Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57785
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 2,3
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och metoden för paraffin snittning och counterstaining. Detta är en enkel och snabb procedur för att övervaka genuttryck under utveckling som kan också tillämpas på vävnadssnitt, organ eller odlade celler.

Abstract

Escherichia coli Lindholm genen, kodning β-galaktosidas, används i stor utsträckning som reporter för genuttryck och som spårämne i cellstudier härstamning. Klassiskt histochemical reaktionen baseras på hydrolys av substratet X-gal i kombination med järnklorid och järn joner, som producerar en olöslig blå fällningen som är lätt att visualisera. Därför, β-galaktosidas aktivitet fungerar som en markör för uttrycksmönstret av genen av intresse som utvecklingen fortsätter. Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och efterföljande metoden för paraffin snittning och counterstaining. Dessutom föreskrivs ett förfarande för att klargöra hela embryon att bättre visualisera X-gal färgning i djupare regioner av embryot. Konsekventa resultat erhålls genom att utföra proceduren, även om optimering av reaktion villkor behövs för att minimera bakgrund aktivitet. Begränsningar i analysen bör också övervägas, särskilt när det gäller storleken på embryot i hela mount färgning. Våra protokollet ger en känslig och en pålitlig metod för β-galaktosidas upptäckt under musen utvecklingen som ytterligare kan tillämpas på de kryostaten sektioner samt hela organ. Således de dynamiska gen uttryck mönsterna i hela utveckling kan enkelt analyseras med hjälp av detta protokoll i hela embryon, men också detaljerade uttryck på cellulär nivå kan bedömas efter paraffin snittning.

Introduction

För att beskriva specifik gen uttrycksmönster, har användning av reporter gener som markörer varit avgörande från Drosophila till däggdjur. I experiment med genmanipulerad och knockout djur, är bakteriell β-galaktosidas genen (Lindholm) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest använda1,2,3, 4. β-galaktosidas (β-gal) katalyserar hydrolys av β-galactosides (t.ex. laktos) till dess monosackarider (glukos och galaktos)5. Dess vanligaste substrat är X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glykosid som hydrolyseras av β-galaktosidas som ger upphov till 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole och galaktos. Först oxideras till en dimer som, när den används i kombination med kalium-ferri- och ferro-cyanid, producerar en karakteristisk olösligt, blå färg fällningen (figur 1)6.

Lindholm genen börjat användas som en reporter gen över trettio år sedan7,8. Vanligtvis, Lindholm infogas nedströms en endogen arrangören i stället för öppen läsning ramen, så den kan användas i bakteriell och cell kultur att visualisera celler som innehåller en viss insats, liksom i transgena djur som spårämne av endogen gen uttrycksmönster under utveckling9. I detta avseende har visualisering av β-galaktosidas aktivitet flitigt använts i Drosophila för att förstå de utvecklingsmässiga och cellulära processerna från enstaka celler till hela vävnader. Drosophila genetik för generering av stabila linjer där en modifierad P-element konstruktion innehållande reporter genen Lindholm är insatt på måfå platser i genomet. Således, när placeras under inflytande av enhancer element kan det driva sitt uttryck på ett särskilt sätt för vävnad, som har möjliggjort en systematisk analys av uttrycksmönster av många gener under de senaste två decennier10. Användningen av transgena möss att övervaka Lindholm genuttryck kan dessutom också upptäckt genen rekombination händelser av Cre-loxP medierad rekombination och lokalisering av muterade embryonala stamceller derivat i chimära analyser 11, som underlättar kontroll av Lindholm uttryck i specifika vävnader samt som temporally. Dessutom i hela embryon, kan upptäckt av β-galaktosidas aktiviteten producera differentiell färgning mönster vid olika intensiteter som bekvämt kan observeras över olika utvecklingsstadier att analysera tidsmässiga förändringar i genuttryck 8,12.

I denna artikel presenterar vi ett protokoll för att visualisera genuttryck genom X-gal färgning i hela mount vävnaden i tidiga utvecklingsstadier av musembryon. Vi presenterar denna histochemical metod som en mycket känslig och billig teknik som gynnar korrekt upptäckt av märkta celler i hela mount exemplar eller på cellnivå efter paraffin inbäddat vävnader eller embryon. Metoden möjliggör direkt visualisering av färgning i mus vävnaden med minsta bakgrunden jämfört med andra metoder13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella rutiner godkändes av kommittén för etik av djur experimenten av CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) och Comunidad Autónoma de Madrid för att säkerställa minimal djurens lidande.

1. insamling av embryon från dräktiga möss (från E8.5 till E12.5)

  1. Offra dräktiga möss av cervikal dislokation eller CO2 inandning. Dagen för först observerade vaginal plug ansågs embryonala dygn 0,5 (E0.5).
  2. Lägga djuret i ryggläge på absorberande pad och rengör bukhuden av musen med 70% etanol.
    Obs: Sterilitet krävs inte i följande steg.
  3. Nyp och lyft magen huden med hjälp av mus-tand pincett.
  4. Gör ett snitt genom huden och den buk-väggen, 2 till 4 cm vertikalt över mittlinjen av buken med kirurgisk sax.
  5. Exponera buken och avlägsna livmodern hornen från mamman med pincett skärande blodkärl längs inre krökning av livmodern med kirurgisk sax.
  6. Ta bort strängen av embryon och överföra den till en petriskål på is som innehåller 10 mL iskallt 0,01 M fosfatbuffert koksaltlösning pH 7,4 (PBS).
  7. Noggrant dissekera embryon ut från livmodern under ett stereomikroskop i en petriskål med 10 mL färsk iskall PBS. Greppa muskel väggen med urmakare pincett att exponera fostersäcken och sedan Riva fostervatten membranet för att ta bort bifogade embryot och gulesäcken med hjälp av tips av tången.
  8. Samla in littermate embryon från dräktiga möss i tidiga skeden (från E8.5 till E12.5) (figur 2).
  9. Överföra embryon till en ny maträtt med 10 mL kallt 1 x PBS med böjd pincett eller för mycket små embryon (E8.5-E9.5), Använd plast överföring pipetter för att samla prover utan embryo skador.
  10. Innan du börjar fixering, ta en embryonala prov i en mikrocentrifug rör för genotypning genom att skära en liten bit av embryot eller ta fostervatten membranet i minsta embryon (från E8.5 till E9.5) med urmakare pincett.
    Obs: Lindholm genotypning bestäms av polymeras-kedjereaktion (PCR) grundfärger: framåt, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; omvänd, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.

2. fixering av musembryon

  1. Överföra varje embryo till en 2 mL mikrocentrifug rör med en rundad bas innehållande 1 mL 1 x PBS.
    Obs: Utföra alla steg i protokollet i dessa rör med agitation rullande skakapparat.
  2. Tvätta embryona i 1 x PBS för 1 min i rumstemperatur att undanröja återstående blodet. Använd plast överföring pipetter ändra vätskor i rören.
  3. Fixa embryot i 1 mL 0,125% glutaraldehyd på is.
    Obs: Tiden för fixering beror på storleken på embryot: 20 min för E8.5-E9.5 embryon, 30 min för E10.5 embryon och 1 h för E12.5 embryon.
  4. Ta bort fixeringsvätskan och tvätta embryon i 1 x PBS två gånger i 10 min i rumstemperatur före bearbetning provet för X-gal färgning.

3. hela Mount β-galaktosidas histokemi mus embryon

  1. Förbereda X-Gal skölj buffert och X-Gal färgning lösning innan du startar proceduren (se tabell 1 och Tabell för material). Använda en vildtyp (WT) littermate embryon som negativa kontroller för den enzymatiska reaktionen.
  2. Inkubera embryon i X-Gal skölj buffert under 10 minuter vid rumstemperatur (figur 2).
  3. Inkubera embryon i X-Gal färgning lösning från 2 h till över natten vid 37 ° C skyddas från ljus. Övervaka färg reaktionen regelbundet via dissekera Mikroskop tills tillräcklig intensitet av blå färgning observeras utan bakgrunden i embryot. Hålla pH-värdet i lösningen mellan 8 och 9 att minska bakgrunden under den hela färgning. Om färglösningen börjar vända ljus, ersätta den med färska substratlösningen till utsträcka den enzymatiska reaktionen.
  4. Stoppa reaktionen när önskad signal erhålls genom att tvätta embryon i en mikrocentrifug rör med 1 mL 1 x PBS två gånger för 10 min varje vid rumstemperatur.
  5. Överföra färgade embryon till 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) att åter fixa dem, för 1 h till övernattning vid 4 ° C.
    Obs: Embryon kan lagras i 4% PFA/PBS för längre tider vid 4 ° C eller omedelbart kan bearbetas för snittning. Detta slutliga fixering steg är avgörande för ett långsiktigt bevarande av färgning mönster.
  6. Tvätta embryona i 1 mL 1 x PBS två gånger under 10 minuter vid rumstemperatur.
  7. Alternativ 1: Rensa embryon genom nedsänkning i en serie av lösningar med ökande koncentrationer av glycerol (20%, 40%, 60% och 80% glycerol i 1 x PBS) för 1 h vid rumstemperatur i varje lösning.
    Obs: Tvätta embryon i 80% glycerol för längre tider, även dagar, tills de raderas, och sedan lagra dem i 80% glycerol vid 4 ° C i detta steg (figur 2). PBS rekommenderas att förhindra mögeltillväxt och att lägga till en mycket liten mängd natrium natriumazid ora kristall av tymol till embryona lagras vid 4 ° C i glycerol eller 1 x. Efter röjning, kan hela mount embryon användas för att fotografera (steg 4).
  8. Alternativ 2: Processen embryon för paraffin inbäddning och snittning använder en mikrotom (figur 2). Dokumentera det uttryck pattern i hela färgade embryon innan snittning (steg 4 och 5).

4. fotografi av hela Mount embryon

  1. Att fotografera hela mount målat embryon innan snittning, överföra dem till en petriskål beredd med en bas av stelnat 1-2% agaros i 1 x PBS.
  2. Täcka embryot helt med 10 mL 1 x PBS i agaros-belagd maträtter att förhindra uttorkning och speglar samtidigt fotografera genom vätskan.
  3. Orientera embryot nedsänkt i 1 x PBS med pincett. För äldre embryon (E10.5-E12.5), göra ett litet hål i Agarens med pincett att placera och placera preparatet inom it i olika vinklar och undvika de fritt flytande under fotografering.
  4. Placera skålen på stereomikroskop scenen, med hjälp av överförda (under steget) ljus. Ändra mellan 'mörkt-fält' och 'ljusa-fältet' justeringar att ställa in önskad belysning vid fotografering och för att optimera genomskinlighet av provet.
    Obs: Använd fiber optic belysning för senare stadier embryon för att undvika speglar på ytan av embryot. När du fotograferar clearade embryon, följa samma procedur men överföra dem till en petriskål som innehåller 100% glycerol och omslutas av dem.

5. paraffin inbäddning och snittning av X-gal målat embryon

  1. Paraffinvax inbäddning
    1. Ta bort X-gal målat embryon från 4 ° C (steg 3.5) och tvätta dem med 1 mL 1 x PBS tre gånger för att eliminera överskott av fixativ.
    2. Överföra varje embryo till en histologi kassett med pincett.
    3. Placera de kassetter som innehåller embryona i en bägare och sedan torkar genom att passera dem genom en graderad etanol serie i rumstemperatur: 70% etanol, en gång för 30 min; 96% etanol, två gånger för 30 min vardera; 100% etanol, två gånger för varje 30 min.
      Obs: Embryon kan lagras i 70% etanol för en obestämd tid vid 4 ° C tills start dehydratiseringsprocessen.
    4. Inkubera hela kassetten i isopropanol för 30 min i rumstemperatur.
    5. Med hjälp av tången, överföra kassetter till ett glas färgning tråg innehållande pre värmde isopropanol och lämna i en ugn vid 60 ° C i 30 min.
    6. Placera korgarna i ett nytt glas färgning tråg innehållande en blandning av 50% isopropanol / 50% smält paraffin vax och låt verka i 4 h i 60 ° C ugn.
    7. Inkubera kassetter med embryon med två ändringar av smält paraffin vax, 30 min 60 ° c varje.
    8. I slutet av den sista paraffin tvätten, öppna kassetten och överföra varje embryo till en separat vävnad inbäddning mögel för att Visa provet under ett stereomikroskop.
    9. Fyll borrhålet med smält paraffin vax vid 60 ° C. Använd uppvärmd pincett att hålla vaxet smält och noggrant orientera embryot i formen.
      Obs: Rätt orientering av provet är ett kritiskt steg för snittning av embryot i önskad planet.
    10. Innan paraffin stelnar i formen, placera en kassett utan locket på toppen av blocket och fyll den med smält paraffin vax. Låt resterande vax svalna tills stelnat över natten i rumstemperatur.
    11. När paraffinet är helt stelnat, ta bort den solida blocket från mögel och lagra de paraffinblock antingen i rumstemperatur eller vid 4 ° C tills snittning14.
  2. Paraffin snittning
    1. Orient bladet på mikrotomen och ställa in 5-7 µm tjocklek. 5.2.2. cool paraffin blocket på isen och trimma det för att producera en kub eller en pyramid.
    2. Bifoga blocket till innehavaren mikrotom med hjälp av en liten mängd smält vax.
    3. Orient blocket för optimal skärning. Avsnitt paraffinblock i 5-7 µm tjocka skivor vid rumstemperatur med standard mikrotomen.
    4. Med hjälp av en fin pensel, placera avsnitten i ett vattenbad vid rumstemperatur för att manipulera och välja skivor.
    5. Plocka upp avsnitt från vattenbadet med ett objektglas och överföra dem i ett vattenbad vid 42 ° C för stretching.
    6. Ta bort avsnitt från vattenbadet och försiktigt placera dem på vidhäftning objektglas.
    7. Torkar glasen väl i en ugn vid 37 ° C över natten så att avsnitten att helt följa, annars kan de gå vilse under färgningen.
      Obs: Förvara bilderna vid 4 ° C tills start färgning förfaranden.
  3. Avparaffinering och Counterstaining av X-Gal-färgade Paraffin avsnitt
    1. Sätt bilder på ett objektglas fack i en ugn vid 60 ° C under minst 45 min att göra paraffin vax mer flytande.
    2. Överföra bilder på ett rack och använda glas färgning rätter för att utföra följande steg: Sänk racket i färgning burkar som innehåller alkoholer med minskande koncentrationer för komplett paraffin borttagning och återfuktning av vävnader: isopropanol för 5 min vid 60 ° C; isopropanol för 3 min; 100% etanol för 2 min; 96-procentig etanol för 1 min; 70% etanol för 1 min i rumstemperatur.
    3. Skölj sektioner i destillerat vatten två gånger för att kontrollera att det finns inga alkohol-rester.
    4. Motfärg sektioner med en fläck (t.ex. kärn-Fast röd lösning) för 5 min (vanligtvis mellan 3-8 min) vid rumstemperatur (figur 2).
      Obs: Denna färgning hjälper till att avslöja övergripande vävnadsstrukturen i avsnitten.
    5. Efter färgning, tvätta objektglasen i destillerat vatten för 1 min och kolla avsnitt färgning i mikroskopet.
      Obs: Om önskad färgningen är för svag, motfärg avsnitten igen under en längre tid.
    6. Torkar ut avsnitten i följande serie med ökande koncentrationer av etanol: två tvättar i 95% etanol för 2 min varje, två tvättar i 100% etanol för 2 min varje, och, för att undvika upplösning blå färgen påskyndar, bara en snabb tvätt i xylen.
    7. Ta bort bilderna från rack en efter en och placera dem på en bit papper. Montera och täckglas varje skjut sedan använder en syntetisk, permanent monteringsmedium.
      Obs: Xylen är en brandfarlig produkt vars ångor är irriterande och skadliga för människors hälsa och för vattenlevande organismer. Det måste manipuleras inom en huva och kräver användning av lämplig skyddsutrustning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här visar vi resultaten från att tillämpa standardprotokollet för β-galaktosidas histochemical reaktionen med X-gal som substratet i hela musembryon (figur 1 och figur 2). Med detta protokoll kan vi undersöka membran typ 4-matrix metalloproteinas (Mt4-mmp) uttryck i olika embryonala utvecklingsstadier (E9.5, E11.5 och E12.5) använder Mt4-mmp muterade möss som express Lindholm reportern under kontroll av den endogena Mt4-mmp arrangören (figur 3, figur 4och figur 5)9,15. Mt4-mmp är en endopeptidase som är bundna till cellmembranet genom en glycophosphatidyl inositol ankare (GPI). Även om Mt4-mmp har upptäckts i flera mänskliga cancerformer och har varit relaterade till utvecklingen av tumörtillväxt, är information om dess proteolytiska aktivitet mot extracellulär matrix komponenter mycket begränsad hittills. Nästan ingenting har dessutom rapporterats om roll och uttryck för Mt4-mmp under fosterutvecklingen9,16.

Vildtyp (WT), Mt4-mmpLindholm / + heterozygot (HT) och knockout (KO) littermate embryon bearbetas parallellt för X-gal färgning protokollet (figur 2). Flera kontroller måste inkluderas under färgning för att validera specificiteten av förfarandet. Således, WT embryon används som negativa kontroller för histochemical reaktionen och tjäna att övervaka icke-specifik X-gal märkning (se figur 3A-D och figur 4A-C). Också, för att undvika ospecifikt bakgrund, pH-värdet i X-Gal färglösningen måste upprätthållas mellan 8 och 9 i hela hela färgningen. I figur 3Evisualiseras β-gal-positiva celler i hela mount HT embryon i thoraxsegmenten och den intersomitic kärlsystemet i E9.5 skede. För att rapportera den exakta platsen för de färgade cellerna, embryo snittning krävs dock att visualisera under mikroskopet rapporterade genuttryck i vävnadssnitt på cellulära upplösning. I det här fallet finns Lindholm-positiva celler i thoraxsegmenten, dorsala aorta, den intersomitic kärlsystemet samt perineural vaskulär plexus i vävnadssnitt (pilar i figur 3F-H). Dessa resultat korrelerar med det uttryck pattern rapporterade för Mt4-mmp i dessa mus embryonala stadier9, som anger att denna teknik är enkelt reproducerbar och pålitlig. Som förväntat, är nivåer av β-gal aktivitet högre i KO embryon jämfört med HT på grund av förekomsten av två kopior av genen Lindholm reporter (figur 3I-L). Dock endast HT Lindholm / + embryon bör analyseras i studier av gen uttrycksmönster och KO vävnad används som ett bevis på konceptet för att demonstrera genomförbarheten av metoden sedan på grund av den riktade gen av intresse, β-gal positiva celler kan vara onormalt ligger i den senare.

När du utför detta protokoll, äldre embryon (från E10.5 till E12.5) är inte genomskinliga, och därför den mest synliga X-gal målat regioner är de nära ytan. Således är ett alternativt steg i denna metod att rensa embryon av tvättar i lösningar med ökande glycerol koncentrationer. I figur 4, E12.5 Lindholm-färgade embryona blev klart bibehållen X-gal färgning, tillåter oss att fotografera djupare färgade regioner av embryot i stereomikroskopet. Som tidigare rapporterats på detta embryonala Stadium, var märkning lokaliserade i olika regioner av hjärnan, armar och ben, follikeln av vibrissa och spetsen av svansen9. Men om man vill få en cellulär resolution, bör embryon vara inbäddade i paraffin, sektioneras och mikroskopiskt undersökt.

I figur 5användes immunhistokemi med anti-β-gal antikroppar för att bekräfta ett uttryck för Mt4-mmp observerats med hjälp av reporter Lindholm färgning. Således, β-gal-positiva celler upptäcktes i poolen av motoneurons av mus ryggmärgen på E11.5 med hjälp av båda metoderna, vilket bekräftar specificiteten av protokollet redovisas här (figur 5A, B).

Figure 1
Figur 1 . Schematisk illustration av E. coli Lindholm reporter gen kodning för de β-galaktosidas och histochemical reaktionen katalyseras av detta enzym. I den traditionella färgning hydrolyserar β-galaktosidas substratet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) till 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole. Därefter oxideras denna mellanliggande, som orsakar dimerization och bildandet av blå-färgade slutprodukten (5, 5'-dibrom-4, 4'-diklor indigo). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Diagram som visar de viktigaste stegen i standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet. Musembryon samlas in och bearbetas för hela mount X-gal färgning. Efter histochemical färgningen utförs enligt protokollet, kan hela mount embryon vara (alternativ 1) rensat med tvättar i lösningar med ökande glycerol koncentrationer och därefter fotograferad i ett stereomikroskop, eller (alternativ 2) inbäddat i paraffin, sektioneras och counterstained. Förkortningar: RT, rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . X-gal färgning av E9.5 WT och Mt4-mmpLindholm / + hela-mount embryon och vävnadssnitt. Genom att använda standard X-gal histochemical analysen, analyserades transgena embryon bär genen Lindholm under kontroll av Mt4-mmp promotorn för β-gal aktivitet. WT (A), HT (E) och KO (jag) E9.5 hela berget embryon bearbetades för detektion av β-galaktosidas uttrycket. Paraffin avsnitt erhållits från dessa embryon på nivå av ryggmärgen att visualisering av färgningen cellulära upplösning. Som förväntat, β-gal positiva celler var frånvarande i WT sektioner (B-D), medan intensiteten av märkning var högre i KO (J-L) jämfört med avsnitten HT vävnad (F-H). Tvärsnitt genom neuralrörsdefekter avslöja β-gal aktivitet i de utvecklingsländerna thoraxsegmenten, dorsala aorta och perineural vaskulär plexus. Förkortningar: da, dorsala aorta; FLB, forelimb bud; h, hjärta; m, mesencephalon; NT, ryggsträng; OTV, öron vesikler; OV, optic vesikler; PNVP, perineural vaskulär plexus; s, somite; t, telencephalon. Skala barer: 500 μm (A, E, jag); 100 μm (B, F, J); 50 μm (C, G, K); 20 μm (D, H, L). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Mikrofotografier av WT och HT X-gal målat musembryon på E12.5 innan (A, D) och efter (B, C, E, F) clearing med tvättar i ökad glycerol. Som förväntat, WT embryon Visa ingen reporter Lindholm uttryck (A-C) medan märkning upptäcktes i armar och ben (vit pilspetsar), primordium follikeln av vibrissa (vit pil), spetsen av svansen (svart pil) och hjärnan av Mt4-mmpLindholm / + embryon på detta stadium (D-F)9. (E, F) Efter röjning i glycerol, embryon blev genomskinlig och märkning kan vara mer enkelt visualiseras i djupare regioner av embryot, som visas i mesencephalon och telencephalon (vita pilar i F). Skalstapeln: 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Histochemical och immunhistokemisk detektion av β-galaktosidas. (A) X-gal färgning (i blått) avslöjar uttryck av Mt4-mmp i poolen av motoneurons i en paraffin avsnitt av ryggmärgen vid E11.5 embryostadiet. (B) immunhistokemi med anti-β-gal antikroppar (i rött) bekräftade uttryck av Mt4-mmp i de ryggmärgen motoneurons vid samma embryostadiet i kryostaten sektioner. Förkortningar: fp, golvplatta; MN, motoneurons; Skalstapeln: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Recept och lösningar som krävs för detta protokoll. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

E. coli Lindholm genen har använts som reporter i studier av gen uttrycksmönster på grund av dess höga känslighet och underlätta identifiering. Protokolls beskriver en klassisk metod för att upptäcka β-gal uttryck baserat på en enzymatisk reaktion som är enkel och snabb att utföra samt billig. Denna metod kan användas även utan större modifieringar i hela mount embryon, intakta organ, kryostaten vävnadssnitt eller odlade celler.

Korrekt tillämpning av denna metod resulterar i en robust och tolkningsbara färgning. Dock rekommenderas samtidiga kontroller och efterföljande bekräftande steg. I detta avseende genomförs detta protokoll parallellt med vildtyp littermate embryon används som negativa kontroller som syftar till att övervaka icke-specifik X-gal färgning. Dessutom uttrycket data erhålls när med β-gal färgning bekräftas av western-blot och kvantitativa-PCR (Q-PCR) analys eller genom β-gal tillåter immunohistokemi (figur 5), som i kombination med andra antikroppar även identifiering av specifika celltyper uttrycker Lindholm9. Fixering steg behöver beaktas för att bibehålla den enzymatiska aktiviteten av de β-galaktosidas och minimera bakgrund under färgningen. Embryon skall således fastställas i glutaraldehyd, vilket ger de mest konsekventa och pålitliga resultat jämfört med PARAFORMALDEHYD fixering17. Förutom, fixering tid är avgörande och bör bestämmas empiriskt för varje embryonala Stadium, eftersom överdriven fixering kan minska β-galaktosidas aktivitet. I detta avseende kan hela mount embryon fixas genom nedsänkning eller perfusion beroende på embryostadiet och storlek. Således rekommenderas transcardial perfusion för embryon som är äldre än E14.5 och postnatal exemplar att säkerställa att fixeringsvätskan når alla regioner av provet. Mindre embryon (från E8.5 upp till E12.5) kan fastställas genom nedsänkning och bearbetas direkt för i sin helhet X-gal färgning (figur 2). Det bör nämnas att X-gal färgning av musembryon yngre än E14.5 kan utföras som hela fästet. I det här fallet upptäcks färgade celler nära ytan lätt genom β-gal färgning. Trots detta kan det hända att djupare märkning visas suddig eller ens dye tränger inte vävnaden, speciellt i äldre embryon. I det här fallet antingen organ eller vuxna möss vävnad kan vara dissekeras, X-gal färgas och visualiseras under ett stereomikroskop. Snittning och mikroskopisk undersökning av färgade vävnad av intresse är emellertid lämpligare (figur 2).

Trots protokollets effektivitet, kan färgning hela embryon och upptäckt vara besvärande. För instans, njure, testiklarna, sekretoriska körtlar innehåller bitestiklar och mag-tarmkanalen höga halter av endogena sura β-galaktosidas18 som kan störa tolkningen av resultaten på grund av bakgrund aktivitet. Av den anledningen bör histochemical reaktionen utföras villkor något basiskt pH (pH 8-9) under färgningen, eftersom E. coli β-galaktosidas har en optimal pH på 7,3. Detta hjälper att avsevärt minska bakgrund och att gynna bakteriell β-galaktosidas aktivitet19,20,21,22. Det bör också noteras att länge färgning gånger kan leda till försurning av X-gal färgning lösning, gynnar en ökad bakgrund. Dessutom går β-galaktosidas aktiviteten förlorad under inkubation temperaturer över 50 ° C, men inte under 42 ° C. I våra händer, inkubation med X-gal substrat fungerar bättre när lämnade över natten vid 37 ° C. Efter färgning och innan steget efter fixering är det viktigt att tvätta alla X-gal reaktion material som noggrant och så snabbt som möjligt eliminera fällningar från histochemical reaktionen som kan deponeras i avsnittet vävnad.

Såsom visas här, är rensa embryon i glycerol viktigt för att göra vävnaden genomskinlig samtidigt som X-gal färgning och vävnad histologi. Således embryona blivit tydligt och märkning kan visualiseras i djupare regioner under stereomikroskopet. Dock för att analysera den exakta platsen för de färgade cellerna, snittning av provet krävs och röjningen är därför inte nödvändigt. I detta fall kan av följande rekommendationer anges i metoden, prover vara noggrant paraffin inbäddade och sektionerad. Under processen inbäddning etanol uttorkad vävnad behöver nedsänkas i en blandning av isopropanol-paraffin. Isopropanol används att gynna ersättandet av etanol i urvalet och att underlätta vävnaden inbäddning i paraffin23. I vissa protokoll används xylen istället för isopropanol för samma ändamål. Användning av xylen presenterar dock nackdelar jämfört med isopropanol, såsom krympning och härdning av provet på grund av avlägsnande av vävnad lipider24 och dess toxikologiska profil som en brandfarlig och irriterande produkt25. Orange oljebaserade clearing agenter är en av de säkraste alternativen till xylen eftersom de tillåter snabb clearing utan toxicitet xylen samt utmärkt vävnad struktur bevarande26. Dessutom använder xylen, bör denna del av protokollet minskas maximalt, eftersom X-gal färgning kan diffusa och förloras19. Efter snittning, från med färgämnen (t.ex. kärnkraft snabbt röd) rekommenderas att underlätta histologiska identifiering av uttrycker celler. Detta färgningsproceduren snabb, kräver endast ett steg, och dess rosa utseende ger bra kontrast med blå-färgade X-gal fällningen. Men är denna counterstaining endast lämplig för användning med icke vattenhaltigt montering media (dvs DPX).

Denna klassiska metod är lämplig för detektion av β-galaktosidas aktivitet, sedan X-gal i kombination med kalium ferro - och ferricyanid producerar en karakteristiska blå fällning som inte bleknar eller blekmedel enkelt och, när välbyggd, kan vara upptäckte även under mikroskopet dissekera. Det finns andra ändringar av den ursprungliga protokollet. Med hjälp av tillgängligt substrat såsom lax-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), Magenta-gal (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) eller Bluo-gal (5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside)13,19 , eller att ersätta den klassiska X-gal/FeCN för Tetrazolium salter kan kraftigt öka känsligheten för upptäckt13,19. Detta rekommenderas särskilt att möjliggöra hög känslighet upptäckt av låga nivåer av protein och mRNA material. Men när den används för länge, någon av dessa förfaranden kan leda till höga bakgrundsvärden och så noggrann hantering av villkoren rekommenderas alltid, särskilt med tanke på att långvarig inkubation perioder kan det underlätta ospecifik färgning på grund endogena β-galaktosidas aktivitet13,27. Angående det senare är det alltid tillrådligt att använda ferric kaliumsalter för att optimera tekniken tillförlitlighet och undvika fallgropar.

En viktig begränsning med denna metod är att den klassiska X-gal färgningsproceduren producerar en olöslig blå fällningen som enkelt kan upptäckas genom ljusmikroskop men inte tillåter samtidig lokaliseringsutredningar av fluorescerande eller confocal microscopy i vävnad sektioner. Ett sätt att övervinna denna begränsning skulle vara att använda antikroppar mot β-gal (se figur 5) kombinerat med immunodetection för en viss celltyp. Dock om uttrycksnivåerna är låga eller höga bakgrunden, immunolabeling kan göra det svårt att upptäcka om reporter genen uttrycks i en viss cell. Framför allt, har en ny teknik rapporterats att få hög kvalitet confocal bilder baserat på fluorescens utsläpp produceras av de X-gal fällning28. Dessutom, denna metod är kompatibel med immunofluorescens och tydligt kan identifiera X-gal positiva celler28. Enzymatisk reportrar som genen Lindholm erbjuder fördelen att vara mer känsliga än lysrör, som är anmärkningsvärt när märkning, om uttrycket är särskilt låg. I detta avseende har den nuvarande tekniken bevisats idealisk för detektion av mikroRNA29, därför tillåter både kvalitativ utvärdering av de uttryck mönsterna och kvantifiering av uttrycksnivåerna. Dubbelrum färgning används för att upptäcka β-gal aktivitet och mRNA närvaro via i situ hybridisering tekniker, som kan ge mycket värdefull information för att undersöka uttrycksmönstret av endogena gener samtidigt övervaka β-gal aktivitet i samma prov 30. dock båda β-gal fläcken och i situ hybridisering upptäckt reaktioner kan visa färg oförenlighet under dubbel färgning. Att välja ett mer passande substrat, såsom S-gal, rekommenderas i specifikt optimerade metoder30.

Denna mångsidiga metod har använts i stor utsträckning att studera geners funktion inom ramen för utvecklingsbiologi. Således, Lindholm genen har antagits för analys av gen uttrycksmönster under fosterutvecklingen av knackar det in en riktade gene locus. Lindholm är en gemensam reporter gen för att studera cis verkande reglerande element (smakförstärkare) inblandade i att styra genuttrycket i begränsade regioner av embryot, tillhandahålla information om aktiviteten transkription av arrangören av intresse31 ,32,33. Också, den ofta används för detektion av genetisk rekombination händelser av Cre-medierad rekombination av loxP platser, vilket är särskilt användbart för detektion av embryonala stamceller derivat i cell öde mappning experiment eller cell transplantation. Gen-fällan mutagenes i embryonala stamceller producerar trunkerade proteiner smält till β-gal som möjliggör utvärdering av promotorn aktivitet under fysiologiska betingelser34. För alla dessa metoder, kyckling transgena djur bär Lindholm och uttrycka bakteriell β-galaktosidas har genererats i råtta35,36,37,38, Xenopus39 eller Zebrafiskar40. Hittills har har denna teknik använts i Drosophila för att förbättra visualisering av genuttryck spatialt och temporalt på grund av tillgängligheten av inducerbara gen uttryck system, vävnad och cell-specifika p-Lindholm markör linjerna41 ,10. Det är värt att notera att bortsett från dessa många tillämpningar som involverar genmanipulerad och knockout djur, Lindholm reporter gen har använts i hela vävnader samt odlade celler att förutsäga rollen av gener i sjukdomen inom biomedicinsk forskning. Ett relevant exempel på det senare är studiet av åldrandet angående svar på stress, tumör dämpning eller utveckling. Senescent celler är lätt att upptäcka både i situ och in-vivo på grund av deras karakteristiska överuttryck och ackumulation av endogena lysosomala beta-galaktosidas42,43. Β-galaktosidas används därför som en senescent biomarkör i kvantitativa analyser i cancer odlade celler44.

Sammanfattningsvis beskriver vi ett genomförbart och optimerad förfarande för att underlätta enkel identifiering av β-galactoside aktivitet i mus embryonala vävnad. Denna metod tillåter ändringar utifrån den vävnad som valts och det substrat som används. Denna mångsidiga och kostnadseffektiv metod sysselsatt med lämpliga kontroller är därför särskilt lämplig för användning med hela musembryon samt histologiska tunnslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka histopatologiska tjänsten för deras tekniskt bistånd på de Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi tackar också Dr Motoharu Seiki för vänligt ge Mt4-mmpLindholm möss och Dr Alicia G. Arroyo för att stödja vårt projekt och för hennes kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka Peter Bonney för korrekturläsning denna artikel. Detta arbete stöds av Universidad Europea de Madrid med hjälp av ett bidrag (# 2017UEM01) till C.S.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
2-Propanol SIGMA-ALDRICH 24137-1L-R
Agarose SCHARLAU 50004/ LE3Q2014
Aqueous mounting medium VECTOR LABS H-5501
Synthetic mounting media MERCK 100579
96% Ethanol PROLABO 20824365
99.9% Ethanol absolute SCHARLAU ET00021000
50% Glutaraldehyde solution SIGMA-ALDRICH G6403-100ml
85% Glycerol MERCK 104094
99.9% Glycerol SIGMA-ALDRICH G5516
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA-ALDRICH 63064
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) SIGMA-ALDRICH 542334
Nuclear Fast Red counterstain SIGMA-ALDRICH N3020
Paraffin pastilles MERCK 111609
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500g
Phosphate buffered saline (tablets) SIGMA-ALDRICH P4417-50TAB
Potassium ferrocyanate MERCK 1049840500
Potassium ferrocyanide MERCK 1049731000
Sodium azide SIGMA-ALDRICH S8032
Sodium deoxycholate SIGMA-ALDRICH 30970
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate SIGMA-ALDRICH 106346
Sodium phosphate dibasic dihydrate SIGMA-ALDRICH 71638
Thymol SIGMA-ALDRICH T0501
Tris hydrochloride (Tris HCl) SIGMA-ALDRICH 10812846001 (Roche)
X-GAL VENN NOVA R-0004-1000
Xylene VWR CHEMICALS VWRC28973.363
EQUIPMENT
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm SAKURA 4566
Rotatory Microtome Leica RM2235
Cassettes Oxford Trade OT-10-9046
Microscope Cover Glasses 24x60 mm VWR ECN631-1575
Microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER AGAA000001#12E
Adhesion microscope slides Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER J1820AMNZ
Flotation Water bath Leica HI1210
Disposable Low Profile Microtome Blades Feather UDM-R35
Paraffin oven J.R. SELECTA 2000205
Wax Paraffin dispenser J.R. SELECTA 4000490
Stereomicroscope Leica DM500
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL SIGMA-ALDRICH T2795
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL SIGMA-ALDRICH T9661
Orbital shaker IKA Labortechnik HS250 BASIC
Stirring Hot Plate Bibby HB502
Vortex Shaker IKA Labortechnik MS1
Laboratory scale GRAM FH-2000
Precision scale Sartorius ISO9001
pHmeter Crison Basic 20
Optic fiber Optech PL2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 136 Lindholm β-galaktosidas paraffin snittning mus utveckling embryonala förtydligande genuttryck
Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco, M. J., Learte, A. I. R.,… More

Blanco, M. J., Learte, A. I. R., Marchena, M. A., Muñoz-Sáez, E., Cid, M. A., Rodríguez-Martín, I., Sánchez-Camacho, C. Tracing Gene Expression Through Detection of β-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (136), e57785, doi:10.3791/57785 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter