Summary
Hier präsentieren wir eine Protokoll, das Details der technischen Aspekte und wesentliche Voraussetzungen, um robuste IG gen Sequenzanalyse bei Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), stellen Sie sicher basierend auf den gesammelten Erfahrungen der Europäischen Forschungsinitiative auf CLL (ERIC).
Abstract
Während der B-Zell-Reifung der komplexe Prozess der Immunglobuline (IG) Gen V (D) J Rekombination mit somatische Hypermutation (SHM) führt zu einer einzigartigen DNA-Sequenz innerhalb jeder einzelnen B Zelle gekoppelt. Da B-Zell-Tumoren durch die klonale Expansion einer einzelnen Zelle entstehen, repräsentieren IG Gene eine einzigartige molekulare Signatur häufig auf die bösartigen Zellen innerhalb eines einzelnen Patienten; So können IG gen Umlagerungen als klonaler Marker verwendet werden. Zusätzlich zu seiner Tätigkeit als wichtige klonalen Bezeichner, kann die IG-gen-Sequenz als "molekulare Timeline" handeln, da steht in Zusammenhang mit bestimmten Entwicklungsstadien und somit die Geschichte der B-Zellen die neoplastische Transformation beteiligt spiegelt. Darüber hinaus gilt für bestimmte Tumoren, insbesondere chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), die IG Gensequenz potenziell prädiktive und prognostische Fähigkeiten. Allerdings rechnet man sinnvolle Schlussfolgerungen aus IG gen Sequenzanalyse unmöglich wäre nicht wären robuste Methoden und Werkzeuge zur Verfügung, um in ihrer Analyse zu unterstützen. Dieser Artikel, gestützt auf die langjährige Erfahrung der Europäischen Forschungsinitiative auf CLL (ERIC), Details der technischen Aspekte und grundlegenden Anforderungen erforderlich, um zuverlässige und reproduzierbare IG gen Sequenzanalyse in CLL, einen Test zu gewährleisten, die jetzt empfohlen wird für alle Patienten mit CLL vor der Behandlung. Genauer gesagt, werden die verschiedenen analytischen Phasen beschrieben die Identifizierung von Clonotypic IG gen Neuordnung und die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz bis hin zu genaue klinische Interpretation von der IG gen Sequenzdaten.
Introduction
Chronische lymphatischer Leukämie (CLL), die häufigste Form der Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern zeichnet sich durch die klonale Expansion der Reife neoplastischen B Zellen1. Aus klinischer Sicht ist der Krankheitsverlauf bei einigen Patienten erleben eine aggressive Krankheit, behandlungsbedürftigen sehr früh nach der Diagnose, und oft rezidivierend oder als Therapie refraktär außerordentlich variabel. Dies steht in krassem Gegensatz zu einem Großteil der Patienten (~ 30 %), die mit einer indolenten Krankheit darstellen, nie Behandlung bedürfen, und haben eine Lebenserwartung, die ähnlich wie bei gesunden Alter abgestimmt2. Diese klinische Heterogenität spiegelt sich in der Vielfalt der molekulare Anomalien gefunden bei CLL-Patienten, die letztlich die Pathogenese und Progression von dieser Krankheit3fahren.
Festlegung, dass eine genaue Diagnose der CLL wird in der Regel unkompliziert, jedoch die oben genannten klinischen Heterogenität behindern das effektive Management von Patienten mit CLL und unterstreicht die Notwendigkeit für prognostische und prädiktive Marker, die in helfen könnte Behandlung Entscheidungen2. Zahlreiche Studien haben versucht, die Prognose der CLL, kulminierend in einer Fülle von neuartigen klinische und biologische Marker vorgeschlagenen4verfeinern. Der Mutationszucht Status des Gens Clonotypic Immunglobulin schwere Variable (IGHV) gehört zu den robustesten prognostische Marker in CLL, vor allem aufgrund der Tatsache, dass (i) es stabil, im Laufe der Zeit und wenn die Krankheit fortschreitet bleibt, und (Ii) es unabhängig von anderen ist klinische und biologische Parameter5. Dass trotzdem, wenn überhaupt nur sehr wenige Markierungen, einschließlich IGHV mutagenen Status, derzeit in der klinischen Routine zum Zeitpunkt der Diagnose angewendet werden.
Erste Berichte über den klinischen Nutzen von IG Gensequenzierung in CLL Datum bereits 1999, als 2 unabhängige Studien, dass Patienten mit Nein oder eine minimale somatische Hypermutation (SHM) Last (Krebszelle CLL, U-CLL berichtet) haben eine schlechtere Prognose als Patienten, die eine höhere Belastung der SHM (mutierte CLL, M-CLL)6,7. Genauer gesagt, die U-CLL-Gruppe bestand aus Fällen Clonotypic IGHV Gene mit wenigen oder keinen SHM beherbergen und damit eine hohe prozentuale Identität an das nächstgelegene Keimbahn IGHV gen (≥98 %), während M-CLL Fällen mit einer höheren mutagenen Last bestand (Prozent Identität, die am nächsten Keimbahn IGHV gen < 98 %). Seit diesen frühen Studien wurde immer wieder nachgewiesen, dass eine kürzere Zeit zu ersten Behandlung (TTFT) und Gesamtüberleben (OS) im Vergleich zu M-CLL U-CLL Vitrinen.
Im Nachhinein markiert dieser bahnbrechenden Studien die zentrale Rolle der B-Zell-Rezeptor (BcR) IG in CLL Pathobiologie, und ebnete damit den Weg für umfangreiche Recherchen in CLL-microenvironmental Interaktionen, die wiederum zu einer umfassenden Würdigung der führte die biologische Heterogenität dieser Erkrankung8,9. Neuere Studien haben zusätzlichen Unterstützung für die Bedeutung der immungenetischen Analysen in CLL durch die Enthüllung, die Einzelfälle in Teilmengen aufgrund Freigabe (quasi-) identische BcR IG Gensequenzen cluster können zur Verfügung gestellt, ein Phänomen genannt BcR IG Stereotypen10 ,11,12,13. Sammeln Beweise unterstützt die Vorstellung, dass Patienten die gleichen Stereotypen Teilmenge Hafen ähnliche Clinicobiological Eigenschaften, die sie deutlich von anderen CLL-Patienten innerhalb der gleichen SHM-Kategorie, aber mit unterschiedlichen IG Gensequenzen zu trennen; Es wurde sogar berichtet, dass die Kategorisierung von Patienten mit CLL basierend auf BcR IG Stereotypen weiter die Bulk Segregation von Patienten mit CLL in U-CLL oder M-CLL Gruppen14,15,16, verfeinert 17 , 18 , 19 , 20.
Aus klinischer Sicht ist es bemerkenswert, dass der SHM-Status des Gens Clonotypic IGHV scheint auf eine konkrete Antwort auf Chemoimmunotherapy beziehen. In bestimmten, M-CLL-Patienten behandelt mit einer Kombination aus Fludarabin/Cyclophosphamid/Rituximab (FCR), die Gold-Standard-Behandlung für medizinisch Fit CLL-Patienten fehlt TP53 Gendefekten, zeigte deutlich längere progressionsfreie Überleben (PFS) und OS im Vergleich zu U-CLL-Patienten, die die gleiche Behandlung21,22,23erhalten. Daher, Identifikation des SHM Status wichtig geworden, insbesondere für die Unterstützung in das therapeutische Management der CLL Patienten z. B. eines prädiktiven Markers und nicht für die Beurteilung der klinischen Verlaufs der Krankheit also, eine prognostische Marker. In der Tat, nach der Aktualisierung der Leitlinien NCI-gesponsert von der International Workshop on CLL der SHM-Status der neu IGHV Gene bestimmt in allen CLL Fällen vor Behandlungsbeginn in beiden Allgemeinmedizin und klinische sollte Studien-24. Darüber hinaus kann die SHM-Status der IG-Molekül aufgrund der letzten Genehmigung des Roman Behandlungsmitteln und die wachsende Zahl von Drogen in Studien, eine noch größere Rolle in der therapeutischen Behandlung von Patienten mit CLL in der nahen Zukunft5spielen.
Dieser Bericht beschreibt alle Aspekte der IG gen Sequenzanalyse, angefangen bei der Wahl des geeigneten Materials und ihren Höhepunkt mit der klinischen Interpretation der Sequenzierung Ergebnisse. Gründliche Bewertung dieser Schritte ist wichtig in der diagnostischen Routine für die Herstellung von zuverlässige Ergebnisse und genaue Patienten Schichtung innerhalb von klinischen Studien zu gewährleisten. Protokolle werden bereitgestellt, um Hilfe bei der Harmonisierung der IG gen Sequenzanalyse, damit Ergebnisse unter verschiedenen Labors vergleichbar sind.
Protocol
Die Forschungs-Protokoll wurde von der Ethikkommission des San Raffaele wissenschaftliche Institute, Mailand, Italien genehmigt.
1. Material-Auswahl
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Wahl des Ausgangsmaterials
Hinweis: In den meisten Fällen der CLL ist die Zellzahl Tumor zum Zeitpunkt der Diagnose hoch (> 80-90 %). Deshalb Zellsortierung oder Bereicherung der leukämischen Zellen in der Regel nicht notwendig.- Peripherem Blut (PB), die am häufigsten verwendete Material der Wahl für IG gen Sequenzanalyse, verwenden eine Blutvolumen zwischen 10-20 mL.
- In Fällen mit einer niedrigen CLL Zelle Belastung, alternativ Zellsortierung PB Proben oder Material aus anderen Geweben, wie Knochenmark (BM) oder Lymphknoten (LN).
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Abtastzeit
- Abtastzeit ist nicht entscheidend, angesichts der Tatsache, dass der IG SHM Status stabil Überstunden; Das heißt, vermeiden Sie Probenahme zu bestimmten Zeiten, wie z. B. unmittelbar nach oder während der Therapie, da die geringe Anzahl der CLL-Zellen kann die Analyse zu erschweren und zu unzuverlässigen Ergebnissen führen.
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Materialsammlung und Lagerung
Hinweis: Erfassung und Speicherung von Ausgangsmaterial, hängt stark von der Wahl des Materials.- Verwenden Sie für PB oder BM Proben EDTA oder CPT (Citrat-Tris-Pyridossalphosphate) Röhrchen, um Hemmung der PCR-Amplifikation Prozess zu verhindern; Alternativ können Sie Heparin-Röhrchen.
- Für LN Proben sind Abholoptionen entweder Zellsuspensionen, Biopsien aus frisch gefrorenes Gewebe oder in seltenen Fällen Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe.
2. Gradient Dichtetrennung
Hinweis: Wenn PB oder BM das Ausgangsmaterial der Wahl, die häufigste Szenario ist, wird mononukleären Zellen isoliert mit Farbverlauf Dichtetrennung empfohlen.
- Fügen Sie 200 µL EDTA (0,5 M EDTA / pH 8.0) für eine 50 mL sterile Sammelröhrchen. 20 mL von PB und 15 mL RPMI hinzugeben. Mix von Pipettieren (2 - 3 Mal ist ausreichend).
- Eine neue Sammlung-Tube 50 mL 15 mL Dichte Gradienten Medium hinzufügen.
Hinweis: für den Fall, dass das PB-Volumen beträgt weniger als 20 mL, die Bände von RPMI (vorheriger Schritt) und Dichtegradient sollte entsprechend geändert werden. - Langsam in die Lösung von Schritt 2.1 Schicht, so dass es nicht, dass das Gefälle stört. Zentrifugieren Sie bei 800 X g für 20 Minuten mit der Zentrifuge Bremse aus.
- Sammeln des mononukleären Zellen-Rings, der zwischen der oberen Plasma/Thrombozyten und der Dichte gradient mittlere Schicht mit einer sterilen Pasteurpipette gebildet hat, dann übertragen auf eine sterile 15 mL Sammelröhrchen.
- Ein Endvolumen von 12 mL RPMI hinzufügen und mischen. Für 8 Minuten bei 750 X g zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.
- Aufschwemmen Sie die Zelle-Pellet mit 10 mL RPMI und wiederholen Sie Schritt 2.5.
- Auflösen der Zelle Pellet in 1 mL PBS (DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium). Durchführen einer Zellzahl mit einer Neubauer-Platte durch das Mischen von 20 µL Probe und 80 µL 01:10 Türk Lösung.
- Wenn downstream-Processing der Probe nicht für den gleichen Tag geplant ist, Zentrifugieren Sie die Probe bei 750 X g für 8 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und speichern Sie die Zelle Pellet bei-80o C.
(3) Nukleinsäure-Extraktion
- Auf einem Substrat für die Analyse von der SHM-Status der IG-Gene entscheiden. Genomischer DNA (gDNA) ist die beliebteste Wahl gibt es keine Notwendigkeit für einen Schritt der reversen Transkription; Alternativ sorgt die Verwendung von RNA/ergänzende DNA (cDNA), zumindest auf transkriptioneller Ebene produktiv, funktionelle Clonotypic IG Neuordnung "bevorzugte" Ziel.
- Verwenden Sie eine der zahlreichen im Handel erhältlichen Kits geeignet für gDNA oder Gesamt-RNA-Extraktion und die Synthese der cDNA (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Integrität der DNA oder RNA mit empfindlichen Nukleinsäure-Quantifizierung Systeme zu bewerten. Wenn mit FFPE-Material für die Analyse, bewerten die Qualität und Quantität der extrahierten gDNA/cDNA durch PCR-Amplifikation eines bekannten Zimmermädchen-Gens, z.B. Retinoic Säure Rezeptor Alpha (RARa), Beta-Actin, etc..
4. Verstärkung und die Abfolge der IGHV-IGHD-IGHJ-gen Rearrangements
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IGH PCR-Primer-Auswahl
- Führen Sie vorzugsweise, Multiplex-PCR mit IGHV Untergruppe spezifische 5' Grundierungen und IGHJ Gen 3' spezifische Primer25,26. Wenn die Ergebnisse nicht optimal sind, bereiten Sie separate PCR Mischungen mit einzelnen IGHV Untergruppe-spezifische Primer.
- Verwenden Sie 5' Primer, die entweder die Leader-Region befindet sich Tempern unmittelbar vor der IG-Umlagerung oder innerhalb der kodierenden Region des Gens IGHV (z. B. Rahmen 1, FR1).
- Verwendung Führer Zündkapseln, die für die Verstärkung des gesamten ermöglichen neu IGHV-IGHD-IGHJ gen-Sequenz, die wiederum die genaue Schätzung der SHM Ebenen ermöglichen. Daher sind IGHV Führer Primer von ERIC in ihren aktualisierten Richtlinien für IG gen-Sequenz-Analyse27empfohlen.
- Verwenden Sie in Fällen, wo Führer Primer Versagen die Clonotypic IG Neuordnung zu verstärken IGHV FR1 Primer. Rahmen Primer jedoch nicht die gesamte Clonotypic IG gen Neuordnung verstärken ungenaue Bestimmung des Niveaus der SHM führen. In diesem Szenario klar im klinischen Bericht, dass die Verwendung von Primern IGHV FR1 Prozent Identität an das nächstgelegene Keimbahn gen überschätzen kann.
- Verwenden Sie für das 3' Ende Konsens Primer für die IGHJ Gene, Multiplex-Sätze von IGHJ gen-spezifische Primer oder Isotype-spezifische Primer, je nach Substrat. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt, während Abbildung 1 die verschiedenen Standorte für Grundierung zu glühen zeigt.
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PCR-Amplifikation der IGHV-IGHD-IGHJ gen rearrangements
- Bereiten Sie die Grundierung-Mix mit äquimolaren Mengen an jede Untergruppe Zündkapseln, um unvoreingenommene Verstärkung zu gewährleisten.
- Beispielsweise werden bei der Verwendung von Führer Primer zwei verschiedene Grundierungen zur Umgestaltungen gehören zur Untergruppe IGHV1 verstärken. So verwenden Sie eine Menge von diesen 2 Primer (IGHV1L und IGHV1bL), die ist die Hälfte im Vergleich zu IGHV4L, die die einzige Grundierung für IGHV4 Untergruppe Umgestaltungen ist.
- Die umgekehrte Vorgehensweise bei der IGHJ1-2 und IGHJ4-5 Primer anwenden. Wie diese Primer zwei unterschiedliche IGHJ gen Untergruppen Ziel, doppelte Menge im Vergleich zu den IGHJ3 und IGHJ6 Primer.
- Verwenden Sie Tabelle 1 , um die genaue Grundierung Mengen zu bestimmen, wann entsprechende Grundierung Mischungen vorbereiten.
- Mix-PCR Reagenzien wie in Tabelle 2aufgeführt. Nach der Kombination der PCR-Reagenzien in einem PCR-Röhrchen, fügen Sie 0.5 µL Taq Polymerase und 100 ng gDNA oder 2 µL cDNA (cDNA sollten bereit sein, mit 1 µg RNA).
Hinweis: Ein Enzym Taq mit Korrekturlesen Tätigkeit ist nicht notwendig, da die Verstärkung Fehlerquote extrem niedrig ist und hat daher keine Auswirkungen auf das Niveau der SHM. - Führen Sie das thermische PCR-Protokoll detailliert in Tabelle 3.
- Bereiten Sie die Grundierung-Mix mit äquimolaren Mengen an jede Untergruppe Zündkapseln, um unvoreingenommene Verstärkung zu gewährleisten.
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Infektionsstaus Bewertung
Hinweis: Ein kritischer nächste Schritt umfasst die Auswertung der Infektionsstaus Muster des PCR Produktes. Infektionsstaus bei Patienten mit CLL zu beurteilen, ist der häufigste Befund eine einzelne, monoklonalen Peak/Band.- Verwenden Sie Methoden mit hoher Empfindlichkeit, wie Fragment oder Heteroduplex Analyse zur Infektionsstaus Bewertung28,29.
- Fragment-Analyse
- Multiplex-PCR mit 5'-Label IGHV Führer oder FR1 Untergruppe spezifische PCR Primer durchzuführen; Dies erbringt PCR-Produkte, die durch Kapillarelektrophorese getrennt werden können, damit bei schönem Infektionsstaus Einschätzung des IGH PCR Produkte basierend auf ihrer IGHV Komplementarität Bestimmung Region 3 (CDR3) Längen.
- Grundierungen, Reagenzien und thermischen Bedingungen identisch mit den zuvor genannten (siehe Tabellen 1-3) zu verwenden. Benutzerdefinierte 5´-mit der Bezeichnung Primer sind Eindringmittel Oligos mit einer Auswahl von Farbstoffen auf 5'-Ende beschriftet. Beispiele für Reporter Farbstoffe 6-FAM, HEX, NED oder TET. Somit sind 2 separate Reaktionen erforderlich basiert auf der Verwendung von 3 verschiedenen Farbstoffen pro Reaktion.
- Beurteilung die Größe der PCR-Produkte auf einem sechs Prozent (6 %)-Polyacrylamid-Gel (dieser Prozentsatz ergibt optimale Auflösung), 1 X TBE als laufende Puffer. Führen Sie bei 80 V für 45 Minuten.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass PCR-Produkte dürfen auf dem Gel ausreichend Zeit zu migrieren, so dass monoklonale Proben aus dem polyklonalen Hintergrund getrennt werden können und die DNA Größe Marker kann ausreichend trennen. Faktoren wie der Größe und Dicke des Gels können Migration beeinflussen also keine einzige Einstellung (Spannung und Zeit) garantieren ein optimales Ergebnis, das Einstellen der Spannung bei 80 V 45 Minuten lang ein guter Ausgangspunkt ist, wie es minimiert das Risiko der Migration zu Probe sagte, schnell und "läuft" deaktiviert das Gel. - Suchen Sie nach PCR-Produkte von rund 500 Basenpaaren Verwendung IGHV Führer Grundierungen und 350 Basenpaaren, wenn IGHV FR1 Grundierung Mischungen zu verwenden.
Hinweis: In seltenen Fällen CLL Fällen wurden gefunden, Doppel, monoklonalen Produkte tragen und in noch selteneren Fällen Fällen können eine Oligoclonal Muster aufweisen. Intercalating Vermittler wie Interkalation Bromid (EtBr) oder weniger gefährliche und empfindlicher im Handel erhältlichen DNA Flecken einsetzbar für die Visualisierung der DNA auf Acrylamid Gele mit UV-Anregung oder blaues Licht.
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PCR-Produkt-Reinigung
Hinweis: PCR-Produkte werden gereinigt, um jedem polyklonale Hintergrund aus normalen B-Zellen innerhalb der CLL Probe sowie Grundierung Dimere, die zu suboptimalen Sequenzierung zu entfernen. Verwenden Sie jede Methode, die nicht rechtsfähige dNTPs und Primer für PCR-Bereinigung, wie z. B. Sap (Shrimp alkalische Phosphatase) eine enzymatische Behandlung entfernt / Exo (Exonuclease ich), oder spaltenbasierten Reinigung.- Laden Sie das Gesamtvolumen des PCR-Produkts auf eine 3 % niedrig schmelzende Agarose-Gel.
- Lassen Sie die PCR-Produkte auf dem Gel laufen lassen, bis sie vom Hintergrund zu trennen.
- Die scharfen, prominente PCR-Bands Verbrauchsteuern, reinigen und eluieren. Wenn zwei Umstellungen erkannt werden, beide Bands sollten herausgeschnitten werden und separat sequenziert.
- Um Sap/Exo-Bereinigung durchzuführen, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers bezüglich der spezifischen Volumen zu verwenden; enthalten jedoch eine typische Reaktion auf 1 µL Sap, 0. 5 µL Exo und 2 µL 5 X Inkubation Puffer pro 5-10 µL PCR-Reaktion. Jede Probe durch sanft aufschütteln mischen und 30 Minuten auf einen PCR-Block bei 37 ° C inkubieren. Deaktivieren Sie die Enzyme durch Erhitzen auf 85 ° C für 15 Minuten.
- Laden Sie eine kleine Menge der PCR-Produkte auf einem 3 % Agarosegel auf die Reinheit des Produktes zu beurteilen.
(5) Sanger-Sequenzierung
Hinweis: Mehrere Sequenzierung, die Strategien existieren, jedoch unabhängig von der genauen Ansatz, direkte Sequenzierung von beiden Strängen ist zwingend erforderlich, um ein zuverlässiges Ergebnis zu gewährleisten.
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Allgemeine Sequenzierung Protokolle
- Wenn Verstärkung mit einzelnen Primern durchgeführt wurde, fahren Sie durch Sequenzierung mit dem entsprechenden IGHV und IGHJ oder konstanten Region-spezifische Primer. Dieser Ansatz kann auch angenommen werden, wenn gemultiplext Eindringmittel beschrifteten Primer verwendet wurden und das PCR-Produkt Fragment Analyse anhand wurde (Sequenzierung Primer sollten nicht beschriftet).
- Wenn Multiplex Primer verwendet wurden und Infektionsstaus auf einem Gel wurden, verwenden Sie dann eine nachgeschaltete Grundierung beim ersten Schritt der Sequenzierung z. B. einen Konsens IGHJ Grundierung mit der Sequenz 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 ". Alternativ kann eine CH-Grundierung verwendet werden, wenn cDNA als Substrat verwendet wurde. Als Nächstes verwenden Sie teilkonzernspezifische IGHV Führer oder FR1 Primer für den zweiten Schritt der Sequenzierung.
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Beispiel-Sequenzierung-Protokoll
Hinweis: Mehrere Sequenzierung Protokolle vorhanden sein und eine Beispiel-Protokoll ist unten.- Verdünnen Sie 33 ng des PCR-Produktes in einem Gesamtvolumen von 11,5 µL verwenden, z. B. sterilem Wasser. Denaturieren Sie das PCR-Produkt durch Erhitzen auf 95 ° C für 5 Minuten. Legen Sie sofort auf Eis für 10 Minuten zur Bildung von Sekundärstrukturen zu verhindern.
- Jedes Rohr zusammen mit 0,5 µL (entsprechend 5 Pmol) des Primers fügen Sie 8 µL des master-Mix hinzu.
- Als Kontrolle bereiten Sie ein Röhrchen mit 8 µL des master-Mix, 0,5 µL pUC18 Steuerelementvorlage, 2 µL (-) 47 Sequenzierung Grundierung und 9,5 µL sterilem Wasser. Das endgültige Gesamtvolumen in jedem Röhrchen sollte 20 µL.
- Verwenden Sie Radsport Temperaturbedingungen für die Sequenzierung Reaktion, wie in Tabelle 4.
- Vorbereiten der Stopplösung durch das Mischen von 2 µL Natriumacetat 3M (pH 5,2), 2 µL EDTA 100 Mm (pH 8,0) und 1 µL von Glykogen (Konzentration 20 mg/mL), fügen Sie 5 µL zu jeder Probe. Übertragen Sie das Produkt auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Fügen Sie 60 µL 100 % Ethanol (-20 ° C) und mischen Sie vorsichtig. Für 15 Minuten (4 ° C) bei 14.000 u/min zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.
- 100 µL 70 % Ethanol (-20 ° C) hinzufügen und vorsichtig mischen. Für 10 Minuten (4 ° C) bei 14.000 u/min zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand. Einmal wiederholen.
- Trocknen Sie das Pellet für 90 Minuten bei Zimmertemperatur. Fügen Sie 40 µL Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung für jede Probe hinzu.
- Übertragen Sie die Probe auf eine Sequenzierung Teller, Deckel mit Streifen Kappen oder Band Dichtungen, auf den Computer laden und führen Sanger Sequenzierung. Die Sequenzierung Platte ist in der Regel eine 96-Well, V-Boden, voll-Rock PCR Platte kompatibel mit dem Sequencer. Die Platten können Barcodes je nachdem, ob die Sequenzierung im eigenen Haus durchgeführt werden, bei einem gewerblichen Unternehmen oder an eine akademische Sequencing Center/Plattform sein.
- Nach der Sequenzierung, "aufeinandersteppen Sie" der 2 liest aus die einzelnen Sequenzierung Schritte bilden eine komplette IGHV gen Neuordnung d. h. die Konsensussequenz generiert.
6. Sequenz-Analyse
Hinweis: Die folgenden Abschnitte Fokussierung auf die Ausgabe von IMGT/V-QUEST Werkzeug30 erhalten, bei der Analyse neu geordnet, IG-Sequenzen und IMGT/JunctionAnalysis31, beide sind besonders relevant für klinische Berichterstattung und Forschung Studien. IMGT/V-QUEST ist ein Alignment-Tool, das Benutzer vergleicht IG Sequenzen mit dem IMGT Referenz Verzeichnis legt30vorgelegt. Die Toolausgabe enthält mehrere Abschnitte, in denen der Benutzer bestimmte Parameter definieren kann.
- Die Arten, z. B. Homo Sapiens (Mensch), und Rezeptor Typ oder Locus (z.B. Nabenschaltungen, IGK oder IGL) angeben.
- Fügen Sie Sequenzen im FASTA-Format und einschließlich Header, in den Textbereich (in Chargen von bis zu 50 Sequenzen pro Durchlauf) analysiert werden. Alternativ ist eine Option, geben den Pfad zu einer lokalen Datei, enthält die FASTA-Sequenzen zur Verfügung.
- Wählen Sie eines der folgenden 3 Anzeigeoptionen für die Ergebnisse:
- Detailansicht: Wählen Sie diese Option, um die Ergebnisse für jede Sequenz einzeln zu bekommen.
- Synthese-Ansicht: Wählen Sie diese Option, um eine zusammenfassende Tabelle sortiert nach IGHV gen und Allel Namen oder Reihenfolge der Eingabe zu kompilieren. Diese Option bietet auch eine Angleichung der Sequenzen, die in jedem eingereichten Batch den gleichen IGHV gen und Allel zugeordnet sind.
- Excel-Datei: Wählen Sie diese Option, bieten alle Ausgabe-Dateien als Tabellen in einer einzigen Datei integriert. Alle Anzeige-Optionen haben eine große Auswahl an grundlegenden und erweiterten Parameter zur Auswahl, aber nur die am meisten für CLL IG Sequenzanalyse relevanten Faktoren werden unten im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse" diskutiert.
(7) Festnahme/AssignSubsets-Tool
- Um BcR IG Stereotypen innerhalb CLL (zusätzliche Angaben weiter unten im Abschnitt "Vertreter führt") zu untersuchen, reichen Sie IGHV-IGHD-IGHJ FASTA Sequenzen der Verhaftung/AssignSubsets Tool32. Das Tool meldet, dass die Zuordnung zu großen CLL Teilmengen Stereotyp. Die Teilmenge-Zuordnung-Tool zusammen mit detaillierten Anweisungen sind auf die Verhaftung/AssignSubset Website-32 und auch auf der Website von ERIC unter der Registerkarte "Dienste".
Representative Results
Nachstehende Beispiele zeigen Ergebnisse aus IG Gen Sequenzierung Analyse folgt die Schritten oben erläutert. Zwar DNA und/oder RNA-Extraktion Routineverfahren für die meisten klinischen/Forschungslabors, wird ein erster entscheidender Schritt überprüft die Qualität/Quantität der gDNA und/oder RNA mit einem Spektralphotometer oder andere geeignete Technologie mit hoher Empfindlichkeit. Der nächste entscheidende Schritt beinhaltet PCR Verstärkung von Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen-Umlagerung. Wie oben erwähnt, ermöglicht nur die Nutzung der IGHV Führer Primer Verstärkung der vollen Länge der neu IGHV Gensequenz, so dass die wahre SHM Last bestimmt werden; IGHV Führer Primer sind daher die empfohlene Grundierung Wahl (Abbildung 2). In seltenen Fällen, wo IGHV Führer Primer können nicht Clonotypic IG Neuordnung zu verstärken, können IGHV FR1 Primer verwendet werden. Wie in Abbildung 3kann mehrere PCR Produkte/Bands beobachtet werden, vor allem, wenn gDNA Ausgangsmaterial; Diese Bänder sollten herausgeschnitten werden und separat sequenziert. Wenn IGHV Führer und IGHV FR1 Primer nicht zu Ergebnissen führen, sollte die Analyse mit einer neuen Patientenprobe (wenn möglich) wiederholt werden. Der letzte Kontrollpunkt vor der Sequenzierung ermittelt die Infektionsstaus der Probe Fragment Analyse (Abbildung 4).
Sequenzen erhalten sollte mit der IMGT/V-QUEST Werkzeug30analysiert werden. Vom Benutzer ausgewählte Parameter gehören Arten, Rezeptor Typ oder Locus, einfügen und löschen Option, etc. suchen und werden zusammen mit der Anzahl der Sequenzen analysiert aufgeführt. Jede FASTA-Sequenz wird angezeigt und die V-Domäne von IMGT/V-QUEST analysiert wird grün hervorgehoben. Darüber hinaus Wenn die Eingabesequenz in der entgegengesetzten Richtung (Antisense) war, das Programm automatisch bietet ergänzende umgekehrten Reihenfolge und sagt dies über die FASTA-Sequenz.
Das Ergebnis gestellten Übersichtstabelle direkt unterhalb der FASTA-Sequenz, an der Spitze der "Detailansicht" Seite, und enthält Informationen, die wichtig für die klinische Berichterstattung über IG gen Sequenzanalyse in CLL. Jede Zeile dieser Tabelle wird im folgenden erläutert.
Ergebnisübersicht. Die erste Zeile in der Ergebnistabelle stellt die Funktionalität der Eingabesequenz: eine IG neu geordnet-Sequenz kann produktiv oder unproduktiv sein (Abbildung 5A & 5 b). Ein IG-gen-Umlagerung ist unproduktiv, wenn Stop Codons innerhalb der V-D-J-REGION (VH) oder innerhalb der V-J-REGION (VL) vorhanden sind bzw. wenn die Umlagerung ist Out-of-Frame durch Einfügungen/Löschungen. Eine dritte Ausgabe wird bereitgestellt, wenn die Funktionalität nicht bestimmt werden kann, d. h. wenn die IGHV-IGHD-IGHJ-Kreuzung nicht identifiziert werden konnten; in diesem Fall würde die Ergebnisübersicht als "Keine Umlagerung gefunden" oder "Keine Junction gefunden" lesen. Es ist wichtig zu beachten, dass nur produktiv und funktionelle Umstellungen sollten so weiter analysiert werden. Wenn die Sohle IG Umlagerung verstärkt ist nicht funktionsfähig (unproduktive oder "keine Umlagerung gefunden"), der PCR Verstärkung Prozess wiederholt werden sollte. Wenn das Ergebnis negativ bleibt, sollte eine neue Patientenprobe eingeholt werden.
V-gen und Allel. Die "V-gen und Allel" Zeile gibt die nächste Keimbahn IGHV gen und Allel mit seiner Ausrichtung und die prozentuale Identität. Wenn mehrere Gene und Allele die gleiche hohe Punktzahl geben, werden alle aufgelistet. Die prozentuale Identität zwischen der eingereichten Sequenz und die nächste IGHV gen und Allel ist von besonderer Bedeutung, da sie den SHM-Status bestimmt. Dieser Wert errechnet sich aus der ersten Nukleotid der V-REGION bis zum 3' Ende der V-REGION mit Ausnahme der CDR3. IGHV FR1 Primer verwendet, sollte die Reihenfolge entsprechend des Primers immer entfernt werden, um so genau ein Ergebnis wie möglich zu gewährleisten. Ist anzumerken, dass prozentual geringer Identität (< 85 %) kann resultieren aus einer einfügen oder löschen (diskutiert weiter unten) und sollte dies der Fall sein ein "Warnhinweis" erscheint in der "Zusammenfassung"-Reihe, den Benutzer zu warnen.
J-gen und Allel. Wie für die V-gen und Allel oben beschrieben, gibt die "J-gen und Allel" Zeile die nächste Keimbahn IGHJ gen und Allel mit seiner Ausrichtung und die prozentuale Identität. Jedoch sind wie das IGHJ-gen ziemlich kurz ist und das 5'-Ende durch Exonuclease Tätigkeit zugeschnitten werden können kann, Alternativen auch durch das Tool, basierend auf der höchsten Anzahl von aufeinander folgenden identischen Nukleotide durchsucht.
D-gen und Allel von IMGT/JunctionAnalysis. Hatte-gen und Allel von IMGT/JunctionAnalysis zeigt die nächste Keimbahn IGHD gen und Allel mit dem D-REGION Leseraster durch das Werkzeug in der Benutzer-Sequenz identifiziert. IMGT/JunctionAnalysis31 bietet eine detaillierte und genaue Analyse der Kreuzung und wurde in die IMGT/V-QUEST-Werkzeug-Schnittstelle integriert. Dieses Tool verwaltet alle Aspekte der Schwierigkeit verbunden, IGHD gen und Allel Identifizierung z. B. (i) die kurze Länge der D-REGION; (Ii) Verwendung von 2 oder sogar 3 Frames zu lesen; (Iii) Exonuclease trimmen an beiden Enden des Gens; und (iv) das Vorhandensein von Mutationen.
FR-IMGT Längen, CDR-IMGT Längen und AA JUNCTION. Diese Zeile enthält die Länge der IGHV FRs und CDRs in Klammern dargestellt und getrennt durch Punkte und der Aminosäure (AA)-Kreuzung. Die AA-Sequenz von der Kreuzung illustriert (i) eine Neuordnung in - oder Out-of-Frame (Out-of-Frame-Positionen sind gekennzeichnet durch das Zeichen "#"), (Ii) das Vorhandensein oder Fehlen des Stop-Codons (ein Stopcodon wird durch ein Sternchen angezeigt "*"), und (Iii) das Vorhandensein oder Fehlen von der Anker der VH CDR3-IMGT: C (2.-CYS 104) und W (J-TRP-118).
Somatische Hypermutations bestehen überwiegend aus Einzel-Nukleotid-Änderungen, jedoch kleine Einfügungen und Löschungen in der V-Region beobachtet werden, wenn auch mit einer viel niedrigeren Frequenz33. Wenn mit den Standardparametern IMGT/V-QUEST, Einfügungen und Löschungen werden nicht automatisch erkannt; jedoch deutet darauf hin, dass eine Folge solcher Veränderungen, d. h. eine niedrige Prozent Identität und/oder IGHV CDR1-IMGT und CDR2-IMGT Längen zwischen der eingereichten Benutzer-Sequenz und die nächsten Keimbahn-gen und Allel tragen kann erkannt werden, durch die Werkzeug und eine Warnung erscheint unterhalb der Ergebnistabelle Zusammenfassung (Abbildung 5).
IMGT bietet eine Option namens 'Suche nach Einfügungen und Löschungen' im Abschnitt 'Erweiterte Parameter' befindet sich unter dem Abschnitt "Ergebnisse anzeigen". In Fällen, in denen relevante Warnungen erscheinen, ist es ratsam, diese Funktionalität zu verwenden. Bei Einfügungen und Löschungen erkannt werden, sind umfassende Details der Feststellung vorausgesetzt, im Abschnitt "Ergebnis-Zusammenfassung" einschließlich (i) wo das Einfügen oder löschen befindet sich z. B. VH FR-IMGT oder CDR-IMGT; (Ii) die Anzahl der Nukleotide eingefügt bzw. gelöscht; (Iii) die Sequenz (nur für Einfügungen); (iv) ob ein Frameshift eingetreten ist; (V) die V-REGION-Codon, aus dem das Einfügen oder löschen beginnt; und (vi) die betroffenen Nukleotid-Position in den eingereichten Sequenz (Abbildung 5). Für Einfügungen das Tool entfernt die Insertion(s) aus den eingereichten Benutzer Sequenz und dann wieder die Sequenz mit den standard IMGT/V-QUEST-Parametern analysiert. Wenn Löschungen erkannt werden, fügt das Tool Lücken, vertreten durch Punkte, die gelöschten Nukleotide vor der Wiederholung der Analysis zu ersetzen.
Wie bei jedem diagnostische oder prognostische Test durchgeführt in klinischen Labors sind strenge Standards und ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit von größter Bedeutung. IMGT/V-QUEST-Ausgang liefert einen Großteil der notwendigen Informationen für die Berichterstattung über die Ergebnisse der IG gen Sequenzanalyse in CLL, d. h. (i) der IGHV, IGHD und IGHJ-gen und Allele genutzt; (Ii) die Funktionalität des Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung d. h., ob die Umlagerung ist produktiv oder unproduktiv; und (Iii) die prozentuale Identität der neu IGHV gen und Allel im Vergleich zu seinen engsten Keimbahn IGHV gen und Allel. Für umfassende Angaben über die klinische Berichterstattung der IG-Gene in CLL, Interpretation der problematischen oder technisch anspruchsvolle Fälle und Empfehlungen für die präzise und robuste Bestimmung des IGHV gen SHM Status in CLL richtet sich der Leser bis vor kurzem aktualisiert ERIC Richtlinien und Berichte27,34.
Zu guter Letzt aufgrund unserer wachsenden Wissen über BcR IG Stereotypen in CLL, zusätzliche empfohlene Voraussetzung für die klinische Berichterstattung über IG gen Rearrangements in CLL bezieht sich auf die Zuweisung der Rechtssachen an Major Stereotyp Teilmengen. Jetzt wird Zustand im klinischen Bericht empfohlen ob die analysierten produktive IGHV gen-Umlagerung zu einem der wichtigsten Stereotypen Teilmengen, nämlich Teilmengen #1, #2, #4 und #812,27zugeordnet werden kann. Zuordnung zu großen CLL Stereotyp Teilmengen sollte mit dem Einsatz der Verhaftung/AssignSubsets-Tool (Abbildung 6)32durchgeführt werden.
| 5' IGHV FR1 Primer | Primer Sequenz | Menge für 60 μL der Grundierung Mischung | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| 5' IGHV Führer Primer | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) AC | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3' IGHJ Primer | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
Tabelle 1. Primer-Sequenzen und Mengen für die PCR-Amplifikation des Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen-Umlagerung.
| Reagenz | Volumen (μL) |
| RB x 10 Puffer | 5 |
| MgCl2 (50 mM) | 3 |
| dNTPs (10 mΜ) | 2 |
| Grundierung IGHV Führer/FR1 Mischung (10 μM) | 3 |
| Primer-IGHJ-Mix (10 μM) | 3 |
| H2O | 31.5 |
| Gesamtvolumen | 47,5 |
Tabelle 2. Reagenzien für die PCR-Amplifikation des Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen-Umlagerung.
| Temperatur | Dauer | Zykluszahl | Beschreibung |
| 94 ° C | 5 Minuten | 1 | Polymerase-Aktivierung |
| 94 ° C | 1 minute | 39 | Denaturierung |
| 59 ° C | 1 minute | Glühen | |
| 72 ° C | 1,5 Minuten | Erweiterung | |
| 72 ° C | 10 Minuten | 1 | letzte Erweiterung |
| 18 ° C | ∞ | 1 | Erhaltung |
Tabelle 3. Radsport Temperaturbedingungen für die PCR-Amplifikation des Clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ-gen-Umlagerung.
| Temperatur | Dauer | Zykluszahl | Beschreibung |
| 94 ° C | 5 Minuten | 1 | Polymerase-Aktivierung |
| 96 ° C | 20 Sekunden | 30 | Denaturierung |
| 50 ° C | 20 Sekunden | Glühen | |
| 60 ° C | 4 Minuten | Erweiterung | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | Erhaltung |
Tabelle 4. Radsport Temperaturbedingungen für die IG Gen Sequenzierung Reaktion.
Abbildung 1: Schematische Darstellung einer IGHV-IGHD-IGHJ gen-Umlagerung mit verschiedenen Primer Glühen Standorte angegeben. 5' IGHV Zündkapseln Tempern, die Leader-Sequenz, die oberhalb der IGHV kodierende Sequenz befindet. 5' IGHV Rahmen (FR) Zündkapseln Tempern bis zum Beginn der FR1 Region, die im neu IGHV gen befindet, während die IGHJ Primer 3' bis zum Ende des neu IGHJ Gens Tempern. UTR: unübersetzte Region. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: PCR-Amplifikation der IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung in 7 Patientenproben mit 5' IGHV Führer Primer. Die achte Spur stellt eine Positivkontrolle während die negative Kontrolle für die PCR in der neunten Spur geladen wurde. Das erwartete PCR-Produkt ist ca. 500 Basenpaare in der Größe, wenn IGHV Führer Primer verwenden. Das Sternchen in der letzten Spalte des Gels zeigt die 100 bp DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. PCR-Amplifikation der IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung in 13 Patientenproben unter Verwendung IGHV FR1 Zündkapseln. Die vierzehnte Spur enthält die positive Kontrolle während die negative Kontrolle in der fünfzehnten Spur geladen wurde. Wie in Bahn 2, wofür DNA das Ausgangsmaterial war sind verschiedenen PCR-Bands beobachtet, die sollten herausgeschnitten werden und separat sequenziert. Proben in Bahnen 5, 7 und 13 polyklonale Ergebnisse (belegt durch den Abstrich im Gel) erbracht, und somit der PCR Schritt wiederholt werden sollte. Unterlässt eine zweite PCR neu IG verstärken DNA Analyse durchgeführt werden auf eine neue Probe (wenn möglich) oder mit verschiedenen Primer einstellen. Das erwartete PCR-Produkt ist ca. 350 Basenpaare in der Größe, wenn IGHV FR1 Grundierung Mischungen zu verwenden. Das Sternchen in der letzten Spalte des Gels zeigt die 100 bp DNA-Leiter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Bewertung von Infektionsstaus mit Hilfe der Genescan Analyse. Genescan Endes geben monoklonalen PCR-Produkte Anlass zu einem dominanten Spitzenwert von fluoreszierenden Produkte gleicher Größe (obere Leiste), während polyklonale PCR-Produkte in einer mehr Normalverteilung der Produktgrößen (untere Leiste) führen. Die roten Spuren sind Spitzen von einer Fluoreszent-markierten DNA-Leiter, die in der gleichen Kapillare Injektion wie die analysierte Probe geladen wird. Die Größe standard Fragmente unterliegen der gleichen elektrophoretischen Kraft wie die Probe und daher den gleichen Injektion Bedingungen ausgesetzt sind. Die gleichmäßige Abstände der Größe standard Fragmente bestätigt präzise Größe Berufung. Die blauen Spuren repräsentieren die monoklonale (Oberseite) oder polyklonalen (Bodenplatte) Natur der Proben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Beispiele für die Ergebnistabellen Zusammenfassung von IMGT/V-QUEST zur Verfügung gestellt. (A) Ergebnis zusammenfassende Tabelle für eine produktive IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung (keine Stop-Codon(s) und ein in-Frame-Sequenz-Kreuzung). Das V-gen und Allel und die J-gen und Allel von IMGT/V-QUEST in der Benutzer-Sequenz identifiziert sind in diesem Fall IGHV4 - 34 * 01 und IGHJ6 * 02 (aufgrund der höchsten Ausrichtung Score Auswertung). Die prozentuale Identität ist 99,65 % aufgrund einer einzigen somatische Mutation. Das D-gen und Allel identifiziert durch IMGT/JunctionAnalysis ist der IGHD3 - 3 * 01 in Frame 1 lesen. Die Längen der 4 Rahmen-Regionen (FRs) sowie die 3 Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) sind in Klammern angegeben. Die Aminosäuresequenz (AA) der IGHV-D-J-Kreuzung ist ebenfalls vorhanden. In diesem Beispiel die Kreuzung umfasste 22 AAs. (B) Ergebnis zusammenfassende Tabelle für eine IGHV-IGHD-IGHJ-Umlagerung Gensequenz, die aufgrund einer Out-of-Frame-Kreuzung unproduktiv ist. Ein X für die CDR3-IMGT Länge bedeutet, dass für diese Sequenz die Länge nicht ermittelt werden konnte. Die '#' Zeichen beobachtet in der AA-Junction-Sequenz stehen eine Frameshift. (C) Ergebnis zusammenfassende Tabelle Warnung vor niedrigen V-REGION Identität (60.94 %) und darauf hinweist, dass die "Einfügungen und Löschungen" Option im Abschnitt "Erweiterte Parameter" verwendet werden soll. (D) Ergebnis zusammenfassende Tabelle für den Fall mit Keimbahn geringe prozentuale Identität in (C) nach Wiederholung der Sequenz-Analysis mit der Option "Suche nach Einfügungen und Löschungen" dargestellt. Die richtige Identität Prozent wird in Klammern angezeigt und wird unter Berücksichtigung der Insertion als ein Einzelereignis mutagenen berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Teilmenge Bericht Zuordnungstabelle von der Verhaftung/AssignSubsets-Tool generiert. Die Verhaftung/AssignSubsets Werkzeug FASTA IG Sequenzen von 10 Patienten mit CLL (A1-A10) abgegeben. Fall A4 wurde beauftragt, CLL Stereotyp Teilmenge #2 (Patienten in dieser Gruppe sind bekannt, haben eine schlechte Prognose unabhängig von SHM Last) mit hohem Vertrauen. Sieben Fälle/Sequenzen wurden keine große Stereotype Teilmenge zugeordnet und daher als nicht zugewiesene eingestuft. Zwei der eingereichten Sequenzen (A7 und A8) nicht für Teilmenge Zuordnung verwendet werden konnten und wurden stattdessen als übersprungen/ungesund aufgrund von Problemen mit der Reihenfolge, d. h. durch eine Out-of-Frame-Kreuzung oder das Vorhandensein von Stop-Codons eingestuft. Eine umfassende Erklärung die Tabellenüberschriften und das Werkzeug ist bei der Verhaftung/AssignSubsets Website32verfügbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die Studie der IG-Gene in CLL wurde entscheidend, nicht nur für die Bereitstellung ein besseres Verständnis in Krankheit Pathobiologie, sondern auch zur Verbesserung der Patienten Risikostratifizierung. Es ist daher sehr wichtig, dass das mehrstufige Verfahren der IG gen Sequenzanalyse und anschließende Interpretation der Sequenzdaten in einer standardisierten Weise durchgeführt werden. Die Verfügbarkeit von geeigneten und ausreichenden Patientenmaterial und der Zeitpunkt der Probenahme sollte keinen Einfluss auf die Fähigkeit, IG Genanalyse Mutationen auszuführen, da der Test auf PB und auf jede Probe mit einer hohen CLL Tumor Zellzahl durchgeführt werden kann. Die Trennung von mononukleären Blutzellen mit Farbverlauf Trennmethoden in diagnostischen Labors routinemäßig durchgeführt wird, und wie immer Vorsicht geboten, wenn Sie das Rohr mit dem Gefälle der Blut/RPMI-Lösung hinzufügen; Diese Aufgabe sollte in einer langsamen, sanften Weise, um nicht zu stören den Farbverlauf und verhindern den Verlust von Zellen durchgeführt werden.
Nach Zellseparation Nukleinsäuren extrahiert werden. Beide gDNA und cDNA eignen sich für SHM-Analyse der Clonotypic IGH Umlagerung, allerdings gibt es vor- und Nachteile für die Verwendung von entweder Material. Die Labor-Workflow geht schneller wenn Sie gDNA verwenden, da kein reverse Transkription muss vor der PCR-Amplifikation durchgeführt werden. Das heißt, mit gDNA wie das Substrat für die PCR Verstärkung der produktiven und unproduktiven Umstellungen führen kann, die wiederum zusätzliche praktische Laborarbeit, d. h. Reinigung oder Gel Exzision mehrerer PCR-Produkte führen können und individuellen Abfolge der alle Umstellungen. Vergleicht man die gDNA und cDNA Ansätze, muss für Letzteres ein reverse Transkription Schritt werden bevor Sie fortfahren mit PCR Verstärkung durchgeführt. Aber in diesem Fall in den meisten Fällen werden nur produktive IG Rearrangements verstärkt und anschließend sequenziert. So wird nur ein einzelnes PCR-Produkt gereinigt und sequenziert, während Ergebnisse Interpretation einfacher ist.
Die Effizienz der Verstärkung hängt weitgehend von der Qualität der gDNA/cDNA, die bewertet werden sollen, mit einem sensiblen Quantifizierungsmethode und die Primer eingesetzt. Die Primer verwendet sind entscheidend für das gesamte analytische Verfahren, da die genaue Bestimmung der SHM Ebene nur erreicht werden kann, durch die die gesamte Sequenz des Gens neu IGHV Verstärkung. Eine Full-length-Umlagerung kann nur beurteilt werden, wenn 5' IGHV Führer Zündkapseln benutzt werden, damit rechtfertigen die jüngsten Empfehlungen von ERIC für die Nutzung der Führer Primer27. Die Verwendung von alternativen Primer, führt zu der Verstärkung der unvollständigen IGHV-IGHD-IGHJ gen Umgestaltungen, eignet sich nicht für IGHV Genanalyse Mutationen und daher dringend abgeraten. Die alleinige Ausnahme bezieht sich auf Fälle, die wiederholt negativen Ergebnissen führen, wenn IGHV Führer Primer verwendet werden und Analyse der neuen Patientenmaterial ist entweder nicht möglich oder auch gar nicht zu Ergebnissen. Wenn verschiedene Patientenproben und/oder Materialeinsatz (gDNA/cDNA) und verschiedenen Primer noch scheitern, ein PCR-Produkt produzieren festlegt, mögliche Gründe könnte sein, dass die Tumorlast Zelle zu niedrig ist oder die Lymphozytose nicht aufgrund eines CLL-Klons ist (in diesem Fall die Immunophenotype sollte neu bewertet werden). Primer für die Analyse verwendet sollte immer in der klinischen Bericht angegeben werden.
Wie CLL aus der Ansammlung von monoklonalen B-Zellen mit der gleichen IGHV-IGHD-IGHJ gen-Umlagerung ergibt, wird für die überwiegende Mehrheit der Fälle Infektionsstaus Bewertung eine einzigartigen monoklonale Spitze, d. h. einen einzigen Klon offenbaren. In seltenen Fällen können doppelte Umgestaltungen oder sogar Oligoclonal Muster35beobachtet werden. In solchen Fällen Gelelektrophorese ist nicht das bevorzugte Verfahren für Infektionsstaus Beurteilung und empfindlichere Methoden wie Fragment Analyse angewandt werden. Sobald Infektionsstaus bestätigt wurde, bezieht sich der letzte Schritt vor der Sequenzierung auf die Reinigung des PCR-Produktes zu gewährleisten, dass die Sequenzen von hoher Qualität gewonnen werden. Schließlich ist das IMGT/V-QUEST-Werkzeug die Ressource für IG Sequenzanalyse von ERIC empfohlen. IMGT Datenbanken werden ständig aktualisiert und Berichten über Ergebnisse konsistent und gut kommentierte, dieses Tool sorgt für standardisierte Analyse und vergleichende Analyse zu verschiedenen klinischen oder wissenschaftlichen Einrichtungen erleichtert.
Als immungenetischen Analyse in CLL hat prognostische und prädiktive Implikationen, robuste Analyse der IGHV-IGHD-IGHJ gen Neuordnung inklusive der Zuordnung zum großen CLL Stereotyp Teilmengen ist insbesondere nicht mehr nur wünschenswert, sondern von zentraler Bedeutung. Dies zeigt sich insbesondere im Zeitalter der neuer Therapeutika und das Potenzial, die IG Genanalyse Behandlung Entscheidungen5,21,22,23,36,37 führen ,38, als offiziell von der jüngsten Aktualisierung der Leitlinien NCI-gesponsert von der International Workshop on CLL24angegeben. Dass gesagt, strenge Normen gerechtfertigt sind, zumal Festlegung des Status von der Clonotypic SHM IGHV Gens bei Patienten mit CLL umgestaltet, ist nicht trivial und beinhaltet einen mehrstufigen Prozess. Wichtig ist, bestimmte experimentelle Schritte eingehalten werden vor allem die Wahl der Primer, Ausbeute bessere Ergebnisse, wenn bestimmte Optionen und/oder nähert sich, andere technische Aspekte sind geeignet, um ein gewisses Maß an Flexibilität, wie Materialauswahl oder die Methode für die Beurteilung der Infektionsstaus, da sie zu feine Unterschiede, ob und gegebenenfalls in Bezug auf die endgültigen Ergebnisse führen.
Im letzten Jahrzehnt hat ERIC versucht, die Standardisierung und Harmonisierung der verschiedenen Methoden zur CLL Diagnose und Prognose zu fördern. Dies spiegelt sich in den veröffentlichten Empfehlungen und Leitlinien für immungenetischen Analyse27,34, zahlreiche organisierte pädagogische Workshops und Veranstaltungen, die Einrichtung von einem IG-Netzwerk sowie ein Online-Expertenforum zu diskutieren und Hilfestellung für IG gen-Sequenz Auslegung im CLL. Das übergeordnete Ziel von ERIC durch diese Aktionen ist es, optimale Behandlung und Versorgung der Patienten zu fördern. Trotz intensiver Bemühungen diese Aufgabe ist bei weitem nicht vollständig und in der Tat komplexer aufgrund der Entwicklung der neuartigen Hochdurchsatz-Sequenzierung zur Profilerstellung immun geworden. Dennoch, obwohl Herausforderungen bleiben bestehen, intensive Bemühungen für die robuste Standardisierung der IG Genanalyse in CLL weiter und stehen derzeit im Mittelpunkt der laufenden Aktivitäten innerhalb von ERIC.
Disclosures
Die Autoren haben keine relevante Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir danken gegenwärtigen und ehemaligen Mitgliedern der unsere Forschungsgruppen, die IgCLL Gruppe und ERIC, für ihr Engagement und ihre Begeisterung an einem Studium Immungenetik in CLL. Wir möchten auch die vertrauensvolle Zusammenarbeit aller Mitglieder der Initiative IMGT/CLL-DB und vor allem Professor Marie-Paule Lefranc und Dr. Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moléculaire, LIGM, Universite anerkennen Montpellier II, Montpellier, Frankreich, und IMGT, das internationale Immungenetik Informationssystem für ihre enorme Unterstützung und helfen bei IG gen Sequenzanalyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von TRANSCAN-179 Roman JTC 2016 unterstützt; Associazione Italiana per la Ricerca Sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 und spezielle Programm molekulare klinische Onkologie-5 Promille #9965), Milano, Italien; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rom, Italien; Der schwedische Cancer Society, der schwedischen Forschungsrat, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Universität Uppsala, Uppsala University Hospital und der Löwe Cancer Research Foundation, Uppsala; ODYSSEUS-Programm implementiert unter der "Aktion für den strategische Entwicklung auf der Forschung und technologischen Sektor", finanziert durch das operationelle Programm "Wettbewerbsfähigkeit, unternehmerische Initiative und Innovation" (NSRP 2014-2020) und Co-finanziert durch Griechenland und der Europäischen Union (European Regional Development Fund).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
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