Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Membranet omdaning av gigantiska blåsor som svar på lokaliserade kalcium Jon övertoningar

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57789
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

Vi presenterar en teknik för kontaktlösa mikromanipulation av blåsor, använda lokaliserade kalcium Jon övertoningar. Mikroskop av en kalcium ion lösande, i närheten av en jätte lipid vesikler, används för att omforma lipid membranet, vilket resulterar i produktionen av membran tubulär utbuktningar.

Abstract

I en mängd olika grundläggande cellprocesser vid exempelvis membran människohandel och apoptos, förekommer cellmembranet form övergångar samtidigt med lokala variationer i kalcium jonkoncentration. De viktigaste molekylära komponenterna som är engagerade i dessa processer har identifierats; dock särskilda samspelet mellan kalcium Jon övertoningar och lipider inom cellmembranet är betydligt mindre känd, främst på grund av den komplicerade karaktären av biologiska celler och difficultly av observation system. För att överbrygga denna klyfta, implementeras en syntetisk metod framgångsrikt för att avslöja lokaliserade effekten av kalciumjoner på cellmembranet härmar. Upprättandet av en härma för att likna villkor inom en cell är ett severalfold problem. Att fånga de fysiska egenskaperna hos celler krävs först en adekvat biomimetiska modell med lämpliga dimensioner och membran sammansättning. För det andra behövs en mikromanipulation setup att leverera en liten mängd av kalciumjoner till en viss aluminiummembran läge. Slutligen krävs ett system för observation för att upptäcka och registrera lipid membranet reagerar på yttre stimulering. Den här artikeln innehåller en detaljerad biomimetiska tillvägagångssätt för att studera kalcium Jon-membran samspelet, där en lipid vesikler system, bestående av en jätte unilamellar vesikler (GUV) ansluten till en multilamellar vesikler (MLV), utsätts för en lokaliserad kalcium gradient bildas med hjälp av ett Mikroskop system. Dynamiken i Joniska påverkan på membranet var observerade med fluorescensmikroskopi och inspelad på video bildhastighet. Till följd av membran stimulering, böjd mycket membran tubulär utbuktningar (Mbps) bildas inuti GUV, orienterade från membranet. Den beskrivna metoden inducerar ombyggnaden av lipid membranet och MTP produktion på ett helt kontaktlöst och kontrollerat sätt. Detta tillvägagångssätt introducerar ett sätt att hantera information om kalcium Jon-membran kontakter, ge nya vägar för att studera mekanismerna i cellmembranet omforma.

Introduction

Rollen av kalciumjoner inom biologiska processer, särskilt deras deltagande i signalering, celldelning och membran fusion, är i fokus för många mekanistiska studier1. Den intracellulära cytoplasmatiska kalciumkoncentration ion är storleksordningen 100 nM, medan kalcium i organeller, såsom det endoplasmatiska nätverket, sekretoriska vesikler och mitokondrier, nå nivåer upp till tiotals millimolars i koncentration. Detta skapar branta kalcium Jon koncentration gradient storleksordningar över intracellulära membran2,3,4,5,6,7,8 ,9. Extracellulära kalcium ion är omkring 2 mM och därför variationer av kalcium jonkoncentration uppstå på båda extracellulära och intracellulära nivåer. Dessutom synkroniserade senaste studier styrker att intracellulära kalciumjon signalering händelser och neuronal aktivitet kan uppstå under de lokala fluktuationer av extracellulära kalcium jonkoncentrationer, om vikten av intra- och extracellulära kalcium Jon variationer10.

Som syftar till att förstå samspelet mellan kalciumjoner och biologiska membran, en syntetisk metod där infödda cellmembran ersätts med lipid lipidens blåsor har genomförts framgångsrikt. Utsätta blåsor till kalcium ion lösningar leder till förändringar i lipid huvud grupper och kolväte kedja packning, ökad membran spänningar, och vesikler aggregering, samt segregeringen av lipider och membran fas övergången11,12 ,13,14,15,16. Egenskaperna för lipid membranen vid exponering för kalciumjoner har undersökts med sådana experimentella tekniker som röntgen, 1H-NMR och spektroskopiska eller termodynamiska studier11,16, 17 , 18. i dessa studier membran sammansättning ofta trimmad för att likna infödda cellmembran och innehåller sådana fysiologiska lipider som fosfatidylkolin (PC) och fosfatidyletanolamin (PE) Fosfatidylserin (PS). PS är särskilt viktigt i konstgjorda vesikler förberedelse eftersom det är en viktig komponent i många cellulära processer inklusive intracellulära membran människohandel, exocytos och apoptos19,20.

Storleken på syntetiserade lipid blåsor varierar ofta från nanometer till flera mikrometer. Bland olika vesikler preparat, giant unilamellar blåsor (GUVs), som är flera tiotals mikrometer i diameter, är av särskild betydelse på grund av sin relativt stora storlek, lufttrafiktjänsten dimensionerna för enskilda celler21 , 22 , 23. den tillgängliga ytan av GUVs gör att effekten av lokala kemiska lutningar på membran biofysiska egenskaper studeras. Genom att exponera endast del av membran yta till de yttre stimuli, kan membran dynamiken undersökas närmare. Det har exempelvis visat att lokaliserade tillämpningen av kemiska eller pH lutningar på ytan av GUVs leder till bildandet av tubulär utskjutande delar, som inte observerats bulk exponering24,25. De observerade skillnaderna i membran beteende kräver ytterligare metodutveckling av singel-vesikler förhör för att få vissa insikter i mekanismerna i cellmembranet remodeling.

Bygger på metoderna för Mikroskop och mikromanipulation från tidigt 1900-tal26,27, i samband med nyare förfiningar av singel-vesikler manipulation system från 2000-talet23,28 , i denna artikel presenteras en strategi som membran remodeling och bildandet av membran tubulär utbuktningar (Mbps) i GUV membranet genereras som svar på lokala tillämpningen av kalciumjoner.

Vår strategi använder tredjeparts en vesikel komplex bestående av en chef som är ansluten till en multilamellar vesikler (MLV) som biomimetiska membran modellsystem (figur 1A). MLV krävs som en lipid reservoar för anläggningen leverera lipid material till GUV under exponering för kalcium Jon toning. Denna anslutning kan anläggningen att kompensera för ökningen av membran spänning under inducerad remodeling och forma övergången av GUV membranet och tillhandahålla lipider för MTP tillväxt. Dessutom underlättar MLV ytan immobilisering eftersom dess massa är större jämfört med det av GUV. GUV-MLV komplexen, när orörlig på ett fast substrat, har tidigare använts för att producera nanotube-vesikler nätverk, studera polymer-membran interaktion, härma sena stadier av exocytos29,30, 31,32,33.

Tidigare protokoll utnyttjas sojabönor polar lipid extrakt (SPE) för att förbereda GUV-MLV komplex28. SPE består av en blandning av fosfolipider som inkluderar PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatidylinositol (PI, 18,4%), fosfatidsyror acid (PA, 6,9%), och en blandning av andra lipider (6,9%). I våra protokoll häri, SPE blandningen är dopad med 20% av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumsalt) (DOPS) att efterlikna den inre bipacksedeln plasma cellmembranet. Ytterligare 1% av ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-knark) används för att färga de lipid lipidens aktivera övervakning av membran ombyggnaden med fluorescensmikroskopi. GUVs har symmetriska lipid sammansättning över lipidens och utsätts lokalt för 5 mM koncentrationer av kalciumklorid (CaCl2). Sådana experimentella förhållanden, med ett förhöjt kalcium jonkoncentration, härma också yttre membran bipacksedeln apoptotiska celler, där de PS molekylerna är uttryckta34. Bildandet av GUV-MLV komplexen kräver användning av en modifierad rehydrering-uttorkning metod som ursprungligen utvecklades av Criado och Keller35. Vesikler förberedelse protokollet innefattar bildandet av ett torrt lipidskikt, som sedan används för att bilda små blåsor i lösning. Denna lösning är då uttorkad och rehydrerad för att bilda de slutliga GUV-MLV komplex. Figur 2A -D illustrerar de viktigaste stegen för beredning av en typisk GUV-MLV komplex.

Efter vesikler preparatet har slutförts och den komplexa vesikler är orörlig på glassubstrat, används Mikroskop tekniken att leverera små mängder av kalciumjoner till den yttre bipacksedeln av GUV genom en öppen-tip glas mikropipett. Flödet av kalcium lösning ur spetsen genererar en lokaliserad kalcium Jon gradient GUV membran yta, vilket leder till membran remodeling och generering av Mbps. Mbps är inriktade bort kalcium Jon och växa inuti GUV. Denna MTP formation kan övervakas direkt med fluorescensmikroskopi och inspelade med en digitalkamera. Figur 3 visar de experiment som används för att producera den membran remodeling. Bildandet av Mbps (figur 2E och figur 4) i detta protokoll visar ett kontrasterande resultat för kalcium Jon exponering experiment utförs i bulk volym villkor. Under bulk förhållanden, GUVs brista och bildar membranet korrigeringsfiler som kan observeras för att följa glas yta25.

Ytterligare information om bildandet av GUV-MLV komplexen samt förfarandet för att utföra Mikroskop av kalciumjoner, förklaras i denna artikel. Protokollen är i hög grad fokuserat på kalcium Jon Mikroskop; Detta tillvägagångssätt kan dock enkelt ändras för användning i studera membran svaren på grund av lokala exponering för andra joner eller proteiner. Dessutom, kan sammansättningen av blåsor stämmas för att isolera rollerna lipid komponent i processen membran remodeling. Presenterade protokollet kräver inte någon sofistikerad utrustning för att producera GUV-MLV komplexen och kännetecknas av en hög grad av reproducerbarhet.

