Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Эта статья описывает конкретные методы для получения биохимических количества моющих средств солюбилизирован TRPV1 для спектроскопического анализа. Объединенные протоколы обеспечивают биохимические и биофизические инструменты, которые могут быть адаптированы для облегчения структурных и функциональных исследований для млекопитающих ионных каналов в среде с контролируемой мембраны.

Abstract

Многодисциплинарного ионных каналов передают несколько раздражителей различной природы в аллостерические изменения; Эти динамические конформации являются сложными для определения и остаются в значительной степени неизвестно. С последних достижений в сингл частица крио электронная микроскопия (крио ЭМ) пролить свет на структурные особенности сайтов связывания агониста и механизм активации нескольких ионных каналов этапе устанавливается для углубленного динамического анализа их стробирования механизмы, с помощью спектроскопических подходов. Спектроскопические методы электронного парамагнитного резонанса (НРА) и двойной электронно электронного резонанса (олень) были главным образом ограничивается изучением прокариот ионных каналов, которые могут быть очищены в больших количествах. Требование для большого количества функциональных и стабильные мембранных белков препятствует изучения млекопитающих ионных каналов, с помощью этих подходов. ОРЭД и оленей предлагают множество преимуществ, включая определение структуры и динамических изменений мобильных белка регионов, хотя и с низким разрешением, что может быть трудно получить кристаллографии рентгеновского снимка или крио EM, и мониторинга реверсивные стробирования Переход (т.е., закрытый, Открытый, сенсибилизированных и десенсибилизированных). Здесь мы предоставляем протоколы для получения миллиграммов функциональных моющих средств солюбилизирован Переходный рецепторный потенциал катиона член subfamily канала V 1 (TRPV1), могут быть помечены для оленей и ЭПР спектроскопии.

Introduction

С последних достижений в сингл частица крио электронная микроскопия (крио ЭМ) были получены млекопитающих ионного канала структуры чрезвычайные скоростью. Особенно структурные исследования многодисциплинарного ионных каналов, таких как Переходный рецепторный потенциал vanilloid 1 (TRPV1), обеспечили дальнейшее понимание ее активации механизмов1,2,3, 4 , 5. Однако, динамические сведения о встроенных в среде мембранных ионных каналов требуется понять их многодисциплинарного механизмы стробирования и наркотиков привязки.

Электронного парамагнитного резонанса (НРА) и двойной электронно электрон рентгеновская спектроскопия резонанса (олень) предоставили некоторые из наиболее окончательное механистической модели для ионных каналов6,,78,9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти подходы были главным образом ограничивается рассмотрение прокариот и archeal ионные каналы, которые дают большое количество стирального порошка очищенной белков при оверэкспрессировали бактерий. С развитием производства белков мембраны эукариотической насекомых и mammalian клеток для функциональных и структурных характеристик14,,1516это теперь возможно получить биохимические количество стирального порошка очищенной белков для спектроскопических исследований.

ОРЭД и олени сигналы возникают из paramagneticspin этикетку (SL) (например, methanethiosulfonate) к одной цистеин остатков в протеине. Спин этикетки сообщить три вида структурной информации: движение, уровни доступности и расстояния. Эта информация позволяет определить похоронены в пределах белка или подвергаются мембраны или водной среды в АПО и лиганд граница государства13,17,18,19остатков. В контексте структуры с высоким разрешением (при наличии) оленей и ОРЭД данных предоставляют коллекцию ограничений, применяемых для расчета динамических моделей в их родной среде при мониторинге реверсивные стробирования перехода (т.е., закрытый, Открытый, ознакомлены и десенсибилизированных). Кроме того гибкая регионов, которые могут быть трудно определить, рентгеноструктурного анализа или крио EM могут быть получены с помощью этих наборов данных для присвоения вторичных структур, а также расположение в пределах белка20. Крио-EM структур, полученные в nanodiscs липидов представили ценную информацию о стробирования ионных каналов3,21,,2223,24, 25; Однако спектроскопические подходы может обеспечить динамическую информацию из конформационных государств (например, температурные изменения), которые могут быть трудно определить с помощью крио EM.

Необходимо преодолеть многие трудности для осуществления ОРЭД и оленей, включая отсутствие функции протеина при удалении всех остатков цистеина (особенно обильный в mammalian каналы), низкое содержание белка урожая, белок нестабильность во время очищения и после отжима маркировки и агрегации белков в моющего средства или липосом. Здесь мы разработали протоколы преодолеть эти критические барьеры и получили сведения о млекопитающих сенсорных рецепторов оленей и ОРЭД спектров. Здесь цель заключается в том, чтобы описать методологий для выражения, очистки, маркировки и восстановление функциональной минимальной хвоща менее крыса TRPV1 (eTRPV1) построить для спектроскопического анализа. Эта методология является подходящим для тех мембранных белков, что держать их функции, несмотря на удаление остатков цистеина или содержат цистеина формируя дисульфидными облигаций. Эта коллекция протоколов могут быть адаптированы для спектроскопического анализа других млекопитающих ионных каналов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 мутагенеза

Примечание: Минимальный TRPV1 конструкции для спектроскопического анализа26 был построен из полнометражных хвоща менее канала TRPV127 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 1). Эта хвоща менее минимальной TRPV1 конструкция (упоминаемый как eTRPV1 ниже) состоит из остатков 110-603 и 627-764. eTRPV1 был клонирован в ОУП (на основе pcDNA3.1 вектор) для функционального анализа и вектор рекомбинантных доноров28 , содержащий 8 x гистидин мальтоза связывающий белок (MBP)-табак etch вирус (TEV) для очистки (рис. 2A) и выражение. Цистеин сингл–eTRPV1, мутанты были сгенерированы с помощью сайта Направленный мутагенез. Вектор и канал последовательности указаны в дополнительный файл 1: дополнительные методы.

  1. Дизайн мутагенеза грунты с онлайн инструменты29.
  2. Смешайте в 0,2 мл: 5 мкл 10 x буфер реакции, 1 мкл dNTP смеси (100 мм), 1 мкл 10 мкм прямого и обратного олигонуклеотиды, 1 мкл 100 нг/мкл eTRPV1 шаблона ДНК26, 1.5 мкл ДМСО, 1 мкл мутагенеза фермента и 38,5 мкл обессоленной воды. Перед укладкой труб в Термоциклер спина смеси.
  3. Выполняйте PCR мутагенеза.
    1. Выполнить () Денатурация при 95 ° C на 2 мин, (b) Денатурация при 95 ° C 20 s, (c) отжиг при 60 ° C для 10 s и (d) удлинение 68 ° C в течение 4 мин (30 сек на 1 КБ). Повторите шаги b-d для 18 циклов, а затем выполнить удлинение 68 ° C за 5 мин и поддерживать реакции на 4 ° C до дальнейшего использования.
  4. Добавить 2 мкл Dpnя ферментные реакции; смешать и затем инкубации при 37 ° C за 30 мин.
  5. Выполнить преобразование
    1. Оттепель E. coli сведущие клетки на льду.
    2. Чтобы предварительно охлажденным 14 мл стерильной пробирке добавьте 75 мкл компетентных клеток и 10 мкл Dpnя лечил смеси ПЦР. Осторожно перемешать.
    3. Инкубировать реакции на льду на 30 мин поддерживать трубки при 42 ° C для 45 s и затем сразу же поместить его на льду на 2 мин пластины смесь на бульоне Лурия (LB)-плита агара, содержащих carbenicillin (0,2 мг/мл). Инкубировать пластину на ночь при 37 ° C.
    4. Урожай по крайней мере три одной колонии от плиты и прививать каждый по 4 мл LB, содержащих carbenicillin (0,2 мг/мл) с использованием 14-мл стерильной пробирке. Инкубировать культур на ночь при 37 ° C и погрозит 250 об/мин.
    5. Спин вниз ночь культур на 8000 x g 10 мин и извлечь ДНК следуя инструкциям коммерчески доступных мини-подготовка комплектов.
    6. Проверьте наличие одного цистеин мутантов, стандартных автоматизированных секвенирования ДНК (см. Таблицу материалы).

2. функциональный анализ eTRPV1 и один цистеин мутантов

  1. HEK293 клеток линии Трансфекция 30
    1. Культура клетки HEK293 в 6 - хорошо пластин в 2 мл среды высокой глюкозы (DMEM) за хорошо (37 ° C, 5% CO2, 95% влажность). Подготовка HEK293 клетки, которые являются 70 \u2012 80% притока.
    2. Подготовьте смесь трансфекции в двух отдельных 1,5 мл микро-пробирок.
      1. Для реакции A добавьте 0,5 мкг eTRPV1 или хвоща мутант содержащих pMO 250 мкл минимальные основные среды (например Opti-MEM). Для реакции B добавьте 3 мкл Реагента трансфекции 250 мкл минимальные основные среды. Инкубируйте каждой реакции на 5 мин при комнатной температуре (RT).
      2. Mix реакции A и B с Пипетка 1-мл. Инкубировать смесь для 45 мин на RT.
    3. Также удалите 500 мкл культуры средств массовой информации из 70-80% притока и 500 мкл реакционной смеси. Хранить пластины на ночь для Ca2 + изображений (37 ° C, 5% CO2и 95% влажности).
  2. CA2 + изображений в HEK293 клетках 30
    1. Очистить coverslips стекла диаметром 12 мм с этанол и вода и поместите их в тарелку 24-хорошо.
    2. 75 мкл поли l Лизин в центре каждого coverslip и хранить пластину для 45 мин (37 ° C, 5% CO2, 95% влажность).
    3. Удалите избыток поли l лизин и мыть coverslips три раза с фосфат амортизированное saline (PBS), чтобы удалить любые остатки.
    4. После coverslips будете готовы, переходите к отсоединить клетки от 6-ну пластины.
    5. Удалите средства массовой информации и 500 мкл теплых PBS (37 ° C) для мытья.
    6. Удаление PBS, 500 мкл трипсина и инкубировать в течение 1 мин.
    7. 500 мкл теплой культуре СМИ (37 ° C) для остановки реакции пищеварение и смешать с пипеткой; Избегайте формирования пузырьков. Если необходимо, отрегулировать концентрацию клеток, разбавления этой ресуспендирования с больше культуры средств массовой информации.
    8. Семя 250 мкл transfected клеток HEK293 (70% притока) плюс 250 мкл культуры средств массовой информации (500 мкл окончательный объем в колодец) на предварительно очищенной coverslips и дайте им успокоиться (для крепления) для 1-2 ч в инкубатор (37 ° C, 5% СО2, влажность 95%).
    9. В то же время, готовить раствор загрузки путем добавления кислоты 0,02% плюрониевого и 1 мкм Fluo-4-ам звонаря буфер. Хорошо перемешайте раствор.
    10. Извлеките носитель культуры HEK293 из колодца и 500 мкл раствора загрузки. Инкубируйте клетки для 1 h (37 ° C, 5% CO2, влажность 95%). Вымойте клетки Fluo-4-загружены дважды с теплой звонаря буфера.
    11. Место coverslip с загруженной клеток в чашке Петри 10-мм в микроскопа (с использованием 10 X цели; 494 Нм возбуждения и 506 выбросов Нм) для выполнения внутриклеточных Ca2 + измерений.
    12. Измерения изменений в интенсивности флуоресценции после perfusing соответствующих лигандами (например, 10 мкм капсаицин) с использованием имеющегося программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
  3. мРНК и подготовка Xenopus laevis ооцитов 30
    1. Линеаризации eTRPV1 и один цистеин мутантов содержащих ОУП с Pmeя за 1 ч при 37 ° C. Чистота после инструкции коммерчески доступных очистки наборы ДНК.
    2. Использование линеаризации и очищены ННО синтезировать ограничен РНК с коммерчески доступных комплект совместим с T7 РНК-полимеразы.
    3. Очистите ограничен RNAs согласно коммерчески доступных очистки наборы. Подсчитать сумму РНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм длины волны.
    4. Передача 5 \u2012 10 мл X. laevis ооцитов (коммерчески доступных) в 50-мл конические трубка, содержащая 20 мл ND96 раствора (96 мм NaCl, 2 мм KCl, 5 мм HEPES, 1 мм MgCl2; рН 7,4) с 1 мг/мл коллагеназы и nutate для 50 мин на RT.
    5. Промыть яйцеклеток в ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным; добавить свежие коллагеназы и встряхнуть для 30 мин на RT. изучения яйцеклеток под микроскопом стерео и остановить пищеварение, когда внешний слой фолликулярной (глянцевый слой с красный кровеносных сосудов) отсутствует в большинстве ооцитов (90%). Промывайте яйцеклеток в ND96 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    6. Ооциты передачи к 50 мл полистирола с ND96 плюс 1 мм CaCl2 и трясти за 1 ч.-переваривается ооцитов будет придерживаться полистирола трубки.
    7. Вымойте яйцеклеток с ND96 плюс 1 мм2 и дополнение решение CaCl с 50 мкг/мл гентамицина и 50 мкг/мл тетрациклина.
      Примечание: Тетрациклин содержащих решения защищайте от воздействия света.
    8. Выберите большой яйцеклетки без поврежденных мембран и отображение четкое разделение между животного и растительного поляков. Пусть ооциты восстановить за 4 ч до микроинъекции на 16 ° C.
    9. Использовать стеклянные пипетки (O.D.: 1.11 мм, ID: 0.5 и длина 8,8 см) для вставки 1-5 нг mRNA от eTRPV1 и один цистеин мутантов в ооцитов, с помощью системы nanoliter инжектор (46 nL/s) и стерео микроскоп (2 X увеличение). Хранить яйцеклеток на 16 ° C в ND96, дополненная CaCl2 и антибиотики (гентамицин/тетрациклинов 1 x).
    10. После 72 ч ток макроскопических с помощью приобретения системы двух электродом напряжения зажим (TEVC)31.
    11. Вытяните боросиликатного стекла пипетки (0,3 MΩ) и заполнить их с 3 M KCl.
    12. Яйцеклетка в зале записи с помощью пипетки передачи и perfuse раствор для ванн (120 мм NaCl, 2 мм KCl, 2 мм MgCl2, 1 мм EGTA и 10 мм HEPES решение; рН 7,4) при низкой скорости.
    13. Погружайте обоих электродов в Ванна решение скорректировать их смещения пипеткой. Аккуратно вставьте пипеткой электродов (боросиликатное стекло пипетки; Диаметр: 1.5 мм, ID: 1.10 и длиной 10 см) в яйцеклетку до крошечных отступы наблюдается под микроскопом стерео (2 крат), а также изменения мембранного потенциала.
    14. Изменить параметры усилителя для записи режим и мера макроскопических токов при применении пандус мембраной от -80 до + 80 МВ 1 s. нагрузки перфузии системы с решения, используемые в шаг 2.3.12 рН 7,4 (как элемент управления) и при рН 5 для проверки деятельности eTRPV1.

3. Создание рекомбинантных Bacmid и бакуловирусы для выражения протеина

  1. Bacmid
    1. Трансформировать 100 мкл DH10Bac E. coli компетентных клеток с 7,5 ng вектора рекомбинантных доноров, содержащие eTRPV1 или одно цистеин мутантов.
    2. Добавить 900 мкл SOC СМИ (20 мг/мл Триптон, 5 мг/мл дрожжевой экстракт, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм MgSO4и 20 мм глюкозы) и проинкубируйте 6-7 ч при 37 ° C и 225 об/мин.
    3. Семя 100 мкл непосредственно из смеси и серийных разведений (1/10 и 1/100), в LB-агар плиты, содержащие 100 мкг/мл X-Гал, 40 мкг/мл ИПТГ, 7 гентамицин мкг/мл, 10 мкг/мл тетрациклин и канамицин 50 мкг/мл. Инкубировать пластины для по крайней мере 48 ч при 37 ° C.
    4. Выберите белый колоний, которые являются 2 мм в диаметре, так как синий колоний не хватает Вставка интерес. Используйте стерео микроскоп для проверки, что белых колоний не содержат каких-либо синие пятна.
    5. Урожай по меньшей мере три одного колоний и перенести их в стерильную пробирку 14-мл, содержащих 4 мл LB СМИ дополнена 7 гентамицин мкг/мл, 10 мкг/мл тетрациклин и канамицин 50 мкг/мл. Инкубируйте клетки на ночь (~ 16 h) при 37 ° C и 250 об/мин.
    6. Возьмите 1,5 мл ночи культур и изолировать bacmid рекомбинантных ДНК (см. дополнительный файл 1 для подробного протокола). Храните bacmid на 4 ° C на срок до двух месяцев.
      Примечание: Подготовьте запасы глицерина DH10Bac E. coli , содержащие bacmid ДНК. Возьмите 300 мкл культуры и добавить 200 мкл глицерина на 50% (концентрация окончательный глицерина 20%). Храните Алиготе-80 ° c до дальнейшего использования.
    7. Проверить наличие eTRPV1 в рекомбинантной bacmid, с помощью ПЦР (см 1 дополнительный файл для подробного протокола).
  2. Бакуловирусы
    Примечание: Для выполнения этой процедуры, transfect Sf9 насекомых клетки в формате 6-хорошо. На основе в ну даны все суммы и томов. Избегайте использования антибиотиков.
    1. Пластина 1 х 106 Sf9 клеток в 2 мл насекомых ячейки СМИ. Позволяют клеткам вложить по крайней мере 45 мин.
    2. Разбавьте 1 мкг bacmid рекомбинантных ДНК в 100 мкл насекомых ячейки СМИ. Осторожно перемешать.
    3. 6 мкл Реагента трансфекции (TR) разбавляют в 100 мкл насекомых ячейки СМИ. Осторожно перемешать.
    4. Объединить решения ДНК и TR (от шаги 3.2.2 и 3.2.3, соответственно). Осторожно перемешать и Инкубируйте 30 мин на RT.
    5. Добавить 0,8 мл СМИ насекомых клеток ДНК/TR смеси; Осторожно перемешать.
    6. Удалить насекомых ячейки СМИ из Sf9 клеток и мыть раз с 1 мл свежей среды.
    7. Удалите средство мыть и добавить смесь ДНК/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) в клетки. Инкубируйте клетки при 27 ° C за 5 ч (без агитации).
    8. Снимите смесь transfection и заменить 2 мл СМИ насекомых клеток, содержащих 0,5% плода бычьим сывороточным (ФБС). Инкубируйте клетки при 27 ° C в течение пяти дней.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Предотвращения испарения ячейки СМИ, заполнив пустые скважин с средствами массовой информации и пластина 6-колодец с двумя слоями пленки парафина.
    9. Перевести средства массовой информации культуры клеток в 15 мл пластиковых пробирок. Изолировать первый проход (P1) вирусных акций, крутя трубки на 8000 x g 15 мин при 4 ° C. Супернатант передать чистые 15 мл пластиковых пробирок и немедленно хранить при 4 ° C.
      Примечание: Защитите вирус от воздействия света, покрывая трубы с алюминиевой фольгой.
    10. Для второго поколения (P2) вирусных запасов, положить 25 мл суспензии культуры клеток насекомых СМИ в6 Sf9 1 x 10 кл/мл, содержащий 2% FBS в 125 мл флакон (дном и вентилируемые). Добавьте 25 мкл P1 вируса в культуре 25 мл.
    11. Инкубируйте культуры при 27 ° C за 72 ч.
    12. Урожай вирусные акции P2, передача культуры новой 50 мл трубки и центрифуги на 8000 x g 15 мин при 4 ° C.
    13. Супернатант передать новой 50 мл трубки и немедленно хранить при 4 ° C.
      Примечание: Защитите вирус от воздействия света, покрывая трубы с алюминиевой фольгой. Выполнение небольших эксперимент к Титруйте вирус/Sf9 коэффициент P2 для оптимального TRPV1 выражения (см. дополнительный файл 1 для подробного протокола, раздел 4 под названием «Мелких эксперимент для P2 вирус.»)
    14. Для крупномасштабных белков, задайте 1-Л Sf9 клеток подвеска культуры в 2 х 106 клеток/мл в СМИ насекомых клеток с 0,5% FBS в колбе 2.8 L боросиликатного стекла.
    15. Добавьте 1 mL P2 вирус фонда культуры 1-L и Инкубируйте на 27 ° C в течение 72 ч.
      Примечание: На третий день, плотность клеток должно быть в 1,5 – 2,5 х 106 клеток/мл.

4. eTRPV1 и один цистеин мутант очистки

  1. Мембраны изоляции28
    1. Урожай, 1-L насекомых клеточной культуры подвеска на спиннинг на 4500 x g, 4 ° C, 20 мин весят гранулы ячейки (это ожидается около 6-9 г).
    2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 25 мл ледяной буфера A (сахароза 36,5 мм, 2 мм tris(2-carboxyethyl) фосфина (TCEP) и 50 мм трис; рН 7,4) в присутствии ингибиторов протеазы (1 мм phenylmethyl сульфонилфторид (PMSF), 3 мкг/мл leupeptin, 3 мкг/мл Апротинин и pepstatin 1 мкг/мл). Дезагрегировать скопления клеток для получения однородной подвеска и повернуть на 4 ° C в течение 20 мин.
    3. Разбейте ячейки, используя ручной (dounce ткани мясорубку) или высокого давления гомогенизатора. Удалите мусор клетки центрифугированием в 8000 x g 20 мин при 4 ° C.
      Примечание: Держите лизированных клетках и трубы на льду во время всего процесса.
    4. Собирать супернатант и центрифуги на 100,000 x г за 30 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле мембраны в общем объеме 20 мл ледяной буфера B (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES мм TCEP, 2; рН 7,4), дополняют ингибиторы протеазы (как в шаге 4.1.2).
    5. Аликвота 20 мл мембраны подвеска в 50-мл пробирок и флэш замораживание в жидком азоте. Хранить образцы на-80 ° C до дальнейшего использования.
  2. Очистка белков26,28
    1. Оттепель аликвоты мембраны на льду и добавить 3 мл n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) на трубу (бульон 200 мм). Поворот трубы для 2 ч при 4 ° C.
    2. Центрифугуйте образцы на 100,000 x г за 30 мин при 4 ° C. Собирать супернатант и добавить 1 мл чистой влажной амилоза смолы. Вращать смесь для 2 ч при 4 ° C. Загрузите белка/амилоза смесь в столбцах хроматографии потока гравитации.
      Осторожностью: Не позволяйте смолы сухой во время мойки.
    3. Вымойте белка прыгните амилоза смолы с 10 раз кровати объемы ледяной буфера C (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES, 0.5 мм DDM, 0,1 мкг/мл asolectin, 0,5 мм TCEP; рН 7,4). Промыть 10 кровати объемы ледяной D буфера (150 мм NaCl, 10% глицерина, 50 мм HEPES, 0.5 мм DDM, 0,1 мкг/мл asolectin, рН 7,4).
      Примечание: Перед стиркой, Дега D буфера без моющего средства или липидов, продувки азотом. После дегазации добавьте DDM и asolectin.
    4. Элюировать eTRPV1 белка с фракции 0,5 мл, до 5 мл, ледяной дегазации D буфера, дополнена мальтоза 20 мм. Если это возможно выполните моет и элюции при 4 ° C.
    5. Подсчитать количество белка путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм.
      Примечание: Этот протокол дает 0,5-1,0 мг белка на литр культуры. Белка урожай могут различаться для каждого eTRPV1 сингл цистеин мутант. Для оленей и ОРЭД экспериментов, расти 4 \u2012 6 L культуры.

5. eTRPV1 сингл цистеина Mutant Site-Directed спина маркировки

  1. Концентрат eTRPV1-содержащие фракции с помощью центробежного фильтра (отсечки = 100 кДа) до 2 \u2012 2,5 мг/мл для маркировки (циклы 7000 x g 2 мин при температуре 4 ° C).
  2. Добавьте десятикратного Молярная избыток (3 раза, каждые 30 мин) (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) метил methanethiosulfonate (MTSSL) спина метки из 100-мм Стоковый раствор в ДМСО в концентрированных белков (eTRPV1 мономеров: MTSSL в 1:10 молярное соотношение) 17. Держите реакции в темноте на RT 1 ч 30 мин, после инкубации на ночь при 4 ° C.
    Примечание: В этот шаг, MBP может быть удалены путем добавления ТэВ протеазы в течение ночи спин маркировки инкубации.
  3. Спин меченых eTRPV1 нагрузки на размер столбца исключение хроматографии достижение равновесного уровня е буфера (150 мм NaCl, 20 HEPES, 0,5 мм DDM; рН 7,4), контролируется системой жидкостной хроматографии (ПСОК) быстро белка. Сбор фракций, содержащих Тетрамер eTRPV1.
    Примечание: Не включают 10% глицерина в этот шаг, как это снижает эффективность реорганизации.
  4. Подсчитать количество белка путем измерения поглощение на длине волны 280 Нм.
  5. Оценка чистоты образца, запустив геля SDS-PAGE (пятно-гель, 4 \u2012 20%). Образец теперь готов для спектроскопических измерений в раствор и/или proteoliposomes.

6. eTRPV1 спин меченых одного хвоща мутант растворения

  1. Сухие 10 мг asolectin с помощью роторный испаритель под вакуумом (≤100 мбар) за 1 час при 40 ° C. Чтобы asolectin липосомы, добавляют 1 мл буфера F (200 мм NaCl, 5 мм швабры; рН 7,4) и sonicate смесь для 15 минут или до тех пор, пока образец является однородной.
  2. Дестабилизировать липосомы, добавив DDM до конечной концентрации 2 мм и Инкубируйте 30 мин на RT.
  3. Концентрат помечены белка в 2 мг/мл и добавить его в липосомах, с использованием в соотношении 1:5 белка/липидов (масса: масса).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Важно сохранить вышеупомянутые белка концентрации, поскольку спин маркировки эффективность снижается при низких концентрациях и высокой, что белок может выпадать в осадок.
  4. Добавление F буфера для регулировки белка/липосом смесь DDM мицеллы критической концентрации (CMC) и инкубировать на ночь при 4 ° C с нежным агитации.
  5. Двойной объем смеси белков/липосом буфера F и удалить моющим средством, последовательно добавив три аликвоты неполярных шарики полистироля адсорбента (30 мг, 50 мг и 80 мг) каждые 1-h с нежным агитации на RT.
  6. Загрузите смесь на фильтр столбцов (тяжести потока хроматографии колонка) удалить бисер и передать proteoliposomes смесь ультрацентрифуга трубки. Центрифугуйте образцы на 100,000 x g за 1 час при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл буфера F.
    Примечание: Образцы готовы для спектроскопического анализа и инъекции в Xenopus ооцитов. Если образцы не может использоваться в тот же день, флэш заморозить их в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus ооцитов электрофизиологии26,32
    1. Придать 50 nL различных разведениях спин меченых proteoliposomes в Xenopus ооцитов, как описано в разделе 2.2.
    2. Выполнения TEVC измерений после 12 h инъекции, как описано в разделе 2.3.10.
  8. Перейдите к выполнить Спектроскопические измерения и анализа (раздел 7).

7. оленей и ОРЭД рентгеновская спектроскопия

  1. Двойной электронно Электронная спектроскопия резонанса (олень).
    1. Выполнения измерений оленей в импульсных ЭПР спектрометр на Q-полоса частот (34 ГГц) и оснащена 10-W усилитель с последовательностью бесплатно четыре пульс мертвых время на 83° с помощью программного обеспечения, поставляемые изготовителем33.
    2. Дополнить 50 мкм стирального порошка очищенной eTRPV1 спин меченых хвоща мутантов в буфер E (шаг 5.5) с 30% (v/v) глицерином для крио защиты.
    3. Загрузите образец в запечатанном кварцевый капилляр и спина в нижней части трубки центрифугированием краткий низкой скорости (100 x g).
    4. Место капиллярной трубки в жидкий азот, чтобы заморозить образца. Образцы можно хранить в этот момент в-80 ° C для последующих измерений.
    5. Поместите образец непосредственно в резонаторе Микроволновая печь и дайте ему заново сбалансировать °-83 на 10 \u2012 20 мин.
    6. Измерить образца с помощью стандартного протокола DEER 4 пульс, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – mw2 (π) – τ2 – (π) mw1 – τ2 – эхо34. Длины импульса для mw1 (π/2) и (π) mw1, 10 и 20 НС, соответственно и 40 НС для mw2 (π). Задайте частоту разделения на 63 МГц.
      Примечание: Основная оленей распада данные могут быть проанализированы с дома встроенный программного обеспечения (например в Matlab) предполагает сумму распределения Гаусса для описания расстояния между спин этикетки19,35.
  2. Непрерывном (CW) ЭПР спектроскопии
    1. Выполните CW EPR эксперименты на RT на X-диапазона (9,6 ГГц) спектрометра с помощью производитель программного обеспечения.
    2. Запустите инструмент, повернув на охладитель воды, консоль и блок питания магнит. Подключите программное обеспечение к инструмент, поместите документ в гармонии и ждать по крайней мере 30 минут для инструмента для разминки.
    3. Загрузить 20 мкл пример из шага 5.5 в стекла 25 мкл капиллярной трубки с помощью капиллярность и уплотнение конец трубки с герметиком.
    4. Загрузить капиллярной трубки в полости микроволновой и критически пара резонатор, вручную или автоматически с помощью функции auto-tune программного обеспечения.
    5. Собирать первые производные спектры в условиях стандартного инструмента: 100 кГц микроволновой модуляции, 1.6 G магнитного поля модуляции и микроволновой мощностью 10 МВт.
    6. Для анализа и представления данных исправить спектров на фоне и нормализации их путем деления спектры, пик пик значение двойной интеграл.
    7. Определите спин лейбл мобильности путем измерения обратное значение ширины центральной линии первой производной спектров поглощения (ΔHo-1)36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Функциональная характеристика минимальной хвоща менее построить TRPV1 (eTRPV1) и один цистеин мутантов

Первый шаг к спектроскопических исследований является инженер и характеризуют белка цистеина менее конструкции (рисунок 2A), которые являются функциональными и дают биохимические количества белков. eTRPV1 является функциональным, как определяется Ca2 + изображений и TEVC (рис. 2B-C). Кроме того, eTRPV1 обеспечивает достаточное количество моющего средства очищенный протеин для оленей и ОРЭД экспериментов (0,5 - 1 мг на литр Sf9 клеток)26. Введение единого которым в частности белка регионах может повлиять на их функции. Рисунок 2B приведены некоторые примеры мутантов сингл цистеин (E651C и A702C) на eTRPV1, которые ведут себя как дикого типа (WT), поскольку их интенсивности флуоресценции увеличивается, когда агониста TRPV1 (например, капсаицин) добавляется к eTRPV1-содержащих HEK293 клетки, как показано на Ca2 + изображений26. С другой стороны A680C является типичным примером нефункциональные хвоща мутант, как флюоресценция неотличима от фона. A680C мутант был исключен для дальнейшего анализа. После Ca2 + изображений эксперименты сингл цистеин мутантов функции проверяется с использованием TEVC или патч зажим для оценки их биофизических свойств. Рисунок 2 c показывает, что мутанты пилки наружу ректификации, характерные для TRPV1, когда оспаривается с pH 5, как определено TEVC26. Функциональный анализ сингл цистеин мутантов является первый контрольно-пропускной пункт перед проведением очистки и выражение протоколы.

Биохимическая характеристика eTRPV1 и один цистеин мутантов

Протокол очистки, описанные выше урожайность моющих средств солюбилизирован белков, которые могут быть помечены через ковалентная модификация хвоща (например, флуорофоров, спин меченых [SL] метил methanethiolsulfonate) вдоль TRPV1 последовательности для спектроскопического анализа. Минимальный TRPV1 канал содержащих остатков цистеина мигрируют как стабильной и монодисперсных видов (~ 13.6 мл), как определяется размер-гель-проникающей хроматографии (рис. 3). eTRPV1 и один цистеин спин меченых мутантов, (E651C-SL и A702C-SL) пилки элюции профиль и стабильности, Рекомендуемые минимальные TRPV1 конструкцию (рис. 3)26. Элюирующий профиля могут варьироваться между различными мутантов, как единый которым может повлиять на стабильность белков. В некоторых случаях мутанты образуют агрегаты; и часть образца может элюировать на void объем столбце (8-9,5 мл), уменьшая количество белка, который переносит как Тетрамер (рис. 3, снизу красной стрелкой). В этом случае томов культуры клеток может масштабироваться компенсировать белка, потеряли в агрегированных дроби, или один можно исключить этот мутант из дальнейшего анализа и приступить к проверить соседние остатков. Другие примеры включают в себя расширение пик, который соответствует Тетрамер. Основные вершины шире, чем 3 мл не рекомендуются для спектроскопического анализа, поскольку они содержат multi-разойтись видов. Биохимическая характеристика спин меченых сингл цистеин мутантов является второй контрольно-пропускного пункта до проведения реорганизации и спектроскопического анализа.

Функциональная характеристика воссоздана спин-меченых eTRPV1 сингл цистеин мутантов

Потому что ОРЭД и олени сигналы полагаться на вложение парамагнитных спин метки для остатков цистеина, важно проверить ли местоположение спин-лейбла изменяет функции протеина. Существует несколько способов для проверки функции после воссоздания спин меченых белка, включая плоские липидного бислоя эксперименты, фиксации и TEVC. TEVC позволяет оценить большое количество спин меченых каналов во время записи макроскопических течений. Чтобы оценить функциональность спин меченых сингл цистеин мутантов, каналы воссоздана в липосомах предварительно сформированных asolectin. Во время этого шага важно исключить 10% глицерина, который присутствует во всем очистки, поскольку глицерол уменьшает эффективность растворения белков в липосомы. Рисунок 4 показывает представитель результат A702C-SL TRPV1 восстановленный в липосомах asolectin и microinjected в Xenopus ооцитов. Как и ожидалось, рН 5 выпытывают надежные внешне выпрямляя токи37 , которые прегражены путем совместного применения TRPV1 антагонист capsazepine (CPZ, синий трассировки)26. Мутантов, которые не сохраняют функциональность после отжима маркировки и восстановление должны быть исключены из дальнейшего анализа. Функциональная характеристика восстановленный спин меченых сингл цистеин мутантов является третьим контрольно-пропускного пункта до проведения спектроскопического анализа.

Структурная динамика спин-меченых eTRPV1 мутантов контролируется CW-ОРЭД и олень

Nitroxide вращения меток чувствительны к окружающей среде и гибкость позвоночника белка, которого является метка придает17. Следовательно CW-ЭПР позволяет определение динамического режима данного спин меченых хвоща; а именно позиции, воздействию водных сред или мембраны более динамичным, чем те, которые только белок белковых взаимодействий17. Рисунок 5A показывает позиции Glu651, Ile679 и Ala702 в TRPV1 решили контролировать параметры мобильности. Чтобы вычислить параметр мобильности спин метки датчика, один вычисляет обратное значение ширины центральной линии первой производной спектров поглощения (Рисунок 5B, черная линия ΔHo−1). Например, E651C-SL (Рисунок 5B) спектральная линия форму и мобильность значение отображается (0,24) часто встречающиеся на динамической позиции на мембраны интерфейс26. С другой стороны, I679C-SL и A702C-SL экспонат, расширение спектра (см. пунктирные линии) и снижение значения мобильности (0,16 и 0,18, соответственно; Рисунок 5B) 26 , которые соответствуют их ограниченного окружающей среды (протеин), согласно крио Эм структуры1.

Рисунок 5 c показывает спектров мутантов спин меченых TRPV1 после растворения в липосомах asolectin. Как и ожидалось, динамические характеристики спектры для E651C-SL и A702C-SL не изменились после растворения, как их форма и мобильность значения одинаковы в решении как мембрана среды26. С другой стороны I679C-SL иллюстрирует шумной спектра; Следовательно нижней (синяя стрелка) и выше (красная стрелка) поле компоненты становятся менее очевидными. Шумные спектры не желаемого обычно, поскольку они склонны недооценивать мобильности спин меченых позиции. Этот тип спектра может быть продуктом воссоздание неэффективных белка, а не под маркировки, поскольку сигнал I679C-SL в растворе является надежной.

Олень данных являются сумму осциллируя, синусоидального сигнала убывает, содержащий информацию о распределении расстояние взаимодействующих спин этикетки38,39. Период и сложность распада непосредственно отражает базового распределения расстояние. Расстояние распределения состоит из количество структурных компонентов, присутствующих в образце и их расстройства. Таким образом, сигнал времени домена происходит от двухполюсные сцепление между метками не фиксированные, далекие спин в растворе, которые обычно вызывают распад экспоненциального фон, andrigidly сочетании спинов в пределах же белка19,40. В частности олени позволяет определить интра белка дальнего расстояния (20-70 Å) между спин меченых остатков19. Рисунок 6 показывает сигнал распада и соответствующего распределения расстояние E651C-сл. Распределение Glu651 показывает три вершины, 24, 36, и 58 Е26. Две короткие расстояния согласуются с закрытой структурой TRPV1 (соответственно 23 и 32 Å для Cβ-Cβ расстояния)1, тогда как третий 58 Å пик может соответствовать агрегации белков.

Figure 1
Рисунок 1. Экспериментальный план. Схема экспериментальной структуры обязаны выразить, очистить и восстановить eTRPV1 для оленей и ОРЭД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Функциональная характеристика мутантов eTRPV1 и один цистеин. (A) схематическое представление TRPV1 конструкций, используемых для спектроскопического анализа (eTRPV1: хвоща менее TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 клетки выражая WT TRPV1, eTRPV1 и мутанты (загружается с Ca2 +-чувствительных Fluo-4-ам) были проанализированы на капсаицин (10 мкм)-вызвали ответы с помощью флуоресценции Ca2 + изображений. Панель цвета указывает относительные изменения в интенсивности флуоресценции, с синим и красным, обозначающий высокиx и низкиx цитоплазматических Ca2 +, соответственно. Белая полоса представляет 100 µm. (C) слева, один субъединицы (S5, поры спирали, S6 и ГТО домена) TRPV1 Тетрамер структуры выделение одного цистеин остатков (желтые сферы) представил вдоль канала последовательности. Правый, вольт амперных отношения определяется TEVC записи из Xenopus ооцитов, выражая WT TRPV1, eTRPV1 и одного цистеин мутантов, оспаривается с pH 5. Токи фон (bkgrd). Изменение от первоначального рисунок26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. Биохимическая характеристика eTRPV1 и один цистеин мутантов.
Размер-гель-проникающей хроматографии профиль DDM-солюбилизирован eTRPV1 и один цистеин спин меченых мутантов после очистки от Sf9 клеток и выражения. Вставка: Геля SDS-PAGE показаны мономерных eTRPV1-MBP синтез белка (изменение от первоначального рисунок26). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Функциональная характеристика спин меченых eTRPV1 мутантов.
Вольт амперных отношения определяется TEVC от Xenopus ооцитов microinjected с proteoliposomes содержащий спин меченых A702C вызов с pH 5 (красный) и заблокирован capsazepine (CPZ, синий: 40 мкм). Токи фон (bkgrd). Изменение от первоначального рисунок26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Подвижности спин меченых eTRPV1 мутантов, определяется CW-ОРЭД.
(A) два подразделения (S5, поры спирали, S6 и ГТО домена) TRPV1 Тетрамер структуры подсветка аминокислотных остатков (желтые сферы) исследовали через сайт направленных спин маркировки рентгеновская спектроскопия. (B) первая производная по спектрам ЭПР CW спин меченых хвоща мутантов в УНБ решение. (C) первой производной по спектрам ЭПР CW спин меченых хвоща мутантов, воссоздана в липосомах asolectin. Спектры получены в рН 7,4 (закрыто). ΔHo−1 обозначает величину параметра мобильности. Черной пунктирной линией подчеркивается, расширение спектра. Синие и красные стрелки обозначают компоненты на низких и высоких местах спектров, соответственно. Общее количество вращения меток были нормализованы спектрам ЭПР. Изменение от первоначального рисунок26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Расстояние распределение eTRPV1 мутант моющего средства.
Олень эхо (A) и распределение (B) расстояние спин меченых мутант E651C; сумма по Гауссу был установлен к данным оленей. P(r) обозначает расстояние распределение спин пары41. Спектры получены в рН 7,4 (закрыто). Изменение от первоначального рисунок26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Современные технологии для очистки млекопитающих мембранных белков и выражения сделали возможным получить достаточное количество белка для спектроскопических исследований14,,1516,42. Здесь мы адаптировали эти технологии, чтобы выразить, очистить, восстановить и спектроскопического анализа в TRPV1.

Среди важных шагов в протоколе ниже являются те, которые мы возникновения для TRPV1 и что может быть скорректирована с учетом других белков. Изменить последовательность ДНК для создания шаблона, который дает 0,5 - 1 мг/мл моющего средства очищенный белок; шаблоны, которые дают меньше, чем 0,5 мг/мл белка являются сложными, поскольку растет более чем 6 литров насекомых клетки культуры потребуются за мутант. Белки должны быть сконцентрированы, не менее 2 мг/мл, без TCEP для повышения эффективности спин маркировки. Маркировка на белок низкой концентрации и/или присутствии TCEP следы будет генерировать шумных спектрам ЭПР. Хотя белки хранятся при температуре 4 ° C во время очистки, крайне важно для выполнения спин маркировки на RT для повышения эффективности. Во время очищения и маркировки глицерин улучшает стабильность белков; Однако она должна быть полностью удалена до растворения, как он уменьшает количество белка в липосомах и генерирует шумных спектрам ЭПР. Уменьшение концентрации моющего средства ниже CMC является обычной практикой во время растворения; Однако TRPV1 клонит осадить до включения в липосомы. Для решения этой проблемы, TRPV1 был инкубированы всю ночь с предварительно сформированных липосомы ровно в CMC избежать осадков белок и увеличить количество каналов в подготовке proteoliposome. TRPV1 является полностью функциональной в asolectin липосомах28; Следовательно это был предпочтительным липидов смеси, используемые в настоящем Протоколе. Однако важно, чтобы определить состав липидов, в котором особый белок является функциональной (например, холестерин) перед продолжением спектроскопического анализа.

Спектроскопические подходы, такие, как ОРЭД и олени представляют ряд ограничений, в том числе: изменения в шаблон последовательности белка, которые улучшают биохимической стабильности может влиять на функции26; введение единого которым не носителями, а также спин метки, может не быть хорошо переносится в некоторых регионах белка; получение большого количества обозначенные протеины; и ограниченные конформационные изменения при определении расстояний с оленей в мицеллах моющего средства. Однако последние ограничения могут быть преодолены путем сбора спектров, в Q-полоса частот, TRPV1 мутантов, воссоздана в nanodiscs19,43. Тем не менее преимущество этих подходов главным образом приходит от модели глобальной динамики, уровни доступности и расстояния более чем от абсолютного значения заданной позиции.

Чувствительность температуры является одним из самых увлекательных и меньше понимать механизмы стробирования; Таким образом используя спектральные подходы, было бы можно определить как мембранных белков перевести тепловую энергию в движение белка в среде мембраны. Важно то, что было бы сложно определить структурные изменения в тепловых стробирования, с помощью рентгеноструктурного анализа или крио EM, как эти методы выполняются на морозе. Будущие эксперименты будет направлена на определение TRPV1 конформационные изменения совместимы с тепловой зависимых стробирования ОРЭД, оленей или флуоресцирование. ЭПР спектроскопии предоставил подробную механистической модели для прокариот ионных каналов, поэтому мы ожидаем, что с помощью протоколов, описанных выше, мы обретем понимание механизмов активации и наркотиков привязка млекопитающих ионных каналов с помощью спектроскопические подходы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы очень благодарны д-р H. Mchaourab для предоставления доступа к НРА и оленей спектрометры и д-р T. Розенбаум для предоставления полнометражного плазмида TRPV1 хвоща менее.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Биохимия выпуск 137 Переходный рецепторный потенциал vanilloid 1 TRPV1 очистки растворения спин маркировки ЭПР спектроскопии олень спектроскопии
Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter