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Biochemistry

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796

Summary

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

Abstract

Polymodal 이온 채널 transduce 다른 성격의 여러 자극에 allosteric 변화; 이러한 동적 conformations 확인 하 고 크게 불명 하 게 남아 도전입니다. 주 작동 근 바인딩 사이트의 구조적 특징 및 여러 이온 채널의 활성화 메커니즘에 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 발산 빛의 최근 발전, 무대는 그들의 게이팅의 깊이 있는 동적 분석에 대 한 설정 분 광 방법을 사용 하 여 기계 장치입니다. 이중 전자-전자 공명 (사슴)와 전자 상자성 공명 (EPR) 분 광 기술을 대량으로 순화 될 수 있는 간결한 이온 채널 연구에 주로 제한 되었습니다. 대량의 기능과 안정적인 막 단백질에 대 한 요구 사항을 이러한 방법을 사용 하 여 포유류 이온 채널 연구를 방해 했다. EPR 및 사슴 이기는 하지만 낮은 해상도에서 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM 얻으려면 어려울 수 있습니다, 구조 결정 및 모바일 단백질 영역의 동적 변화를 포함 하 여 및 가역 게이팅 모니터링 많은 장점을 제공합니다 (, 폐쇄, 오픈, 응, 그리고 desensitized) 전환. 여기, 우리는 기능성 세제 solubilized 일시적 수용 체 잠재적인 양이온 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 사슴 및 EPR 분광학에 대 한 분류 수 밀리 그램을 얻기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Introduction

단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)의 최근 발전, 포유류 이온 채널 구조는 특별 한 속도로 얻은 되었습니다. 특히, 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 같은 polymodal 이온 채널의 구조 연구를 제공 추가 활성화 메커니즘1,2,3, 의 이해 4 , 그러나 5., 막 환경에 포함 된 이온 채널에 대 한 동적 정보는 그들의 polymodal 제어 및 약물-바인딩 메커니즘을 이해 하는 데 필요한.

전자 상자성 공명 (EPR) 및 이중 전자-전자 공명 (사슴) spectroscopies 이온 채널6,7,,89 에 대 한 가장 확실 한 기계적 모델의 일부를 제공합니다 , 10 , 11 , 12 , 13. 이러한 접근의 간결한 검사에 주로 제한 되었습니다 및 archeal 이온 채널을 때 박테리아에 overexpressed 세제 정화 단백질 많은 양의 얻을. 곤충과 포유류 세포 기능 및 구조 특성화14,,1516진 핵 막 단백질 생산의 개발, 그것은 지금 생화학 얻을 수 분 광 연구에 대 한 세제 정화 단백질의 금액.

EPR 및 사슴 신호 단백질에서 단일-시스테인 잔류물에 연결 된 paramagneticspin 레이블 (SL) (, methanethiosulfonate)에서 발생 한다. 스핀-레이블을 보고 세 가지 유형의 구조 정보: 모션, 각, 및 거리. 이 정보는 잔류물 단백질 내 매장 하거나 막 또는 apo에 ligand 바인딩 상태13,17,,1819수성 환경에 노출 되는 수 있습니다. 고해상도 구조 (사용 가능한 경우)의 맥락에서 EPR 및 사슴 데이터 제공 가역 제어 전환 (, 폐쇄, 오픈, 모니터링 하는 동안 그들의 네이티브 환경에서 동적 모델을 파생에 대 한 제약 조건의 컬렉션 응, 그리고 desensitized). 또한, 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-그들 확인 하기 어려울 수 있습니다 유연한 지역 2 차 구조는 단백질20내의 위치 할당을 이러한 환경 데이터 집합을 사용 하 여 얻을 수 수 있습니다. 이온의 게이팅에 대 한 귀중 한 정보 채널3,,2122,,2324, 를 제공 하는 곳을 알아내는-EM 구조 지질 nanodiscs에서 25; 그러나, 분 광 방법 구조적 하는 상태에서 (예를 들어, 열 변경) 곳을 알아내는-그들을 사용 하 여 결정 하기 어려울 수 있습니다 동적 정보를 제공할 수 있습니다.

EPR와 사슴, 단백질 기능의 부족을 포함 하 여 모든 시스테인 잔류물 (특히 풍부한 포유류 채널에서), 낮은 단백질 수확량, 단백질 불안정성을 제거 하는 정화 동안 고 스핀 라벨링 후 구현 하 많은 어려움을 극복 한다 그리고 단백질 집계 세제 또는 리. 여기, 우리는 이러한 중요 한 장벽을 극복 하 여 포유류 감각 수용 체에 대 한 사슴 및 EPR 스펙트럼 정보를 얻은 프로토콜 설계. 여기 목적은 식, 정화, 라벨, 및 기능 최소화 시스테인-덜 쥐 TRPV1의 재구성 (eTRPV1) 분 광 분석에 대 한 구성에 대 한 방법론을 설명 하는 것입니다. 이 방법론은 그 막 단백질 이황화 결합을 형성 하는 시스테인을 포함 하는 또는 시스테인 잔류물의 제거에도 불구 하 고 그들의 기능을 유지 하는 것에 적합 합니다. 프로토콜의이 컬렉션은 다른 포유류 이온 채널의 분 광 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

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Protocol

1. TRPV1 Mutagenesis

참고: 분 광 분석26 에 대 한 최소한의 TRPV1 구문 전체 길이 시스테인-덜 채널 TRPV127 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법 (그림 1)를 사용 하 여에서 건축 되었다. 110-603, 627-764 잔류물이 시스테인 없는 최소한의 TRPV1 구문 (라고도 함 eTRPV1 이후)에 의하여 이루어져 있다. eTRPV1와 히스티딘 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) x 8을 포함 하는 재조합 기증자 벡터28 pMO (pcDNA3.1 기반 벡터) 기능 분석에서에서 복제 했다-담배 엣지 표현과 정화 (그림 2A)에 대 한 바이러스 (TEV). eTRPV1-단일 시스테인 돌연변이 사이트 지시 된 mutagenesis를 사용 하 여 생성 된. 벡터 및 채널 시퀀스에 지정 된 보조 파일 1: 보충 방법.

  1. 온라인 도구29와 mutagenesis 뇌관 디자인.
  2. 0.2 mL 튜브에 혼합: 반응 버퍼, dNTP 믹스 (100 mM)의 1 μ, μ M 정방향 및 역방향 oligonucleotides 10, 100 ng/μ eTRPV1 서식 파일 DNA26의 1 μ, DMSO, mutagenesis 효소의 1 μ의 1.5 μ의 각 1 μ x 10의 5 μ 그리고 이온된 수의 38.5 μ. 튜브는 thermocycler에 배치 하기 전에 혼합물을 회전 합니다.
  3. PCR mutagenesis를 수행 합니다.
    1. 2 분 동안 95 ° C에서 변성 (a), (b) 20 95 ° C에서 변성 수행 s, (c) 10 s, 및 (d) 신장 4 분 동안 68 ° C에서 60 ° C에서 어 닐 링 (30 1 kb / s). 18 주기 위한 단계 b d 반복 다음 5 분, 68 ° C에서 신장 수행 하 고 추가 사용 때까지 4 ° C에서 반응 유지.
  4. Dpn의 2 μ 추가 나 효소 반응; 믹스와 다음 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  5. 변환 수행
    1. 대장균 유능한 세포 얼음에 녹여
    2. 사전 냉각된 14 mL 무 균 튜브에 유능한 세포의 75 μ와 10 μ DpnI 치료 PCR 혼합물의 추가 합니다. 부드럽게 혼합.
    3. 30 분 유지 45 42 ° C에서 튜브에 대 한 얼음에 반응을 품 어 s 다음 즉시 제자리에 2 분 접시에 얼음 혼합물에 Luria 국물 (파운드)-carbenicillin (0.2 mg/mL)를 포함 하는 한 천 배지. 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
    4. 플레이트에서 최소한 3 개의 단일 식민지를 수확 하 고 각각 carbenicillin (0.2 mg/mL) 14 mL 살 균 튜브를 사용 하 여 포함 된 파운드의 4 mL에 접종. 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어 고 250 rpm에 흔들.
    5. 10 분 동안 8000 x g에서 하룻밤 문화 아래로 회전 시키십시오 그리고 상업적으로 사용 가능한 미니 준비 키트의 지침에 따라 DNA를 추출.
    6. 표준 자동화 된 DNA 시퀀싱에 의해 단일-시스테인 돌연변이의 존재를 확인 ( 재료의 표참조).

2. eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 분석

  1. HEK293 세포 transfection 라인 30
    1. 잘 당 2 ml 높은 포도 당 매체 (DMEM)의 6-잘 접시에서 HEK293 세포 문화 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도). 70 \u2012 80% 합칠 HEK293 세포를 준비 합니다.
    2. 두 개의 별도 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 transfection 혼합물을 준비 합니다.
      1. A 반응, 최소한의 필수 매체 (예: Opti 메모리)의 250 µ L를 0.5 µ g eTRPV1 또는 시스테인 돌연변이 포함 된 pMO를 추가 합니다. B 반응에 대 한 최소한의 필수적인 매체의 250 µ L를 transfection 시 약의 3 µ L를 추가 합니다. 각 반응 실내 온도 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
      2. 1 mL 피 펫과 반응 A와 B를 혼합. 실시간에서 45 분을 위한 혼합물을 품 어
    3. 70-80% 합칠에서 문화 미디어의 500 µ L를 잘 제거 하 고 반응 혼합물의 500 µ L을 추가. 하룻밤 위한 캘리포니아2 + (37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도) 이미지를 저장 합니다.
  2. 캘리포니아2 + HEK293 세포 이미징 30
    1. 12 m m 직경 유리 coverslips 에탄올과 물으로 청소 하 고 24-잘 접시에 그들을 배치.
    2. 각 coverslip의 센터에서의 폴 리-l-리 신 75 µ L을 추가 하 고 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 45 분 동안 접시를 저장.
    3. 인산 염 버퍼 염 분 제거 어떤 남은 하 (PBS)와 세 번 초과 폴 리-l-라이 신 및 세척 coverslips를 제거 합니다.
    4. coverslips 준비가 되 면, 일단 6 잘 플레이트 세포 분리를 진행 합니다.
    5. 미디어를 제거 하 고 세척에 대 한 따뜻한 PBS (37 ° C)의 500 µ L를 추가 합니다.
    6. PBS를 제거, 트립 신의 500 µ L을 추가 하 고 1 분 동안 품 어.
    7. 따뜻한 문화 (37 ° C) 및 미디어를 소화 반응을 중지 피펫으로; 혼합의 500 µ L을 추가 거품을 형성 하지 마십시오. 필요한 경우 더 많은 문화 미디어와이 물의 resuspension diluting 셀 농도 조정 합니다.
    8. 문화 미디어 (500 µ L 최종 볼륨 잘 당) 전 대우 coverslips의 250 µ L 플러스 transfected HEK293 세포 (70% 합칠)의 250 µ L 씨와 인큐베이터 (37 ° C, 5 %CO2, 95% 습도)에 1-2 h (첨부 파일)에 대 한 진정 하자.
    9. 한편, 0.02 %pluronic 산과 1 µ M를 추가 하 여 로드 솔루션 준비 Fluo-4-오전 벨의 버퍼를. 솔루션을 잘 섞는다.
    10. 우물에서 HEK293 문화 미디어를 제거 하 고 로드 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다. 1 시간 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 대 한 셀을 품 어. 씻어 따뜻한 벨의 버퍼와 두 번 Fluo-4 로드 셀.
    11. 세포내 캘리포니아2 + 측정을 수행 (를 사용 하 여 목표; 494 nm 여기 및 506 nm 방출 X 10) 현미경 스테이지에 10 mm 페 트리 접시에 로드 셀 coverslip을 놓습니다.
    12. (예를 들어, 10 μ M capsaicin) 각각 ligands perfusing 후 형광 강도에 변화를 측정 상용 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조).
  3. mRNA와 Xenopus laevis oocytes 준비 30
    1. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 포함 된 pMO Pme로 선형화 37 ° c.에 1 시간을 위한 나 DNA 상용 정화 키트의 지침에 따라 청소.
    2. 사용 선형화 및 상용 키트 T7 RNA 중 합 효소와 호환와 함께 출장된 RNAs를 합성 하는 DNAs를 청소.
    3. 상업적으로 이용 가능한 정화 키트에 따라 출장된 RNAs를 청소. 260 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 RNA의 양을 계량.
    4. 전송 5 \u2012 포함 하는 ND96 솔루션의 20 mL 50 mL 원뿔 튜브에 X. laevis oocytes (상용)의 10 mL (96 m NaCl, KCl, 5 mM HEPES, 2mm m 1 m m MgCl2, pH 7.4) 1 mg/mL 콜라와 실시간에 50 분 nutate
    5. 린스는 oocytes ND96에까지 솔루션은 분명 하다. 신선한 콜라를 추가 하 고 스테레오 현미경 oocytes 실시간 검사에서 30 분 동안 흔들어 외부 follicular 레이어 (광택 레이어 붉은 혈관)는 결 석 때 소화를 중지 대부분 oocytes (90%)에서. 솔루션은 분명 때까지 ND96에 oocytes를 씻어.
    6. ND96 플러스 1 m m CaCl2 와 쉐이크 1 헤-소화 oocytes에 대 한 폴리스 티 렌 50 mL 튜브에 전송 oocytes는 폴리스 티 렌 튜브에 충실 합니다.
    7. ND96 플러스 1 mM gentamicin의 50 µ g/mL와 항생물질의 50 µ g/mL CaCl2 와 보충 솔루션 oocytes를 씻어.
      참고: 가벼운 노출에서 항생물질을 포함 하는 솔루션을 보호 합니다.
    8. 손상 된 막과 동물과 야채 기둥 사이의 명확한 분리 표시 없이 큰 oocytes를 선택 합니다. Oocytes 16 ° c.에 microinjection 전에 4 h에 대 한 복구를 하자합니다
    9. 유리 펫을 사용 하 여 (마약: 1.11 m m, 아이디: 0.5, 그리고 길이 8.8 cm) oocytes nanoliter 인젝터 시스템 (46 nL/s)와 스테레오 현미경 (2 배 확대)를 사용 하 여 eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 체에서 mRNA의 1-5 ng 주입 하. 항생제와 CaCl2 보충 하는 ND96에 16 ° C에 oocytes를 저장 (gentamycin/항생물질 1 x).
    10. 72 h 후 거시적인 전류 2 전극 전압 클램프 (TEVC) 수집 시스템31를 사용 하 여 측정 합니다.
    11. 붕 규 산 유리 펫 (0.3 m ω)을 당겨 하 고 3m KCl 그들을 채우십시오.
    12. 전송 피 펫을 사용 하 여 녹음 실에는 oocyte 놓고 낮은 속도로 목욕 솔루션 (120 mM NaCl, KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 그리고 10 mM HEPES 솔루션 2mm, pH 7.4) perfuse.
    13. 그들의 피 펫 오프셋 조정 목욕 솔루션에 두 전극을 담가. 부드럽게 밀어 피 펫 전극 (붕 규 산 유리 펫; 마약: 1.5 m m, 아이디: 1.10, 및 길이 10 cm) oocyte 막 잠재력에 있는 변화 뿐만 아니라 작은 들여쓰기 (2 배 확대), 스테레오 현미경 관찰 될 때까지에.
    14. 80-80에서 전압 클램프 램프를 적용 하는 동안 모드 및 측정 거시적인 전류를 기록 앰프 설정 변경 1 s. 부하 관류 시스템에서 사용 하는 솔루션에 대 한 mV 2.3.12 pH 7.4 (컨트롤로)와 pH eTRPV1 활동을 확인 하는 5 단계.

3. 단백질 표정을 위한 재조합 Bacmid 및 잠재 생성

  1. Bacmid
    1. 7.5와 DH10Bac 대장균 유능한 세포의 100 μ 변환 eTRPV1 또는 단일-시스테인 돌연변이 포함 하는 재조합 기증자 벡터의 ng.
    2. SOC 미디어의 900 μ 추가 (20 mg/mL Tryptone, 5 mg/mL 효 모 추출, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 10 m m MgSO4및 20 m m 포도 당)과 6-7 h 37 ° C에서와 225 rpm에 품 어.
    3. 혼합물에서 직접 및 직렬 희석에서 100 µ L 씨 (1/10과 1/100)에 파운드-한 천 배지 100 μ g/mL X-여자, 40 μ g/mL IPTG, 포함 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질 및 50 μ g/mL 대. 37 ° c.에 적어도 48 h에 대 한 번호판을 품 어
    4. 백색 식민지는 직경에서 2 mm 블루 식민지 부족의 삽입을 선택 합니다. 스테레오 현미경을 사용 하 여 백색 식민지 어떤 푸른 반점 든 지를 포함 하지 않는 확인 하십시오.
    5. 적어도 3 개의 단일 식민지를 수확 하 고 파운드 미디어 7 μ g/mL gentamicin, 10 μ g/mL 항생물질 및 50 μ g/mL 대 보충의 4 mL를 포함 하는 14 mL 무 균 튜브에 그들을 전송. 셀 하룻밤 (~ 16 h) 37 ° C, 250 rpm에서 품 어.
    6. 야간 문화 및 격리 재조합 bacmid DNA (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조)의 1.5 mL를 가져가 라. 최대 2 개월까지 4 ° C에서 bacmid를 저장 합니다.
      참고: bacmid DNA를 포함 하는 DH10Bac 대장균 의 글리세롤 주식 준비. 문화의 300 μ 고 200 μ 글리세롤의 50% (최종 글리세롤 농도 20%의) 추가. 추가 사용까지-80 ° C에서 약 수를 저장 합니다.
    7. PCR를 사용 하 여 재조합 bacmid에서 eTRPV1의 존재를 확인 (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조).
  2. 잠재
    참고:이 절차에 대 한 6-잘 형식에서 Sf9 곤충 세포 transfect. 모든 금액과 볼륨 당 잘으로 받는다. 항생제의 사용을 하지 마십시오.
    1. 곤충 세포 미디어의 2 mL에 1 x 106 Sf9 세포를 플레이트. 적어도 45 분 동안 연결할 셀 수 있습니다.
    2. 곤충 세포 미디어의 100 μ에 재조합 bacmid DNA의 1 μ g을 희석. 부드럽게 혼합.
    3. 곤충 세포 미디어의 100 μ에 transfection 시 약 (TR)의 6 μ를 희석. 부드럽게 혼합.
    4. DNA와 TR 솔루션을 결합 (에서 단계 3.2.2, 3.2.3, 각각). 부드럽게 혼합 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
    5. DNA/TR 혼합물;에 곤충 세포 미디어의 0.8 mL을 추가 부드럽게 혼합.
    6. Sf9 세포에서 곤충 세포 미디어를 제거 하 고 신선한 매체의 1 mL로 한 번 씻어.
    7. 세척 매체를 제거 하 고 DNA/TR 혼합물 추가 (3.2.2 \u2012 3.2.5) 셀에. 셀 (동요) 없이 5 h 27 ° C에서 품 어.
    8. Transfection 혼합물을 제거 하 고 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 곤충 세포 미디어의 2 개 mL를 바꿉니다. 5 일 동안 셀 27 ° c를 품 어.
      주의: 미디어 빈 우물을 작성 하 고 파라핀 영화의 2 개의 층으로 6 잘 플레이트를 취재 하 여 셀 미디어의 증발을 방지.
    9. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 배양을 전송. 4 ° c.에 15 분 동안 8000 x g에서 튜브를 회전 시켜 바이러스 성 주식의 첫 대목 (P1)을 분리 깨끗 한 15 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송 및 즉시 4 ° c.에 그것을 저장합니다
      참고: 알루미늄 호 일을 가진 관을 취재 하 여 가벼운 노출에서 바이러스를 보호 합니다.
    10. 바이러스 성 주식의 2 세대 (P2), 1 x 106 Sf9 셀/mL 2% 포함에 곤충 세포 미디어의 현 탁 액 25 mL 문화 넣어 125 mL 플라스 크에 FBS (일반 바닥 및 배기). 25 mL 문화에 P1 바이러스의 25 μ를 추가 합니다.
    11. 72 h 27 ° C에서 문화를 품 어.
    12. P2 바이러스 성 주식을 수확, 새로운 50 mL 튜브에 문화를 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 8000 x g에서 원심
    13. 새로운 50 mL 튜브에는 상쾌한 전송 및 즉시 4 ° c.에 그것을 저장합니다
      참고: 알루미늄 호 일을 가진 관을 취재 하 여 가벼운 노출에서 바이러스를 보호 합니다. 최적의 TRPV1 식 P2 바이러스/Sf9 비율을 적정 하는 소규모 실험 수행 (자세한 프로토콜에 대 한 보충 파일 1 참조, 섹션 4 라는 "P2 바이러스에 대 한 소규모 실험.")
    14. 곤충 세포 미디어 0.5%와 보충에 2 x 106 셀/mL에서 대규모 단백질 표정, 설정 1-L Sf9 세포 현 탁 액 문화 FBS 2.8 L 붕 규 산 유리 플라스 크에.
    15. 1 L 문화에 P2 바이러스 주식의 1 mL을 추가 하 고 72 h 27 ° C에서 품 어.
      참고: 세번째 날에 셀 밀도 약 1.5 ~ 2.5 x 106 셀/mL에 있어야 합니다.

4. eTRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이 정화

  1. 막 분리28
    1. 4500 x g, 4 ° C, 20 분에 회전에 의해 1 L 곤충 세포 현 탁 액 문화 무게 (약 6-9 g을 될 것으로 예상) 셀 펠 릿 추수.
    2. 25 mL의 얼음 처럼 차가운 버퍼 A에 셀 펠 릿 resuspend (36.5 m m 자당, 2 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), 및 50 mM Tris; pH 7.4) protease 억제제 (1 m m phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF), 3 μ g/mL leupeptin, 3 μ g/mL aprotinin 존재 그리고 1 μ g/mL pepstatin). 균질 정지를 20 분 동안 4 ° C에서 회전 셀 덩어리 세분화
    3. 설명서 (dounce 조직 분쇄기) 또는 고압 균질 화기를 사용 하 여 셀을 휴식. 4 ° c.에 20 분 동안 8000 x g에서 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거
      참고: 전체 프로세스 중 lysed 세포와 얼음에 튜브를 유지.
    4. 상쾌한 및 4 ° c.에 30 분 동안 100000 x g에서 원심 분리기를 수집 상쾌한 무시 하 고 막 펠 릿 (4.1.2 단계)에서 프로 테아 제 억제제와 보충 (150 mM NaCl, 2mm TCEP, 50 mM HEPES 10% 글리세롤, pH 7.4), 얼음 처럼 차가운 버퍼 B의 20 mL의 총 볼륨에 resuspend.
    5. Aliquot 20 mL 50 mL 튜브에 막 펜션과 플래시-동결 액체 질소에서의. 추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
  2. 단백질 정화26,28
    1. 멤브레인 aliquots 얼음에 녹여 고 n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) 튜브 (200 m m 재고) 당 3 mL를 추가 합니다. 2 h 4 ° c.에 대 한 튜브를 회전
    2. 4 ° c.에 30 분 동안 100000 x g에서 샘플을 원심 수집 하는 상쾌한 고 깨끗 한 젖은 amylose 수 지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h 4 ° c.에 대 한 혼합물을 회전 단백질/amylose 혼합물 중력 흐름 크로마토그래피 열에 로드 합니다.
      주의: 세척 중 건조 수 지를 허용 하지 않습니다.
    3. 10 배 얼음 처럼 차가운 버퍼 C (150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 0.5 m m DDM, 0.1 μ g/mL asolectin, 0.5 m m TCEP 10% 글리세롤, pH 7.4)의 침대 볼륨 단백질 바인딩 amylose 수 지를 세척. 얼음 처럼 차가운 버퍼 D (150 m m NaCl, 10% 글리세롤, 50 mM HEPES, 0.5 m m DDM, 0.1 μ g/mL asolectin, pH 7.4)의 10 침대 볼륨 씻어.
      참고: 이전에 세척, 세제 또는 지질, 질소 제거 없이 버퍼 D를 드. Degasification, 후 DDM와 asolectin를 추가 합니다.
    4. 0.5 mL 분수와 eTRPV1 단백질을 elute, 얼음의 5 mL, 최대 degassed 버퍼 D, 20 mM 糖 보충. 만약에 가능 하다 면, 세척 및 4 ° c.에서 차입을 수행
    5. 280 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 양을 계량.
      참고:이 프로토콜 문화의 리터 당 단백질의 0.5 ~ 1.0 mg을 생성합니다. 각 eTRPV1 단일-시스테인 돌연변이 단백질 수확량이 다 수 있습니다. EPR 및 사슴 실험, 성장 4 \u2012 6 L 문화.

5. eTRPV1 단일-시스테인 Mutant Site-Directed 레이블 회전

  1. 원심 필터 단위를 사용 하 여 포함 하는 eTRPV1 분수 집중 (컷오프 = 100 kDa) 최대 2 \u2012 2.5 mg/mL (4 ° C에서 2 분 동안 7000 x g의 주기)를 라벨에 대 한.
  2. DMSO에 100 m m 재고 솔루션에서 집중된 단백질 (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) 메 틸 methanethiosulfonate (MTSSL) 스핀 라벨의 사진 어 금 니 과잉 (3 번, 매 30 분)를 추가 (eTRPV1 모노 머: MTSSL 1시 10분에 어 금 니 비율) 17. 1 h 30 분, 야간 보육 4 ° c.에 의해 다음에 대 한 실시간 반응 어둠 속에서 계속
    참고:이 단계에서 MBP는 하룻밤 스핀 라벨 인큐베이션 기간 동안 TEV 프로 테아 제를 추가 하 여 제거할 수 수 있습니다.
  3. 크기 배제 크로마토그래피 열 부하 회전 표시 eTRPV1 equilibrated 버퍼 e (150 m m NaCl, 20 mM HEPES, 0.5 m m DDM, pH 7.4), 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 의해 제어. 포함 하는 eTRPV1 tetramer 분수를 수집 합니다.
    주: 재구성 효율성을 줄일 수로이 단계에서 10% 글리세롤을 포함 하지 마십시오.
  4. 280 nm 파장에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 양을 계량.
  5. SDS 페이지 젤 (젤 얼룩-무료, 4 \u2012 20%)를 실행 하 여 샘플의 순도 평가 합니다. 이 예제는 이제 솔루션 및/또는 proteoliposomes 분 광 측정에 대 한 준비.

6. eTRPV1 단일 시스테인 돌연변이 재구성 회전 표시

  1. 10 mg 1 h 40 ° c.에 대 한 진공 (≤100 mbar)에서 회전 증발 기를 사용 하 여 asolectin의 건조 Asolectin 리를 하려면 버퍼 F (200 m m NaCl, 5mm MOPS, pH 7.4)의 1 mL을 추가 하 고 15 분 또는 때까지 샘플은 균질 혼합물을 sonicate.
  2. 2mm의 최종 농도에 DDM을 추가 하 여에 리를 불안정 하 게 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
  3. 2 mg/mL에서 레이블이 지정 된 단백질을 집중 하 고 1:5 단백질/지질 비율 (질량: 질량)을 사용 하 여 리에 추가.
    주의: 그것은 스핀 라벨 효율 높은 단백질 침전 수와 낮은 농도에 감소 이후 앞서 언급 한 단백질 농도 유지 하는 것이 중요.
  4. DDM 임계 micelle 농도 (CMC)에 단백질/Liposome 혼합물을 조정 하 여 부드러운 동요와 4 ° C에서 밤새 품 어 버퍼 F를 추가 합니다.
  5. 이중 버퍼 F와 순차적으로 실시간에 부드러운 동요와 1 h 간격 비 극성 폴리스 티 렌 adsorbent 구슬 (30mg, 50mg, 및 80 mg)의 3 개의 aliquots를 추가 하 여 제거 세제 단백질/Liposome 혼합물의 볼륨
  6. 비즈를 제거 하는 ultracentrifuge 튜브에 proteoliposomes 혼합물을 전송 열 필터 (중력 흐름 크로마토그래피 칼럼)에 혼합물을 로드 합니다. 1 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 샘플을 원심 상쾌한 무시 하 고 버퍼 f.의 30 μ에 펠 릿 resuspend
    참고: 샘플은 분 광 분석 및 Xenopus oocytes에 주입에 대 한 준비. 샘플 같은 날 사용할 수 없습니다, 플래시 동결 그들 액체 질소와-80 ° c.에 게
  7. Proteoliposomes-Xenopus oocyte 전기 생리학26,32
    1. 50 주사 Xenopus oocytes 섹션 2.2에에서 설명 된 대로에 스핀 표시 된 proteoliposomes의 다른 희석의 nL.
    2. 2.3.10 섹션에 설명 된 대로 주입의 12 h 후 TEVC 측정을 수행 합니다.
  8. 분 광 측정 및 분석 (섹션 7)로 이동 합니다.

7. 사슴 및 EPR Spectroscopies

  1. 이중 전자-전자 공명 (사슴)의 분광학
    1. Q-밴드 주파수 (34 g h z)와 83 °33제조업체에서 제공한 소프트웨어 사용 하 여 데드 타임 무료 4 펄스 시퀀스는 10 W 앰프를 갖춘 펄스 EPR 분석기에서 사슴 측정을 수행 합니다.
    2. 곳을 알아내는-보호에 대 한 30% (v/v) 글리세롤과 버퍼 E (단계 5.5)에서 세제 정화 eTRPV1 스핀 표시 된 시스테인 돌연변이의 50 µ M를 보충 한다.
    3. 간단한 저속 원심 분리 (100 x g)에 의해 봉인된 석 영 모 세관 튜브와 튜브의 아래쪽 스핀으로 샘플을 로드 합니다.
    4. 샘플을 동결에 액체 질소로 모 세관 튜브를 놓습니다. 이 시점 이후 측정-80 ° C에서 샘플을 저장할 수 있습니다.
    5. 마이크로파 공 진 기에 직접 샘플을 놓고 다시 10 \u2012 위한-83 ° equilibrate 그것은 20 분.
    6. 표준 4 펄스 사슴 프로토콜, mw1 (π/2)를 사용 하 여 샘플 측정-τ1-(π) mw1-τ1-(π) mw2-τ2-(π) mw1-τ2-에코34. (Π/2) mw1 및 (π) mw1 펄스 길이 10와 20 ns, 각각, 그리고 40 (π) m w 2에 대 한 ns. 63 mhz 주파수 분리를 설정 합니다.
      참고: 기본 사슴 부패 데이터는 집에서 만든 소프트웨어 (예: Matlab에) 스핀 레이블을19,35간의 거리를 설명 하기 위해 가우스 분포의 합 가정 하 분석할 수 있습니다.
  2. 연속파 (CW) EPR 분광학
    1. 제조 업체 소프트웨어를 사용 하 여 X-밴드 (9.6 g h z) 분석기에 RT에서 CW EPR 실험을 수행 합니다.
    2. 물 냉각 장치, 콘솔, 그리고 자석 전원 공급 장치를 켜서 악기를 시작 합니다. 소프트웨어 악기를 연결, 악기 튜닝에 놓고 워밍업 악기에 대 일 분 이상 기다려야 합니다.
    3. 모 세관 동작을 사용 하 여 25 µ L 유리 모 세관 튜브로 5.5 단계에서 20 µ L의 샘플을 로드 하 고 실 란 트와 튜브의 끝 인감.
    4. 전자 레인지 강에 모 세관 튜브를 로드 하 고 비판적으로 부부는 소프트웨어의 자동 조정 기능을 사용 하 여 수동 또는 자동으로 공.
    5. 표준 계기 조건 하에서 첫 번째 파생 스펙트럼 수집: 100 kHz 마이크로파 변조, 1.6 G 자기장 변조, 그리고 10 mW 마이크로웨이브 파워.
    6. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션, 배경 스펙트럼을 수정 하 고 이중 적분의 피크-피크 값으로 스펙트럼을 나누어 정규화 합니다.
    7. 첫 번째 파생 흡수 스펙트럼 (ΔHo-1)36의 중앙 선 두께의 역함수 값을 측정 하 여 스핀 레이블 이동성을 결정 합니다.

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Representative Results

최소한의 시스테인-덜 TRPV1 구성 (eTRPV1) 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성

분 광 연구 향한 첫 번째 단계 엔지니어 및 시스테인-덜 단백질 구조 (그림 2A) 기능 및 단백질의 생 화 확 적인 금액을 산출 하는 특성입니다. eTRPV1는 Ca2 + 이미징 및 TEVC (그림 2B-C)에 의해 결정 된 대로 작동 합니다. 또한, eTRPV1 EPR 및 사슴 실험 (0.5-1 mg Sf9 셀의 리터 당)에 대 한 세제 정화 단백질의 충분 한 양을 제공 한다26. 소개 하는 특정 단백질 영역에서 단일 시스테인 그들의 기능에 영향을 수 있습니다. 그림 2B HEK293 포함 하는 eTRPV1에 TRPV1 길 항 제 (, capsaicin) 추가 될 때 그들의 형광 강도 증가 때문에 야생 유형 (WT) 처럼 동작 하는 eTRPV1에 단일-시스테인 돌연변이 (E651C 및 A702C)의 몇 가지 예를 보여 줍니다. 셀, 캘리포니아2 + 26영상에서 같이. 다른 한편으로, A680C로 형광은 배경에서 구별할 수 비 기능 시스테인 돌연변이의 전형적인 예입니다. A680C 돌연변이 추가 분석을 위해 제외 되었다. 후 Ca2 + 이미징 실험, 단일-시스테인 돌연변이 기능 그들의 생물 속성을 평가 하기 위해 TEVC 또는 패치 클램프를 사용 하 여 테스트 됩니다. 그림 2C 돌연변이 바깥쪽 정류 TRPV1 TEVC26정한 ph 5, 도전 때의 특성을 정리를 보여 줍니다. 단일-시스테인 돌연변이의 기능 분석 식 및 정화 프로토콜을 착수 하기 전에 첫 번째 검사점입니다.

ETRPV1 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성

위에서 설명한 정화 프로토콜 TRPV1 순서를 따라 시스테인 화학식 수정 (예:fluorophores, 회전 표시 [SL] 메 틸-methanethiolsulfonate)를 통해 표시 될 수 있다 세제 solubilized 단백질 생성 분 광 분석입니다. 최소 TRPV1 시스테인 잔류물을 포함 하는 채널 안정 및 단 분산 종족으로 마이그레이션 (~ 13.6 mL), 크기 배제 크로마토그래피 (그림 3)에 의해 결정. eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 (E651C-SL와 SL A702C) 최소한의 TRPV1 구조 (그림 3)26여 보안과 차입 프로필 정리. 차입 프로필 단일 시스테인 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 뮤턴트 들 다 수 있습니다. 어떤 경우에 돌연변이 형성 집계; 그리고 샘플의 분수 수 열 (8-9.5 mL), (그림 3, 빨간색 아래쪽 화살표) tetramer로 마이그레이션합니다 단백질의 양을 감소의 무효 볼륨에 elute. 이 경우에, 셀 문화 볼륨 집계 분수 또는 하나에 단백질 추가 분석에서이 돌연변이 제외 하 고 이웃 잔류물 테스트 진행 수에 대 한 보상 확장할 수 있습니다. 다른 예로 tetramer에 해당 하는 피크의 확대. 그들은 멀티 포함 주요 봉우리 3 mL 보다 넓은 분 광 분석에 대 한 권장 하지 않습니다-종 분산. 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화 사업 재구성 및 분 광 분석 하기 전에 두 번째 검사점입니다.

기능 특성의 재구성 회전 표시 된 eTRPV1 단일-시스테인 돌연변이

EPR 및 사슴 신호 시스테인 잔류물을 상자성 스핀 라벨 부착에 의존 하기 때문에 그건 스핀-라벨의 위치 단백질 기능 변경 여부를 확인 하는 것이 중요. 회전 표시 된 단백질, 평면 지질 bilayer 실험, 패치 클램프, 및 TEVC를 포함 하 여 재구성 후 기능에 대 한 테스트 하는 방법은 여러 가지가 있습니다. TEVC는 거시적인 전류를 기록 하는 동안 회전 표시 된 채널의 다 수의 평가 허용 한다. 회전 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능을 평가 하기 위해 채널은 미리 형성 된 asolectin 리에서 재구성 된다. 이 단계는 정화를 통해 글리세롤 리로 단백질 재구성의 효율성 감소 이후 10% 글리세롤을 제외 하는 것이 중요입니다. 그림 4 는 대표 A702C SL TRPV1의 결과 asolectin 리 재구성 및 Xenopus oocytes에 microinjected. 예상 했던 대로, pH 5 elicits 강력한 겉으로 정류 전류37 TRPV1 길 항 제 (CPZ, 블루 추적) capsazepine26의 공동 응용 프로그램에 의해 차단 되는. 스핀 라벨 및 재구성 후 기능을 유지 하지 않는 돌연변이 추가 분석에서 제외 해야 합니다. 재구성된 스핀 표시 된 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성화 사업 분 광 분석 전에 세 번째 검사점입니다.

구조 역학의 회전 표시 된 eTRPV1 돌연변이 의해 모니터링 CW EPR과 사슴

Nitroxide 스핀 라벨은 주변 환경에 민감한 고 라벨은 단백질 백본의 유연성 첨부17. 따라서, CW-EPR 수 주어진된 회전 표시 된 시스테인;의 동적 처방의 결정 즉, 위치 수성 미디어 나 막에 노출 되는 단백질 단백질 상호 작용17제한 보다 더 역동적인. 그림 5A TRPV1 이동성 매개 변수를 모니터링 하도록 선택의 Glu651, Ile679, 및 Ala702 위치를 보여줍니다. 스핀 레이블 프로브의 이동성 매개 변수를 계산 하려면 하나 (그림 5B, 검은 선 ΔHo1) 첫 번째 파생 흡수 스펙트럼의 중앙 선 두께의 역을 계산 합니다. 예를 들어, E651C-SL (그림 5B)는 괴기 한 선 모양 및 이동성 값을 표시 (0.24) 막 인터페이스26동적 위치에 일반적으로 발견 합니다. 다른 한편으로, I679C-SL와 SL A702C (점선 참조) 스펙트럼과 이동성 값 감소의 확장을 전시 (0.16 및 0.18, 각각; 그림 5B) 26 곳을 알아내는-EM 구조1에 따르면 그들의 제한 된 주변 환경 (단백질)와 일치 하는.

그림 5C asolectin 리에서 재구성 후 회전 표시 TRPV1 돌연변이의 스펙트럼을 보여준다. 예상 했던 대로, 그들의 모양 및 이동성 값은 막 환경26에서 솔루션에 동일 E651C SL와 SL A702C에 대 한 스펙트럼의 동적 기능 재구성, 후 변화 하지 않았다. 다른 한편으로, I679C-SL 보여줍니다 시끄러운 스펙트럼을; 따라서, (파란색 화살표)과 높은 (빨간 화살표) 필드 구성 요소 덜 분명 되었다. 시끄러운 스펙트럼은 하지 일반적으로 원하는, 그들은 회전 표시 위치 이동성을 과소 평가 하는 경향이. 강력한 솔루션에서 I679C SL 신호 이므로 이와 같은 스펙트럼에서-라벨, 보다는 오히려 비효율적인 단백질 재구성의 제품 수 있습니다.

사슴 데이터 합계 진동, 정현파 신호 부패 한다 상호 작용 스핀 레이블38,39의 거리 배포에 대 한 정보를 포함 하는. 기간 및 복잡 한 감퇴의 직접 기본 거리 분포를 반영 한다. 거리 유통 구조 부품 샘플 및 그들의 장애에 수 구성 됩니다. 시간 영역 신호는 배위에서 파생 하는 따라서, 일반적으로 배경 지 수 감퇴 원인이 솔루션에 고정 되지 않은, 먼 스핀 레이블 사이의 커플링, andrigidly 결합 같은 단백질19,40내 스핀. 특히, 사슴 스핀 표시 된 잔류물19사이 내 단백 장거리 거리 (20-70 Å)의 결정을 허용 한다. 그림 6 신호 감퇴 E651C SL의 해당 거리 배포를 보여 줍니다. Glu651의 분포는 24, 36, 및 58 Å26에 해당 하는 3 개의 봉우리를 보여줍니다. 닫힌된 TRPV1 구조와 일치 하는 두 개의 짧은 거리 (23, 32 Å Cβ Cβ 거리, 각각)1, 반면 3 58 Å 피크 단백질 집계 일치 수도 있습니다.

Figure 1
그림 1입니다. 실험 개요. 표현, 정화, 및 EPR 및 사슴에 대 한 eTRPV1를 다시 구성 하는 데 필요한 실험 개요의 도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성. (A)의 분 광 분석에 사용 되는 TRPV1 구문 도식 표현 (eTRPV1: 시스테인-덜 TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 세포 표현 WT TRPV1, eTRPV1, 및 돌연변이 (Ca2 +로드-민감한 Fluo-4-오전) capsaicin (10 µ M)에 대 한 분석 했다-형광 캘리포니아2 + 이미지를 사용 하 여 응답을 불러 일으켰다. 색상 막대 형광 강도, 블루와 레드 최저 / 최고를 나타내는 상대적 변화를 나타냅니다 세포질 캘리포니아2 +, 각각. 흰색 바 100 µ m. (C) 왼쪽, TRPV1 tetramer 구조 단일-시스테인 잔류물 (노란색 구체) 채널 시퀀스에 따라 도입 강조의 1 개의 소 단위 (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인)를 나타냅니다. 오른쪽, 전류-전압 관계 Xenopus oocytes WT TRPV1, eTRPV1, 및 단일-시스테인 돌연변이 ph 5 도전 표현에서 TEVC 기록에 의해 결정 됩니다. 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. ETRPV1 및 단일-시스테인 돌연변이의 생 화 확 적인 특성화
크기 배제 크로마토그래피 DDM solubilized eTRPV1 및 단일-시스테인 스핀 표시 된 돌연변이 식 및 Sf9 세포에서 정화 후의 프로 파일. 삽입: SDS 페이지 젤 (원래 그림26에서 수정) 단위체 eTRPV1 MBP 융합 단백질을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 기능 특성화
A702C ph 5 (레드) 도전 및 capsazepine에 의해 차단 전류-전압 관계 Xenopus oocytes 스핀 표시 된 포함 하는 proteoliposomes와 microinjected에서 TEVC에 의해 결정 (CPZ, 블루: 40 µ M). 백그라운드 전류 (bkgrd)입니다. 원래 그림26에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. CW-EPR에 의해 결정 하는 회전 표시 eTRPV1 돌연변이의 mobilities.
스핀 라벨 spectroscopies 사이트 감독을 통해 조사 하 여 아미노산 잔류물 (노란색 구체)를 강조 하는 TRPV1 tetramer 구조 (A) 2 subunits (S5, 기 공 나선, S6 및 TRP 도메인) DDM-솔루션에 스핀 표시 된 시스테인 돌연변이의 CW EPR 스펙트럼의 (B) 첫 번째 파생. (C) 회전 표시 된 시스테인 돌연변이 asolectin 리 재구성의 CW EPR 스펙트럼의 첫 파생. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. ΔHo1 는 이동성 매개 변수의 크기를 나타냅니다. 검은 점선은 스펙트럼의 확대를 강조 표시 합니다. 파란색과 빨간색 화살표는 스펙트럼의 낮고 높은 필드 구성 요소를 각각 나타냅니다. EPR 스펙트럼 스핀 라벨의 총 수를 정상화 했다. 원래 그림26에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6입니다. 세제에는 eTRPV1 돌연변이의 거리 분포입니다.
사슴 에코 (A)와 거리 배포 (B) 스핀 표시 된 돌연변이 E651C; 가우시안의 합계는 사슴 데이터에 장착 했다. P(r) 스핀 쌍41의 거리 배포를 나타냅니다. 스펙트럼은 pH 7.4 (닫힌된 상태)에서 얻은 했다. 원래 그림26에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

표현과 포유류 막 단백질의 정화에 대 한 현재 기술 분 광 연구14,15,,1642단백질의 충분 한 양을 얻을 수 만들었습니다. 여기, 우리 표현, 정화, 다시 구성, TRPV1에 분 광 분석을 수행 하는 이러한 기술을 적응 시켰다.

프로토콜에 중요 한 단계 중 아래는 TRPV1에 대 한 트러블 슈팅을 수행한 우리 하 고는 다른 단백질을 위해 조정 될 수 있습니다. 0.5-1 mg/mL 단백질 세제 정화;의 생성 하는 템플릿을 생성 하려면 DNA 시퀀스 수정 미만 0.5 mg/mL 단백질의 생성 하는 템플릿, 돌연변이 당 해야 할 것 이다 곤충 세포 문화 6 리터 이상 성장 이후 도전적. 단백질 해야 집중 될, 이상 2 mg/mL, 스핀 라벨 효율 증가에 한 TCEP 없이. 낮은 단백질 농도에 또는 TCEP 존재 라벨 흔적 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성 합니다. 단백질 정화 중 4 ° C에 보관 됩니다, 하지만 스핀 효율 향상을 위해 RT에서 라벨을 수행 하기 위해 필수적 이다. 정화 및 라벨, 글리세롤 단백질 안정성 향상 그러나, 그것은 제거 되어야 한다 완전히 재구성, 전에 리에는 단백질의 양이 감소 하 고 시끄러운 EPR 스펙트럼을 생성. 재구성; 중 관행은 CMC 아래 세제 농도 감소 그러나, TRPV1는 리에 통합 하기 전에 침전 경향이 있다. 이 문제를 해결 하려면 TRPV1 단백질 강 수를 방지 하 고 채널 proteoliposome 준비에서의 수량 증가를 CMC에서 정확 하 게 미리 형성 된 리와 하룻밤 incubated 했다. TRPV1이 완전히 기능 asolectin 리28; 따라서,이 프로토콜에 사용 되는 기본 지질 혼합물 이었다. 그러나, 분 광 분석을 진행 하기 전에 특정 단백질 기능 (예:콜레스테롤)은 지질 구성 결정에 필수적 이다.

분 광 접근 같은 선물로 EPR 및 사슴을 포함 한 몇 가지 제한: 생 화 확 적인 안정성을 개선 하는 단백질 템플릿 순서에서 변경 기능26;에 영향을 미칠 수 기본이 아닌 단일 시스테인, 스핀 라벨의 소개 수도 잘 용납 되지; 단백질의 특정 지역에서 얻는 많은 양의 레이블이 단백질; 그리고 제한 된 구조적 변화 세제 micelles에 사슴으로 거리를 결정할 때. 그러나, 후자의 제한 TRPV1 돌연변이 nanodiscs19,43재구성의 Q-밴드 주파수 스펙트럼을 수집 하 여 극복 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방법의 장점은 글로벌 역학, 각, 그리고의 주어진된 위치에서 더 이상 거리의 패턴에서 주로 온다.

온도 감도 가장 흥미로운 중 하나 이며 덜 이해 제어 메커니즘; 따라서, 분 광 방법을 사용 하 여, 그것은 가능한 것 막 단백질 막 환경에서 단백질 모션으로 열 에너지를 번역 하는 어떻게 결정 하. 중요 한 것은, 열 게이팅 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM을 사용 하 여 이러한 기술은 냉동 온도에서 수행 되는 동안 구조 변화를 확인 하기 위해 도전 것입니다. 미래 실험 TRPV1 구조적 변경 열 종속 게이팅 EPR, 사슴, 또는 형광을 사용 하 여 호환 확인으로 이동 합니다. 그래서 우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용해 서, 우리는 약물-바인딩을 사용 하 여 포유류 이온 채널의 활성화의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻게 될 것 이다 기대 EPR 분광학 간결한 이온 채널에 대 한 자세한 기계적 모델을 제공 하고있다 광 접근입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 EPR 및 사슴 분석기에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 박사 H. Mchaourab와 박사 T. 로젠바움 전장 시스테인-덜 TRPV1 플라스 미드를 제공 하기 위한 매우 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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References

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생화학 문제 137 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 TRPV1 정화 재구성 스핀 라벨 EPR 분광학 사슴 분광학
정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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