Protocol

1. beredning av små Lipid blåsor

  1. Bered en lösning av lipider SPE/DOPS/ATTO488-knark i kloroform med en massa blandningsförhållande av 79/20/1.The slutliga koncentrationen av lipider i kloroform är 1 mg/mL, och den slutliga massan är 0,6 mg (vanligtvis mindre än 1 mg). Använda disponibla rund botten injektionsflaskor av glas (runda botten glasrör, 10 x 75 mm) när beredning av lipid lösning utan en pre rengöring steg.
    1. Fylla och skölj glas sprutor (25 µL) med kloroform minst 5 gånger innan användning. Att fylla och skölja glassprutan minst 5 gånger, räcker 3-4 mL kloroform.
      Varning: När hantering kloroform, använda glas sprutor och utför procedurerna i dragskåp med lämpliga handskar och skyddsglasögon vid alla tillfällen. Använd inte någon plast kolvar, sprutor och pipetter vid hantering av kloroform.
  2. Linda i injektionsflaska av glas innehållande lipid blandningen med metallfolie skydda innehållet från omgivande ljus och avdunsta lösningsmedlet i rotationsindunstare för 3 h att ta bort kloroform, med trycket når 7 kPa vakuum vid 80 rpm. En torr lipid film bildas på botten av injektionsflaskan med glas efter avdunstning (figur 2A).
    Obs: Skala upp flera gånger och använder större mängder lipider kan kräva längre roterande avdunstning tid att säkerställa fullständig borttagning av kloroform.
  3. Tillsätt långsamt 600 µL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) buffertlösning (pH 7,8, utan spädning) ovanpå torkade lipid filmen. Efter tillägg av bufferten, varsamt tillsätt 6 µL av glycerol att skydda provet från fullständig uttorkning under den GUV-MLV bildande steg (att uppnå en slutlig koncentration av glycerol 1 wt %)36. Försegla glasflaskan använda parafilm och täck med metallfolie för att skydda från omgivande ljus. Förvaras i kylskåp vid 4 ° C över natten.
    Obs: PBS buffertlösningen består av 0.151 g för Trizma base, 1.592 g K3PO4, 1.021 g KH2PO4, 0.062 g MgSO4 ·7H2O och 0.0465 g EDTA i 250 mL renat vatten. Lagra lösningen vid 4 ° C och rumstemperatur före användning. Motsvarande mängd 10 mM HEPES bufferten kan användas istället för PBS-lösning. HEPES buffertlösningen bereds genom att en 1 M HEPES stamlösning med renat vatten.
  4. Följande dag, Sonikera i injektionsflaska av glas innehållande lösningen för 1 min med ett ultraljud bad vid rumstemperatur. Ta bort parafilm och Pipettera tills en visuellt enhetlig lösning av små lipid blåsor bildas (figur 2B). Alikvotens 30 µL av erhållna små lipid vesikler lösningen till enskilda 0,5 mL plaströr. Hålla dessa lager alikvoter vid-18 ° C i högst 6 månader.
    Obs: Om små lipid vesikler lösningen inte är visuellt uniform, vortex lösningen 4 gånger för 1-2 s använder en vortex mixer med maximal hastighet.

2. upprättande av GUV-MLV komplex

  1. Tina i rumstemperatur ett plaströr som innehåller en alikvot av den frysta suspensionen av små lipid blåsor. Vortex röret 4 gånger för 1-2 s använder en vortex mixer med maximal hastighet.
  2. Placera 5 µL av de små lipid vesikler fjädringen på ytan av ett glas täckglas (24 x 60 mm) att bilda en liten runda droplet. Använd en glas täckglas utan före rengöring steg.
  3. Placera glas täckglas i vakuum exsickator (< 100 kPa vakuum) i 20 min.
  4. Lagra torkade lipid filmen i rumstemperatur i 4 min, sedan långsamt pipett 50 μL 10 mM HEPES buffert ovanpå den torra lipid filmen för rehydrering. Vänta 5 min före bildar de GUV-MLV komplex (figur 2 c).
  5. Centrera ett glas täckglas på Mikroskop scenen, då Pipettera 300 µL av HEPES buffert på den och placera mitten av droplet-programmet ovan målet (figur 3B).
  6. Över den 50 µL av förformad GUV-MLV lösningen till HEPES lösningen (300 µL). Vänta 25 min att tillåta glest bildade GUV-MLV komplex ordentligt följa ytan av glas cover slip (figur 2D).
    Obs: Ibland, GUV-MLV komplexen bildar inte på glas cover slip och istället lipid fläckar eller endast MLVs observeras. Detta kan förklaras genom oavsiktlig skakning av provet under stegen 2.4 eller 2.6 eller talrika frysning-tining cykler av den små vesikler fjädringen. Upprepa steg 2.1-2.6 eller Använd nygjord lipid stamlösning (steg 1.1) för att få GUV-MLV komplexen.

3. mikropipett förberedelse och Mikroskop

  1. Runt kanterna på borosilikatglas kapillärerna av försiktigt placera kapillären slutar i lågan av ett ljus att förhindra mikropipett bryts medan du kopplar den till innehavaren av en mikropipett.
  2. Dra minst 3 glas kapillärer med hjälp av en automatisk laser avdragare med hjälp av den program: värme = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Värme = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Inställda programmet måste anges med det första värdet i Pul tomt. Med hjälp av borosilikatglas kapillärerna i innerdiameter (I.D.) 1,00 mm och ytterdiameter (OD) 0,78 mm resulterar i en mikropipett med en tip öppning på cirka 0,3 µm i diameter.
  3. Back-fylla varje mikropipett med 8 µL av 5 mM CaCl2 lösning i HEPES buffert (10 mM) med en microloader. Filtrera om CaCl2 lösningen med en 0,2-0,5 µm spruta filter före användning för att undvika igensättning av pipettspetsen.
    Anmärkning: Se till att den CaCl2 är helt upplöst i HEPES buffertlösningen, som också används för steg 2.4-2.6.
  4. Anslut en mikropipett hållare till en micromanipulator. Montera mikropipett i mikropipett hållaren tätt. Anslut Insprutningspump och kapillär innehavaren använder utbudet röret.
  5. Starta insprutningspumpen. Justera inställningarna på insprutningspumpen till 20 hPa (insprutningstryck) och ange ett 5 hPa ersättning tryck, på automatiskt läge. Pausa insprutningspumpen tills mikropipett är redo för Mikroskop.
  6. Ställ mikroskopet på brightfield mode. Konfigurera den för differentiell störningar kontrast (DIC). Använda 63 X eller 100 X hög NA (1,3) mål för att uppnå optimal membran kanten resolutionen.
  7. Använda den grova micromanipulator för att placera mikropipett ovan droplet-programmet som innehåller GUV-MLV komplexen. Leta upp spetsen av en mikropipett ovanför målet.
  8. Fokusera mikroskopet på mittpunkten av GUV-MLV anläggningen och sedan fokusera cirka 50 µm ovan GUV. Använd grova läget av micromanipulator att försiktigt föra mikropipett i fokus.
  9. Växla till micromanipulator till fina läge. Långsamt refocus GUV yta medan översätta mikropipett spetsen ner och hålla spetsen i fokus. Placera den mikropipett tip cirka 20 µm från GUV ytan. Om mikropipett spetsen bryts på grund av oavsiktlig kontakt med glas cover slip (exempel i figur 5B), ersätta den omedelbart för att undvika onödiga kalcium Jon utsättning i bulk provlösningen.

4. bildandet och översättning av Mbps med hjälp av kalcium Jon Source

  1. Ställa in mikroskopet i fluorescens-läge. Ställa in dichroics att excitera på 488 nm och upptäcka utsläpp vid 505-550 nm.
  2. Slå på insprutningspumpen och starta kalcium Jon injektionen. Använd fina läget av micromanipulator och sakta närmar GUV mikropipett spets. Placera mikropipett spetsen på ett avstånd av 3 µm från membran yta medan du injicerar CaCl2 lösningen från den mikropipett att låta Mbps form (figur 4).
  3. För att översätta Mbps längs GUV ytan, långsamt flytta pipettspetsen (med en hastighet av 0.1-0.3 µm/s) runt GUV yta med den fina micromanipulator (figur 6). Behålla ungefär samma avstånd (3 µm) mellan GUV ytan och mikropipett spetsen samtidigt som kalcium Jon injektionen.
    Obs: På hög översättning priser av mikropipett spetsen (över 0,7 µm/s), Mbps kommer att migreras inte i synk med mikropipett. Istället kommer de scatter och förkorta, medan nya Mbps kommer att bildas på den nya platsen av mikropipett spetsen (figur 7).
  4. För att stoppa Mikroskop, Stäng av insprutningspumpen och flytta mikropipett från GUV yta.

Representative Results

I detta arbete visar vi skapandet av GUV-MLV komplex och hur de kan användas för att belysa effekten av kalcium Jon lutningar på cellmembranet dynamics. Surface-anslutna GUV-MLV komplex krävs för dessa experiment som möjliggör en fast cell-sized härma samtidigt fastställa en ion lutning genom Mikroskop. GUV membranet reagerar på lokaliserade kalciumkoncentration genom bildandet av Mbps riktade bort från kalcium Jon källan. Dessutom kan Mbps översättas runt GUV på ett kontaktlöst sätt genom att flytta mikropipett spetsen runt membranet ytan.

En Schematisk illustration av GUV-MLV förberedelser proceduren visas i figur 2. Även om protokollet presenteras, GUV-MLV komplexen redan före bildas under steg 2,4 (figur 2 c), tillåter överföra vesikler lösningen till en annan 300 µL droplet buffert (steg 2,6 i protokollet) glest bildade GUV-MLV komplexen till tillräckligt följa glassubstrat. På detta sätt en lämplig komplex för mikromanipulation och Mikroskop är etablerad (figur 2D). Ibland, innehålla GUVs en eller flera anhållna lipid blåsor, som inte påverkar MTP bildandet, som visas i figur 4A. Dessa GUVs producera Mbps; bildtagning kan dock hindras om de anhållna blåsor är stora. Majoriteten av de förberedda GUVs (upp till 75%) visas halvrunda och är kopplade till MLVs, som visas i figur 1A. Dessa blåsor är huvudfokus för detta protokoll och lämpar sig för Mikroskop förfarandet. Cirka 25% av de återstående GUVs visas böljande (figur 1B), vilket är ett tecken på en lägre membranet spänning regim. Dessa böljande blåsor också möjliggöra bildandet av tubulär utskjutande delar; dock uppvisar de olika kinetik och en annan morfologi av de bildade Mbps, som är utanför ramen för detta protokoll25. De beredda blåsor typiska diameter varierar mellan 2 till 15 µm för MLVs och mellan 2 till 40 µm för GUVs. Den optimala GUV storlek för exponering för kalciumjoner är 5 µm eller större.

Mikropipetter har använts i singe-cell förhör system samt i förfaranden som kräver manipulation av syntetiska GUVs för flera årtionden37,38. Majoriteten av dessa program inblandade direkt fysisk kontakt mellan mikropipett och ytan av celler eller blåsor. Exempel inkluderar den patch-clamp tekniken eller dra membranet tjuder från GUV membranet, förutom bygga nanotube-vesikler nätverk23,28,39. Mikropipetter har nyligen också använts för att generera lokaliserade lutningar av joner och molekyler runt GUVs att rekonstruera heterogena cell mikromiljö24,25. I protokollet presenteras är en väl fungerande mikropipett (figur 5A) en avgörande faktor för att fastställa en kalcium Jon övertoning på GUV ytan genom att släppa den lösning som finns i. Korrekt positionering av en mikropipett på GUV ytan och undvika kontakt med lipid membranet är väsentliga för framgångsrika Mikroskop. Mikropipett spetsen hålls på ett avstånd av cirka 3 µm från GUV ytan, som är ett optimalt avstånd att generera Mbps samtidigt imitera variationer av kalcium nära cellmembranet. Om mikropipett spetsen är misstag bruten (figur 5B), krävs en ersättare. Den tidigare testade koncentrationen utbud av CaCl2 inuti den mikropipett, vilket möjliggör MTP bildandet, är mellan 2 och 5 mM25, vilket motsvarar extracellulära kalcium koncentrationer. Vid lägre CaCl2 koncentrationer, dvs., 1 mM observeras ingen Mbps.

Bildandet av Mbps vid den kalcium Mikroskop börjar med bildandet av små membran invaginations, som växer in i Mbps på platsen för exponeringen (figur 4B). Mbps fortsätter att växa så länge som GUV membran resterna exponeras för kalciumjonerna. De fluktuerar och peka bort kalcium Jon (figur 4 c, kompletterande film 1). När kalcium Jon utbudet avslutas, Mbps scatter över GUV ytan, vilket gör det svårt att konstatera huruvida Mbps kvar eller så småningom försvinna.

Bildandet av Mbps kan förklaras av lokaliserade kalciumjon binder till den utsatta yttre bipacksedeln av GUV membranet och utlösa spontana krökning (m), som är direkt förknippade med bildandet av spontana spänning σ = 2κm2 (Κ är bockning styvhet), som inducerar böjning av membranet och bildar inåt Mbps. Tidigare rapporter har visat att deformationen av membranet kan förklaras av kondens eller klustring av de negativt laddade lipider vid bindning av kalciumjoner till membranet, vilket resulterar i negativa spontana krökning40. Alternativt, den starka bindningen av Ca2 + på ytan av de negativt laddade lipidens neutraliserar ytan laddningstätheten exponerade lipid lipidens bipacksedel. Detta leder till laddningstätheten skillnaden över den lipidens, vilket resulterar i noll spontana krökning, tillräckligt att böja membran25.

Observerade bildandet av Mbps visar en känslighet av lipid membran att kalciumjoner och erbjuder en ny beröringsfri metod för att producera tubulär membranstrukturer. Belysa ursprunget av detta membran tubulation kan vara viktiga för att förstå dynamiken i membran form övergår under olika cellfunktioner och cell form och kan vara till hjälp för att få insikter i lipid organisation inom cellen membran.

De observerade Mbps genereras alltid på plats på membranet som genomgår kalcium Jon exponering. Således, genom att välja platsen för mikropipett spetsen, det är möjligt att definiera området på GUV ytan för utstick tillväxt. Nästa, om mikropipett är långsamt (0.1-0.3 µm/s) flyttade runt GUV ytan, samtidigt som avståndet från membranet, Mbps översätts i tandem med mikropipett. Figur 6 och den motsvarande kompletterande film 2 visar sådan migration av Mbps runt GUV ytan. Denna process är sannolikt att åtföljas av bildandet av nya Mbps vid kontinuerlig kalcium Jon injektion25. Vid hög översättning priser (över 0,7 µm/s) är Mbps inte kunna följa mikropipett spetsen. Istället bildas nya utskjutande delar på den nya platsen av mikropipett spetsen (figur 7).

Observerade kontaktlösa kalcium Jon-guidad översättning av Mbps runt den GUV ytan kan ytterligare vår förståelse av den drivande krafter bakom dynamiken i membran tubulära strukturer inuti celler. Dessutom erbjuder detta synsätt en roman kontaktlösa läge för kontroll av transport av material i mjuk materia system genom att använda kemiska gradienter.

Figure 1
Figur 1 : Representativa fluorescerande mikroskopi bilder av GUV-MLV komplex orörlig på ytan av ett glas täckglas. (A). exempel på en sfärisk GUV. GUV visas i form av ett halvklot som bifogas MLV. (B). exempel på en böljande GUV. De svarta pilarna visar de deformerade områdena av membranet. Bilderna är förbättrad och vändas för att förbättra visualisering av fluorescently märkt GUV membran. Skalstapeln representerar 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Schematiska illustrationer av GUV-MLV preparatet och Mikroskop systemen. (A). ett torrt lipidskikt bildas på botten av injektionsflaskan glas till följd av roterande avdunstning av kloroform från lipid lösningen. (B). återfuktad lipidskiktet är sonicated och små lipid blåsor bildas. (C). en liten droppe av vesikler lösningen (5 µL) placeras på ytan av ett glas täckglas och övergår i en exsickator för 20 min att torka lipid lösningen och bildar en torr lipid film (detta steg inte är visas). Återfuktande torrt lipid filmen med 50 µL buffertlösning producerar redan bildade GUV-MLV komplexen. (D). överföring av de redan bildade komplex till en större volym av buffert resulterar i bildandet av glest separerade GUV-MLVs kopplad till ytan av glas cover slip. (E). positionering i mikropipett nära ytan av GUV och släppa kalciumjonerna utlöser bildandet av Mbps. Illustrationerna är inte ritade i skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Experimentell setup för Mikroskop av kalciumjoner. (A). komponenter i de experiment som krävs för att generera Mbps i GUVs. (B). Detaljer för den Mikroskop setup. Täckglas med lösningen av GUV-MLV komplexen placerats på Mikroskop scenen. Vinkeln mellan mikropipett och ytan av glas cover slip är 30° (markerade i vitt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Bildandet av Mbps vid Mikroskop av kalciumjoner på ytan av GUV. (A). The GUV-MLV komplex före exponering för kalcium Jon toning. Pilen anger en lipid vesikler anhållna inuti GUV, och som inte hindrar observationen av den Mbps. (B). Liten Mbps bildas vid Mikroskop av kalciumjoner (5 mM koncentration av CaCl2 i mikropipett). (C). tillväxten av Mbps vid kontinuerlig exponering för kalciumjoner. Fluorescens bilderna är förbättrad och inverterad för visualisering. Skalstapeln representerar 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Glas Mikropipetter används för kalcium Jon Mikroskop. (A). ett exempel på en väl fungerande mikropipett. (B). ett exempel på en mikropipett som har en bruten spets (det skadade området är märkt med en svart pil). Båda bilderna är förbättrad och inverterad för bättre visualisering. Skalstapeln representerar 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Kalcium Jon-guidad översättning av Mbps runt ytan av GUV. (A). The Mbps bildas vid GUV ytan vid Mikroskop på 5 mM CaCl2 lösning. (B-C). Översättning av mikropipett spetsen (0,2-0,3 μm/s) runt membranet ytan utlöser förflyttning av Mbps i riktning mot kalcium Jon källan. De svarta pilarna Markera den mikropipett rörelseriktning. Bilderna är förbättrad och vändas för att förbättra membran visualisering. Skalstapeln representerar 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Mbps hög översättning hastighet av mikropipett spetsen. (A). The Mbps bildas vid GUV ytan vid Mikroskop av 5 mM CaCl2 lösning (vit linje). (B-C). En hög översättning hastighet av en mikropipett runt GUV ytan (1 μm/s) resulterar i bildandet av nya Mbps på den nya platsen av mikropipett spetsen (magentafärgade linjen), samt spridning av de tidigare bildade Mbps (vit linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Kompletterande Movie 1: Bildandet av Mbps i GUV vid lokaliserade exponering för certifikatutfärdaren 2 + lutning. Vänligen klicka här för att ladda ner denna film. 

Movie 2
Kompletterande film 2: Kalcium Jon-guidad MTP migration runt GUV.   Vänligen klicka här för att ladda ner denna film. 

Discussion

Biomimetiska cellsystem möjliggör studiet av membran beteende vid exponering för yttre stimuli som joner, proteiner eller nanopartiklar. GUVs, sådan en modell, kan svara på förändringar i den kemiska miljön genom att justera sin form, vilket ofta innebär bildandet av tubulära strukturer och invaginations24,41,42,43 .

Denna artikel erbjuder en metod för att generera Mbps på ett kontaktlöst sätt via omdaning av GUV ytan vid lokaliserade injektion av kalciumjoner GUV yta. Protokollet beskrivs utarbetandet av GUV-MLV komplexet, som härmar en cell plasmamembran, samt hur anställa en Mikroskop-teknik för att generera kalcium Jon övertoningar nära GUV yta att bilda Mbps. Majoriteten av tidigare experimentella studier som adresserat kalcium Jon-membran interaktioner utsatt lipid blåsor till bulk kalcium Jon koncentration14,17. Beroende på de experimentella förhållandena, kan sådana bulk exponering leda till olika membran svar med tubulär utskjutande delar bildade25.

Bildandet av GUV-MLV komplexen är ganska enkelt och kräver endast vanlig laboratorieutrustning, såsom en roterande indunstare, ultraljudsbad och vakuum exsickator. Fortfarande finns det flera kritiska steg att överväga under vesikler beredning. Det är viktigt att säkerställa att uttorkningen av blåsor är klar (under steg 2,3 i protokollet) och en torr cirkulär lipid film som innehåller endast en liten mängd salt kristaller bildas på ytan av glas täckglas. Under experimentet, använda färska lipid stamlösning i kloroform samt färska HEPES buffert, noggrann hantering av vesikler lösningen, är väsentliga för framgångsrik beredning av GUV-MLV komplexen. Säker fastsättning av GUV-MLV anläggningen till täckglas glasytan är dessutom avgörande för mikromanipulation och Mikroskop. För att bekräfta tillräcklig vidhäftning av den GUV-MLV komplex, mikropipett (utan injektion flöde) kan användas för tryck försiktigt mot GUV ytan. En fast klibbade vesikler kommer inte att glida längs ytan vid direkt fysisk kontakt. Eftersom experimenten utförs i en öppen buffert droplet, som kan förhöras i flera timmar, måste avdunstning beaktas. Avdunstning från buffert droplet-programmet kommer att ändra de osmotiska förhållanden, som kunde påverka och destabilisera blåsor. Återställa osmotiska förhållanden, återgår periodiska tillägg av rent vatten till provet att återställa den ursprungliga volymen systemet till homeostas.

När du ändrar lipid membranet sammansättning, är det avgörande att blåsor produceras i form av ett GUV-MLV komplex eftersom MLV möjliggör överföring av lipid materialet till GUV under den membran omforma. Tidigare studier har visat att ersätta komponenter i SPE blandningen med ren lipider, eller lägga till 5-30% av kolesterol, kan också för GUV-MLV komplexa bildande28,44. Majoriteten av de förberedda GUVs är unilamellar45.

Dessutom när du testar andra divalenta katjoner såsom magnesium joner, beror bildandet av Mbps tungt på närvaron av negativt laddade DOPS i lipid blandningen. Utan DOPS utgör inte Mbps i de blåsor som beskrivs i detta protokoll. Dessutom resulterar monovalenta katjoner såsom kalium och natrium, inte i bildandet av Mbps, även i DOPS-innehållande vesikler25.

Förutom de kritiska steg när det gäller förberedelser och manipulation av GUVs finns det flera viktiga faktorer att överväga under förfarandet för Mikroskop. Den framgångsrika Mikroskop av kalciumjoner är starkt beroende av väl fungerande glas Mikropipetter, som är beredda på dagen för experimentet. I området i närheten finns det flera faktorer som kan orsaka den mikropipett till funktionsfel. Den vanligaste orsaken är en igensatt tip öppning. Liten lipid partiklar, som är biprodukter av vesikler preparatet, sprids i lösningen och tenderar att följa mikropipett tipset, därmed generera en igensättning. Rengöring pipettspetsen görs bäst genom att lyfta upp från vesikler lösningen och placera det tillbaka nära GUV ytan. Användning av funktionen blowen-out av Mikroskop pumpen måste undvikas eftersom det leder till massiv injektion av kalciumjoner i bulk lösningen. Dessutom, små luftbubblor anhållna inuti mikropipett förhindra korrekt Mikroskop, i vilket fall mikropipett bör ersättas med en ny. Tips brott kan minimeras avsevärt genom att placera den experimentella setup på en vibrationsdämpande tabell att minimera tip svängningar.

Dessutom måste vidtas när du väljer en observation system, att minimera fotoblekning samtidigt få de bästa tiden-löst bilderna. Wide-fältet laserinducerad fluorescensmikroskopi utnyttjades i detta protokoll eftersom det möjliggör för en relativt hög bild förvärv på en objektiv begränsad sonden djup. Dessutom möjliggör användning av inverterad mikroskopi samtidiga Mikroskop och observationen av lipid blåsor och Mbps.

En av de viktigaste begränsningarna av den presenterade metoden krävs omfattande manuellt arbete och tillräckligt mikromanipulation färdigheter. Eftersom komplexen bildas genom en spontan svullnad, inte kan storleken på den GUVs och MLVs kontrolleras. Dessutom tillåter inte detta protokoll för kontroll av membran spänningen av de beredda GUV-MLV komplex, som kan vara nödvändigt att samla in ytterligare information när det gäller membran remodeling. GUVs är anslutna till MLVs med det sistnämnda levererande lipid materialet för betydande tillväxt av Mbps i en utsträckning som skulle vara omöjligt att uppnå enbart utnyttja tillgänglig från GUVs membranet. MLVs också bidra till att sänka laterala ytspänning variationer inom den GUV-MLV komplexa44som skulle komplicera försöken att styra spänningen av vesikler med mikropipett aspiration. Denna GUV-MLV-baserad modell ger en lägre spänning som bättre efterliknar de spänningar regimerna i cellulära membranstrukturer ansluten till membran reservoarer, såsom membran veck och invaginations46. Samtidigt, kan mikropipett aspiration tekniken användas framgångsrikt för att styra membranet spänningar i enstaka GUVs. Till exempel som arbetet av Graber et al. Detaljer på bildandet av membran tubulär invaginations i enda GUVs vid bindning av kalciumjoner membranet på bulk villkor från varierad spänning regimer40. Slutligen, jämförelse av membran beteendet på både lokal och bulk exponering för kalcium kräver bättre kontroll av membran vidhäftning till ytan, som är utanför ramen för detta protokoll.

För att sammanfatta, möjliggör föreslagna tekniken kontaktlös membran remodeling och bildandet av Mbps vid lokaliserade stimulering med kalciumjoner. Framtida tillämpningar av denna metod center på översättningen från syntetiska vesikler system till inhemska biologiska membran, såsom cell blebs. Den föreslagna metoden kan ingå med andra encelliga förhör system, såsom patch-clamp eller mikroelektrod amperometry, eller i kombination med lokaliserad uppvärmning strategier31,47,48. Testa effekten av andra joner eller molekyler är enkelt och innebär helt enkelt ersätta kalciumjonerna med molekylarna av intresse. Dessutom kan komplexa syntetiska lipid blåsor produceras genom membran funktionalisering med transmembrana proteiner, som kan utöka vår förståelse av biofysisk cell omforma och cellmembranet dynamics är associerad med avkänning av lokala kemiska gradienter. Sist men inte minst, kontaktlösa stimulering av lipid membranet kan också översättas till polymera mjuk materia system, som erbjuder en grund för en roman kontaktlösa manipulation plattform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soy bean polar lipid extract Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 541602C 100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 840035C 1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO-TEC (Germany) AD 488-31 1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack Corning Incorporated (Corning, NY 14831) 99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer Sigma Aldrich (Missouri, USA) 650498-1L-D
Rotary evaporator Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm KEBO lab (Sweden) MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO Sharlau Chemie S.A. (Spain) P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% Sigma Aldrich (Missouri, USA) S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% Sigma Aldrich (Missouri, USA) G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% Sigma Aldrich (Missouri, USA) T-1503 2050 g
Trizma base Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 5886
MgSO4 Merck (USA) 34549-100 g
EDTA Sigma Aldrich (Missouri, USA) H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture Sigma Aldrich (Missouri, USA) Z260282-1PAK 24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm Sigma Aldrich (Missouri, USA) 631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slip VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer Labnet International (USA)
488 nm laser line  Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes Leica (Germany) 12847995 
Inverted fluorescence microscopy system  Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) Technologies GmbH (Thuringia, Germany) 300038
PatchStar Micromanipulator Scientifica (Uckfield, UK) 612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.  Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips) VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller  Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet Eppendorf (Germany)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum? Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Tags

Kemi fråga 137 jätte blåsor lipid membranet mikromanipulation Mikroskop kalciumjoner kalcium lutning membran tubulär utbuktningar spontana krökning membran remodeling
Membranet omdaning av gigantiska blåsor som svar på lokaliserade kalcium Jon övertoningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali Doosti, B., Cans, A. S.,… More

Ali Doosti, B., Cans, A. S., Jeffries, G. D. M., Lobovkina, T. Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients. J. Vis. Exp. (137), e57789, doi:10.3791/57789 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter