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Cancer Research

जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में Immunoglobulin जीन अनुक्रम विश्लेषण: रोगी सामग्री से अनुक्रम व्याख्या करने के लिए

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/57787
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 4, 5, 6, 7, 2,3, 1,2, 8
1Institute of Applied Biosciences, Centre for Research and Technology Hellas, 2Department of Immunology, Genetics and Pathology, Science for Life Laboratory, Uppsala University, 3Department of Molecular Medicine and Surgery, Karolinska Institutet, 4Division of Immunology, Transplantation and Infectious, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 5Department of Immunology, Laboratory for Medical Immunology, Erasmus University Medical Center, 6Hematology Department, Nikea General Hospital, 7Assistance publique - Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hopital Pitié-Salpêtrière, Department of Hematology, and UPMC University Paris 06, UMRS 1138, 8Division of Experimental Oncology, IRCCS Istituto Scientifico San Raffaele and Università Vita-Salute San Raffaele
* These authors contributed equally

Summary

इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि तकनीकी पहलुओं और आवश्यक आवश्यकताओं विवरण के लिए पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) के साथ रोगियों में मजबूत ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए, पर यूरोपीय अनुसंधान पहल के संचित अनुभव के आधार पर पेश CLL (एरिक) ।

Abstract

बी सेल परिपक्वता के दौरान, immunoglobulin की जटिल प्रक्रिया (़) जीन वी (घ) जे पुनर्संयोजन दैहिक hypermutation के साथ युग्मित (SHM) प्रत्येक व्यक्ति बी सेल के भीतर एक अनूठा डीएनए अनुक्रम को जन्म देता है । एक एकल कोशिका के क्लोनल विस्तार से बी सेल द्रोह परिणाम के बाद से, ़ जीन एक अद्वितीय आणविक एक व्यक्तिगत रोगी के भीतर सभी घातक कोशिकाओं के लिए आम हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व; इस प्रकार, ़ जीन पुनर्व्यवस्थाओं क्लोनिंग मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण क्लोनर पहचानकर्ता के रूप में सेवारत होने के अलावा, ़ जीन अनुक्रम एक ' आणविक समयरेखा ' के रूप में कार्य कर सकते हैं क्योंकि यह विशिष्ट विकास के चरणों के साथ जुड़ा हुआ है और इसलिए नवोत्पादित परिवर्तन में शामिल बी सेल के इतिहास को दर्शाता है । इसके अलावा, विशेष रूप से जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) में कुछ दुष्टों के लिए, ़ जीन अनुक्रम शकुन और संभावित पूर्वानुमान क्षमताओं रखती है । उस ने कहा, extrapolating ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण से सार्थक निष्कर्ष अगर मजबूत तरीकों और उपकरणों के लिए उनके विश्लेषण में सहायता उपलब्ध नहीं थे असंभव होगा । यह लेख, CLL (एरिक) पर यूरोपीय अनुसंधान पहल के विशाल अनुभव पर ड्राइंग, विवरण तकनीकी पहलुओं और आवश्यक आवश्यकताओं को सुनिश्चित करने के लिए विश्वसनीय और reproducible ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण CLL में, एक परीक्षण है कि अब की सिफारिश की है उपचार से पूर्व सभी CLL रोगियों के लिए । अधिक विशेष रूप से, विभिंन विश्लेषणात्मक चरणों clonotypic ़ जीन पुनर्व्यवस्था की पहचान और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के निर्धारण के आइजी जीन अनुक्रम डेटा की सटीक नैदानिक व्याख्या को लेकर वर्णित हैं ।

Introduction

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL), पश्चिमी देशों में वयस्कों में ल्यूकेमिया का सबसे आम रूप, परिपक्व नवोत्पादित बी कोशिकाओं के क्लोनल विस्तार की विशेषता है1. एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, रोग पाठ्यक्रम कुछ रोगियों को एक आक्रामक बीमारी का अनुभव के साथ अत्यंत परिवर्तनशील है, निदान के बाद बहुत जल्दी इलाज की आवश्यकता होती है, और अक्सर relaps या चिकित्सा के लिए किया जा रहा है । यह रोगियों का एक पर्याप्त अनुपात (~ 30%), जो एक indolent रोग के साथ मौजूद है, उपचार की आवश्यकता नहीं है, और एक जीवन प्रत्याशा स्वस्थ उंर के समान है-मिलान व्यक्तियों2के लिए इसके विपरीत में है । इस नैदानिक विविधता CLL रोगियों में पाया आणविक विषमताओं की विविधता में परिलक्षित होता है जो अंततः इस रोग की रोगजनन और प्रगति ड्राइव3.

एक सटीक CLL निदान की स्थापना आमतौर पर सीधा है, तथापि, aforementioned नैदानिक विविधता CLL रोगियों के प्रभावी प्रबंधन में बाधा और शकुन और भविष्यवाणी मार्करों कि में सहायता कर सकता है के लिए की जरूरत को रेखांकित कर सकते है उपचार निर्णय लेने2. कई अध्ययनों से CLL के शकुन को परिष्कृत करने का प्रयास किया है, उपंयास नैदानिक और जैविक मार्कर के एक बहुतायत में समापन4प्रस्तावित किया जा रहा है । clonotypic immunoglobulin भारी चर (IGHV) जीन के उत्परिवर्तन की स्थिति CLL में सबसे मजबूत शकुन मार्करों में से एक है, मोटे तौर पर इस तथ्य के कारण है कि (i) यह समय के साथ स्थिर रहता है और के रूप में रोग की प्रगति, और (ii) यह स्वतंत्र है अंय नैदानिक और जैविक मानकों5. के बावजूद, बहुत कुछ है, अगर IGHV उत्परिवर्तन स्थिति सहित किसी भी मार्कर, वर्तमान में नैदानिक दिनचर्या में लागू कर रहे है निदान के समय ।

CLL की तारीख में ़ जीन अनुक्रमण के नैदानिक उपयोगिता पर प्रारंभिक रिपोर्ट के रूप में १९९९ के रूप में वापस दूर है, जब 2 स्वतंत्र अध्ययन की सूचना दी है कि कोई या एक ंयूनतम दैहिक hypermutation (SHM) लोड (विलक्षण CLL, U-CLL) के साथ रोगियों को ले जाने से एक बदतर रोग का निदान उच्चतर SHM बोझ (रूपांतरित CLL, एम-CLL)६,७. अधिक विशेष रूप से, U-CLL समूह के कुछ या कोई SHM और इसलिए निकटतम germline IGHV जीन (≥ ९८%), के लिए एक उच्च प्रतिशत की पहचान के साथ clonotypic IGHV जीन बंदरगाह मामलों के शामिल है, जबकि एम-CLL एक उच्च उत्परिवर्तन लोड (प्रतिशत पहचान के साथ मामलों के शामिल निकटतम germline IGHV जीन < 98%) । इन प्रारंभिक अध्ययनों के बाद से यह लगातार दिखा दिया गया है कि यू-CLL मामलों में कम समय के लिए पहली उपचार (TTFT) और समग्र अस्तित्व (ओएस) एम-CLL की तुलना में प्रदर्शित ।

मसा में, इन प्राथमिक अध्ययन बी सेल रिसेप्टर (BcR) CLL pathobiology में ़ की निर्णायक भूमिका पर प्रकाश डाला, इस प्रकार CLL में व्यापक अनुसंधान के लिए जिस तरह फ़र्श-microenvironmental बातचीत, बारी में, की एक और अधिक व्यापक सराहना करने के लिए नेतृत्व इस रोग की जैविक विविधता८,९. अधिक हाल के अध्ययनों से CLL में immunogenetic विश्लेषण के महत्व के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान की है खुलासा है कि व्यक्तिगत मामलों के उपक्रमों में साझा करने के कारण क्लस्टर मई (अर्ध) समान BcR ़ जीन जुगाड़, एक घटना BcR ़ stereotypy10 ,११,१२,१३. सबूत संचित धारणा है कि रोगियों को एक ही छवि सबसेट बंदरगाह समान clinicobiological गुण है कि स्पष्ट रूप से उंहें एक ही SHM श्रेणी के भीतर अंय CLL रोगियों से अलग है लेकिन अलग ़ जीन दृश्यों के साथ, को सौंपा का समर्थन करता है; यह वास्तव में बताया गया है कि BcR ़ stereotypy के आधार पर CLL रोगियों की वर्गीकरण आगे यू में CLL रोगियों के थोक अलगाव को परिष्कृत-CLL या एम CLL समूहों14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20।

एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य से, यह उल्लेखनीय है कि clonotypic IGHV जीन की SHM स्थिति chemoimmunotherapy के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी करने के लिए लगता है । विशेष रूप से, M-CLL रोगियों fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR) के संयोजन के साथ इलाज किया, चिकित्सकीय फिट CLL जीन दोषों की कमी रोगियों के लिए सोने के मानक उपचार, काफी लंबी प्रगति प्रदर्शित-मुक्त जीवन रक्षा (PFS) और ओएस की तुलना में U-CLL रोगियों को जो एक ही उपचार प्राप्त21,22,23. इसलिए, SHM स्थिति की पहचान विशेष रूप से CLL रोगियों अर्थात् के चिकित्सीय प्रबंधन में सहायता के लिए महत्वपूर्ण हो गया है, एक पूर्वानुमान मार्कर, बल्कि रोग के नैदानिक पाठ्यक्रम का आकलन करने के लिए के बजाय , एक शकुन मार्कर. वास्तव में, NCI के हाल ही के अद्यतन के अनुसार CLL पर अंतर्राष्ट्रीय कार्यशाला से दिशानिर्देश प्रायोजित, पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन की SHM स्थिति सभी CLL मामलों में सामांय अभ्यास और नैदानिक दोनों में उपचार दीक्षा से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए परीक्षण24. इसके अलावा, उपंयास उपचार एजेंटों के हाल ही में अनुमोदन के कारण, और परीक्षणों में दवाओं की बढ़ती संख्या, ़ अणु के SHM स्थिति निकट भविष्य5में CLL के साथ रोगियों के चिकित्सीय प्रबंधन में एक भी बड़ी भूमिका निभा सकता है ।

इस रिपोर्ट का ब्यौरा आइजी जीन अनुक्रम विश्लेषण के सभी पहलुओं, उपयुक्त सामग्री को चुनने और अनुक्रमण परिणामों की नैदानिक व्याख्या के साथ समापन के साथ शुरुआत । इन चरणों के गहन मूल्यांकन में विश्वसनीय परिणाम के उत्पादन के लिए नैदानिक दिनचर्या में महत्वपूर्ण है और नैदानिक परीक्षणों के भीतर सटीक रोगी स्तरीकरण सुनिश्चित करने के लिए । प्रोटोकॉल के लिए आइजी जीन अनुक्रम विश्लेषण के अनुरूप में सहायता प्रदान की जाती हैं, इस प्रकार सुनिश्चित करना है कि परिणाम विभिंन प्रयोगशालाओं के बीच तुलना कर रहे हैं ।

Protocol

अनुसंधान प्रोटोकॉल सैन Raffaele वैज्ञानिक संस्थान, मिलान, इटली की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सामग्री चयन

  1. शुरू सामग्री का विकल्प
    नोट: CLL के अधिकांश मामलों में ट्यूमर कोशिका गिनती निदान में उच्च है (> 80-90%) । इस प्रकार, कोशिका छंटाई या ल्यूकेमिया से प्रभावित कोशिकाओं के संवर्धन आमतौर पर आवश्यक नहीं है ।
    1. यदि परिधीय रक्त (पंजाब), ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण के लिए पसंद की सबसे आम सामग्री का उपयोग कर, 10-20 मिलीलीटर के बीच एक रक्त की मात्रा का उपयोग करें ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक कम CLL सेल बोझ के साथ मामलों में, पंजाब के नमूनों या अंय ऊतकों से सामग्री, अस्थि मज्जा (बीएम) या लिम्फ नोड्स (LN) की तरह की छंटाई सेल का उपयोग करें ।
  2. नमूना समय
    1. नमूना समय है कि आइजी SHM स्थिति स्थिर ओवरटाइम है दिया महत्वपूर्ण नहीं है; उस ने कहा, इस तरह के तुरंत बाद या चिकित्सा के दौरान के रूप में कुछ समय पर नमूने से बचें, CLL कोशिकाओं की कम संख्या के बाद से विश्लेषण जटिल हो सकता है और अविश्वसनीय परिणाम के लिए नेतृत्व.
  3. सामग्री संग्रह और भंडारण
    नोट: संग्रह और शुरू सामग्री का भंडारण सामग्री विकल्प पर दृढ़ता से निर्भर करता है ।
    1. पंजाब या बीएम नमूनों के लिए, पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया के निषेध को रोकने के लिए EDTA या CPT (साइट्रेट-tris-pyridossalphosphate) संग्रह ट्यूबों का उपयोग करें; वैकल्पिक रूप से, हेपरिन ट्यूबों का उपयोग करें ।
    2. LN नमूनों के लिए, संग्रह विकल्प या तो सेल निलंबन कर रहे हैं, ताजा जमे हुए ऊतक से बायोप्सी या, दुर्लभ उदाहरणों में formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) के ऊतकों ।

2. घनत्व ढाल जुदाई

नोट: यदि पंजाब या बीएम पसंद है, जो सबसे लगातार परिदृश्य है की प्रारंभिक सामग्री है, mononuclear कोशिका अलगाव घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग करने की सिफारिश की है ।

  1. जोड़ें २०० µ l of EDTA (०.५ M EDTA/pH ८.०) एक ५० मिलीलीटर बाँझ संग्रह ट्यूब । पंजाब के 20 मिलीलीटर और RPMI के 15 मिलीलीटर जोड़ें । pipetting द्वारा मिश्रण (2-3 बार पर्याप्त है) ।
  2. एक नया ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब करने के लिए घनत्व ढाल माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: मामले में पंजाब की मात्रा से कम है 20 मिलीलीटर, RPMI की मात्रा (पिछले कदम) और घनत्व ढाल तदनुसार संशोधित किया जाना चाहिए ।
  3. धीरे चरण २.१ से समाधान में परत ताकि यह ढाल बाधित नहीं करता है । केंद्रापसारक ब्रेक के साथ 20 मिनट के लिए ८०० x g पर ।
  4. mononuclear सेल अंगूठी है कि ऊपरी प्लाज्मा/प्लेटलेट परत और घनत्व ढाल मध्यम एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग कर परत के बीच का गठन किया है, तो एक बाँझ 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण लीजिए ।
  5. 12 मिलीलीटर और मिश्रण के एक अंतिम मात्रा में RPMI जोड़ें । 8 मिनट के लिए ७५० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
  6. RPMI के 10 मिलीलीटर और दोहराने चरण २.५ का उपयोग कर सेल गोली resuspend ।
  7. पंजाब के 1 मिलीलीटर (DPBS, कोई कैल्शियम, नहीं मैग्नीशियम) में सेल गोली को भंग । 1:10 Türk's सॉल्यूशन के 20 µ l का नमूना और ८० µ l को मिलाकर एक Neubauer प्लेट का उपयोग करते हुए एक सेल काउंट करें ।
  8. नमूना के अनुप्रवाह संसाधन एक ही दिन के लिए निर्धारित नहीं है, तो 8 मिनट के लिए ७५० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और सेल गोली की दुकान पर-८०ओ सी ।

3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण

  1. ़ जीन की SHM स्थिति के विश्लेषण के लिए एक सब्सट्रेट पर फैसला । जीनोमिक डीएनए (gDNA) सबसे लोकप्रिय विकल्प के रूप में वहाँ एक रिवर्स प्रतिलेखन कदम के लिए कोई ज़रूरत नहीं है; वैकल्पिक रूप से, आरएनए/पूरक डीएनए (सीडीएनए) के उपयोग से यह सुनिश्चित होता है कि, कम से transcriptional स्तर पर, उत्पादक, कार्यात्मक clonotypic ़ पुनर्व्यवस्था "इष्ट" लक्ष्य है ।
  2. कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध gDNA या कुल आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए के संश्लेषण के लिए उपयुक्त किट में से एक का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. संवेदनशील न्यूक्लिक अम्ल ठहराव प्रणालियों का उपयोग डीएनए या आरएनए की अखंडता का आकलन करें । यदि विश्लेषण के लिए FFPE सामग्री का उपयोग कर, एक ज्ञात गृह व्यवस्था जीन, जैसे retinoic एसिड रिसेप्टर अल्फा (र्ि), बीटा actin, आदिकी पीसीआर प्रवर्धन द्वारा निकाली gDNA/सीडीएनए की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करें ।

4. IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्थाओं का प्रवर्धन और अनुक्रमण

  1. ि्ग पीसीआर प्राइमरी का चयन
    1. अधिमानतः, IGHV उपसमूह विशिष्ट 5 ' प्राइमरों और IGHJ जीन विशिष्ट 3 ' प्राइमरों25,26के साथ मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रदर्शन । यदि परिणाम उप इष्टतम हैं, अलग पीसीआर तैयार एकल IGHV उपसमूह विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर घोला जा सकता है ।
    2. ' 5 प्राइमरों का प्रयोग करें कि या तो नेता क्षेत्र के तुरंत ऊपर स्थित आइजी पुनर्व्यवस्था या कोडिंग क्षेत्र के भीतर (जैसे फ्रेमवर्क 1, FR1) IGHV जीन की ।
      1. उपयोग नेता प्राइमरों कि पूरे पुनर्व्यवस्थित IGHV-IGHD-IGHJ जीन अनुक्रम है, जो बारी में SHM के स्तर का सही आकलन सक्षम हो जाएगा के प्रवर्धन के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रकार, IGHV नेता प्राइमरों ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण के लिए अपने अद्यतन दिशा निर्देशों में एरिक द्वारा सिफारिश कर रहे है27।
      2. उदाहरणों में जहां नेता प्राइमरों clonotypic ़ पुनर्व्यवस्था बढ़ाना विफल, IGHV FR1 प्राइमरों का उपयोग करें । हालांकि, फ्रेमवर्क प्राइमरों पूरे clonotypic ़ जीन पुनर्व्यवस्था बढ़ाना नहीं है, जो SHM के स्तर के गलत निर्धारण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस परिदृश्य के लिए, स्पष्ट रूप से नैदानिक रिपोर्ट में राज्य है कि IGHV FR1 प्राइमरों के उपयोग निकटतम germline जीन के लिए सही प्रतिशत पहचान का अनुमान लगा सकते हैं ।
    3. 3 ' अंत के लिए, IGHJ जीन, IGHJ जीन के मल्टीप्लेक्स सेट विशिष्ट प्राइमरों या isotype विशिष्ट प्राइमरों लक्ष्यीकरण का उपयोग आम सहमति प्राइमरों, सब्सट्रेट पर निर्भर करता है । प्राइमर अनुक्रम तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं, जबकि चित्रा 1 प्राइमरी एनीलिंग के लिए विभिंन स्थानों को दर्शाया गया है ।
  2. IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्थाओं का पीसीआर प्रवर्धन
    1. निष्पक्ष प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक उपसमूह प्राइमर (ओं) की equimolar मात्रा का उपयोग कर प्राइमरी मिश्रण तैयार करें ।
      1. उदाहरण के लिए, जब नेता प्राइमरों का उपयोग कर, दो अलग प्राइमरों IGHV1 उपसमूह से संबंधित पुनर्व्यवस्था बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस प्रकार, इन 2 प्राइमरों की एक मात्रा (IGHV1L और IGHV1bL) है कि IGHV4L, जो IGHV4 उपसमूह पुनर्व्यवस्थाओं के लिए ही किताब है की तुलना में आधा है का उपयोग करें ।
      2. IGHJ1-2 और IGHJ4-5 प्राइमरों के मामले में विपरीत दृष्टिकोण लागू करें । के रूप में इन प्राइमरों दो अलग IGHJ जीन उपसमूहों लक्ष्य, IGHJ3 और IGHJ6 प्राइमरों की तुलना में दोगुनी मात्रा ।
      3. जब प्रासंगिक प्राइमर घोला जा रहा है की तैयारी सटीक प्राइमर मात्रा निर्धारित करने के लिए तालिका 1 का उपयोग करें ।
    2. तालिका 2में सूचीबद्ध के रूप में पीसीआर रिएजेंट मिलाएं । एक पीसीआर ट्यूब में सभी पीसीआर रिएजेंटों के संयोजन के बाद, Taq पोलीमरेज़ के ०.५ µ एल और gDNA के १०० एनजी या µ के 2 सीडीएनए एल जोड़ें (सीडीएनए 1 µ जी आरएनए का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए) ।
      नोट: गतिविधि को ठीक करने के साथ एक Taq एंजाइम प्रवर्धन त्रुटि दर के रूप में आवश्यक नहीं है बहुत कम है और इसलिए SHM के स्तर को प्रभावित नहीं करेगा.
    3. थर्मल पीसीआर भागो तालिका 3में विस्तृत प्रोटोकॉल ।
  3. Clonality भत
    नोट: एक महत्वपूर्ण अगले कदम पीसीआर उत्पाद के clonality पैटर्न का मूल्यांकन शामिल है । जब CLL रोगियों में clonality का आकलन, सबसे आम खोज एक एकल, मोनोक्लोनल चोटी/
    1. clonality आकलन28,29के लिए उच्च-संवेदनशीलता, जैसे अंश या heteroduplex विश्लेषण के साथ विधियों का उपयोग करें ।
    2. अंश विश्लेषण
      1. प्रदर्शन मल्टीप्लेक्स पीसीआर ५ '-त्यसपछि IGHV नेता वा FR1 उपसमूह विशिष्ट पीसीआर प्राइमरी; यह पीसीआर उत्पादों है कि केशिका ट्रो से अलग किया जा सकता है, जिससे उनके IGHV complementarity निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) लंबाई के आधार पर ि्ग पीसीआर उत्पादों के clonality आकलन की अनुमति उपज होगी ।
      2. का प्रयोग करें प्राइमर, रिएजेंट और थर्मल उन पहले उल्लेख के समान स्थिति (1-3 तालिकाओं देखें) । कस्टम 5 ´-लेबल प्राइमरों फ्लोरोसेंट ' 5 अंत पर रंजक का एक विकल्प के साथ ओलिगोस्पर्मिया लेबल हैं । रिपोर्टर रंजक के उदाहरणों में ६-FAM, हेक्सा, नेड या TET शामिल हैं. इस प्रकार, 2 अलग प्रतिक्रियाओं की प्रतिक्रिया के अनुसार 3 अलग रंजक के उपयोग के आधार पर आवश्यक हैं ।
    3. एक चल रहे बफर के रूप में 1x TBE का उपयोग करते हुए छह प्रतिशत (6%) polyacrylamide जेल (इष्टतम संकल्प में यह प्रतिशत परिणाम) पर पीसीआर उत्पादों के आकार का आकलन करें । ४५ मिनट के लिए ८० V पर भागो ।
      नोट: यह सिफारिश की है कि पीसीआर उत्पादों को पर्याप्त समय के लिए जेल पर स्थानांतरित करने की अनुमति दी जाती है ताकि मोनोक्लोनल नमूने polyclonal पृष्ठभूमि से अलग किया जा सकता है और डीएनए आकार मार्कर पर्याप्त रूप से अलग कर सकते हैं । इस तरह के आकार और जेल की मोटाई के रूप में कारकों माइग्रेशन को प्रभावित कर सकते हैं तो कोई एकल सेटिंग (वोल्टेज और समय) एक इष्टतम परिणाम की गारंटी कर सकते हैं ने कहा कि, ४५ मिनट के लिए ८० वी पर वोल्टेज की स्थापना एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है के रूप में यह भी पलायन के जोखिम को कम करता है जल्दी और ' चल ' जेल बंद ।
    4. जब IGHV FR1 प्राइमर घोला जा सकता है का उपयोग कर जब IGHV नेता प्राइमरों और ३५० आधार जोड़े का उपयोग कर लगभग ५०० आधार जोड़े के पीसीआर उत्पादों के लिए जांच करें ।
      नोट: दुर्लभ उदाहरणों में, CLL मामलों डबल ले जाने के लिए पाया गया है, मोनोक्लोनल उत्पादों और भी दुर्लभ उदाहरणों में, मामलों में एक oligoclonal पैटर्न प्रदर्शन कर सकते हैं. Ethidium ब्रोमाइड (EtBr) या कम खतरनाक और अधिक संवेदनशील व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए दाग के रूप में एक intercalating एजेंट यूवी acrylamide या नीले प्रकाश का उपयोग कर उत्तेजना जैल पर डीएनए के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. पीसीआर उत्पाद शुद्धि
    नोट: पीसीआर उत्पादों किसी भी polyclonal CLL नमूना के भीतर सामांय बी कोशिकाओं से उद्भव के रूप में अच्छी तरह से प्राइमरी dimers है कि उपइष्टतम अनुक्रमण करने के लिए नेतृत्व कर सकते है की पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए शुद्ध कर रहे हैं । किसी भी विधि है कि पीसीआर साफ-अप, जैसे एक एंजाइमी उपचार, जैसे , एसएपी (चिंराट alkaline फॉस्फेट)/Exo (Exonuclease मैं), या स्तंभ आधारित शुद्धि के लिए unincorporate और प्राइमरों को हटा का उपयोग करें ।
    1. एक 3% कम पिघलने agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद की कुल मात्रा लोड ।
    2. जब तक वे पृष्ठभूमि से अलग जेल पर चलने के लिए पीसीआर उत्पादों की अनुमति दें ।
    3. एक्साइज तेज, त्यातील पीसीआर बैंड्स, शुद्ध व elute. यदि दो पुनर्व्यवस्थाओं का पता लगाया जाए तो दोनों बैंडों को एक्साइज और अलग का जुगाड़ करना चाहिए.
    4. Sap/Exo क्लीन-अप करने के लिए, उपयोग करने के लिए विशिष्ट वॉल्यूंस के बारे में निर्माता के निर्देशों का पालन करें; हालांकि एक ठेठ प्रतिक्रिया 1 µ एल एसएपी, 0 शामिल हो सकते हैं । 5 µ l Exo और 2 µ l 5x मशीन बफर प्रति 5-10 µ l पीसीआर रिएक्शन. मिश्रण धीरे से प्रत्येक नमूना भंवर और 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर एक पीसीआर ब्लॉक पर मशीन । 15 मिनट के लिए ८५ ° c करने के लिए हीटिंग द्वारा एंजाइमों को निष्क्रिय ।
    5. उत्पाद की शुद्धता का आकलन करने के लिए 3% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों की एक छोटी मात्रा लोड करें ।

5. सैंज अनुक्रमण

नोट: कई अनुक्रमण रणनीतियों मौजूद हैं, हालांकि, सटीक दृष्टिकोण की परवाह किए बिना, दोनों किस्में के प्रत्यक्ष अनुक्रमण एक विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य है.

  1. सामांय अनुक्रमण प्रोटोकॉल
    1. यदि प्रवर्धन एकल प्राइमरों का उपयोग किया गया है, sequencing उपयुक्त IGHV-और IGHJ-या लगातार क्षेत्र-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर के साथ आगे बढ़ना । इस दृष्टिकोण को भी अपनाया जा सकता है अगर मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमरों का इस्तेमाल किया गया है और पीसीआर उत्पाद टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था (sequencing प्राइमरों लेबल नहीं किया जाना चाहिए) ।
    2. यदि division प्राइमरों का इस्तेमाल किया गया है और clonality एक जेल पर आकलन किया गया है, तो sequencing के पहले कदम पर एक बहाव प्राइमर का उपयोग करें 5 '-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 ' के अनुक्रम के साथ एक आम सहमति IGHJ प्राइमर । वैकल्पिक रूप से, अगर सीडीएनए सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक CH प्राइमर इस्तेमाल किया जा सकता है । अगला, उपसमूह-विशिष्ट IGHV लीडर या दूसरी sequencing चरण के लिए FR1 प्राइमरों का उपयोग करें ।
  2. उदाहरण sequencing प्रोटोकॉल
    नोट: कई sequencing प्रोटोकॉल मौजूद है और एक उदाहरण प्रोटोकॉल नीचे विस्तृत है ।
    1. पतला ३३ ११.५ µ एल का एक कुल मात्रा में पीसीआर उत्पाद के एनजी का उपयोग, जैसे, बाँझ पानी । 5 मिनट के लिए ९५ ° c करने के लिए हीटिंग द्वारा पीसीआर उत्पाद स्वभाव । तुरंत बर्फ पर 10 मिनट के लिए जगह माध्यमिक संरचनाओं के गठन को रोकने के लिए ।
    2. ०.५ µ एल के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए मास्टर मिश्रण के 8 µ एल जोड़ें (5 pmol के लिए इसी) प्राइमर के ।
    3. एक नियंत्रण के रूप में, मास्टर मिक्स के 8 µ एल, ०.५ µ एल pUC18 नियंत्रण टेम्पलेट, 2 µ एल (-) ४७ अनुक्रमण प्राइमर और ९.५ µ l बाँझ पानी युक्त एक ट्यूब तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब में अंतिम कुल मात्रा 20 µ एल होना चाहिए ।
    4. तालिका 4में विस्तृत के रूप में sequencing प्रतिक्रिया के लिए थर्मल सायक्लिंग शर्तों का उपयोग करें ।
    5. 2 µ l को सोडियम एसीटेट 3m (ph ५.२), 2 µ l EDTA १०० Mm (ph ८.०) और µ के 1 ग्लाइकोजन l को मिलाकर स्टॉप सॉल्यूशन तैयार करें (एकाग्रता 20 mg/एमएल), फिर प्रत्येक नमूने में 5 µ l डालें । एक नई microcentrifuge ट्यूब करने के लिए उत्पाद स्थानांतरण ।
    6. १००% इथेनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) के ६० µ एल जोड़ें और धीरे मिश्रण । 15 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए १४,००० rpm पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    7. ७०% इथेनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) के १०० µ एल जोड़ें और धीरे मिश्रण । 10 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए १४,००० rpm पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें । एक बार दोहराएं ।
    8. कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए गोली सूखी । प्रत्येक नमूने के लिए सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान के ४० µ एल जोड़ें ।
    9. एक sequencing थाली के लिए नमूना स्थानांतरण, पट्टी टोपियां या टेप जवानों के साथ कवर, मशीन के लिए लोड और सैंज sequencing प्रदर्शन करते हैं । sequencing प्लेट आमतौर पर एक ९६-well, v-नीचे, पूर्ण स्कर्ट, sequencer के साथ संगत पीसीआर प्लेट है । प्लेटों में एक वाणिज्यिक कंपनी पर या एक अकादमिक अनुक्रमण केंद्र/मंच पर, घर में प्रदर्शन किया जा करने के लिए है कि क्या के आधार पर बारकोड हो सकता है ।
  3. sequencing के बाद, एक पूर्ण IGHV जीन पुनर्व्यवस्था यानी, आम सहमति अनुक्रम बनाने के लिए व्यक्तिगत अनुक्रमण कदम से उत्पन्न 2 पढ़ता है ' एक साथ सिलाई.

6. अनुक्रम विश्लेषण

नोट: निंनलिखित वर्गों IMGT/वी-क्वेस्ट उपकरण30 से प्राप्त उत्पादन पर ध्यान जब पुनर्व्यवस्थित आइजी दृश्यों का विश्लेषण, और IMGT/JunctionAnalysis31, दोनों जिनमें से विशेष रूप से नैदानिक रिपोर्टिंग और अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है अध्ययन. IMGT/V-क्वेस्ट एक संरेखण उपकरण है कि उपयोगकर्ता IMGT संदर्भ निर्देशिका के साथ प्रस्तुत आइजी दृश्यों की तुलना करता है30सेट । उपकरण आउटपुट जिसमें उपयोगकर्ता कुछ पैरामीटर्स को परिभाषित कर सकते हैं कई अनुभागों में शामिल हैं ।

  1. प्रजातियों, जैसे, होमो sapiens (मानव), और रिसेप्टर प्रकार या लोकस (जैसे ि्ग, IGK या आईजीएल) निर्दिष्ट करें ।
  2. चिपकाने के दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए, फसता प्रारूप में और हेडर सहित, पाठ क्षेत्र में (अप करने के लिए बैच में ५० अनुक्रम प्रति रन). वैकल्पिक रूप से, फसता अनुक्रम वाले स्थानीय फ़ाइल के लिए पथ दर्ज करने के लिए एक विकल्प प्रदान किया गया है ।
  3. परिणामों के लिए निंन 3 में से एक प्रदर्शन विकल्प चुनें:
    1. विस्तृत दृश्य: व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अनुक्रम के लिए परिणाम प्राप्त करने के लिए इस विकल्प का चयन करें ।
    2. संश्लेषण दृश्य: IGHV जीन और एलील नाम या अनुक्रम इनपुट क्रम द्वारा आदेश दिया सारांश तालिका संकलित करने के लिए इस विकल्प का चयन करें । यह विकल्प भी अनुक्रम का एक संरेखण है कि, किसी भी प्रस्तुत बैच में, एक ही IGHV जीन और एलील को सौंपा जाता है प्रदान करता है ।
    3. Excel फ़ाइल: किसी एकल फ़ाइल में शामिल स्प्रेडशीट्स के रूप में सभी आउटपुट फ़ाइलें प्रदान करने के लिए इस विकल्प का चयन करें । सभी विकल्पों को देखने से चुनने के लिए बुनियादी और उंनत मापदंडों का एक बड़ा चयन किया है, लेकिन केवल सबसे CLL आइजी अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रासंगिक कारकों के नीचे ' प्रतिनिधि परिणाम ' अनुभाग में चर्चा कर रहे हैं ।

7. गिरफ्तारी/AssignSubsets उपकरण

  1. जांच करने के लिए BcR ़ stereotypy के भीतर CLL (अतिरिक्त विवरण नीचे दिए गए ' प्रतिनिधि परिणाम ' अनुभाग में), IGHV-IGHD-IGHJ फसता को गिरफ्तार करने के जुगाड़ में जमा AssignSubsets टूल३२/ उपकरण प्रमुख CLL तोडऩे सबसेट के लिए असाइनमेंट रिपोर्ट करता है । विस्तृत निर्देशों के साथ सबसेट असाइनमेंट उपकरण के साथ गिरफ्तारी पर उपलब्ध है/AssignSubset वेबसाइट३२ और भी सेवा टैब के तहत एरिक वेबसाइट पर ।

Representative Results

उदाहरण नीचे दिए गए विस्तृत चरणों के बाद ़ जीन अनुक्रमण विश्लेषण से प्राप्त परिणामों को दर्शाते हैं । हालांकि डीएनए और/या आरएनए निष्कर्षण सबसे नैदानिक/अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए नियमित प्रक्रिया कर रहे हैं, एक पहले महत्वपूर्ण कदम उच्च संवेदनशीलता के साथ एक spectrophotometer या अन्य उपयुक्त प्रौद्योगिकी का उपयोग gDNA और/या आरएनए की गुणवत्ता की जाँच शामिल है । अगले महत्वपूर्ण कदम clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था की पीसीआर प्रवर्धन शामिल है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, केवल IGHV नेता प्राइमर का उपयोग पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन अनुक्रम की पूरी लंबाई के प्रवर्धन सक्षम बनाता है, इस प्रकार सही SHM लोड की अनुमति के लिए निर्धारित किया जाएगा; इसलिए, IGHV नेता प्राइमर की सिफारिश की प्राइमर पसंद (चित्रा 2) हैं । दुर्लभ उदाहरणों में जहां IGHV नेता प्राइमरों clonotypic ़ पुनर्व्यवस्था बढ़ाना नहीं कर सकते, IGHV FR1 प्राइमरों इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्र 3में सबूत के रूप में, कई पीसीआर उत्पादों/बैंड मनाया जा सकता है, खासकर जब gDNA प्रारंभिक सामग्री है; इन बैंड्स को एक्साइज और अलग का जुगाड़ करना चाहिए । यदि दोनों IGHV नेता और IGHV FR1 प्राइमर परिणाम उपज में विफल, विश्लेषण एक नए मरीज के नमूने का उपयोग कर दोहराया जाना चाहिए (जब संभव हो) । sequencing करने से पहले अंतिम चेकपॉइंट अंश विश्लेषण (आरेख 4) का उपयोग करते हुए नमूना का clonality निर्धारित कर रहा है ।

प्राप्त अनुक्रम IMGT/वी-क्वेस्ट उपकरण30का उपयोग कर विश्लेषण किया जाना चाहिए । उपयोगकर्ता-चयनित मापदंडों प्रजातियों, रिसेप्टर प्रकार या लोकस, प्रविष्टि के लिए खोज, और विलोपन विकल्प, आदि शामिल हैं और विश्लेषण अनुक्रम की संख्या के साथ एक साथ सूचीबद्ध हैं. प्रत्येक फसता अनुक्रम प्रदर्शित किया जाता है और वी-डोमेन IMGT/वी-क्वेस्ट द्वारा विश्लेषण हरे रंग में डाला जाता है । इनपुट अनुक्रम विपरीत ओरिएंटेशन (antisense) में किया गया था, तो इसके साथ ही, प्रोग्राम स्वचालित रूप से पूरक रिवर्स अनुक्रम प्रदान करता है और फसता अनुक्रम से ऊपर यह बताता है ।

परिणाम सारांश तालिका सीधे फसता अनुक्रम के नीचे, ' विस्तृत दृश्य ' परिणाम पृष्ठ के शीर्ष पर प्रदान की गई है, और CLL में आइजी जीन अनुक्रम विश्लेषण के नैदानिक रिपोर्टिंग के लिए महत्वपूर्ण जानकारी शामिल है । इस तालिका की प्रत्येक पंक्ति नीचे समझाया गया है ।

परिणाम सारांश । परिणाम तालिका में पहली पंक्ति इनपुट अनुक्रम की कार्यक्षमता बताती है: एक आइजी पुनर्व्यवस्थित अनुक्रम या तो उत्पादक या अनुत्पादक (चित्र 5 & 5B) हो सकता है । एक ़ जीन पुनर्व्यवस्था अनुत्पादक है यदि रोक codons वी डी-जे क्षेत्र (VH के लिए) के भीतर या वी-जे क्षेत्र (वीएल के लिए) के भीतर मौजूद है और/या यदि पुनर्व्यवस्था बाहर है-फ्रेम के कारण सम्मिलन/विलोपन । यदि IGHV-IGHD-IGHJ जंक्शन की पहचान नहीं की जा सकी, तो कार्यक्षमता निर्धारित नहीं की जा सकती, अर्थात एक तीसरा आउटपुट प्रदान किया जाता है; इस उदाहरण में, परिणाम सारांश ' कोई पुनर्व्यवस्था पाया ' या ' कोई जंक्शन नहीं मिला ' के रूप में पढ़ा जाएगा । यह ध्यान दें कि केवल उत्पादक और, इस प्रकार महत्वपूर्ण है, कार्यात्मक पुनर्व्यवस्थाओं और विश्लेषण किया जाना चाहिए । यदि एकमात्र प्रवर्धित आइजी पुनर्व्यवस्था कार्यात्मक नहीं है (अनुत्पादक या ' कोई पुनर्व्यवस्था पाया '), पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए. यदि परिणाम नकारात्मक रहता है एक नए मरीज के नमूने प्राप्त किया जाना चाहिए ।

वी-जीन और एलील । ' वी-जीन और एलील ' पंक्ति अपने संरेखण स्कोर और प्रतिशत पहचान के साथ निकटतम germline IGHV जीन और एलील को इंगित करती है. यदि कई जीन (ओं) और alleles एक ही उच्च स्कोर दे, सभी सूचीबद्ध हैं । प्रस्तुत अनुक्रम और निकटतम IGHV जीन और एलील के बीच प्रतिशत पहचान विशेष महत्व का है क्योंकि यह SHM स्थिति निर्धारित करता है । इस मान की गणना वि-क्षेत्र के प्रथम न्यूक्लियोटाइड से CDR3 को छोड़कर वि क्षेत्र के 3 ' अंत तक की जाती है. यदि IGHV FR1 प्राइमरों का इस्तेमाल कर रहे हैं, प्राइमर के लिए इसी अनुक्रम हमेशा के रूप में संभव के रूप में सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए हटाया जाना चाहिए । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक कम पहचान प्रतिशत (< 85%) एक सम्मिलन या विलोपन से परिणाम हो सकता है (नीचे आगे चर्चा की) और, इस मामले होना चाहिए एक ' चेतावनी ' नोट उपयोगकर्ता को सचेत करने के लिए ' परिणाम सारांश ' पंक्ति में दिखाई देगा ।

जम्मू-जीन और एलील । के रूप में वी के लिए वर्णित जीन और एलील ऊपर, ' जे जीन और एलील ' पंक्ति अपने संरेखण स्कोर और प्रतिशत पहचान के साथ निकटतम germline IGHJ जीन और एलील इंगित करता है । हालांकि, के रूप में IGHJ जीन बल्कि कम है और इसके 5 ' अंत exonuclease गतिविधि के कारण छंटनी की गई है हो सकता है, वैकल्पिक विकल्प भी उपकरण द्वारा खोजा, लगातार समान न्यूक्लियोटाइड की सबसे अधिक संख्या के आधार पर कर रहे हैं ।

डी-जीन और एलील द्वारा IMGT/JunctionAnalysis. ' d-जीन और एलील द्वारा IMGT/JunctionAnalysis ' निकटतम germline IGHD जीन और डी क्षेत्र पढ़ने उपयोगकर्ता अनुक्रम में उपकरण द्वारा की पहचान की फ्रेम के साथ एलील इंगित करता है । IMGT/JunctionAnalysis31 जंक्शन का एक विस्तृत और सटीक विश्लेषण प्रदान करता है और IMGT/वी-क्वेस्ट टूल इंटरफेस में एकीकृत किया गया है । यह टूल IGHD जीन और एलील पहचान से जुड़ी कठिनाई के सभी पहलुओं का प्रबंधन करता है अर्थात, (i) डी-क्षेत्र की कम लम्बाई; (ii) 2 या यहां तक कि 3 पढ़ने के फ्रेम का उपयोग; (iii) जीन के दोनों सिरों पर ट्रिमिंग exonuclease; और, (iv) उत्परिवर्तनों की उपस्थिति ।

FR-IMGT लंबाई, सीडीआर-IMGT लंबाई और एए जंक्शन । यह पंक्ति IGHV FRs और कोष्ठक के भीतर दिखाया CDRs और डॉट्स और एमिनो एसिड (एए) जंक्शन से अलग की लंबाई प्रदान करता है । जंक्शन के ए. ए. अनुक्रम दिखाता है (i) एक में या आउट-की-फ़्रेम पुनर्व्यवस्था (आउट-की-फ़्रेम स्थिति ' # ' चिह्न द्वारा इंगित किया गया है), (ii) रोक codons की उपस्थिति या अनुपस्थिति (एक रोक codon को तारांकन चिह्न ' * ' द्वारा दिखाया गया है), और (iii) उपस्थिति या अनुपस्थिति VH CDR3 के एंकर-IMGT: C (2nd-CYS १०४) और डब्ल्यू (जंमू टीआरपी ११८) ।

दैहिक hypermutations मुख्य रूप से एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन से मिलकर बनता है, तथापि, छोटे निवेशन और विलोपन वी क्षेत्र के भीतर, हालांकि एक बहुत कम आवृत्ति३३पर मनाया जा सकता है । जब डिफ़ॉल्ट IMGT/वी-क्वेस्ट पैरामीटर, सम्मिलन और विलोपन का उपयोग स्वचालित रूप से पता नहीं कर रहे हैं; हालांकि, मजबूत संकेत है कि एक अनुक्रम ऐसे परिवर्तन, अर्थात् ले सकते हैं , एक कम प्रतिशत की पहचान और/या अलग IGHV CDR1-IMGT और CDR2-प्रस्तुत उपयोगकर्ता अनुक्रम और निकटतम IMGT जीन और germline के बीच लंबाई एलील, द्वारा पता लगाया जाता है टूल और एक चेतावनी चेतावनी परिणाम सारांश तालिका (चित्रा 5C) के नीचे प्रकट होता है ।

IMGT ' प्रदर्शन परिणाम ' अनुभाग के नीचे स्थित ' उन्नत पैरामीटर ' अनुभाग में ' सम्मिलन और विलोपन के लिए खोज ' नामक एक विकल्प प्रदान करता है. ऐसे मामलों में जहां प्रासंगिक चेतावनियां दिखाई देती हैं, इस कार्यक्षमता का उपयोग करना उचित है । जब सम्मिलन और हटाने का पता लगाया जाता है, तो खोज का व्यापक विवरण ' परिणाम सारांश ' अनुभाग में प्रदान किया जाता है, जिसमें (i) जहाँ संमिलन या विलोपन स्थित है अर्थात, VH FR-IMGT या सीडीआर-IMGT; (ii) सम्मिलित/हटाए गए न्यूक्लियोटाइड की संख्या; (iii) अनुक्रम (केवल सम्मिलन के लिए); (iv) चाहे कोई frameshift हुई हो; (v) वि-क्षेत्र codon से जो संमिलन या विलोपन प्रारंभ होता है; और (vi) सबमिट किए गए अनुक्रम (आरेख 5d) में प्रभावित न्यूक्लियोटाइड स्थिति । सम्मिलन के लिए, उपकरण प्रविष्टि (s) सबमिट किए गए उपयोगकर्ता अनुक्रम से निकालता है और फिर मानक IMGT/वि-खोज पैरामीटर्स का उपयोग करके अनुक्रम पुन: विश्लेषण करता है । हटाए गए का पता लगाया है, तो उपकरण विश्लेषण दोहराने से पहले हटाए गए न्यूक्लियोटाइड को प्रतिस्थापित करने के लिए डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व अंतराल, जोड़ता है ।

नैदानिक प्रयोगशालाओं, कड़े मानकों और reproducibility के एक उच्च स्तर में प्रदर्शन किया हर नैदानिक या शकुन परीक्षण के लिए के रूप में अत्यंत महत्वपूर्ण हैं । IMGT/वी-क्वेस्ट आउटपुट CLL में ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण के परिणामों की रिपोर्टिंग के लिए आवश्यक जानकारी के बहुत प्रदान करता है, अर्थात्, (i) IGHV, IGHD और IGHJ जीन और alleles का उपयोग; (२) clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था की कार्यप्रणाली , चाहे पुनर्व्यवस्था उत्पादक हो या अनुत्पादक; और (iii) अपने निकटतम germline IGHV जीन और एलील की तुलना में पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन और एलील की प्रतिशत पहचान. CLL में ़ जीन के नैदानिक रिपोर्टिंग के बारे में व्यापक जानकारी के लिए, समस्याग्रस्त या तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण मामलों की व्याख्या और CLL में IGHV जीन SHM स्थिति के सटीक और मजबूत निर्धारण के लिए सिफारिशों, पाठक निर्देशित है हाल ही में एरिक दिशानिर्देश और रिपोर्ट27,३४अद्यतन करने के लिए ।

अंत में, हमारे बढ़ते CLL में BcR ़ stereotypy के विषय में ज्ञान के कारण, CLL में आइजी जीन पुनर्व्यवस्थाओं के नैदानिक रिपोर्टिंग के लिए एक अतिरिक्त सिफारिश की आवश्यकता के मामलों के प्रमुख तोडऩे सबसेट के काम से संबंधित है । अब यह नैदानिक रिपोर्ट में राज्य के लिए सिफारिश की है कि क्या विश्लेषित उत्पादक IGHV जीन पुनर्व्यवस्था के प्रमुख तोडऩे उपसमुच्चय, अर्थात् सबसेट #1, #2, #4 या #812,27में से एक को सौंपा जा सकता है । प्रमुख CLL छवि प्रदर्शन के लिए असाइनमेंट गिरफ्तार/AssignSubsets उपकरण (चित्रा 6)३२के उपयोग के साथ किया जाना चाहिए ।

5 ' IGHV FR1 प्राइमर्स प्राइमरी सीक्वेंस प्राइमरी मिक्स के ६० μL के लिए मात्रा
IGHV1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG 10
IGHV2 CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 10
IGHV3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 10
IGHV4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG 10
IGHV5 GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC 10
IGHV6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG 10
5 ' IGHV लीडर प्राइमर्स
IGHV1L AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG 5
IGHV1bL AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG (C/ 5
IGHV2aL AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) AC 5
IGHV2bL AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC 5
IGHV3aL AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC 5
IGHV3bL AAATCGATACCACCACCATGGA (a/g) (c/t) t (g/t) (g/t) g (g/a) CT (g/c/t) (a/t) GC 5
IGHV4L AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT 10
IGHV5L AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC 10
IGHV6L AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC 10
3 ' IGHJ प्राइमर
IGHJ1-2 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC 20
IGHJ3 TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC 10
IGHJ4-5 TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC 20
IGHJ6 TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC 10

तालिका 1. clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था के पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्राइमरी जुगाड़ और मात्राएं ।

अभिकर्मक मात्रा (μL)
आरबी एक्स 10 बफर 5
MgCl2 (५० मिमी) 3
dNTPs (10 mΜ) 2
प्राइमरी IGHV लीडर/FR1 मिक्स (10 माइक्रोन) 3
प्राइमरी IGHJ मिक्स (10 माइक्रोन) 3
एच२ओ ३१.५
कुल मात्रा ४७.५

तालिका 2. clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था के पीसीआर प्रवर्धन के लिए रिएजेंट ।

तापमान अवधि सायकल क्रमांक विवरण
९४ ° c 5 मिनट 1 पोलीमरेज़ सक्रियण
९४ ° c 1 मिनट ३९ विकार
५९ ° c 1 मिनट एनीलिंग
७२ ° c १.५ मिनट एक्सटेंशन
७२ ° c 10 मिनट 1 अंतिम विस्तार
18 डिग्री सेल्सियस ∞ 1 संरक्षण

तालिका 3. clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था के पीसीआर प्रवर्धन के लिए थर्मल सायक्लिंग शर्तें ।

तापमान अवधि सायकल क्रमांक विवरण
९४ ° c 5 मिनट 1 पोलीमरेज़ सक्रियण
९६ ° c 20 सेकंड 30 विकार
५० ° c 20 सेकंड एनीलिंग
६० ° c 4 मिनट एक्सटेंशन
4 ° c ∞ 1 संरक्षण

तालिका 4. ़ जीन अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।

Figure 1
चित्र 1. एक IGHV के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-IGHD-IGHJ विभिंन प्राइमर एनीलिंग स्थानों के साथ जीन पुनर्व्यवस्था का संकेत दिया । 5 ' IGHV प्राइमर नेता अनुक्रम है कि IGHV कोडन अनुक्रम के ऊपर स्थित है को एनएन । 5 ' IGHV फ्रेमवर्क (एफआर) FR1 क्षेत्र है, जो पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन के भीतर स्थित है के शुरू करने के लिए एनएन, जबकि 3 ' IGHJ प्राइमरों ऐनी पुनर्व्यवस्थित IGHJ जीन के अंत में । UTR: अनअनुवादित क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. पीसीआर का प्रवर्धन IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था 7 रोगी नमूनों में 5 ' IGHV नेता प्राइमर का उपयोग कर । आठवीं लेन एक सकारात्मक नियंत्रण जबकि पीसीआर के लिए नकारात्मक नियंत्रण नौवें लेन में लोड किया गया था का प्रतिनिधित्व करता है । अपेक्षित पीसीआर उत्पाद IGHV लीडर प्राइमरों का उपयोग करते समय आकार में लगभग ५०० आधार जोड़े हैं । जेल के अंतिम कॉलम में तारांकन १०० बीपी डीएनए सीढ़ी इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. IGHV FR1 प्राइमरों का उपयोग कर 13 रोगी नमूनों में IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था का पीसीआर प्रवर्धन । चौदहवें लेन नकारात्मक नियंत्रण whilst पंद्रहवीं लेन में लोड किया गया था सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं । के रूप में लेन 2 में सबूत है, जिसके लिए डीएनए शुरू सामग्री था, कई पीसीआर बैंड, जो उत्पाद और अलग अनुक्रम किया जाना चाहिए मनाया जाता है । गलियों में नमूने 5, 7, और 13 झुकेंगे polyclonal परिणाम (जेल में धब्बा द्वारा सबूत) और, इस प्रकार, पीसीआर कदम दोहराया जाना चाहिए । यदि एक दूसरी पीसीआर को बढ़ाना विफल रहता है पुनर्व्यवस्थित आइजी जीन (ओं) विश्लेषण एक नया नमूना (यदि संभव हो) पर किया जाना चाहिए या एक अलग प्राइमर सेट का उपयोग कर । अपेक्षित पीसीआर उत्पाद IGHV FR1 प्राइमर घोला जा सकता है का उपयोग करते समय आकार में लगभग ३५० आधार जोड़े है । जेल के अंतिम कॉलम में तारांकन १०० बीपी डीएनए सीढ़ी इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. genescan विश्लेषण का उपयोग कर clonality का मूल्यांकन । genescan विश्लेषण में, मोनोक्लोनल पीसीआर उत्पादों समान आकार (ऊपरी पैनल) के फ्लोरोसेंट उत्पादों की एक प्रमुख चोटी को जंम दे, जबकि polyclonal पीसीआर उत्पादों उत्पाद आकार (कम पैनल) के एक अधिक सामांय वितरण में परिणाम है । लाल निशान नमूना विश्लेषण किया जा रहा है के रूप में एक ही केशिका इंजेक्शन में भरी हुई है कि एक फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए सीढ़ी से चोटियों हैं. आकार मानक टुकड़े नमूने के रूप में एक ही electrophoretic बल के अधीन है और इसलिए एक ही इंजेक्शन की स्थिति को उजागर कर रहे हैं । आकार मानक टुकड़ों की वर्दी रिक्ति सटीक आकार कॉलिंग की पुष्टि करता है । नीले निशान नमूने के मोनोक्लोनल (शीर्ष पैनल) या polyclonal (नीचे पैनल) प्रकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. IMGT/वि-क्वेस्ट द्वारा प्रदान किए गए परिणाम सारांश तालिकाओं के उदाहरण । (क) एक उत्पादक के लिए परिणाम सारांश तालिका IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था (कोई रोक नहीं codon (ओं) और एक में फ्रेम अनुक्रम जंक्शन) । वी-जीन और एलील और जे-जीन और एलील उपयोगकर्ता अनुक्रम में IMGT द्वारा पहचान/वी-क्वेस्ट इस मामले में IGHV4-34 * 01 और IGHJ6 * 02 (उच्चतम संरेखण स्कोर मूल्यांकन के आधार पर) हैं । प्रतिशत पहचान ९९.६५ एक दैहिक उत्परिवर्तन के कारण% है । IMGT/JunctionAnalysis द्वारा पहचाने गए डी-जीन और एलील को पढ़ने के फ्रेम 1 में IGHD3-3 * 01 है । 4 ढांचा क्षेत्र (FRs) के साथ ही 3 complementarity निर्धारित क्षेत्रों (CDRs) की लंबाई कोष्ठक में संकेत कर रहे हैं । IGHV-डी-जे जंक्शन का अमीनो अम्ल (एए) अनुक्रम भी उपलब्ध कराया गया है । इस उदाहरण में जंक्शन में 22 आस शामिल थी. (ख) एक IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था अनुक्रम है कि एक बाहर के फ्रेम जंक्शन के कारण अनुत्पादक है के लिए परिणाम सारांश तालिका । CDR3-IMGT लंबाई के लिए एक X इंगित करता है कि इस अनुक्रम के लिए लंबाई निर्धारित नहीं किया जा सका । ए. ए. जंक्शन अनुक्रम में स्वीकार्य ' # ' संकेत एक frameshift इंगित करते हैं । (C) निम्न V-क्षेत्र पहचान (६०.९४%) का परिणाम सारांश तालिका चेतावनी और यह इंगित करता है कि ' उन्नत पैरामीटर ' अनुभाग में ' सम्मिलन और हटाए गए ' विकल्प का उपयोग किया जाना चाहिए. (घ) germline कम प्रतिशत पहचान के साथ मामले के लिए परिणाम सारांश तालिका में सचित्र (ग) ' सम्मिलन और विलोपन के लिए खोज ' विकल्प का उपयोग करके अनुक्रम विश्लेषण दोहराने के बाद. सही पहचान प्रतिशत कोष्ठक में प्रदर्शित किया जाता है और एक भी परिवर्तन की घटना के रूप में प्रविष्टि पर विचार की गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. गिरफ्तार/AssignSubsets उपकरण द्वारा जनरेट किया गया सबसेट असाइनमेंट रिपोर्ट तालिका । फसता ़ जुगाड़ से 10 CLL रोगियों (A1-A10) की गिरफ्तारी के लिए AssignSubsets उपकरण प्रस्तुत किए गए. मामले A4 CLL तोडऩे के लिए आवंटित किया गया था #2 (इस समूह के भीतर रोगियों को एक गरीब रोग का निदान SHM लोड के बावजूद) उच्च विश्वास के साथ जाना जाता है । अंय मामलों में से सात/अनुक्रम को एक प्रमुख छवि वाले सबसेट को नहीं सौंपा गया था और इसलिए इंहें असाइन नहीं किया गया । प्रस्तुत अनुक्रम (A7 और A8) के दो सबसेट असाइनमेंट के लिए उपयोग नहीं किया जा सका और स्थान के रूप में छोड़े गए/अस्वस्थ अनुक्रम के साथ समस्याओं के कारण, अर्थात, एक आउट-की-फ़्रेम जंक्शन या स्टॉप codons की उपस्थिति के कारण के रूप में दर्ज की गई । तालिका शीर्षकों और उपकरण की एक व्यापक विवरण गिरफ्तारी/AssignSubsets वेबसाइट३२पर उपलब्ध है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

CLL में ़ जीन का अध्ययन न केवल रोग pathobiology में एक बेहतर समझ प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी रोगी जोखिम स्तरीकरण में सुधार के लिए । यह इसलिए सर्वोपरि है कि बहु-चरण की प्रक्रिया ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण और क्रमिक आंकड़ों के बाद की व्याख्या एक मानकीकृत तरीके से किया जाता है । उपयुक्त और पर्याप्त रोगी सामग्री की उपलब्धता और नमूने के समय के बाद से परीक्षण पंजाब पर प्रदर्शन किया जा सकता है और एक उच्च CLL ट्यूमर सेल गिनती के साथ किसी भी नमूने पर ़ जीन उत्परिवर्तन विश्लेषण करने की क्षमता पर प्रभाव नहीं होना चाहिए । रक्त mononuclear कोशिकाओं के जुदाई ढाल जुदाई तरीकों का उपयोग नियमित रूप से नैदानिक प्रयोगशालाओं में किया जाता है, और हमेशा की तरह, देखभाल जब रक्त जोड़ने/RPMI ढाल युक्त ट्यूब के समाधान के लिए लिया जाना चाहिए; यह कार्य एक धीमी, कोमल तरीके से ढाल परेशान और कोशिकाओं की हानि को रोकने से बचने के लिए किया जाना चाहिए ।

कोशिका जुदाई के बाद, न्यूक्लिक एसिड निकाले जाते हैं । दोनों gDNA और सीडीएनए clonotypic ि्ग पुनर्व्यवस्था के SHM विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, तथापि, वहां या तो सामग्री के उपयोग के लिए लाभ और नुकसान कर रहे हैं । प्रयोगशाला कार्यप्रवाह जल्दी जब gDNA का उपयोग कर के बाद से कोई रिवर्स प्रतिलेखन के लिए पीसीआर प्रवर्धन से पहले प्रदर्शन किया जाना है आय । उस ने कहा, पीसीआर के लिए सब्सट्रेट के रूप में gDNA का उपयोग दोनों उत्पादक और अनुत्पादक पुनर्व्यवस्थाओं के प्रवर्धन में परिणाम हो सकता है, जो बारी में, अतिरिक्त हाथ प्रयोगशाला काम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यानी, कई पीसीआर उत्पादों की शुद्धि या जेल उत्पाद शुल्क और सभी पुनर्व्यवस्थाओं के व्यक्तिगत अनुक्रमण । जब gDNA और सीडीएनए दृष्टिकोण की तुलना, बाद के लिए एक रिवर्स प्रतिलेखन कदम पीसीआर प्रवर्धन के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, इस उदाहरण में, अधिकांश मामलों के लिए, केवल उत्पादक ़ पुनर्व्यवस्थाओं को परिलक्षित और बाद में अनुक्रम किया जाएगा । इस प्रकार, केवल एक ही पीसीआर उत्पाद शुद्ध और अनुक्रम होगा, जबकि परिणाम व्याख्या और अधिक सरल है ।

प्रवर्धन की दक्षता काफी हद तक gDNA/सीडीएनए, जो एक संवेदनशील ठहराव विधि का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाना चाहिए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, और प्राइमरों का उपयोग । प्राइमरों का इस्तेमाल संपूर्ण विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि SHM स्तर का सही निर्धारण केवल पुनर्व्यवस्थित IGHV जीन के पूरे अनुक्रम को बढ़ाना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । एक पूर्ण लंबाई की व्यवस्था ही अगर 5 ' IGHV नेता प्राइमरों का इस्तेमाल कर रहे है मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे एरिक ने नेता प्राइमरों के प्रयोग के लिए हाल ही में सिफारिशों को सही ठहराते27। वैकल्पिक प्राइमरों का उपयोग, अपूर्ण IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था के प्रवर्धन के लिए अग्रणी, IGHV जीन उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है, और इसलिए दृढ़ता के खिलाफ की सलाह दी । एकमात्र अपवाद मामलों से संबंधित है जो बार नकारात्मक परिणाम जब IGHV नेता प्राइमरों का इस्तेमाल किया और नए रोगी सामग्री का विश्लेषण कर रहे है या तो संभव नहीं है या भी परिणाम उपज नहीं है । यदि एक अलग रोगी नमूना और/या सामग्री (gDNA/सीडीएनए) और विभिंन प्राइमरों का उपयोग अभी भी एक पीसीआर उत्पाद का उत्पादन करने में विफल सेट, संभावित कारणों से हो सकता है कि ट्यूमर कोशिका बोझ बहुत कम है या कि lymphocytosis एक CLL क्लोन के कारण नहीं है (जो मामले में immunophenotype का पुनः मूल्यांकन किया जाना चाहिए). विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों हमेशा नैदानिक रिपोर्ट में कहा जाना चाहिए ।

मोनोक्लोनल बी कोशिकाओं के संचय से CLL परिणाम के रूप में एक ही IGHV-IGHD-IGHJ जीन पुनर्व्यवस्था असर, मामलों के विशाल बहुमत के लिए clonality आकलन एक अनूठा मोनोक्लोनल शिखर, यानी, एक क्लोन प्रकट होगा । दुर्लभ अवसरों पर, डबल rearrangement या भी oligoclonal पैटर्न३५मनाया जा सकता है । ऐसे मामलों में, जेल ट्रो clonality आकलन और टुकड़ा विश्लेषण जैसे अधिक संवेदनशील तरीकों के लिए पसंदीदा तकनीक नहीं है लागू किया जाना चाहिए । एक बार clonality की पुष्टि की गई है, अनुक्रमण करने से पहले अंतिम कदम पीसीआर उत्पाद की शुद्धि से संबंधित है सुनिश्चित करने के लिए कि उच्च गुणवत्ता के अनुक्रम प्राप्त कर रहे हैं । अंत में, IMGT/वी-क्वेस्ट उपकरण संसाधन एरिक द्वारा आइजी अनुक्रम विश्लेषण के लिए सिफारिश की है । के रूप में IMGT डेटाबेस लगातार अद्यतन कर रहे है और एक साथ मिलकर और अच्छी तरह से व्याख्या तरीके में परिणाम रिपोर्ट, इस उपकरण मानकीकृत विश्लेषण सुनिश्चित करता है और विभिंन नैदानिक या शैक्षणिक सुविधाओं के बीच तुलनात्मक विश्लेषण की सुविधा ।

CLL में immunogenetic विश्लेषण के रूप में शकुन है और, विशेष रूप से, पूर्वानुमान निहितार्थ, IGHV के मजबूत विश्लेषण-IGHD-IGHJ प्रमुख CLL के लिए असाइनमेंट सहित जीन पुनर्व्यवस्था, अब केवल वांछनीय है, लेकिन महत्वपूर्ण महत्व की । यह उपंयास चिकित्सीय और क्षमता के इस युग में विशेष रूप से स्पष्ट है कि ़ जीन विश्लेषण के लिए उपचार के निर्णय गाइड है5,21,22,23,३६,३७ ,३८, के रूप में आधिकारिक तौर पर NCI के हाल ही में अद्यतन द्वारा संकेत-24CLL पर अंतरराष्ट्रीय कार्यशाला से दिशानिर्देश प्रायोजित । उस ने कहा, कठोर मानकों का वारंट, विशेष रूप से clonotypic के SHM स्थिति के निर्धारण के रूप में IGHV CLL रोगियों में जीन पुनर्व्यवस्थित कर रहे है एक तुच्छ बात नहीं है और एक बहु कदम प्रक्रिया शामिल है । महत्वपूर्ण बात, कुछ प्रायोगिक कदम, सबसे विशेष रूप से प्राइमरों के विकल्प, जब विशिष्ट विकल्प और/या दृष्टिकोण का पालन कर रहे है बेहतर परिणाम उपज, अंय तकनीकी पहलुओं के लचीलेपन के कुछ अंश के लिए उत्तरदाई हैं, जैसे सामग्री चयन या clonality का आकलन करने के लिए विधि, तथ्य यह है कि वे सूक्ष्म मतभेद के लिए नेतृत्व के कारण, यदि कोई हो, अंतिम परिणाम के संबंध में.

पिछले दशक से अधिक, एरिक मानकीकरण और विभिंन CLL निदान और शकुन के लिए उचित तरीकों के अनुरूपता को बढ़ावा देने के लिए प्रयासरत है । यह प्रकाशित सिफारिशों और immunogenetic विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश27,३४, कई संगठित शैक्षिक कार्यशालाओं और घटनाओं, एक आइजी नेटवर्क की स्थापना, साथ ही साथ एक विशेषज्ञ ऑनलाइन मंच में परिलक्षित होता है चर्चा और CLL में ़ जीन अनुक्रम व्याख्या पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं । इन कार्यों के माध्यम से एरिक के समग्र लक्ष्य इष्टतम नैदानिक प्रबंधन और रोगी की देखभाल को बढ़ावा देने के लिए है । तीव्र प्रयासों के बावजूद, इस कार्य को पूरा से दूर है, और वास्तव में उपंयास उच्च प्रवाह प्रतिरक्षा रूपरेखा के उद्देश्य से अनुक्रमण के विकास के कारण और अधिक जटिल हो गया है । फिर भी, हालांकि चुनौतियां बनी रहती है, CLL में आइजी जीन विश्लेषण के मजबूत मानकीकरण के लिए गहन प्रयास जारी है और वर्तमान में एरिक के भीतर चल रही गतिविधियों का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं ।

Disclosures

लेखकों के हित का कोई प्रासंगिक विरोध प्रकट नहीं है.

Acknowledgments

हम अपने अनुसंधान समूहों के वर्तमान और पिछले सदस्यों, IgCLL समूह और एरिक, उनकी प्रतिबद्धता और CLL में immunogenetics अध्ययन में उत्साह के लिए धंयवाद । हम यह भी IMGT/CLL-DB पहल के सभी सदस्यों के भरोसेमंद सहयोग को स्वीकार करना चाहूंगा और, विशेष रूप से, प्रोफेसर मैरी-पॉल Lefranc और डॉ Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite मोंटेपेल्लियर द्वितीय, मोंटेपेल्लियर, फ्रांस, और IMGT, अंतरराष्ट्रीय ImMunoGeneTics सूचना प्रणाली, उनके भारी समर्थन के लिए और ़ जीन अनुक्रम विश्लेषण के साथ मदद करते हैं । यह काम TRANSCAN-१७९ उपंयास JTC २०१६ से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया; Associazione Italiana प्रति ला Ricerca सुल कांसरो AIRC (जांचकर्ता अनुदान #20246 और विशेष कार्यक्रम आणविक नैदानिक ऑन्कोलॉजी-5 प्रति मिलिंग #9965), मिलानो, इटली; ईटली di Rilevante Interesse Nazionale (पृण) #2015ZMRFEA, MIUR, रोम, इटली; स्वीडिश कैंसर सोसायटी, स्वीडिश अनुसंधान परिषद, Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, कारोलिंस्का Institutet, उपसाला विश्वविद्यालय, उपसाला विश्वविद्यालय अस्पताल और शेर के कैंसर रिसर्च फाउंडेशन, उपसाला; ओडीसियस कार्यक्रम, अनुसंधान और तकनीकी क्षेत्र पर सामरिक विकास के लिए "कार्रवाई" के तहत कार्यान्वित, संचालन कार्यक्रम "प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार" द्वारा वित्त पोषित "(NSRF 2014-2020) और ग्रीस द्वारा वित्त पोषण और सह यूरोपीय संघ (यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper ThermoFisher scientific 02-689-4 material storage
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin Becton Dickinson 362753 material storage
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ Daigger Scientific 366480 material storage
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15575038 cell processing
Centrifuge tubes 15 mL CS500 Corning 352096 cell processing
Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 Corning 352070 cell processing
RPMI Medium 1640 (1X) liquid Invitrogen 21875-091 cell processing
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL STEMCELL Technologies 17-1440-02 cell processing
Serological pipettes 5 mL Sarstedt 861,253,001 cell processing
Serological pipettes 10 mL Sarstedt 861,254,001 cell processing
Serological pipettes 25 mL Sarstedt 861,685,001 cell processing
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) Invitrogen 14190250 cell processing
Neubauer plate Marienfeld-Superior 640010 cell processing
Tuerk solution Sigma-Aldrich 93770 cell processing
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K1820-01 DNA extraction
QIAamp RNA Blood Mini Kit Qiagen 52304 RNA extraction
AllPrep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 DNA/RNA extraction
5X first-strand buffer Invitrogen P/N Y02321 cDNA synthesis
Random Primers, 20 µg Promega C1181 cDNA synthesis
RNaseOUT&trade; Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen 10777019 cDNA synthesis
DTT Invitrogen P/N Y00147 cDNA synthesis
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064-014 cDNA synthesis
10 mM dNTP Mix Invitrogen 18427013 cDNA synthesis, PCR
PCR Buffer Invitrogen O00065 PCR
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher scientific AB0359 PCR
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342-020 PCR
Applied Biosystems 5′ Labeled Primers ThermoFisher scientific - PCR/Clonality assessment
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 PCR product quantification
UltraPure TBE Buffer, 10X ThermoFisher scientific 15581044 gel electrophoresis
UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL ThermoFisher scientific 15585011 gel electrophoresis
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher scientific S33102 gel electrophoresis
10X BlueJuice Gel Loading Buffer Invitrogen 16500100 gel electrophoresis
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use Geneon 305-105 gel electrophoresis
UltraPure Agarose ThermoFisher scientific 16500500 gel electrophoresis
Agarose low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414-250G gel electrophoresis
Novex TBE Gels, 10%, 10 well ThermoFisher scientific EC6275BOX gel electrophoresis
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent ThermoFisher scientific 78201.1.mL PCR product clean-up
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 PCR product clean-up
GenomeLab DTCS Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 Sanger sequencing
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 ThermoFisher scientific R1181 Sanger sequencing
Glycogen, molecular biology grade ThermoFisher scientific R0561 Sanger sequencing
Ethanol absolute EMD Millipore 1024282500 Sanger sequencing
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72,706 general use
Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP Sarstedt 72,737,002 general use
Centrifuge equipment
PCR machine equipment
Bioanalyzer Agilent Technologies equipment

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४१ जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) दैहिक hypermutation (SHM) immunoglobulin immunoglobulin भारी चर (IGHV) complementarity निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) अंतर्राष्ट्रीय ImMunoGeneTics सूचना प्रणाली (IMGT)
जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में Immunoglobulin जीन अनुक्रम विश्लेषण: रोगी सामग्री से अनुक्रम व्याख्या करने के लिए
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Agathangelidis, A., Sutton, L. A., Hadzidimitriou, A., Tresoldi, C., Langerak, A. W., Belessi, C., Davi, F., Rosenquist, R., Stamatopoulos, K., Ghia, P. Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation. J. Vis. Exp. (141), e57787, doi:10.3791/57787 (2018).

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