 1 x PBS에 배아 찾으시는 오래 된 배아 (E10.5-E12.5), 배치 하 고 다른 각도에서 그것에서 견본을 위치 하 고 동안을 피하기 위해는 부동성 사진 집게와는 agarose 작은 구멍을 확인 합니다.
- 전송된 (아래 단계) 빛을 사용 하 여 stereomicroscope 단계에 접시를 놓습니다. ' 다크 필드 '와 ' 밝은 필드 ' 조정 사진 중 원하는 조명 설정 하 고 최적화 하는 샘플의 반투명을 변경 합니다.
참고: 파이버 광섬유 조명 나중 단계 배아에 대 한를 사용 하 여 태아의 표면에서 반사를 피하기 위해. 지운된 태아 촬영 때 동일한 절차에 따라 하지만 100% 글리세롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 전송 하 고 완전히 그들을 담가.
5. 파라핀 포함 하 고 X-여자의 단면 스테인드 배아
- 파라핀 왁 스 포함
- 4 ° C (3.5 단계)에서 배아 스테인드 X gal을 제거 하 고 그들을 씻어 1 mL 1 x PBS와 세 번 정착 액의 과잉을 제거 하.
- 집게를 사용 하 여 조직학 카세트에 각 배아를 전송 합니다.
- 비 커에 배아를 포함 하는 카세트를 놓고 다음 실 온에서 등급된 에탄올 시리즈를 통해 전달 하 여 탈수: 70% 에탄올, 한 번 30 분; 96% 에탄올, 각; 30 분 동안 두 번 30 분 동안 두 번 100% 에탄올
참고: 배아 저장할 수 있습니다 70% 에탄올에서 탈수 과정을 시작 때까지 4 ° C에서 알 수 없는 시간에 대 한. - 실 온에서 30 분 동안 소 프로 파 놀에 전체 카세트를 품 어.
- 집게를 사용 하 여 미리 데워 진된 소 프로 파 놀을 포함 하 여 물 얼룩 유리를 카세트를 전송 하 고 오븐에서 30 분 동안 60 ° C에 두고.
- 새로운 유리 50% 소 프로 파 놀의 혼합물을 포함 하 여 물 얼룩에 카세트를 배치 / 50% 파라핀 왁 스를 녹아 하 고 60 ° C 오븐에서 4 h 떠나.
- 녹은 파라핀 왁 스, 60 ° C에서 30 분의 변화 2와 배아와 카세트를 품 어.
- 최종 파라핀 세척의 끝에, 카세트 열고 몰드는 stereomicroscope 아래 샘플을 볼 수를 포함 하는 별도 조직에 각 배아를 전송 합니다.
- 60 ° c.에 녹은 파라핀 왁 스로 잘 채우기 열띤된 집게를 사용 하 여 녹은 왁 스를 유지 하 고 신중 하 게 금형에 배아를 찾으시는.
참고: 샘플의 적절 한 방향을 원하는 평면에서 배아를 단면에 대 한 중요 한 단계입니다. - 금형에 파라핀 굳은, 전에 블록 위에 뚜껑 없이 카세트 놓고 녹은 파라핀 왁 스와 함께 작성 합니다. 하룻밤 실 온에서 경화 될 때까지 나머지 왁 스 식 지.
- 파라핀은 완전히 경화, 일단 금형에서 고체 블록을 제거 하 고 단면14까지 실내 온도에 또는 4 ° C에 파라핀 블록 저장.
- 파라핀 단면
- 동양에 톰 블레이드 하 고 5-7 µ m 두께의 설정. 5.2.2. 시원한 얼음에 파라핀 블록 하 고 큐브 또는 피라미드 트림.
- 녹은 왁 스의 작은 금액을 사용 하 여 블록 톰 홀더를 연결 합니다.
- 최적의 절단에 대 한 블록을 방향을 정하십시오. 표준 톰을 사용 하 여 실 온에서 5-7 µ m 두꺼운 조각으로 파라핀 블록 섹션.
- 좋은 붓을 사용 하 여, 조작 하 고 슬라이스 선택에 대 한 실 온에서 물 욕조에 섹션을 배치 합니다.
- 현미경 슬라이드와 물 탕에서 섹션을 선택 하 고 스트레칭을 위한 42 ° C에 물 목욕으로 그들을 전송.
- 물 목욕에서 섹션을 제거 하 고 부드럽게 접착 현미경 슬라이드에 그들을 배치.
- 건조 오븐에서 37 ° C 하룻밤 수 있도록 완전히 준수 섹션에서 슬라이드, 그렇지 않으면, 그들은 얻을 수 있습니다 손실 얼룩이 지는 동안.
참고: 절차를 얼룩 시작까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.
- Deparaffinization 및 X Gal 스테인드 파라핀 섹션의 Counterstaining
- 현미경 슬라이드 트레이 더 액체 파라핀 왁 스를 만들기 위해 적어도 45 분 동안 60 ° C에서 오븐에서에 슬라이드를 넣어.
- 전송에 랙 슬라이드 및 유리 얼룩 요리를 사용 하 여 다음 단계를 수행: 감소 하는 완전 한 파라핀 제거 및 조직의 수 분 농도의 알콜을 포함 하는 얼룩 항아리에 랙 잠수함: 소 프로 파 놀에서 5 분 60 ° C; 소 프로 파 놀 3 분;에 대 한 2 분;에 대 한 100% 에탄올 96% 에탄올 1 분; 실 온에서 1 분의 70% 에탄올
- 없는 알코올 잔류물 있는지 확인을 두 번 증류수에 섹션 린스.
- (예를 들어 핵-빠른 레드 솔루션) 실내 온도 (그림 2)에 (3-8 분) 사이 보통 5 분에 대 한 얼룩으로 섹션 counterstain
참고:이 얼룩 섹션에서 전체 조직 구조를 밝히는 데 도움이 됩니다. - 얼룩, 후 1 분 증류수에 슬라이드를 세척 하 고 현미경에 얼룩 섹션을 확인 합니다.
참고: 원하는 착 색 하는 것이 너무 약한 경우 counterstain 섹션 다시 긴 시간. - 에탄올의 농도 증가 함께 다음 시리즈에서 섹션 탈수: 2 분에 대 한 95% 에탄올에 두 세척,이 분 각, 100% 에탄올에 씻어 하 고, 파란색을 해산 하지 않으려면 색 침전 물, 크 실 렌에서 한 빠른 세척.
- 랙 하나 하나에서에서 슬라이드를 제거 하 고 종이의 조각에 그들을 배치. 다음 산과 coverslip 각 합성, 영구 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드.
참고: 크 실 렌의 증기는 자극 하 고 인간의 건강 및 수생 생물에 유해 인화성 제품 이다. 그것은 후드 내에서 조작 하 고 적절 한 보호 장비를 사용 해야 합니다.
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Representative Results
여기 우리는 X-gal을 사용 하 여 전체 마우스 배아 (그림 1 및 그림 2)에서 기판으로 β-galactosidase 조직화 학적인 반응에 대 한 표준 프로토콜을 적용 결과 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리는 서로 다른 배아 발달 단계 (E9.5, E11.5, 및 E12.5)에 막 유형 4 매트릭스 metalloproteinase (Mt4-mmp) 식 검사 LacZ 기자는 내 생의 통제를 표현 하는 Mt4 mmp 돌연변이 마우스를 사용 하 여 Mt4 mmp 발기인 (그림 3, 그림 4및 그림 5)9,15. Mt4 mmp는 endopeptidase glycophosphatidyl 이노 시 톨 앵커 (GPI)을 통해 세포 막에 닿는 곳입니다. Mt4 mmp 여러 인간 암에서 발견 되 고 종양 성장의 진행에 관련 되어, 비록 기질 구성 요소에 대 한 그것의 분해 활동에 대 한 정보까지 매우 제한 됩니다. 또한, 거의 아무것도 역할 및 배아 개발9,16동안 Mt4 mmp의 표현에 보고 되었습니다.
야생 타입 (WT), Mt4 mmpLacZ / + heterozygous (HT) 및 녹아웃 (KO) littermate 배아 X gal 얼룩 프로토콜 (그림 2)에 대 한 병렬 처리 됩니다. 여러 컨트롤 프로시저의 특이성을 확인 하기 위해 얼룩 과정 포함 되어야 합니다. 따라서, WT 배아 조직화 학적인 반응에 대 한 부정적인 컨트롤으로 사용 되 고 일반적인 X-여자 라벨을 모니터링 하는 역할 ( 그림 3A-D 와 그림 4A-C참조). 또한, 불특정 배경을 방지 하려면 X Gal 얼룩 솔루션의 pH 8과 전체 얼룩 통해 9 사이의 유지 되어야 합니다. 그림 3E, β-gal-긍정적인 세포는 E9.5 단계에서 전체 마운트 HT 배아는 somites와 intersomitic 맥 관 구조에 시각화 됩니다. 그러나, 스테인드 셀의 정확한 위치를 보고, 배아 단면화는 필요한 현미경 시각화 하 유전자 발현 세포 해상도에서 조직 섹션에서 보고. 이 경우에 LacZ-긍정적인 세포 조직 단면도 ( 그림 3 층-H에 화살표)에 somites, 등 쪽 대동맥, intersomitic 맥 관 구조 뿐만 아니라 perineural 혈관 총에서 발견 된다. 이러한 결과 Mt4 mmp에 대 한 이러한 마우스 배아 단계9이 기술은 쉽게 재현할 수 및 신뢰성을 나타내는 보고 식 패턴와 연관. 예상 했던 대로, β-gal 활동의 수준을 LacZ 취재 원 유전자 (그림 3I-L)의 2 개의 사본의 존재로 인해 HT에 비해 코 배아에서 높은 수 있습니다. 그러나, 단지 HT LacZ / + 진 식 패턴의 연구에 배아를 분석 해야 합니다 및 코 조직 개념의 증거로 서 관심의 대상된 유전자의 부족 이후 방법의 타당성을 입증 하는, β-gal 긍정적인 세포 수 비정상적으로 후자에 위치 해 있습니다.
이 프로토콜을 수행할 때 이전 배아 (에서 E12.5 E10.5)은 반투명, 그리고, 그러므로, 가장 눈에 띄는 X gal 스테인드 지역 표면에 가까이. 따라서,이 방법에 대체 단계 글리세롤 농도 증가 함께 솔루션에 세척 하 여 배아를 취소 하는. 그림 4, E12.5 LacZ 스테인드 배아 얼룩 X gal을 유지 하면서 취소 되었다, 깊은 사진 수는 stereomicroscope에서 태아의 스테인드. 이전이 배아 단계에서 보고, 뇌, 팔 다리, vibrissa의 뿌리와 꼬리9끝의 뚜렷한 지역에서 지역화는 라벨. 그러나, 만약 하나의 소원을 셀룰러 분해능, 배아 한다 파라핀에 포함, 구분 되며 현미경 검사.
그림 5에서 안티-β-gal 항 체와 immunohistochemistry Mt4 mmp의 식 기자 LacZ 얼룩에 의하여 관찰 확인 하 사용 되었다. 따라서, β-gal-긍정적인 세포 E11.5에서 마우스 척수의 motoneurons의 수영장에서 여기 보고 프로토콜 (그림 5A, B)의 특이성을 확인 두 가지 방법을 사용 하 여 발견 했다.
그림 1 . 대장균 LacZ 리포터 유전자 인코딩 β-galactosidase 및 조직화 학적인 반응이이 효소에 의해 촉매의 개요 그림. 전통적인 얼룩에서 β-galactosidase는 기판 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole hydrolyzes. 그 후,이 중간은 산화, 이합체 화 및 블루 색 완성품 (5, 5'-dibromo-4, 4'-dichloro indigo)의 형성을 일으키는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 다이어그램. 마우스 배아는 수집 하 고 전체 마운트 X gal 얼룩에 대 한 처리. 조직화 학적인 얼룩 프로토콜에 따라 수행 된 후 전체 마운트 배아 (옵션 1) 글리세롤 농도 증가 함께 솔루션에서 세척과 고 이후에 stereomicroscope에서 촬영 또는 (옵션 2)에 포함 된 수 있습니다. 파라핀, 단면화 및 counterstained 약어: RT, 실내 온도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . X-gal E9.5 WT Mt4 mmp의 얼룩LacZ / + 전체-마운트 배아 및 조직 단면도. 사용 하 여 표준 X gal 조직화 학적인 분석 결과, Mt4 mmp 발기인 통제 LacZ 유전자를 운반 하는 유전자 변형 태아는 β-gal 활동에 대 한 분석 했다. WT (A), HT (E)와 (나) 코 E9.5 전체 마운트 배아 β-galactosidase 식의 검출에 대 한 처리 되었습니다. 파라핀 섹션 척수의 수준에서 이러한 배아에서 얻은 세포 해상도에서 얼룩의 시각화를 수 있습니다. 예상 했던 대로, β-gal 긍정적인 세포 결 석 했다 WT 섹션 (B-D), 라벨의 강도 높은 HT 조직 단면도 (F-H)에 비해 코 (J-패) 동안에. 신경 관을 통해 서 횡단면 개발 somites, 등 쪽 대동맥에 perineural 혈관 총 β-gal 활동 공개. 약어: 다, 등 쪽 대동맥; flb, forelimb 새싹; h, 심장; m, mesencephalon; nt, notochord; otv, otic 소포; ov, 광학 기; PNVP, perineural 혈관 총; s, somite; t, telencephalon입니다. 바 규모: 500 μ m (A, E, I); 100 μ m (B, F, J); 50 μ m (C, G, K); 20 μ m (D, H, L) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Photomicrographs WT와 HT X-여자의 얼룩진 (A, D) 전에 E12.5에서 마우스 배아 (B, C, E, F) 후 증가 된 글리세롤에 세척과 청소. 예상 대로 WT 배아 아니 기자 LacZ 식 (A C) 동안 검색 된 라벨에 표시 사지 (흰색 화살표), vibrissa (흰색 화살표)의 여 포, 꼬리 (검은색 화살표)의 팁과 Mt4 mmp의 두뇌의 primordiumLacZ / + 이 배아 단계 (D-F)9. (E, F) 글리세롤에 개간, 후 배아 반투명 되었고 라벨 수 보다 쉽게 시각화 된 태아의 더 깊은 지역에는 mesencephalon에 telencephalon (흰색 화살표 f에서)와 같이. 눈금 막대: 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . Β-galactosidase의 조직화 학적인 고 immunohistochemical 탐지. (A) X-여자 (파란색)에서 얼룩 E11.5 배아 단계에서 척수의 파라핀 섹션에서 motoneurons의 수영장에서 Mt4 mmp의 식을 보여준다. (B) Immunohistochemistry (빨간색)으로 안티-β-gal 항 체와 식 Mt4 mmp의 척수 motoneurons 동일한 배아 단계에서 cryostat 섹션에서 확인. 약어: fp, 바닥에 접시; 미네소타, motoneurons; 눈금 막대: 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1입니다. 이 프로토콜에 필요한 기기와 조리법. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대장균 LacZ 유전자 널리 사용 되었습니다 유전자 표현 패턴의 연구에 기자로 서의 높은 감도 및 검출의 용이성. 현재 프로토콜은 간단 하 고 저렴 한 뿐만 아니라 수행 하는 효소 반응에 따라 β-gal 식 탐지 하기 위한 고전적인 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 또한 전체 마운트 배아, 그대로 장기, cryostat 조직 섹션 또는 배양된 세포에서 중요 수정 없이 적용할 수 있습니다.
이 방법의 정확한 응용 프로그램 강력 하 고 해석할 얼룩이 발생합니다. 그러나, 동시 컨트롤 및 후속 확정 단계는 좋습니다. 이와 관련, 현재 프로토콜 일반적인 X-여자 얼룩 모니터링을 제공 하는 부정적인 컨트롤으로 사용 하는 야생 타입 littermate 배아에서 병렬로 수행 됩니다. 또한, 식 데이터 때 서쪽 오 점 그리고 양이 많은 PCR (Q-PCR)에 의해 확인 된다 β-gal 얼룩을 사용 하 여 얻은 분석 또는 β-gal에 의하여 immunohistochemistry (그림 5), 다른 항 체와 결합 하는 또한의 수 특정 세포 유형 LacZ9을 표현입니다. 정착 단계는 착 색 하는 동안 백그라운드를 최소화 하 고 β-galactosidase의 효소 활동을 유지 하기 위해 고려 될 필요가 있다. 따라서, 배아 paraformaldehyde 고정17에 비해 가장 일관 되 고 신뢰할 수 있는 결과 주는 글에 고정 되어야 합니다. 게다가, 정착 시간은 중요 한 고-고정 β-galactosidase 활동을 줄일 수 있기 때문에 각 배아 단계에 대 한 실험적으로 결정 되어야 한다. 이와 관련, 전체 마운트 배아 침수 또는 배아 단계와 크기. 에 따라 관류에 의해 고쳐질 수 있다 따라서, transcardial 관류 E14.5 보다 오래 된 태아 및 출생 후 표본을 정착 액 샘플의 모든 영역에 도달 하면 좋습니다. (에서 E12.5까지 E8.5) 더 작은 배아 수 침수로 고정 하 고 토토 X-여자에 대 한 직접 처리 얼룩 (그림 2). 그것은 언급 되어야 합니다 그 X gal E14.5 전체 마운트로 수행할 수 있는 보다 젊은 마우스 배아의 얼룩. 이 경우 얼룩진된 세포 표면에 가까운 β-gal 얼룩에 의하여 쉽게 검색 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 그 깊은 라벨 흐리게 나타나거나 심지어 염료 조직은, 특히 더 오래 된 배아를 침투 하지 않습니다 발생할 수 있습니다. 이 경우에, 중 장기 또는 성인 생쥐 조직 해 부 될 수 있다, X-여자, 스테인드는 stereomicroscope에서 시각. 그럼에도 불구 하 고, 단면 및 현미경 검사 관심의 스테인드 직물의 더 적당 한 (그림 2)입니다.
프로토콜의 효율성에도 불구 하 고 모든 배아 및 탐지 얼룩 성가신 될 수 있습니다. 인스턴스, 신장, 고환, 분 비 샘, epididymis 및 위장 백그라운드 작업 때문에 결과의 해석을 방해할 수 있는 내 생 산 성 β-galactosidase18 의 높은 금액을 포함 합니다. 그 이유로, 조직화 학적인 반응 조건 알칼리 pH (pH 8-9) 얼룩, E. 콜라이 β-galactosidase는 7.3의 최적 pH 때문에 걸쳐 수행 되어야 한다. 이것을 크게 줄이고 배경 세균성 β-galactosidase 활동19,20,,2122에 도움이 됩니다. 또한 그 X-여자 솔루션 얼룩, 증가 배경 애 용의 산성화에 발생할 수 있습니다 긴 시간을 얼룩이 지 주목 한다. 또한, β-galactosidase 활동 부 화 온도가 50 ° C 이상 하지만 아래의 42 ° c.에서 분실 된다 우리의 손에서 인큐베이션 X gal 기판으로 더 나은 작품 37 ° c.에서 하룻밤 왼쪽 얼룩 후 고 후 정착 단계 이전, 신중 하 게 그리고 조직 섹션에서 예금 될 수 있는 조직화 학적인 반응에서 침전을 제거 최대한 빨리 모든 X 분 반응 물질을 씻어 중요 하다.
다음과 같이, 글리세롤에 배아를 삭제 하는 것이 만들기 위한 조직 반투명 X gal을 유지 하면서 얼룩 및 조직 조직학 중요 합니다. 따라서, 배아 명확 해지고 라벨에 stereomicroscope 아래 더 깊은 지역에 구상 될 수 있다. 그러나, 스테인드 셀의 정확한 위치를 분석 하는 샘플의 단면 필수 이며, 따라서 개간은 필수. 이 경우 다음 권장 사항을 메서드에서 표시 하 여 샘플 수 수 신중 하 게 파라핀 임베디드 및 sectioned. 삽입 과정에서 에탄올 탈수 소 프로 파 놀-파라핀의 혼합에 몰입 될 필요가 조직. 소 프로 파 놀 샘플에서 에탄올의 교체를 선호 하 고 파라핀23에 포함 하는 조직을 촉진 하기 위하여 사용 됩니다. 일부 프로토콜에 크 실 렌 같은 목적을 위해 소 프로 파 놀 대신 사용 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 크 실 렌의 사용 소 프로 파 놀, 수축 및 가연성 및 자극성 제품25조직 지질24 와 그것의 독물학 프로 파일의 제거 때문에 샘플의 경화 등 대 불리를 선물 한다. 오렌지 오일 기반 개간 에이전트는 크 실 렌을 대체 하는 가장 안전한 방법 중 하나 때문에 그들은 급속 한 우수한 조직 구조 보존26크 실 렌의 독성 없이 청소 허용. 또한, 크 실 렌을 사용 하 여, X-여자 얼룩이 확산 수19손실 이후 프로토콜의이 부분에 최대, 감소 한다. 후의 단면, 염료와 counterstaining (예: 핵 빠른 레드) 표현 하는 세포의 조직학 식별을 용이 하 게 하 것이 좋습니다. 이 착 절차는 급속 한, 요구 한 단계, 그리고 분홍색 외관 블루 색 X gal 침전과 좋은 대조를 제공 합니다. 그러나,이 counterstaining만 적당 하다 (즉, DPX) 비 수 설치 미디어와 함께 사용에 대 한
이 고전적인 방법은 X-여자와 함께 칼륨 페로-이후 β-galactosidase 활동의 탐지를 위해 적당 하 고 ferricyanide 퇴색 하지 않는다 특성 푸른 침전 또는 표 백제를 쉽게 생성 하 고, 잘 지어진 수 해 현미경의 밑에 조차 발견. 원래 프로토콜의 다른 수정이 있다. 연어-여자 (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), 자홍-여자 (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 또는 Bluo-여자 (5-브로 모-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 등 사용 가능한 기판 사용 , 또는 고전적인 X-여자/FeCN Tetrazolium 소금과 탐지13,19의 감도 크게 향상 시킬 수 있습니다에 대 한 대체. 이것은 특히 mRNA와 단백질 소재의 낮은 식 레벨의 고감도 검출을 허용 하는 것이 좋습니다. 그러나, 너무 오래 사용 하는 경우이 절차의 높은 배경 수준으로 이어질 수 있습니다 때문 조건의 주의 깊은 관리는 항상, 특히 그 연장된 보육 고려 기간 수 용이 하 난다로 인해 얼룩 내 인 성 β-galactosidase 활동13,27 후자에 대하여 그것은 항상 제 2 철 칼륨 소금 기술은의 신뢰성을 최적화 하 고 함정을 피하기 위해 사용 하는 것이 좋습니다.
이 방법의 중요 한 한계는 클래식 X gal 얼룩 절차 가벼운 현미경 검사 법에 의해 쉽게 검출 될 수 있지만 조직에 형광 또는 confocal 현미경 검사 법에 의해 공동 지역화 연구를 허용 하지 않는 불용 성 푸른 침전을 생성 섹션입니다. Β-gal에 대 한 항 체를 사용 하는 것이이 제한을 극복 하기 위해 한 가지 가능한 방법은 특정 세포 유형에 대 한 immunodetection와 결합 ( 그림 5참조). 그러나, 만약 식 수준 낮은 또는 높은 배경 immunolabeling 만들 수 있습니다 그것은 감지 하기 어려운 여부 취재 원 유전자 표현 된다 특정 셀에. 특히, 새로운 기술 X gal 촉진28제작한 형광 방출에 따라 고품질 confocal 이미지를 보고 되었습니다. 또한,이 메서드는 면역 형광 검사와 호환 이며 명확 하 게 X gal 긍정적인 세포28를 식별할 수 있습니다. 효소 기자 LacZ 유전자 등이 주목할 때, 식 수준 특히 낮은 경우 형광 보다 더 민감한의 이점을 제공 합니다. 이와 관련, 현재 기술 입증 되었습니다 예측에 관한29, 따라서 모두 식 패턴의 질적 평가 식 레벨의 정량화를 허용의 검출에 이상적. 동일한 샘플에서 β-gal 활동을 모니터링 하는 동안 내 생 유전자의 표현 패턴을 검사 하는 매우 유용한 정보를 제공할 수 있는 교 잡 기술 현장에 를 통해 β-gal mRNA 활동 및 존재를 감지 하는 이중 얼룩 30. 그럼에도 불구 하 고, 모두 β-gal 얼룩 및 현장에서 교 잡 검출 반응 더블 얼룩 동안 컬러 호환성을 표시할 수 있습니다. 선택 S 여자 같은 더 적당 한 기질, 특별히 최적화 된 방법30것이 좋습니다.
이 다재 다능 한 방법 개발 생물학의 맥락에서 유전자 기능 연구를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 따라서, LacZ 유전자는 채택 되었다 유전자 표현 패턴의 분석에 대 한 배아 개발 하는 동안 대상된 유전자 소재 시에 그것을 노크 하 여. LacZ는 cis 행동 규제 요소 (강화) 태아의 제한 된 지역으로 지시 하는 유전자 발현에 관련 된 공부를 위한 일반적인 취재 원 유전자 관심31 의 발기인의 녹음 방송 활동에 정보를 제공 하는 ,3233. 또한, 그것은 자주 사용 유전 재결합 이벤트의 검출에 Cre 중재 loxP 사이트의 재결합에 의해 배아 줄기 세포 유래 세포 운명 매핑 실험 또는 세포 이식의 탐지를 위해 특히 유용. 배아 줄기 세포에서 유전자-트랩 mutagenesis β-gal 생리 조건34에서 발기인 활동의 평가 허용 하 게 융합 하는 잘린된 단백질을 생성 합니다. 이러한 모든 방법에 대 한 유전자 변형 동물 LacZ 운반 하 고 세균성 β-galactosidase 표현 쥐35,36, 생성 된37,38, Xenopus39 치킨 또는 zebrafish40. 지금까지,이 기술을 사용 되었습니다 초파리 에서 유도할 수 있는 유전자 표정 시스템, 그리고 조직과 세포 특정 p LacZ 마커 라인41의 가용성으로 인해 공간 및 일시적으로 유전자 발현의 시각화를 개선 하기 위해 ,10. 그것은 그이 외에도 유전자 변형 및 녹아웃 동물을 포함 하는 많은 응용 LacZ 취재 원 유전자 사용 되었습니다 전체 조직에 협조할 뿐만 아니라 생물 의학 연구에서 질병에 유전자의 역할을 예측 하는 세포 배양. 후자에의 한 관련 예 스트레스, 종양 억제, 또는 개발에 대 한 응답에 대 한 노화 과정의 연구 이다. 노화 세포는 모두 제자리에서 그리고 vivo에서 그들의 특성 overexpression 및 생 lysosomal 베타-galactosidase42,43의 축적 때문에 검출 하기 쉽다. 따라서, β-galactosidase 암 교양 양적 분석 실험에서 노화 biomarker 세포44로 사용 됩니다.
요약, 우리는 마우스 배아 조직에서 β-galactoside 활동의 쉬운 탐지를 촉진 하기 위하여 가능 하 고 최적화 된 절차를 설명 합니다. 현재 메서드 수정을 선정 조직 및 사용 하는 기판에 따라 수 있습니다. 따라서,이 다재 다능 하 고 비용 효율적인 방법이 적절 한 컨트롤은 특히 전체 마우스 배아 뿐만 아니라 얇은 조직학 단면도에 사용 적합 합니다.
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Disclosures
저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 Histopathological 서비스 센트 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)에 감사 하 고 싶습니다. 지원 우리의 프로젝트 및 원고 그녀의 중요 한 독서에 대 한 우리는 또한 친절 하 게 제공 Mt4 mmpLacZ 마우스, 박사 전 部와 박사 엘리샤 G. 아로요를 감사. 피터 Bonney이이 문서를 교정 하는 것을 감사 하 길. 이 이는 그랜트 (# 2017UEM01) C.S.C.에 게 수 여에 의하여 대학 Europea 마드리드에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24x60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
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