Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Membran remodellering af gigantiske vesikler i svar til lokaliserede Calcium Ion forløb

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57789
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

Vi præsenterer en teknik til kontaktløse micromanipulation af vesikler, ved hjælp af lokaliserede calcium ion forløb. Mikroinjektion af en calcium ion opklaring, i nærheden af en kæmpe lipid vesikel, er udnyttet til at remodel lipid membranen, hvilket resulterer i produktionen af membran rørformede fremspring.

Abstract

I en lang række grundlæggende celle processer, såsom membran handel og apoptose, forekomme cellemembranen figur overgange sammen med lokale variationer i Calciumionkoncentrationen. De molekylære hovedkomponenter involveret i disse processer er konstateret; men den specifikke samspillet mellem calcium ion gradienter og lipider i cellemembranen er langt mindre kendt, hovedsagelig på grund af de biologiske celler komplekse karakter og den difficultly for observation ordninger. For at slå bro over denne kløft, er en syntetisk tilgang med held gennemført for at afsløre lokaliseret effekten af calciumioner på cellemembranen efterligner. Oprettelse af en efterligner til at ligne betingelserne inden for en celle er et severalfold problem. Først, en passende biomimetiske model med passende dimensioner og membran sammensætning er forpligtet til at fange de fysiske egenskaber af celler. For det andet en micromanipulation opsætning er nødvendig for at levere en lille mængde af calciumioner til en særlig membran placering. Endelig er en bemærkning ordningen forpligtet til at spore og registrere svar af lipid membranen til den eksterne stimulation. Denne artikel giver en detaljeret biomimetiske tilgang til at studere calcium ion-membran interaktion, hvor en lipid vesikel system, bestående af en kæmpe unilamellar vesikel (GUV) forbundet til en multilamellar vesikel (MLV), er udsat for en lokaliseret calcium gradient dannet ved hjælp af en mikroinjektion system. Dynamikken i den ioniske indflydelse på membranen blev observeret ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og indspillede-video frame rates. Som følge af membran stimulation, buet stærkt membran rørformede fremspring (MTPs) dannet inde GUV, orienterede væk fra membranen. Den beskrevne fremgangsmåde inducerer remodellering af lipid membranen og MTP produktion i et helt kontaktløse og kontrolleret måde. Denne tilgang introducerer et middel til at behandle oplysninger om calcium ion-membran interaktioner, giver nye muligheder for at studere mekanismerne af cellemembranen omformningen.

Introduction

Rollen af calciumioner inden for biologiske processer, specielt deres inddragelse i signalering, celledeling, og membranen fusion, er i fokus i mange Mekanistiske undersøgelser1. Intracellulære cytoplasmatisk Calciumionkoncentrationen er størrelsesordenen 100 nM, mens calcium i organeller, såsom endoplasmatiske reticulum, sekretoriske vesikler og mitokondrier, nå niveauer op til ti millimolars i koncentration. Dette skaber stejle calcium ion koncentration gradient størrelsesordener over intracellulære membraner2,3,4,5,6,7,8 ,9. Det ekstracellulære calcium ion niveau er ca 2 mM og derfor forekomme variationer af Calciumionkoncentrationen på begge de ekstracellulære og intracellulære niveauer. Desuden, de seneste undersøgelser dokumenterer, at intracellulære calcium ion signalering begivenheder og neuronal aktivitet kan finde sted under de lokale udsving af ekstracellulære calcium ion koncentrationer, der angiver betydningen af synkroniseret intra- og ekstracellulært calcium ion varianter10.

Med henblik på at forstå samspillet mellem calciumioner og biologiske membraner, en syntetisk tilgang, hvor indfødte cellemembraner er erstattet med lipid tolagede vesikler er gennemført med succes. Udsætter vesikler til calcium ion løsninger fører til ændringer i lipid hoved grupper og kulbrinte kæde pakning, øget membranen spændinger, og vesikel sammenlægning og opdeling af lipider og membran fase overgang11,12 ,13,14,15,16. Egenskaber i lipid membraner ved udsættelse for calciumioner er blevet undersøgt ved hjælp af sådanne eksperimentelle teknikker som X-ray, 1H-NMR og spektroskopiske eller termodynamiske undersøgelser11,16, 17 , 18. i disse studier, membran sammensætning er ofte indstillet til at ligne indfødte cellemembraner og indeholder sådanne fysiologiske lipider som phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE) og Phosphatidylserin (PS). PS er især vigtig i kunstige vesikel forberedelse, fordi det er et væsentligt element i mange cellulære processer herunder intracellulære membran handel, exocytose og apoptose19,20.

Størrelsen på syntetiserede lipid vesikler ofte spænder fra nanometer til flere mikrometer. Blandt forskellige vesikel præparater, giant unilamellar vesikler (GUVs), som har flere til et tocifret af mikrometer i diameter, er af særlig betydning på grund af deres relativt store størrelse, der ligner dimensioner for enkelte celler21 , 22 , 23. det tilgængelige areal af GUVs giver effekten af lokale kemiske gradienter på membran biofysiske egenskaber til at blive undersøgt. Ved at udsætte kun en del af membranen overflade til de eksterne stimuli, kan membranen dynamics undersøges nærmere. For eksempel, har det vist sig at lokaliseret anvendelse af kemiske eller pH forløb på overfladen af GUVs fører til dannelsen af rørformede fremspring, som ikke blev overholdt på bulk eksponering24,25. De konstaterede forskelle i membranen adfærd kræver yderligere metodeudvikling af single-vesikel forhør ordninger at få nogle indblik i mekanismerne i cellemembranen remodellering.

Bygger på metoder til mikroinjektion og micromanipulation fra det tidlige 1900-tallet26,27, i forbindelse med nyere fremskridt for single-vesikel manipulation ordninger fra 2000s23,28 , denne artikel præsenterer en tilgang, i hvilken membran remodeling og dannelsen af membran rørformede fremspring (MTPs) i GUV membran er genereret svar til lokal anvendelse af calciumioner.

Vores tilgang udnytter en vesikel kompleks bestående af en GUV tilsluttet en multilamellar vesikel (MLV) som en biomimetiske membran modelsystem (figur 1A). MLV er påkrævet som en lipid reservoir for kompleks til at levere lipid materiale til GUV under eksponering til et calcium-ion gradient. Denne forbindelse gør det komplekse til at kompensere for stigningen i membranen spændinger under induceret remodellering og forme skiftes af GUV membran og lipider MTP vækst. Desuden, MLV letter den overflade immobilisering, fordi dens masse er større sammenlignet med GUV. GUV-MLV komplekser, når immobiliseret på et fast underlag, har tidligere været brugt til fremstilling af nanorør-vesikel netværk, studerer polymer-membran interaktion og efterligne de sene stadier af exocytose29,30, 31,32,33.

Tidligere protokoller udnyttet sojabønner polar lipid ekstrakt (SPE) til at forberede GUV-MLV komplekser28. SPE består af en blanding af fosfolipider, der inkluderer PC (45,7%), PE (22,1%), phosphatidylinositol (PI, 18,4%), phosphatidic syre (PA, 6,9%), og en blanding af andre lipider (6,9%). I vores protokol heri, SPE blandingen er dopet med 20% af 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumsaltet) (DOPS) til at efterligne den indre folder af plasma cellemembranen. En yderligere 1% af ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) bruges til at plette lipid tolagede for at aktivere overvågning af membran remodeling ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. GUVs har symmetriske lipid sammensætning på tværs af tolagede og er udsat lokalt til 5 mM koncentrationer af calciumchlorid (CaCl2). Sådanne forsøgsbetingelser, med en forhøjet Calciumionkoncentrationen efterligner også ydre membran indlægsseddel apoptotiske celler, hvor PS molekyler er udtrykt34. Dannelsen af GUV-MLV komplekser kræver brug af en modificeret rehydrering-dehydrering metode oprindeligt udviklet af Criado og Keller35. Vesikel forberedelse protokol omfatter dannelsen af en tør lipid lag, som derefter bruges til at danne små blærer i løsning. Denne løsning er derefter dehydreret og rehydreret for at danne de endelige GUV-MLV komplekser. Figur 2A -D illustrerer de vigtigste skridt til forberedelse af et typisk GUV-MLV kompleks.

Efter vesikel forberedelse er afsluttet og den komplekse vesikel er immobiliseret på glas substrat, bruges mikroinjektion teknik til at levere små mængder af calciumioner af ydre indlægsseddel af GUV gennem en åben-tip glas mikropipette. Strømmen af calcium løsning ud af spidsen genererer en lokaliseret calcium ion gradient på GUV membranen overflade, hvilket fører til membran remodellering og generation af MTPs. MTPs er orienteret fra calcium ion kilde og vokse inde i GUV. Denne MTP dannelse kan være direkte overvåges ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og registreres ved hjælp af et digitalt kamera. Figur 3 viser opsætningen af eksperimenterende anvendes til fremstilling af membran remodellering. Dannelsen af MTPs (figur 2E og figur 4) i denne protokol viser en kontrasterende resultat at calcium ion eksponering eksperimenter udført i bulk volumen betingelser. Under bulk betingelser, i GUVs briste og danne membran patches, som kan observeres for at tiltræde glas overflade25.

Yderligere oplysninger om dannelsen af GUV-MLV komplekser, samt at udføre mikroinjektion af calciumioner procedure, er forklaret i denne artikel. Protokollerne er stort set fokuseret på calcium ion mikroinjektion; denne fremgangsmåde kan dog nemt ændres til brug i at studere membran svar på grund af lokal eksponering for andre ioner eller proteiner. Derudover kan sammensætningen af vesikler indstilles for at isolere lipid komponent roller i processen med membran remodeling. Den præsenterede protokol kræver ikke nogen sofistikeret udstyr til at producere GUV-MLV komplekser og er karakteriseret ved en høj grad af reproducerbarhed.

Protocol

1. forberedelse af små Lipid vesikler

  1. Der fremstilles en opløsning af lipider SPE/DOPS/ATTO488-DOPE i chloroform med en masse blanding forholdet mellem 79/20/1.The endelige koncentration af lipider i chloroform er 1 mg/mL, og den endelige masse er 0,6 mg (typisk mindre end 1 mg). Brug engangs rund bund hætteglas (rund bund glasrør, 10 x 75 mm) ved udarbejdelsen af lipid løsning uden en forudgående rengøring trin.
    1. Fylde og skylle glas sprøjter (25 µL) med den chloroform, mindst 5 gange før brug. Til at fylde og skylle glas sprøjte mindst 5 gange, 3-4 mL chloroform er tilstrækkelig.
      Forsigtig: Når håndtering chloroform, bruge glas sprøjter og udføre alle procedurer i et stinkskab mens iført passende handsker og beskyttelsesbriller på alle tidspunkter. Brug ikke nogen plastik flasker, sprøjter eller pipetter, når du håndterer chloroform.
  2. Wrap hætteglasset indeholdende lipid blanding med metalfolie til at beskytte indholdet fra omgivende lys og fordamper opløsningsmidler i en rotationsfordamper til 3 h til at fjerne chloroform, med presset at nå 7 kPa vakuum på 80 rpm. En tør lipid film er dannet i bunden af hætteglasset efter fordampning (figur 2A).
    Bemærk: Skalere op flere gange og ved hjælp af større mængder af lipider kan kræve længere roterende fordampning tid til at sikre fuld fjernelse af chloroform.
  3. Langsomt tilføje 600 µL af phosphat bufferet saltvand (PBS) bufferopløsning (pH 7,8, uden fortynding) oven på tørret lipid film. Efter tilsætning af bufferen, forsigtigt tilføje 6 µL af glycerol til at beskytte prøven fra komplet dehydrering under GUV-MLV dannelse trin (at opnå en endelig koncentration på glycerol 1 wt %)36. Forsegle hætteglasset med parafilm og dække med metalfolie for at beskytte fra omgivende lys. Opbevares i køleskab ved 4 ° C natten over.
    Bemærk: PBS stødpudeopløsning består af 0.151 g af Trizma base, 1.592 g K3PO4, 1.021 g KH2PO4, 0.062 g af MgSO4 ·7H2O og 0.0465 g af EDTA i 250 mL renset vand. Gemme løsning ved 4 ° C, og varme til stuetemperatur før anvendelse. Det tilsvarende beløb i 10 mM HEPES buffer kan anvendes i stedet for PBS løsning. HEPES stødpudeopløsning fremstilles ved fortynding af en 1 M HEPES stamopløsning med renset vand.
  4. Den følgende dag, sonikeres hætteglasset indeholdende løsning i 1 minut ved hjælp af en ultralydbehandling bad ved stuetemperatur. Fjerne parafilm og afpipetteres indtil en visuelt ensartet løsning af små lipid blærer dannes (figur 2B). Alikvot 30 µL af den opnåede lille lipid vesikel løsning til individuelle 0,5 mL plasticrør. Holde disse stock delprøver på 18 ° C i højst 6 måneder.
    Bemærk: Hvis den lille lipid vesikel løsning ikke er visuelt uniform, vortex løsning 4 gange for 1-2 s brug en vortex-mixer ved maksimal hastighed.

2. forberedelse af GUV-MLV komplekser

  1. Tø til stuetemperatur et plastikrør, som indeholder en alikvot af frosne suspension af små lipid vesikler. Vortex tube 4 gange for 1-2 s brug en vortex-mixer ved maksimal hastighed.
  2. Sted 5 µL af små lipid vesikel suspension på overfladen af et glas dækning slip (24 x 60 mm) til at danne en lille runde slipværktøj. Bruge et glas dækning slip uden forudgående rengøring trin.
  3. Placer glas dækning slip i et vakuum ekssikkator (< 100 kPa vakuum) i 20 min.
  4. Gemme tørrede lipid filmen ved stuetemperatur i 4 min., derefter langsomt afpipetteres 50 µL af 10 mM HEPES buffer på toppen af den tørre lipid film til rehydrering. Vent 5 min. til at pre danne GUV-MLV komplekser (figur 2 c).
  5. Centrere et glas dækning slip på mikroskop scenen, så Tilsæt 300 µL af HEPES buffer på det og placere midten af droplet over målet (figur 3B).
  6. Overføre de 50 µL af opløsningen præformerede GUV-MLV i HEPES løsning (300 µL). Vente 25 min. så tyndt dannede GUV-MLV komplekser til fast overholder overfladen af glas dækning slip (figur 2D).
    Bemærk: Lejlighedsvis, GUV-MLV komplekser udgør ikke på glas dækning slip og i stedet lipid patches eller kun MLVs overholdes. Dette kan forklares ved utilsigtet ryster af prøven under trin 2.4 eller 2.6 eller talrige fryse-tø cykler af små vesikel suspension. Gentag trin 2.1-2.6 eller bruge frisklavede lipid stamopløsning (trin 1.1) til at hente GUV-MLV komplekser.

3. mikropipette forberedelse og mikroinjektion

  1. Runde kanterne af borsilikatglas kapillærerne ved forsigtigt at kapillar ender i flamme fra et stearinlys til at forhindre mikropipette fra brudt mens den vedhæftes mikropipette indehaveren.
  2. Trækker mindst 3 glas kapillærer ved hjælp af en automatisk laser puller ved hjælp af programmet sæt: varme = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Varme = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Programmet sæt skal indtastes med den første værdi af Pul tomt. Ved hjælp af borsilikatglas kapillærer af indre diameter (I.D.) 1.00 mm og udvendig diameter (OD) 0,78 mm resultater i en mikropipette en aflæsse åbningen af omkring 0,3 µm i diameter.
  3. Back-fyld hver mikropipette med 8 µL af 5 mM CaCl2 løsning i HEPES buffer (10 mM) ved hjælp af en microloader. Filtrer CaCl2 løsning ved hjælp af en 0,2-0,5 µm sprøjte filter før brugen for at undgå tilstopning af pipette tip.
    Bemærk: Sikre at CaCl2 er helt opløst i HEPES bufferopløsning, som også anvendes til trin 2,4-2,6.
  4. Tilslut en mikropipette indehaver til en micromanipulator. Montere mikropipette i mikropipette holder stramt. Tilslut indsprøjtningspumpe og kapillær indehaver bruger levering røret.
  5. Start indsprøjtningspumpen. Juster indstillingerne under indsprøjtningspumpe til 20 hPa (indsprøjtning pres) og sat en 5 hPa kompensation pres, automatisk tilstand. Pause indsprøjtningspumpen indtil mikropipette er klar til mikroinjektion.
  6. Sat lup til brightfield tilstand. Konfigurer det for differential interferens kontrast (DIC). Bruge 63 X eller 100 X høj NA (1.3) mål for at opnå den optimale membran kant opløsning.
  7. Brug den grove micromanipulator til at placere mikropipette ovenfor slipværktøjet indeholdende GUV-MLV komplekser. Find spidsen af mikropipette over målet.
  8. Fokusere mikroskopet på midtpunktet af GUV-MLV kompleks og derefter koncentrere ca 50 µm ovenfor GUV. Bruge den grove tilstand af micromanipulator at mikropipette forsigtigt i fokus.
  9. Skift micromanipulator til den fine tilstand. Langsomt koncentrere GUV overflade mens oversætte mikropipette spidsen ned og holde spids i fokus. Placer mikropipette spids ca 20 µm fra GUV overflade. Hvis mikropipette tip er brudt på grund af utilsigtet kontakt med glas dækning slip (eksemplet i figur 5B), Erstat det straks for at undgå unødvendige calcium ion overgang til bulk prøveopløsningen.

4. dannelse og oversættelse af MTPs ved hjælp af Calcium Ion kilde

  1. Sat lup i fluorescens tilstand. Sæt dichroics til at ophidse på 488 nm og opdage emission på 505-550 nm.
  2. Tænd indsprøjtningspumpen og starte calcium ion injektion. Bruge den fine tilstand af micromanipulator, og langsomt nærmer GUV med mikropipette spids. Placer mikropipette tip i en afstand af 3 µm fra membranen overflade samtidig indsprøjtning CaCl2 løsning fra mikropipette til at tillade MTPs at form (figur 4).
  3. For at oversætte MTPs langs GUV overflade, langsomt flytte pipette tip (med en hastighed på 0,1-0,3 µm/s) omkring GUV overflade ved hjælp af den fine micromanipulator (figur 6). Vedligeholde omtrent den samme afstand (3 µm) mellem GUV overflade og mikropipette tip samtidig med calcium ion injektion.
    Bemærk: Til høj oversættelse priser mikropipette spids (over 0,7 µm/s), MTPs vil ikke migrere i sync med mikropipette. I stedet vil de sprede og forkorte, mens nye MTPs vil blive dannet på den nye placering af mikropipette tip (figur 7).
  4. Stop mikroinjektion, aktivere off indsprøjtningspumpen og flytte mikropipette fra GUV overflade.

Representative Results

I dette arbejde vise vi oprettelsen af GUV-MLV komplekser og hvordan de kan bruges til at belyse effekten af calcium ion forløb på cellemembranen dynamics. Overflade-attached GUV-MLV komplekser er nødvendige for disse eksperimenter for at give mulighed for en fast celle mellemstore efterligner samtidigt med at indrettede en ion forløb gennem mikroinjektion. GUV membran reagerer på lokaliserede calcium koncentration gennem dannelsen af MTPs rettet fra calcium ion kilde. Derudover kan MTPs oversættes omkring GUV i en kontaktløs måde ved at flytte mikropipette tip omkring membranen overflade.

En skematisk illustration af proceduren GUV-MLV forberedelse er vist i figur 2. Selvom præsenteres protokollen, GUV-MLV komplekser er allerede pre dannet under trin 2.4 (figur 2 c), tillader overføre vesikel løsning til en anden 300 µL droplet buffer (trin 2.6 i protokollen) de sparsomt dannede GUV-MLV komplekser til tilstrækkeligt overholde glas substrat. På denne måde et egnet kompleks for micromanipulation og mikroinjektion er etableret (figur 2D). Lejlighedsvis, indeholder GUVs en eller flere fanget lipid blærer, som ikke påvirker MTP dannelse, som vist i figur 4A. Disse GUVs producere MTPs; imaging kan dog blokeres, hvis de fanget vesikler er store. Fleste af de tilberedte GUVs (op til 75%) vises halvkugleformet og er knyttet til MLVs, som vist i figur 1A. Disse vesikler er hovedfokus i denne protokol og er velegnet til mikroinjektion procedure. Omkring 25% af de resterende GUVs vises bølgende (figur 1B), som er vejledende for en lavere membran spænding regime. Disse bølgende vesikler også mulighed for dannelsen af de rørformede fremspring; men de udviser forskellige kinetik og en forskellig morfologi af de dannede MTPs, som ligger uden for rammerne af denne protokol25. Den typiske diameter af de forberedte vesikler varierer fra 2 til 15 µm for MLVs og mellem 2 til 40 µm for GUVs. Den optimale GUV størrelse for eksponering for calciumioner er 5 µm eller større.

Mikropipetter har været brugt i singe-celle forhør ordninger samt som procedurer kræver manipulation af syntetiske GUVs for flere årtier37,38. Fleste af disse programmer involveret direkte fysisk kontakt mellem mikropipette og overfladen af celler eller blærer. Eksempler kan nævnes patch-clamp-teknik eller trække membran bindsler fra GUV membran, foruden bygning nanorør-vesikel netværk23,28,39. For nylig, Mikropipetter har også været brugt til at generere lokaliserede forløb af ioner og molekyler omkring GUVs at rekonstruere heterogene celle microenvironments24,25. I præsenteret protokollen er en velfungerende mikropipette (figur 5A) en afgørende faktor for at etablere en calcium ion gradient på GUV overflade ved at frigive den løsning, der er indeholdt i. Korrekt positionering af mikropipette på GUV overflade og undgå kontakt med lipid membranen er afgørende for vellykket mikroinjektion. Mikropipette spids holdes i en afstand af ca 3 µm fra GUV overflade, som er en optimal afstand til at generere MTPs mens efterligne variationer af calcium i nærheden af cellemembranen. Hvis mikropipette tip er tilfældigt brudt (figur 5B), er en udskiftning nødvendig. Den tidligere testede koncentration vifte af CaCl2 inde mikropipette, der giver mulighed for MTP dannelse, er mellem 2 og 5 mM25, hvilket svarer til ekstracellulære calcium koncentrationer. Ved lavere CaCl2 koncentrationer, dvs., 1 mM, er ingen MTPs observeret.

Dannelsen af MTPs ved calcium mikroinjektion begynder med dannelsen af små membran invaginations, som vokser i MTPs i stedet for eksponering (figur 4B). MTPs fortsætte med at vokse så længe GUV membran rester udsat for calciumioner. De svinger og pege væk fra calcium ion kilde (figur 4 c, supplerende Movie 1). Når calcium ion forsyning er afbrudt, MTPs scatter over GUV overflade, hvilket gør det vanskeligt at konkludere, om MTPs forblive eller i sidste ende forsvinde.

Dannelsen af MTPs kan forklares ved lokaliserede calcium ion binding til den eksponerede ydre folder af GUV membran og udløser spontan krumning (m), som er direkte forbundet med dannelsen af spontan spænding σ = 2κm2 (Κ er bøjning stivhed), der inducerer bøjning af membranen og danner indad MTPs. Tidligere rapporter har vist, at deformation af membranen kan blive forklaret af kondens og/eller klynger af de negativt ladede lipider ved binding af calciumioner til membranen, hvilket resulterede i negative spontan krumning40. Alternativt, den stærke binding af Ca2 + til overfladen af den negativt ladede tolagede neutraliserer den overflade massefylde udsatte lipid tolagede indlægsseddel. Dette fører til massefylde forskellen på tværs af tolagede, hvilket resulterer i nul spontan krumning, tilstrækkelig til at bøje membran25.

Den observerede dannelsen af MTPs viser en følsomhed af lipid membraner til calciumioner og tilbyder en roman kontaktløse tilgang for at producere membran rørformede strukturer. Belyse oprindelsen af denne membran tubulation kan være vigtigt for at forstå dynamikken i membran form skifter under forskellige cellefunktioner og celle omlægning og kan være nyttige for at få indsigt i lipid organisation inden for celle membraner.

De observerede MTPs er altid genereres på webstedet på membranen gennemgår calcium ion eksponering. Således, ved at vælge placeringen af mikropipette tip, det er muligt at definere området af GUV overfladen for fremspring vækst. Næste, hvis mikropipette er langsomt (0,1-0,3 µm/s) flyttet rundt GUV overflade, samtidig med at afstanden fra membran, MTPs er oversat i tandem med en mikropipette. Figur 6 og den tilsvarende tillægs Movie 2 viser sådan migration af MTPs omkring GUV overflade. Denne proces forventes at være ledsaget af dannelsen af nye MTPs ved kontinuerlig calcium ion injektion25. Til høj oversættelse priser (over 0,7 µm/s) er MTPs ikke kunnet følge mikropipette tip. I stedet er nye fremspring dannet på den nye placering af mikropipette tip (figur 7).

Den observerede kontaktløse calcium ion-styrede oversættelse af MTPs omkring GUV overflade kan yderligere vores forståelse af den drivende kræfter bag dynamikken i membranen rørformede strukturer inde i cellerne. Desuden, denne tilgang tilbyder en roman kontaktløse mode for at kontrollere transport af materiale i blød sag systemer ved hjælp af kemiske gradienter.

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant fluorescerende mikroskopi billeder af GUV-MLV komplekser immobiliseret på overfladen af et glas dækning slip. A. eksempel på en sfærisk GUV. GUV vises i form af en halvkugle, der er knyttet til MLV. B. eksempel på en bølgende GUV. De sorte pile angiver de deforme områder af membranen. Billederne er forbedret og omvendt for at forbedre visualiseringen af fluorescently mærket GUV membraner. Skalalinjen repræsenterer 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematiske illustrationer af GUV-MLV forberedelse og mikroinjektion ordninger. (A). en tør lipid lag er dannet i bunden af hætteglasset som følge af den roterende fordampning af chloroform fra lipid løsning. B. rehydreret lipid lag er sonicated, og små lipid blærer dannes. (C). en lille dråbe af vesikel løsning (5 µL) er placeret på overfladen af et glas dækning slip og overført i en ekssikkator i 20 min. til at dehydrere lipid løsningen og danne en tør lipid film (dette trin ikke er vist). Rehydrating tør lipid film med 50 µL stødpudeopløsning producerer præformerede GUV-MLV komplekser. (D). overførsel af de præ-dannet komplekser til en større volumen af buffer resulterer i dannelsen af tyndt adskilt GUV-MLVs knyttet til overfladen af glas dækning slip. (E). positionering mikropipette nær overfladen af GUV og frigivelse af calciumioner udløser dannelsen af MTPs. Illustrationerne er ikke trukket til skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Eksperimentel opsætning for mikroinjektion af calciumioner. (A). komponenterne i den eksperimentelle opsætning er nødvendig til at generere MTPs i GUVs. B. nærmere oplysninger om opsætningen af mikroinjektion. Glas coverslip med løsning af GUV-MLV komplekser placeret på stadiet mikroskop. Vinklen mellem mikropipette og overfladen af glas dækning slip er 30° (markeret med hvide). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Dannelsen af MTPs ved mikroinjektion af calciumioner på overfladen af GUV. (A). The GUV-MLV kompleks før eksponering til et calcium-ion gradient. Pilen angiver en lipid vesikel fanget inde i GUV, og som ikke hindrer observation af MTPs. (B). Små MTPs er dannet ved mikroinjektion af calciumioner (5 mM koncentration af CaCl2 i mikropipette). C. vækst af MTPs ved kontinuerlig eksponering til calciumioner. Fluorescens billeder er udvidet og omvendt for visualisering formål. Skalalinjen repræsenterer 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Glas Mikropipetter bruges til calcium ion mikroinjektion. (A). et eksempel på en velfungerende mikropipette. (B). et eksempel på en mikropipette, der har en brækket tip (det beskadigede område er angivet med en sort pil). Begge billeder er udvidet og omvendt for bedre visualisering. Skalalinjen repræsenterer 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Calcium ion-styrede oversættelse af MTPs i nærheden af overfladen af GUV. (A). The MTPs dannes på GUV overfladen ved mikroinjektion af 5 mM CaCl2 løsning. (B-C). Oversættelse af mikropipette tip (0,2-0,3 μm/s) omkring membranen overflade udløser bevægelse af MTPs i retning af calcium ion kilde. De sorte pile fremhæve retning bevægelighed mikropipette. Billederne er forbedret og omvendt for at forbedre membran visualisering. Skalalinjen repræsenterer 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : MTPs med høj oversættelse sats på mikropipette tip. (A). The MTPs dannes på GUV overfladen ved mikroinjektion af 5 mM CaCl2 løsning (hvid streg). (B-C). En høj oversættelse på mikropipette omkring GUV overflade (1 μm/s) resulterer i dannelse af nye MTPs på den nye placering af mikropipette tip (magentarød linje), samt spredning af de tidligere dannede MTPs (hvid streg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Supplerende Movie 1: Dannelsen af MTPs i GUV ved lokaliserede udsættelse for Ca 2 + gradient. Venligst klik her for at downloade denne film. 

Movie 2
Supplerende Movie 2: Calcium ion-styrede MTP migration omkring GUV overflade.   Venligst klik her for at downloade denne film. 

Discussion

Biomimetiske celle systemer giver mulighed for undersøgelse af membran adfærd ved udsættelse for eksterne stimuli som ioner, proteiner eller nanopartikler. GUVs, at være sådan en model, kan reagere på ændringer i det kemiske miljø ved at justere deres form, som ofte involverer dannelsen af rørformede strukturer og invaginations24,41,42,43 .

Denne artikel indeholder en fremgangsmåde til at generere MTPs i en kontaktløs måde via remodellering af GUV overfladen ved lokaliserede injektion af calciumioner på GUV overflade. Protokollen beskriver forberedelse af GUV-MLV-komplekset, som efterligner en celle plasmamembran samt, hvordan til at ansætte en mikroinjektion teknik til at generere calcium ion forløb tæt på GUV overflade til at danne MTPs. Fleste af tidligere eksperimentelle undersøgelser, behandles calcium ion-membran interaktioner udsat lipid vesikler til bulk calcium ion koncentration14,17. Afhængigt af de eksperimentelle betingelser, kan sådan bulk eksponering resultere i forskellige membran svar med rørformede fremspring dannet25.

Dannelsen af GUV-MLV komplekser er temmelig ligetil og kræver kun almindeligt laboratorieudstyr, såsom en roterende fordamper, ultralyd bad og vakuum ekssikkator. Alligevel er der stadig flere vigtige skridt til at overveje at vesikel forberedelsen. Det er vigtigt at sikre, at dehydrering af vesikler er komplet (under trin 2.3 i protokollen) og en tør cirkulære lipid film der indeholder kun en lille mængde salt krystaller dannes på overfladen af glas dækning slip. Omhyggelig håndtering af vesikel løsning, ved hjælp af friske lipid stamopløsning i kloroform samt friske HEPES buffer, er afgørende for vellykket forberedelse af GUV-MLV komplekser under eksperimentet. Sikker fastgørelse af GUV-MLV kompleks glas dækning slip overflade er desuden afgørende for micromanipulation og mikroinjektion. For at bekræfte tilstrækkelig vedhæftning af GUV-MLV komplekse, mikropipette (uden injektion flow) kan bruges til at forsigtigt skubbe mod GUV overflade. En fast overholdt vesikel vil ikke glide langs overfladen ved direkte fysisk kontakt. Fordi eksperimenterne er udført i en åben buffer droplet, som kan blive afhørt i flere timer, skal fordampning tages i betragtning. Fordampning fra buffer slipværktøjet vil ændre de osmotiske betingelser, som kunne påvirke og destabilisere vesikler. Hvis du vil gendanne osmotisk betingelser, returnerer periodiske tilsætning af rent vand til at prøve at gendanne den oprindelige diskenhed systemet til homøostase.

Når du ændrer lipid membranen sammensætning, er det afgørende, at vesikler er produceret i form af et GUV-MLV kompleks fordi MLV giver mulighed for overførsel af lipid materiale til GUV under membran omdannelsen. Tidligere undersøgelser har vist, at erstatte komponenter af SPE blanding med ren lipider, eller tilføje 5-30% af kolesterol, også giver mulighed for GUV-MLV kompleks dannelse28,44. Fleste af de tilberedte GUVs er unilamellar45.

Desuden, når du tester andre divalent kationer, såsom magnesiumioner, dannelsen af MTPs stærkt afhænger af tilstedeværelsen af negativt ladede DOPS i lipid blanding. Uden DOPS udgør MTPs ikke i de blærer, der er beskrevet i denne protokol. Også, monovalent kationer, kalium og natrium, ikke resulterer i dannelsen af MTPs, selv i DOPS-holdige vesikler25.

Ud over de kritiske trin vedrørende forberedelse og manipulation af GUVs er der flere vigtige faktorer at overveje ved mikroinjektion procedure. Den succesfulde mikroinjektion af calciumioner stærkt afhængig af fungerende glas Mikropipetter, som tilberedes på dagen af forsøget. Der er flere faktorer, der kan forårsage mikropipette funktionsfejl. En almindelig årsag er en tilstoppet tip åbning. Lille lipid partikler, som er biprodukter af vesikel forberedelse, er spredt i løsningen og har tendens til at tiltræde mikropipette tip, derved skabe en tilstopning. Rengøring pipette tip gøres bedst ved at løfte det op fra vesikel løsningen og placere det tilbage tæt på GUV overflade. Brugen af blow-out funktion af mikroinjektion pumpen skal undgås, fordi det resulterer i massiv indsprøjtning af calciumioner i bulk løsning. Derudover forhindre små luftbobler fanget inde mikropipette korrekt mikroinjektion, som tilfældet mikropipette bør udskiftes med en ny. Tip brud kan minimeres væsentligt ved at placere den eksperimentelle setup på en vibrations-dæmpning tabel at minimere tip svingninger.

Derudover skal pleje tages, når du vælger en observation ordning, at minimere photobleaching, samtidig med at opnå de bedste tidsopløst billeder. Wide-felt laser-induceret Fluorescens mikroskopi blev udnyttet i denne protokol, fordi det giver mulighed for en relativt høj image erhvervelse sats på en objektiv begrænset sonde dybde. Desuden brug af inverteret mikroskopi giver mulighed for samtidige mikroinjektion og observation af lipid vesikler og MTPs.

En af de vigtigste begrænsninger af metoden præsenteres er kravet om omfattende manuelt arbejde og tilstrækkelig micromanipulation færdigheder. Fordi komplekser er dannet gennem en spontan proces, hævelse, ikke kan GUVs og MLVs størrelse kontrolleres. Denne protokol tillader desuden ikke til kontrol af membran spændingen i de forberedte GUV-MLV komplekser, som kan være nødvendigt at indsamle yderligere oplysninger om membran remodellering. GUVs er forbundet til MLVs med den sidstnævnte leverer lipid materiale for den betydelige vækst i MTPs i et omfang, der ville være umuligt at opnå, udelukkende udnytter den membran, der er tilgængelige fra GUVs. MLVs også bidrage til at sænke enhver laterale overfladespænding variationer inden for den GUV-MLV komplekse44, som ville vanskeliggøre forsøg på at styre spændingen i vesikel ved hjælp af mikropipette aspiration. Denne GUV-MLV-baseret model giver en lavere spænding, der bedre efterligner de spænding regimer fundet i cellulære membran strukturer forbundet med membran reservoirer, såsom membran folder og invaginations46. På samme tid, kan mikropipette aspiration teknik anvendes med succes for at styre membran spændinger i enkelt GUVs. For eksempel tilsendt arbejde af Graber et al. detaljer på dannelsen af membran rørformede invaginations i enkelt GUVs ved binding af calciumioner membran på bulk betingelser fra varieret spænding regimer40. Endelig, sammenligning af membran adfærd på både lokale og bulk eksponering for calcium kræver bedre kontrol af membranen vedhæftning til overfladen, som er uden for rammerne af denne protokol.

For at opsummere, den foreslåede teknik gør det muligt for kontaktløse membran remodellering og dannelsen af MTPs ved lokaliserede stimulation med calciumioner. Fremtidige anvendelser af denne metode center på oversættelse fra syntetisk vesikel systemer til native biologiske membraner, såsom celle blebs. Den foreslåede metode kan være indarbejdet med andre encellede forhør ordninger, som patch-klemme eller mikroelektrode amperometry, eller kombineret med lokaliseret varme strategier31,47,48. Test effekt af andre ioner eller molekyler er ligetil og indebærer simpelthen erstatter calciumioner med molekyler af interesse. Derudover kan komplekse syntetiske lipid blærer produceres gennem membran functionalization med transmembrane proteiner, som kan udvide vores forståelse af Biofysik af celle omlægning og cellemembranen dynamics tilknyttet sansning af lokale kemiske gradienter. Sidst men ikke mindst, kontaktløse stimulation af lipid membranen kan også oversættes til polymere bløde sagen systemer, tilbyder et grundlag for en roman kontaktløse manipulation platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soy bean polar lipid extract Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 541602C 100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 840035C 1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO-TEC (Germany) AD 488-31 1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack Corning Incorporated (Corning, NY 14831) 99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer Sigma Aldrich (Missouri, USA) 650498-1L-D
Rotary evaporator Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm KEBO lab (Sweden) MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO Sharlau Chemie S.A. (Spain) P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% Sigma Aldrich (Missouri, USA) S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% Sigma Aldrich (Missouri, USA) G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% Sigma Aldrich (Missouri, USA) T-1503 2050 g
Trizma base Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 5886
MgSO4 Merck (USA) 34549-100 g
EDTA Sigma Aldrich (Missouri, USA) H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture Sigma Aldrich (Missouri, USA) Z260282-1PAK 24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm Sigma Aldrich (Missouri, USA) 631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slip VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer Labnet International (USA)
488 nm laser line  Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes Leica (Germany) 12847995 
Inverted fluorescence microscopy system  Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) Technologies GmbH (Thuringia, Germany) 300038
PatchStar Micromanipulator Scientifica (Uckfield, UK) 612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.  Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips) VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller  Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet Eppendorf (Germany)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum? Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Tags

Kemi sag 137 Giant vesikler lipid membranen micromanipulation mikroinjektion calciumioner calcium gradient membran rørformede fremspring spontane krumning membran remodeling
Membran remodellering af gigantiske vesikler i svar til lokaliserede Calcium Ion forløb
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali Doosti, B., Cans, A. S.,… More

Ali Doosti, B., Cans, A. S., Jeffries, G. D. M., Lobovkina, T. Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients. J. Vis. Exp. (137), e57789, doi:10.3791/57789 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter