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Biochemistry

光谱分析 TRPV1 的纯化与重构

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

本文介绍了获得洗涤剂-可溶性 TRPV1 的生化量的具体方法, 用于光谱分析。这些联合协议提供了生物化学和生物物理工具, 可用于促进膜控制环境中哺乳动物离子通道的结构和功能研究。

Abstract

Polymodal 离子通道传感器不同性质的多种刺激构变化;这些动态构象是挑战, 以确定和仍然很大的未知。近年来, 单粒子低温电子显微镜 (低温 EM) 脱落光对激动剂结合部位的结构特征和几种离子通道的活化机理进行了研究, 确定了其浇口深度动态分析的阶段。使用光谱学方法的机制。电子顺磁共振 (EPR) 和双电子-电子共振 (鹿) 等光谱技术主要局限于可大量纯化的原核离子通道的研究。对大量功能性和稳定的膜蛋白的要求, 阻碍了使用这些方法研究哺乳动物离子通道。EPR 和鹿提供了许多好处, 包括确定移动蛋白区域的结构和动态变化, 虽然在低分辨率, 可能难以获得 X 射线结晶学或低温 EM, 并监测可逆门过渡 (即闭合、开放、敏感和麻木)。在这里, 我们提供的协议, 获取毫克的功能洗涤剂-可溶性瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 1 (TRPV1), 可以标记为 EPR 和鹿光谱学。

Introduction

近年来, 在单粒子低温电子显微镜 (冷冻 EM) 的研究进展中, 哺乳动物离子通道结构得到了非常的速度。特别是, polymodal 离子通道的结构研究, 如瞬态受体电位辣椒 1 (TRPV1), 已进一步了解其活化机制1,2,3,4,5. 然而, 在膜环境中嵌入离子通道的动态信息需要了解它们的 polymodal 门和药物结合机制。

电子顺磁共振 (EPR) 和双电子-电子共振 (鹿) spectroscopies 提供了一些最明确的机械模型的离子通道6,7,8,9,10,11,12,13. 这些方法主要限于检查原核和 archeal 离子通道, 在细菌抗原时产生大量的洗涤剂纯化蛋白。随着在昆虫和哺乳动物细胞中的真核膜蛋白的发展, 用于功能和结构表征14,15,16, 现在可以获得生物化学用于光谱研究的洗涤剂纯化蛋白质的数量。

EPR 和鹿信号产生于一个 paramagneticspin 标签 (SL) (即methanethiosulfonate) 附着在一个单一的半胱氨酸残留的蛋白质。自旋标签报告三种结构信息: 运动、可访问性和距离。这一信息允许确定残留物是埋藏在蛋白质中, 还是暴露于膜或水环境中的蛋白和配体约束状态13,17,18,19。在高分辨率结构 (如果可用) 的背景下, EPR 和鹿数据提供了在其本机环境中派生动态模型的约束集合, 同时监视可逆的浇口转换 (即闭合、打开、敏化, 和麻木)。此外, 可以通过使用这些环境数据集分配二级结构以及蛋白质20中的位置来获得可能难以由 X 射线晶体学或冷冻 EM 确定的灵活区域。在脂质 nanodiscs 中获得的低温 EM 结构提供了关于离子通道3、21、22、23、24 的浇口的宝贵信息,25;然而, 光谱方法可以提供动态信息从构象状态 (例如, 热变化), 可能是难以确定使用低温 EM。

在去除所有半胱氨酸残留物 (特别是哺乳动物通道中的丰富)、蛋白质产量低、纯化过程中蛋白质不稳定、自旋标记后, 必须克服许多困难, 以实现 EPR 和鹿类, 包括缺乏蛋白质功能。, 以及在洗涤剂或脂质体中的蛋白质聚集。在这里, 我们设计了克服这些关键屏障的协议, 并获得了哺乳动物感官受体的鹿和 EPR 光谱信息。这里的目的是描述的方法, 以表达, 纯化, 标记和重组功能极小的半胱氨酸小鼠 TRPV1 (eTRPV1) 结构的光谱分析。这种方法适用于那些保留其功能的膜蛋白, 尽管除去半胱氨酸残留物或含有半胱氨酸形成二硫键。这些协议的收集可以适应其他哺乳动物离子通道的光谱分析。

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Protocol

1. TRPV1 诱变

注:26的最小 TRPV1 结构是用聚合酶链反应 (PCR) 法从全长半胱氨酸少通道 TRPV127 (图 1) 建立的。这种半胱氨酸的最小 TRPV1 构造 (称为 eTRPV1 以后) 由残留物 110-603 和 627-764 组成。eTRPV1 被克隆在 pMO (一个 pcDNA3.1 的载体) 进行功能分析, 并在一个重组捐助者向量28包含8x 组氨酸-麦芽糖结合蛋白 (MBP)-烟草蚀刻病毒 (TEV) 的表达和纯化 (图 2A)。eTRPV1 单半胱氨酸突变体是利用现场定向诱变产生的。向量和信道序列在补充文件1中指定: 辅助方法.

  1. 利用在线工具设计诱变底漆29。
  2. 混合在一个0.2 毫升管: 5 ul 10x 反应缓冲器, 1 ul 的 dNTP 混合 (100 毫米), 1 ul 每10微米前和反向寡核苷酸, 1 ul 的 100 ng/ul eTRPV1 模板 DNA26, 1.5 ul 的亚砜, 1 ul 的诱变酶和 38.5 ul 的去离子水。在把管子放进 thermocycler 之前先旋转混合物。
  3. 进行 PCR 诱变。
    1. 执行 (a) 变性在95°c 为2分钟, (b) 变性在95°c 二十年代, (C) 退火在60°c 十年代和 (d) 伸长率在68°c 为4分钟 (三十年代每 1 kb)。重复步骤 b 到 d 的18个周期, 然后执行伸长率在68°c 5 分钟, 并保持在4°c 的反应, 直到进一步使用。
  4. 添加 2 ul DpnI 酶反应;混合, 然后孵化在37°c 30 分钟。
  5. 执行转换
    1. 在冰上解冻大肠杆菌的能力细胞。
    2. 对预冷的14毫升无菌管, 加入 75 ul 的合格细胞和 10 ul 的DpnI 治疗 PCR 混合物。轻轻拌匀。
    3. 在冰上孵育反应30分钟. 保持管在42°c 四十五年代, 然后立即把它放在冰上2分钟. Luria 汤 (LB) 琼脂板上的混合物 (含羧苄青霉素 (0.2 毫克/毫升)。在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
    4. 使用14毫升不育管, 从盘子中收获至少三个单一的菌落, 并接种4毫升的 LB, 其中含有羧苄青霉素 (0.2 毫克/毫升)。在37摄氏度的一夜之间孵化文化, 在250转每分钟摇晃。
    5. 以 8000 x g 为10分钟, 根据商业上可用的迷你准备套件的指示提取 DNA。
    6. 通过标准的自动 DNA 测序验证单半胱氨酸突变体的存在 (见材料表)。

2. eTRPV1 和单半胱氨酸突变体的功能分析

  1. HEK293 细胞线转染 30
    1. 培养 HEK293 细胞在6井板在2毫升高葡萄糖媒介 (DMEM) 每井 (37 °c, 5% CO2, 95% 湿气)。准备 HEK293 70 u2012 80% 汇合的细胞。
    2. 在两个独立的1.5 毫升微离心管中制备转染混合物。
      1. 对于反应 A, 添加0.5 µg eTRPV1 或半胱氨酸突变体的 pMO, 以250µL 的最低基本培养基 (如:对于反应 B, 添加3µL 的转染试剂到250µL 的最低基本培养基。在室温下孵育每个反应5分钟。
      2. 用1毫升的吸管混合反应 a 和 B。在 RT 中孵育45分钟的混合物。
    3. 从 70-80% 汇合井中移除500µL 培养基, 并加入500µL 的反应混合物。为 Ca2 +成像 (37 °c、5% CO2和95% 湿度) 隔夜存储板块。
  2. HEK293 细胞中的 Ca2 +成像30
    1. 清洁12毫米直径的玻璃盖玻片与乙醇和水, 并把它们放入一个24井板。
    2. 在每个盖玻片的中心添加75µL 的聚 l-赖氨酸, 并将板材储存45分钟 (37 °c, 5% CO2, 95% 湿度)。
    3. 除去多余的聚 l-赖氨酸, 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗盖玻片三次, 除去任何残留物。
    4. 一旦盖玻片准备就绪, 继续从6井板块分离出细胞。
    5. 卸下介质并添加500µL 的温 PBS (37 °c) 进行洗涤。
    6. 移除 PBS, 加入500µL 的胰蛋白酶, 孵育1分钟。
    7. 添加500µL 的温暖培养基 (37 °c), 以停止消化反应, 并与吸管混合;避免形成气泡。如果需要, 调整细胞浓度稀释此泥沙与更多的培养基培养基。
    8. 种子250µL 转染的 HEK293 细胞 (70% 汇合) 加上250µL 培养基 (500 µL 最终体积每井) 在预处理盖玻片, 让他们定居下来 (为附件) 1-2 h 在孵化器 (37 °c, 5% CO2, 95% 湿度)。
    9. 同时, 通过将 0.02% pluronic 酸和1µM Fluo-4-AM 加入到一个铃声的缓冲器中, 准备一个加载解决方案。把溶液混合好。
    10. 从井中移除 HEK293 培养基, 并添加500µL 的加载解决方案。孵育细胞为 1 h (37 °c, 5% CO2, 95% 湿气)。用温铃的缓冲器清洗 Fluo-4-loaded 细胞两次。
    11. 在显微镜阶段将盖玻片与负载细胞放入10毫米培养皿中 (使用10X 目标; 494 nm 激发和 506 nm 发射) 执行胞内 Ca2 +测量。
    12. 使用商用软件灌注各自配体 (例如10 微米辣椒素) 后荧光强度的变化 (见材料表)。
  3. mRNA 和爪蟾卵母细胞的制备30
    1. 进行线性化 eTRPV1 和单半胱氨酸突变体, 含PmeI 1 小时, 37 摄氏度。清洁的 DNA 遵循商业可用的净化套件的指示。
    2. 使用线性化和清洁的 dna 合成有上限的 rna 与商业上可用的套件兼容 T7 RNA 聚合酶。
    3. 根据商业上可用的净化套件清洁已覆盖的 rna。通过测量 260 nm 波长的吸收量来量化 RNA 的数量。
    4. 将 5 \ u2012 10 毫升x 蟾卵母细胞 (商用) 转化为50毫升圆锥管, 含20毫升 ND96 溶液 (96 毫米氯化钠, 2 毫米氯化钾, 5 毫米 HEPES, 1 毫米氯化镁2; pH 7.4), 与1毫克/毫升胶原酶和 nutate 为50分钟在 RT。
    5. 在 ND96 中冲洗卵母细胞直到溶液清晰;加入新鲜的胶原酶, 在 RT 中摇动30分钟. 在立体显微镜下检查卵母细胞, 并在大多数卵母细胞 (90%) 中不存在外滤泡层 (红色血管光泽层) 时停止消化。在 ND96 中冲洗卵母细胞直到溶液清晰为止。
    6. 将卵母细胞转移到一个50毫升的聚苯乙烯管上, ND96 加1毫米 CaCl2 , 并摇动 1 h. 未消化的卵母细胞将粘在聚苯乙烯管上。
    7. 用 ND96 + 1 毫米 CaCl2和补充溶液与50µg/毫升庆大霉素和50µg/毫升的四环素来洗涤卵母细胞。
      注: 保护含四环素的溶液免受光照射。
    8. 选择大的无损伤膜的卵母细胞, 并显示动物和植物两极之间的清晰分离。让卵母细胞在16摄氏度的微注射前恢复4小时。
    9. 使用玻璃吸管 (外径: 1.11 毫米, id: 0.5, 长度8.8 厘米) 将 1-5 ng 的 mRNA 从 eTRPV1 和单半胱氨酸突变体注入卵母细胞, 使用 nanoliter 喷射系统 (46 nL/秒) 和一个立体显微镜 (2X 放大)。储存卵母细胞在16°c ND96 补充 CaCl2和抗生素 (庆大霉素/四环素 1x)。
    10. 72小时后, 使用两电极电压钳 (TEVC) 采集系统测量宏观电流31。
    11. 拉硼硅酸盐玻璃吸管 (0.3 MΩ), 并填写3米氯化钾。
    12. 将卵母细胞放在录音室中使用转移吸管和灌注浴溶液 (120 毫米氯化钠, 2 毫米氯化钾, 2 毫米氯化镁2, 1 毫米 EGTA, 10 毫米 HEPES 溶液; pH 7.4) 低速。
    13. 将两个电极浸入浴缸溶液中以调整其吸管偏移量。轻轻推吸管电极 (硼硅酸盐玻璃吸管;外径: 1.5 毫米, id: 1.10, 长度10厘米) 到卵母细胞, 直到一个微小的压痕被观察在立体声显微镜 (2X 放大), 以及膜电位的变化。
    14. 将放大器设置更改为记录模式并测量宏观电流, 同时将电压钳坡道从-80 到 +80 mV 中应用1秒. 负载灌注系统的解决方案中使用的步骤2.3.12 在 ph 7.4 (作为一个控制) 和 ph 值5检查 eTRPV1 活动。

3. 生成重组 Bacmid 和杆状病毒用于蛋白质表达

  1. Bacmid
    1. 用 eTRPV1 和/或单半胱氨酸突变体的重组施主载体的 7.5 ng 转化 100 DH10Bac大肠杆菌的 ul。
    2. 添加 900 ul 的 SOC 介质 (20 毫克/毫升胰蛋白胨, 5 毫克/毫升酵母提取物, 2.5 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁2, 10 毫米 MgSO4, 20 毫米葡萄糖) 和孵化为 6-7 h 在37°c 和 225 rpm。
    3. 种子100µL 直接从混合物, 并从串行稀释 (1/10 和 1/100), 在 LB 琼脂板块含有100微克/毫升 X 加仑, 40 微克/毫升 IPTG, 7 微克/毫升庆大霉素, 10 微克/毫升四环素和50微克/毫升卡那霉素。在37摄氏度上孵化出至少48小时的板材。
    4. 选择直径为2毫米的白色菌落, 因为蓝色的殖民地缺乏兴趣的插入。使用立体显微镜验证白色的菌落不包含任何蓝色斑点。
    5. 收获至少三个单一的殖民地和转移到一个14毫升的不育管含有4毫升的 LB 介质补充7微克/毫升庆大霉素, 10 微克/毫升四环素, 50 微克/毫升卡那霉素。孵化细胞过夜 (16 小时) 在37°c 和 250 rpm。
    6. 采取1.5 毫升的隔夜文化和分离重组 bacmid DNA (参考补充文件1的详细协议)。将 bacmid 存放在4摄氏度, 最多两个月。
      注: 制备含有 bacmid DNA 的 DH10Bac大肠杆菌的甘油类。采取 300 ul 的文化, 并添加 200 ul 的甘油 50% (最后甘油浓度为 20%)。将整除存放在-80 摄氏度, 直到进一步使用。
    7. 使用 PCR 技术验证重组 bacmid 中 eTRPV1 的存在 (请参阅补充文件 1以查看详细协议)。
  2. 杆状 病毒
    注意: 对于这个过程, 染 Sf9 昆虫细胞的6井格式。所有金额和数量都是以每井为基础的。避免使用抗生素。
    1. 板 1 x 106 Sf9 细胞在2毫升昆虫细胞媒介。允许单元格附加至少45分钟。
    2. 在昆虫细胞培养基 100 ul 中稀释1微克的重组 bacmid DNA。轻轻拌匀。
    3. 稀释 6 ul 的转染试剂 (TR) 在 100 ul 的昆虫细胞培养基。轻轻拌匀。
    4. 结合 DNA 和 TR 溶液 (分别从步骤3.2.2 和 3.2.3)。轻轻混合, 在 RT 中孵化30分钟。
    5. 将0.8 毫升的昆虫细胞培养基添加到 DNA/TR 混合物中;轻轻拌匀。
    6. 从 Sf9 细胞中取出昆虫细胞培养基, 用1毫升新鲜培养基冲洗一次。
    7. 取出洗涤介质, 并将 DNA/TR 混合物 (3.2.2 \ u2012 3.2.5) 添加到细胞中。孵育细胞在27°c 5 小时 (无搅拌)。
    8. 去除转染的混合物, 并替换2毫升的昆虫细胞培养基含有0.5% 胎牛血清 (血清)。孵育细胞在27°c 五天。
      警告:用介质填充空阱, 用两层石蜡膜覆盖6井板, 防止细胞介质蒸发。
    9. 将细胞培养介质转化为15毫升离心管。用 8000 x g 旋转管, 在4摄氏度的15分钟内分离出病毒 P1 的第一通道。将上清液转移到干净的15毫升离心管, 并立即将其存储在4摄氏度。
      注意: 通过铝箔覆盖管来保护病毒不受光照射。
    10. 对于第二代 (P2) 病毒的股票, 把25毫升悬浮培养昆虫细胞媒介在 1 x 106 Sf9 细胞/毫升含有2% 血清的125毫升瓶 (平原底部和排气)。添加 25 ul 的 P1 病毒到25毫升的文化。
    11. 培养在27°c 72 小时的文化。
    12. 为了收获 P2 病毒的股票, 转移到一个新的50毫升管和离心机它在 8000 x 克15分钟在4摄氏度。
    13. 将上清液转移到新的50毫升管, 并立即将其存储在4摄氏度。
      注意: 通过铝箔覆盖管来保护病毒不受光照射。执行小规模实验, 滴定 P2 virus/Sf9 比, 以获得最佳 TRPV1 表达式 (参考详细协议的补充文件 1 , 4 节题为 "P2 病毒的小规模实验")。
    14. 对于大规模的蛋白质表达, 设置一个1升 Sf9 细胞悬浮培养在 2 x 106细胞/毫升的昆虫细胞培养基补充0.5% 血清为2.8 升硼硅酸盐玻璃瓶。
    15. 将1毫升的 P2 病毒储存到1升培养中, 并将其孵化27摄氏度为72小时。
      注: 第三天, 细胞密度应在大约1.5 至 2.5 x 106细胞/毫升。

4. eTRPV1 和单胱氨酸突变体纯化

  1. 膜隔离28
    1. 以 4500 x g、4°c 为单位, 以20分钟为单位, 收获 1 L 昆虫细胞悬浮培养. 称细胞颗粒 (预计约 6-9 克)。
    2. 并用重悬25毫升冰冷缓冲器 A (36.5 毫米蔗糖) 中的细胞颗粒, 2 毫米三 (2-羧乙基) 膦 (TCEP) 和50毫米三; pH 7.4) 在蛋白酶抑制剂 (1 毫米苄磺酸氟 (PMSF), 3 微克/毫升 leupeptin, 3 微克/毫升抑肽酶的存在下);, 1 微克/毫升 pepstatin)。分解细胞团簇以获得均匀悬浮和旋转在4°c 20 分钟。
    3. 使用手动 (dounce 组织磨床) 或高压均质机打破细胞。离心 8000 x g 20 分钟以4摄氏度去除细胞碎片。
      注意: 在整个过程中, 把裂解细胞和管子放在冰上。
    4. 收集上清和离心机在 10万 x g 30 分钟在4摄氏度。在20毫升的冰冷缓冲器 B (150 毫米氯化钠, 10% 甘油, 2 毫米 TCEP, 50 毫米 HEPES; pH 7.4) 的总容积中, 丢弃上清和并用重悬膜颗粒, 辅以蛋白酶抑制剂 (如步骤 4.1.2)。
    5. 整除20毫升的膜悬浮在50毫升管和闪光冷冻在液氮。将样品贮存在-80 摄氏度, 直到进一步使用。
  2. 蛋白质纯化26,28
    1. 在冰上解冻膜整除数, 每管增加3毫升的 n-Docecyl β D-Maltopyranoside (200 毫米的股票)。旋转管2小时在4摄氏度。
    2. 离心样品在 10万 x g 30 分钟在4°c。收集上清液, 加入1毫升干净湿直链淀粉树脂。将混合物旋转2小时, 在4摄氏度。在重力流层析柱中加载蛋白质/直链淀粉混合物。
      警告:不要让树脂在洗涤过程中干燥。
    3. 用10倍于冰冷缓冲 C (150 毫米氯化钠, 10% 甘油, 50 毫米 HEPES, 0.5 毫米, 0.1 微克/毫升 asolectin, 0.5 毫米 TCEP; pH 7.4) 的床卷洗涤蛋白质束缚的直链淀粉树脂。洗涤与10个床容量冰冷的缓冲 D (150 毫米氯化钠, 10% 甘油, 50 毫米 HEPES, 0.5 毫米被分解, 0.1 微克/毫升 asolectin, pH 7.4)。
      注: 清洗前, 德加缓冲 D 没有洗涤剂或脂质, 用氮气清洗。脱气作用后, 添加 asolectin 和。
    4. 洗脱 eTRPV1 蛋白与0.5 毫升分数, 高达5毫升, 冰冷脱气缓冲 D, 补充20毫米麦芽糖。如果可能, 执行洗涤和洗脱在4°c。
    5. 通过测量 280 nm 波长的吸收量来量化蛋白质的含量。
      注: 本协议每升培养0.5 至1.0 毫克蛋白质。每个 eTRPV1 单胱氨酸突变体的蛋白质产量都有差异。对于 EPR 和鹿实验, 生长 4 \ u2012 6 升的文化。

5. eTRPV1 单半胱氨酸突变体定点自旋标记

  1. 使用离心过滤单元 (截止 = 100 kDa) 将 eTRPV1-containing 分数集中到 2 \ u2012 2.5 毫克/毫升进行标记 (7000 x g 的周期为2摄氏度)。
  2. 添加10倍摩尔过剩 (3 倍, 每30分钟) (1-oxyl 22, 55-四 methylpyrrolidin-3-基) 甲基 methanethiosulfonate (MTSSL) 自旋标签从100毫米的股票溶液中亚砜到浓缩蛋白 (eTRPV1 单体: MTSSL 在1:10 摩尔比)17. 保持在黑暗中的反应在 RT 为1小时30分钟, 其次是隔夜孵化在4°c。
    注意: 在这一步, 可以通过添加 TEV 蛋白酶在夜间旋转标记孵化过程中去除 MBP。
  3. 负载自旋标记的 eTRPV1 在大小排除色谱柱平衡在缓冲 E (150 毫米氯化钠, 20 毫米 HEPES, 0.5 毫米分解; pH 7.4), 由一个快速的蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统控制。收集含有 eTRPV1 聚丙烯的分数。
    注: 在这个步骤中不包括10% 甘油, 因为它降低了重组效率。
  4. 通过测量 280 nm 波长的吸收量来量化蛋白质的含量。
  5. 通过运行 SDS 页凝胶 (无污渍的凝胶, 4 \ u2012 20%) 来评估样品的纯度。样品现在已经准备好用于光谱测量的溶液和/或 proteoliposomes。

6. eTRPV1 自旋标记的单半胱氨酸突变体重建

  1. 干燥10毫克的 asolectin 使用旋转蒸发器在真空 (≤100毫巴) 1 小时40摄氏度。要制造 asolectin 脂质体, 添加1毫升的缓冲 F (200 毫米氯化钠, 5 毫米拖把; pH 7.4) 和油脂实验混合物为15分钟或直到样品是均匀的。
  2. 使脂质体不稳定, 将其添加到最终浓度为2毫米, 在 RT 中孵育30分钟。
  3. 将标记的蛋白质集中在2毫克/毫升上, 并将其添加到脂质体中, 使用1:5 的蛋白质/脂质比 (质量: 质量)。
    警告:保持上述蛋白质浓度是很重要的, 因为自旋标记效率降低在低浓度和高蛋白质可能沉淀。
  4. 添加缓冲 F, 以调整蛋白质/脂质体混合物的分解临界胶束浓度 (CMC) 和孵化隔夜在4摄氏度与温和的搅拌。
  5. 将蛋白质/脂质体混合物的体积加倍与缓冲 F 和去除洗涤剂通过连续地增加三整除数非极性聚苯乙烯吸附剂珠 (30 毫克, 50 毫克和80毫克) 在 1 h 间隔以柔和的鼓动在 RT。
  6. 将混合物装入柱状过滤器 (重力流层析柱) 上, 去除珠子并将 proteoliposomes 混合物转移到 ultracentrifuge 管上。离心样品在 10万 x g 1 小时在4°c。在缓冲 F 的 30 ul 中丢弃上清和并用重悬颗粒。
    注: 样品已准备好进行光谱分析和注射到爪蟾卵母细胞。如果样品不能同一天使用, 则在液氮中进行闪光冷冻, 并贮存在-80 摄氏度。
  7. Proteoliposomes-爪蟾卵母细胞电生理学26,32
    1. 将不同稀释的自旋标记 proteoliposomes 的 50 nL 注入爪蟾卵母细胞, 如2.2 节所述。
    2. 按照2.3.10 节的说明, 在注射12小时后进行 TEVC 测量。
  8. 进行光谱测量和分析 (7 节)。

7. 鹿和 EPR Spectroscopies

  1. 双电子-电子共振 (鹿) 光谱学。
    1. 在采用 Q 波段频率 (34 GHz) 的脉冲 EPR 光谱仪中进行鹿测量, 并在83°使用制造商提供的软件33, 配备 10 W 放大器, 其死时免费四脉冲序列。
    2. 补充50µM 洗涤剂纯化 eTRPV1 自旋标记半胱氨酸突变体 E (步骤 5.5) 与 30% (v/v) 甘油为低温保护。
    3. 将样品装入一个密封的石英毛细管中, 用简单的低速离心 (100 x g) 向管子底部旋转。
    4. 将毛细管放入液氮中冷冻试样。样品可以被存放在这个点在-80 °c 为以后测量。
    5. 将样品直接放到微波谐振器中, 让它重新平衡 83° 10 \ u2012 20 分钟。
    6. 使用标准的四脉鹿协议 (π/2) mw1–τ1– (π) mw1–τ1– (π) mw2–τ2– (π) mw1–τ2–echo34来测量样品。脉冲长度为 (π/2) mw1 和 (π) mw1 是10和 20 ns, 分别和 40 ns 为 (π) mw2。将频率分离设置为 63 MHz。
      注意: 主要的鹿衰变数据可以用内置的软件 (如Matlab) 进行分析, 假设一个高斯分布的总和来描述自旋标签19,35之间的距离。
  2. 连续波 (CW) EPR 光谱学
    1. 使用制造商软件在 X 波段 (9.6 GHz) 光谱仪上执行 CW EPR 实验。
    2. 通过打开冷水机、控制台和磁铁电源来启动仪器。将软件连接到仪器, 将仪器调至最少30分钟, 使仪器预热。
    3. 将20µL 的样品从步骤5.5 加载到一个25µL 的玻璃毛细管中, 使用毛细管作用, 密封管的末端与密封胶。
    4. 将毛细管装入微波腔内, 并将谐振器手动或自动使用该软件的自动调谐功能。
    5. 在标准仪器条件下收集第一导数谱: 100 赫微波调制, 1.6 G 磁场调制, 10 兆瓦微波功率。
    6. 为了进行数据分析和演示, 在背景上校正光谱, 并通过将光谱除以双积分的峰值峰值来使其正常化。
    7. 通过测量第一导数吸收谱 (ΔHo-1)36的中心线宽度的逆, 确定自旋标签的移动性。

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Representative Results

最小半胱氨酸-少 TRPV1 构造 (eTRPV1) 和单半胱氨酸突变体的功能表征

向光谱学研究迈出的第一步是对功能化和产生生化量蛋白质的半胱氨酸蛋白质结构 (图 2A) 进行设计和表征。eTRPV1 的功能, 由 Ca2 +成像和 TEVC (图 2B-C) 确定。此外, eTRPV1 为 EPR 和鹿实验提供了足够数量的洗涤剂纯化蛋白 (每公升 0.5-1 毫克 Sf9 细胞)26。在特定的蛋白质区域引入单个半胱氨酸可能会影响它们的功能。图 2B显示了 eTRPV1 的单半胱氨酸突变体 (E651C 和 A702C) 的一些例子, 因为它们的荧光强度随着 TRPV1 激动剂 (如辣椒素) 添加到 eTRPV1-containing HEK293单元格, 如 Ca2 +成像26所示。另一方面, A680C 是一个非功能性半胱氨酸突变体的典型例子, 因为荧光与背景不区分。A680C 突变体被排除在外进行进一步分析。经过2 +影像学实验, 用 TEVC 或膜片钳对单半胱氨酸突变体的功能进行了测试, 以评估其生物物理特性。图 2C显示突变体在 pH 值为5的情况下, 对 TRPV1 的外矫正特性进行了重述, TEVC26。单半胱氨酸突变体的功能分析是实施表达和纯化协议前的第一个检查点。

eTRPV1 和单半胱氨酸突变体的生化特性研究

上面描述的纯化协议产生洗涤剂-可溶性蛋白, 可以通过半胱氨酸共价修饰 (例如, 显影, 自旋标记 [SL] 甲基 methanethiolsulfonate) 沿 TRPV1 序列来标记光谱分析。最小 TRPV1 通道含半胱氨酸残留迁移为稳定和单分散的物种 (~ 13.6 毫升), 由大小排除色谱确定 (图 3)。eTRPV1 和单胱氨酸自旋标记突变体 (E651C-SL 和 A702C-SL) 重述了最小 TRPV1 构造特征的洗脱剖面和稳定性 (图 3)26。在不同突变体中, 洗脱剖面可能会有所不同, 因为单半胱氨酸可能会影响蛋白质的稳定性。在某些情况下, 突变体形成聚集;样品的一小部分可以洗脱在柱 (8-9.5 毫升) 的空隙体积上, 减少作为聚丙烯迁移的蛋白质数量 (图 3, 下红色箭头)。在这种情况下, 细胞培养卷可以放大, 以弥补在累积分数中丢失的蛋白质, 或者你可以排除这个突变体进一步分析, 并进行测试相邻残留。其他例子包括扩大与聚丙烯对应的峰值。不建议在光谱分析中使用比3毫升宽的主峰值, 因为它们含有多分散的物种。自旋标记的单半胱氨酸突变体的生化特性是进行重构和光谱分析前的第二个检查点。

重组自旋标记 eTRPV1 单半胱氨酸突变体的功能表征

由于 EPR 和鹿信号依赖于对半胱氨酸残留物的顺磁性自旋标签的附着, 所以验证自旋标签的位置是否改变蛋白质功能是很重要的。在重组自旋标记蛋白后, 有多种方法可以进行功能测试, 包括平面脂质双层实验、膜片钳和 TEVC。TEVC 允许在记录宏观电流的同时对大量的自旋标记通道进行评估。为了评估自旋标记的单半胱氨酸突变体的功能, 在预形成的 asolectin 脂质中重组了通道。在这一步骤中, 重要的是排除在整个纯化过程中存在的10% 甘油, 因为甘油降低了蛋白质重组为脂质体的效率。图 4显示了 A702C-SL TRPV1 重组 asolectin 脂质体和杏仁成爪蟾卵母细胞的典型结果。正如预期的那样, pH 值5引出了强大的向外整流电流37被 TRPV1 拮抗剂 capsazepine (CPZ, 蓝迹)26的联合应用阻断。在旋转标记和重构后不保留功能的突变体应排除在进一步分析之外。重组自旋标记单半胱氨酸突变体的功能表征是进行光谱分析前的第三个检查点。

连续波-EPR 和鹿监测的自旋标记 eTRPV1 突变体的结构动力学

氮氧自由旋转标签是敏感的周围环境和灵活性的蛋白质骨干, 标签是附加17。因此, CW-EPR 允许确定一个给定的自旋标记半胱氨酸的动态方案;也就是说, 暴露在水介质或膜上的位置比那些限于蛋白质-蛋白质相互作用的部位更有活力17。图 5A显示了在 TRPV1 中选择用于监视移动参数的位置 Glu651、Ile679 和 Ala702。要计算旋转标签探头的移动参数, 你计算第一导数吸收光谱的中心线宽度的逆 (图 5B, 黑线ΔHo−1)。例如, E651C-SL (图 5B) 显示了在膜接口26的动态位置上通常发现的谱线形状和移动值 (0.24)。另一方面, I679C-SL 和 A702C-SL 展示了光谱的加宽 (参见虚线) 和流动性价值的减退 (分别0.16 和 0.18;图 5B)26是符合他们的约束周围环境 (蛋白质-蛋白质), 根据低温 EM 结构1。

图 5C显示了 asolectin 脂质体重组后的自旋标记 TRPV1 变种的光谱。正如预期的那样, E651C-SL 和 A702C-SL 的光谱动态特性在重组后没有改变, 因为它们的形状和移动值在溶液中和膜环境26中是相同的。另一方面, I679C-SL 说明了一个嘈杂的频谱;因此, 较低 (蓝色箭头) 和更高 (红色箭头) 字段组件变得不那么明显。通常不需要有噪声的光谱, 因为它们往往低估了自旋标记位置的移动性。这种频谱类型可能是低效蛋白质重组的产物, 而不是标记下, 因为 I679C-SL 信号在溶液中是健壮的。

鹿数据是一个振荡的, 正弦信号衰变的总和, 包含有关相互作用的自旋标签38,39的距离分布的信息。衰变的周期和复杂性直接反映了底层的距离分布。距离分布由样本中存在的结构成分数和它们的无序度组成。因此, 时域信号来源于非固定的, 遥远的自旋标签之间的偶极耦合, 通常导致指数背景衰减, andrigidly 耦合的旋转在同一蛋白质19,40。具体来说, 鹿允许测定蛋白质的长距离距离 (20-70 Å) 之间的自旋标记残留19。图 6显示了 E651C-SL 的信号衰减和相应的距离分布。Glu651 的分布显示三个峰值对应于24、36和58Å26。两个较短的距离是一致的闭合的 TRPV1 结构 (分别为 Cβ-Cβ距离的23和32Å)1, 而第三58Å高峰可能对应于蛋白质汇集。

Figure 1
图1。实验大纲.为 EPR 和鹿 eTRPV1 的表达、纯化和重建所需的实验轮廓图。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。eTRPV1 和单半胱氨酸突变体的功能表征.(A) 用于光谱学分析的 TRPV1 结构的示意图表示 (eTRPV1: 半胱氨酸--TRPV1 110-603/627-764)。(B) 用荧光钙2 +成像技术分析了 TRPV1、eTRPV1 和突变体 (载有钙2 +敏感 Fluo-4-AM) 的 HEK293 细胞, 用于辣椒素 (10 µM) 诱发反应。颜色条指示荧光强度的相对变化, 蓝色和红色表示最低和最高胞质钙2 +, 分别。白色酒吧代表100µm (C) 左, 一个亚基 (S5, 孔螺旋, S6 和多党领域) TRPV1 聚丙烯结构突出显示单半胱氨酸残留 (黄色球体) 沿通道序列引入。正确的, 电流-电压关系确定的 TEVC 记录从爪蟾卵母细胞表达的 TRPV1, eTRPV1 和单半胱氨酸突变体挑战 pH 值5。背景电流 (bkgrd)。从原始图26修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。eTRPV1 和单半胱氨酸突变体的生化特性。
可溶性 eTRPV1 和单胱氨酸自旋标记突变体在 Sf9 细胞表达纯化后的大小排斥色谱剖面。嵌入: SDS 页凝胶显示单体 eTRPV1-MBP 融合蛋白 (从原图26修改)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。自旋标记 eTRPV1 突变体的功能表征。
TEVC 从爪杏仁卵母细胞中测定的电流-电压关系 proteoliposomes 含有自旋标记 A702C 挑战 pH 值为 5 (红色), 并被 capsazepine (CPZ, 蓝色:40 µM) 阻断。背景电流 (bkgrd)。从原始图26修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。导纳的自旋标记 eTRPV1 突变体的测定。
(A) TRPV1 聚丙烯结构的两个亚基 (S5、孔螺旋、S6 和多党域), 突出了通过现场定向自标记 spectroscopies 探测到的氨基酸残留物 (黄色球体)。(B) 首次导数的自旋标记半胱氨酸突变体的连续波 EPR 谱。(C) 在 asolectin 脂质体中重组的自旋标记半胱氨酸变种的连续波 EPR 谱的第一导数。光谱在 pH 值 7.4 (闭合的状态) 获得。ΔHo−1表示移动参数的大小。黑色虚线突出了光谱的扩大。蓝色和红色箭头分别表示光谱的低和高场分量。EPR 谱被规范化为自旋标签总数。从原始图26修改。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图6。洗涤剂中 eTRPV1 突变体的距离分布。
鹿回声 (a) 和距离分布 (B) 的自旋标记突变 E651C;对鹿的数据高斯模型了一笔。P (r)表示旋转对41的距离分布。光谱在 pH 值 7.4 (闭合的状态) 获得。从原始图26修改。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

目前, 哺乳动物膜蛋白的表达和纯化技术使得获得足够数量的蛋白质用于光谱学研究14,15,16,42。在这里, 我们已经适应了这些技术来表达, 纯化, 重建, 并执行光谱分析在 TRPV1。

在《议定书》的关键步骤中, 下面是我们为 TRPV1 诊断的, 可能会对其他蛋白质进行调整。修改 DNA 序列生成一个模板, 产生 0.5-1 毫克/毫升的洗涤剂纯化蛋白;产生少于0.5 毫克/毫升蛋白质的模板是有挑战性的, 因为每个变种人需要生长超过6公升的昆虫细胞培养物。蛋白质必须集中, 不少于2毫克/毫升, 没有 TCEP 提高自旋标签的效率。标记在低蛋白质浓度和/或在存在的 TCEP 痕迹将产生嘈杂的 EPR 光谱。尽管蛋白质在纯化过程中保持在4摄氏度, 但在 RT 上进行自旋标记以提高效率是必不可少的。在纯化和标记过程中, 甘油提高蛋白质的稳定性;然而, 它必须在重组前完全消除, 因为它减少了脂质体中蛋白质的数量, 产生了嘈杂的 EPR 谱。减少在 CMC 下面的洗涤剂浓度是一个常见的做法, 在重组;然而, 在加入脂质体之前, TRPV1 倾向于沉淀。为了解决这一问题, TRPV1 与预形成的脂质体在 CMC 上进行了一夜的孵化, 以避免蛋白质沉淀, 增加 proteoliposome 制剂中的通道数量。TRPV1 在 asolectin 脂质体28中功能齐全;因此, 它是本议定书中使用的首选脂质混合物。然而, 在进行光谱分析之前, 确定某一特定蛋白质的功能性 (如胆固醇) 的脂质成分是至关重要的。

像 EPR 和鹿这样的光谱学方法存在一些局限性, 包括: 蛋白质模板序列的变化, 改善生物化学稳定性可能会影响功能26;引入非原生单半胱氨酸, 以及自旋标签, 在蛋白质的某些区域可能不能很好地耐受;获得大量的标记蛋白;和有限的构象变化时, 确定距离与鹿在洗涤剂胶束。然而, 后者的限制可以克服通过收集光谱, 在 Q 波段频率, TRPV1 突变体重组在 nanodiscs19,43。然而, 这些方法的优势主要来自于全球动力学、可访问性和距离的格局, 而非给定位置的绝对值。

温度灵敏度是最吸引人和不理解的浇口机构之一;因此, 使用光谱学方法, 就有可能确定膜蛋白如何将热能转化为蛋白质在膜环境中的运动。重要的是, 这将是挑战, 以确定在热门的结构变化使用 X 射线结晶学或低温 EM, 因为这些技术是在低温下执行。未来的实验将用于确定 TRPV1 构象变化兼容与热依赖的门使用 EPR, 鹿, 或荧光。EPR 光谱学为原核离子通道提供了详细的机械模型, 因此我们期望通过使用上述的协议, 我们将深入了解哺乳动物离子通道活化和药物结合的机制, 利用光谱学方法。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们非常感谢 h. Mchaourab 博士提供了获得 EPR 和鹿分光仪和 t 鲍姆博士的机会, 以提供全长半胱氨酸--较少的 TRPV1 质粒。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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光谱分析 TRPV1 的纯化与重构
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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