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Biochemistry

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

Abstract

Canales del ion del polimodal transducen múltiples estímulos de diversa índole en cambios alostéricos; Estas conformaciones dinámicas son desafiantes para determinar y siguen siendo en gran parte desconocidos. Con los avances recientes en vertiendo luz de solo-partícula cryo-Electrón microscopia (cryo-EM) en las características estructurales de los sitios de unión del agonista y el mecanismo de activación de varios canales del ion, el escenario está preparado para un análisis profundo de la dinámico de su gating mecanismos mediante métodos espectroscópicos. Técnicas espectroscópicas como resonancia paramagnética electrónica (EPR) y la resonancia doble electrón-electrón (ciervos) se han limitado principalmente al estudio de los canales iónicos procariotas que pueden ser purificados en grandes cantidades. La necesidad de grandes cantidades de proteínas de membrana funcional y estable ha dificultado el estudio de los canales del ion mamíferos utilizando estos enfoques. EPR y los ciervos ofrecen muchas ventajas, incluyendo la determinación de la estructura y los cambios dinámicos de las regiones de la proteína móvil, aunque a baja resolución, que podría ser difícil de obtener por cristalografía de rayos x o cryo-EM, y monitoreo que bloquean reversible transición (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Aquí, le ofrecemos protocolos para obtener miligramos de receptor transitorio detergente solubilizado funcional potencial catión subfamilia V miembro del canal 1 (TRPV1) que pueden ser etiquetados para espectroscopia EPR y ciervos.

Introduction

Con los recientes avances en microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM), estructuras de canal del ion mamíferos han sido obtenidas a un ritmo extraordinario. Particularmente, los estudios estructurales de los canales iónicos de Polimodal, como los vaniloides potencial transitorio del receptor 1 (TRPV1), han proporcionado mayor comprensión de su activación mecanismos1,2,3, 4 , 5. sin embargo, información dinámica sobre canales del ion encajado en un ambiente de membrana se requiere para entender sus mecanismos Polimodal bloquea y atascamiento de la droga.

Resonancia paramagnética electrónica (EPR) y espectroscopías de resonancia (ciervos) doble electrón-electrón han proporcionado algunos de los modelos mecanicistas más definitivos para ion canales6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. estos enfoques se han limitado principalmente a la examinación de procariotas y ion archeal canales que producen una gran cantidad de proteínas purificadas de detergente cuando overexpressed en bacterias. Con el desarrollo de la producción de proteínas de membrana eucariota en insectos y células de mamíferos para la caracterización funcional y estructural14,15,16, ahora es posible obtener bioquímico cantidades de proteínas purificadas de detergente para estudios espectroscópicos.

Las señales de EPR y ciervos surgen de una etiqueta de paramagneticspin (SL) (es decir, methanethiosulfonate) unida a un residuo de cisteína solo en la proteína. Las etiquetas de vuelta informan tres tipos de información estructural: movimiento, accesibilidad y distancias. Esta información permite determinar si los residuos se entierran dentro de la proteína o se exponen a la membrana o ambiente acuoso en la apo y Estados de la ligand-limite13,17,18,19. En el contexto de una estructura de alta resolución (cuando esté disponible), el EPR y los ciervos los datos proporcionan una colección de restricciones para derivar modelos dinámicos en su medio natural manteniéndose en transición bloquea reversible (es decir, cerrado, abierto, sensibilizados y desensibilizar). Por otra parte, las regiones flexibles que podrían ser difíciles de determinar por cristalografía de rayos x o cryo-EM podían obtenerse mediante el uso de estos conjuntos de datos ambientales para asignar estructuras secundarias, así como la ubicación dentro de la proteína20. Estructuras de Cryo-EM obtenidas en nanodiscs de lípidos proporcionan información valiosa sobre la compuerta del ion de canales3,21,22,23,24, 25; sin embargo, métodos espectroscópicos podrían proporcionar información dinámica de Estados conformacionales (p. ej., cambios térmicos) que podría ser difícil de determinar utilizando cryo-EM.

Hay que superar muchas dificultades para implementar EPR y los ciervos, como la falta de función de la proteína al quitar todos los residuos de cisteína (especialmente abundantes en mamíferos canales), rendimiento de proteína baja, inestabilidad de la proteína durante la purificación y después centrifugado etiquetado y la agregación de la proteína en detergente o liposomas. Aquí, hemos diseñado protocolos para superar estas barreras críticas y han obtenido información de ciervos y EPR espectros para un receptor sensorial mamífero. El objetivo aquí es describir metodologías para construyen la expresión, la purificación, el etiquetado y la reconstitución de una rata menos cisteína mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) para análisis espectroscópico. Esta metodología es apropiada para las proteínas de la membrana que mantienen su función a pesar de la eliminación de residuos de cisteína o que contienen cisteína formando enlaces disulfuro. Esta colección de protocolos podría adaptarse para el análisis espectroscópico de los otros canales iónicos mamíferos.

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Protocol

1. TRPV1 mutagénesis

Nota: Una mínima construcción de TRPV1 para análisis espectroscópico26 fue construida desde el largometraje cisteína-menos canal TRPV127 usando el método de reacción en cadena (PCR) polimerasa (figura 1). Esta construcción mínima de TRPV1 cisteína-menos (denominada eTRPV1 en adelante) consiste en residuos 110-603-627-764. eTRPV1 fue clonado en pMO (un vector basado en pcDNA3.1) para el análisis funcional y en un donante recombinante vectores28 que contiene 8 x histidina maltosa proteína-(MBP)-tabaco etch virus (TEV) para la expresión y purificación (figura 2A). eTRPV1 cisteína solo–se generaron mutantes mediante mutagénesis sitio-dirigida. Secuencias del vector y el canal se especifican en el archivo complementario 1: métodos suplementarios.

  1. Diseño de cartillas de mutagénesis con herramientas en línea29.
  2. Mezclar en un tubo 0.2 mL: 5 μL de 10 x buffer de reacción, 1 μL de dNTP mix (100 mM), 1 μL de 10 oligonucleótidos de avance y retroceso de μM, 1 μL de la plantilla de eTRPV1 de 100 ng/μL de ADN26, 1,5 μL de DMSO, 1 μL de enzima de mutagénesis y 38.5 μL de agua desionizada. Girar la mezcla antes de colocar los tubos en el termociclador.
  3. Realizar mutagénesis PCR.
    1. Realizar una desnaturalización a 95 ° C por 2 min, b desnaturalización a 95 ° C por 20 s, (c) recocido a 60 ° C durante 10 s y (d) alargamiento a 68 ° C durante 4 min (30 s por 1 kb). Repita los pasos b a d de 18 ciclos, luego realizar elongación a 68 ° C por 5 min y mantener la reacción a 4 ° C hasta su uso posterior.
  4. Añadir 2 μL de DpnI enzima a la reacción; mezclar y luego incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  5. Realizar la transformación
    1. Descongelar las células competentes de e. coli en hielo.
    2. A un tubo estéril previamente enfriado de 14mL, añadir 75 μL de células competentes y 10 μL de la mezcla PCR-traté de Dpn. Mezclar suavemente.
    3. Incubar la reacción en hielo por 30 minutos, mantenga el tubo a 42 ° C por 45 s y luego inmediatamente en hielo durante 2 minutos la placa la mezcla en el caldo de Luria (LB)-placa de agar que contiene carbenicilina (0,2 mg/mL). Incube la placa durante la noche a 37 ° C.
    4. Cosecha por lo menos tres colonias individuales de la placa y sembrar cada una en 4 mL de LB con carbenicilina (0,2 mg/mL) mediante un tubo estéril de 14 mL. Incubar los cultivos durante la noche a 37 ° C y agitar a 250 rpm.
    5. Desactivación de las culturas durante la noche a 8.000 x g por 10 min y extraer ADN siguiendo las instrucciones de los kits de preparación mini disponible en el mercado.
    6. Verificar la presencia de cisteína solo mutantes por la secuencia de ADN automatizada estándar (véase Tabla de materiales).

2. funcional análisis de eTRPV1 y solo-cisteína mutantes

  1. Transfección de línea celular HEK293 30
    1. Cultura las células HEK293 6 - placas de pozos en 2 mL de medio de glucosa alta (DMEM) por pozo (37 ° C, 5% CO2, 95% humedad). Preparar células HEK293 70 \u2012 80% confluente.
    2. Preparar la mezcla de transfección en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separados.
      1. Para la reacción A, Añadir 0,5 μg eTRPV1 o cisteína que contiene mutante de pMO a 250 μl de medio mínimo esencial (por ejemplo, Opti-MEM). Para la reacción B, agregar 3 μl de reactivo de transfección a 250 μl de medio mínimo esencial. Incubar cada reacción por 5 min a temperatura ambiente (RT).
      2. Mezcle las reacciones A y B con una pipeta de 1 mL. Incubar la mezcla por 45 min a TA.
    3. Retire 500 μl de medio de cultivo de la confluencia del 70-80% bien y agregar 500 μl de la mezcla de reacción. Almacenar las placas durante la noche para el Ca2 + proyección de imagen (37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad).
  2. CA2 + proyección de imagen en células HEK293 30
    1. Limpiar cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro con etanol y agua y colocarlos en una placa de 24 pozos.
    2. Añadir 75 μl de la polivinílico-l-lisina en el centro de cada cubreobjetos y guardar la placa durante 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
    3. Quite el cubreobjetos exceso de poli-l-lisina y lavar tres veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar cualquier resto.
    4. Una vez que el cubreobjetos estén listos, proceder a separar las células de la placa de la pozo 6.
    5. Retire los medios de comunicación y agregar 500 μl de PBS caliente (37 ° C) para el lavado.
    6. Quitar PBS, agregar 500 μl de tripsina e Incube por 1 minuto.
    7. Agregar 500 μl de medios de cultivo caliente (37 ° C) para detener la reacción de digestión y mezclar con la pipeta; evitar la formación de burbujas. Si es necesario, ajustar la concentración de células diluir esta resuspensión con más medios de cultivo.
    8. Semilla de 250 μl de células HEK293 transfected (70% confluente) más 250 μl de medio de cultivo (500 μl volumen final por pozo) en el cubreobjetos previamente tratado y dejarlos reposar (accesorio) para 1-2 h en la incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
    9. Mientras tanto, preparar una solución de carga mediante la adición de ácido de pluronic de 0.02% y 1 μm Fluo-4-AM al búfer de un timbre. Mezcle bien la solución.
    10. Retire los medios de cultivo HEK293 del pozo y agregar 500 μl de la solución de carga. Incube las células para 1 h (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad). Lavar las células Fluo-4 cargó dos veces con tampón de cálido timbre.
    11. Coloque un cubreobjetos con las células de carga en un plato de Petri de 10 mm en una platina del microscopio (usando un 10 X objetivo; 494 de nm de excitación y emisión de nm 506) para realizar mediciones de Ca2 + intracelulares.
    12. Medir los cambios en la intensidad de la fluorescencia después perfundiendo respectivos ligandos (por ejemplo, la capsaicina μM 10) utilizando el software disponible en el mercado (véase Tabla de materiales).
  3. mRNA y preparación de ovocitos de Xenopus laevis 30
    1. Alinear eTRPV1 y solo-cisteína que contiene mutantes pMO con Pmepara 1 h a 37 ° C. Limpiar siguiendo las instrucciones de los kits disponibles en el mercado de la purificación de ADN.
    2. El uso lineal y limpia ADN para sintetizar ARN capsulado con un kit disponible en el mercado compatible con T7 ARN polimerasa.
    3. Limpie con RNAs según kits disponibles en el mercado de la purificación. Cuantificar la cantidad de RNA midiendo la absorbancia a longitud de onda de 260 nm.
    4. Transferencia 5 \u2012 10 mL de X. laevis ovocitos (disponibles comercialmente) en un tubo cónico de 50 mL que contenga 20 mL de solución ND96 (96 mM NaCl, KCl, 5 mM HEPES, de 2 mM 1 mM MgCl2, pH 7,4) con colagenasa 1 mg/mL y nutate por 50 min a TA.
    5. Enjuague los ovocitos en ND96 hasta que la solución es clara; Añadir colagenasa fresco y agitar durante 30 min a TA. examinar los óvulos bajo un microscopio estéreo y detener la digestión cuando la capa folicular externa (capa brillante con vasos rojos de la sangre) está ausente en los oocitos de la mayoría (90%). Enjuague los ovocitos en ND96 hasta que la solución es clara.
    6. Transferencia de ovocitos a un tubo de poliestireno de 50 mL con ND96 plus 1 mM CaCl2 y agitar durante ovocitos bajo digerido de 1 h. se adhieren al tubo de poliestireno.
    7. Lavado de ovocitos con ND96 plus 1 mM CaCl2 y suplemento de solución con 50 μg/mL de gentamicina y 50 μg/mL de la tetraciclina.
      Nota: Proteger las soluciones que contienen tetraciclina de exposición a la luz.
    8. Seleccionar ovocitos grandes sin las membranas dañadas y mostrando una clara separación entre los polos de vegetales y animal. Que ovocitos recuperar durante 4 horas antes de la microinyección en 16 ° C.
    9. Utilizar pipetas de vidrio (D.E.: 1,11 mm, ID: 0,5 y la longitud 8.8 centímetros) para inyectar 1-5 ng de mRNA de mutantes eTRPV1 y solo-cisteína ovocitos utilizando un sistema nanoliter-inyector (46 nL/s) y un microscopio estéreo (2 aumentos). Almacenar ovocitos a 16 ° C en ND96 complementado con CaCl2 y antibióticos (gentamicina/tetraciclina 1 x).
    10. Después de 72 h, medir corriente macroscópica utilizando un sistema de adquisición de dos electrodos de pinza de voltaje (TEVC)31.
    11. Tire de pipetas de vidrio de borosilicato (0,3 MΩ) y llenarlos con 3 M KCl.
    12. Coloque el ovocito en la sala de grabación con una pipeta de transferencia y perfusión de la solución de baño (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM solución de MgCl2, 1 mM EGTA y 10 mM HEPES, pH 7,4) a baja velocidad.
    13. Sumergir dos electrodos en la solución del baño para ajustar sus desplazamientos de la pipeta. Empuje suavemente los electrodos de la pipeta (pipetas de vidrio de borosilicato; Diámetro exterior: 1,5 mm, ID: 1.10 y longitud 10 cm) en el oocito hasta una muesca pequeña se observa bajo un microscopio estéreo (2 aumentos), así como un cambio en el potencial de membrana.
    14. Cambie la configuración de amplificador a modo y medida las corrientes macroscópicas de grabación mientras se aplica una rampa de voltaje-abrazadera de -80 a + 80 mV para carga s. 1 el sistema de perfusión con la solución utilizada en paso 2.3.12 en pH 7,4 (como control) y en pH 5 para comprobar la actividad eTRPV1.

3. generación de la Bacmid recombinante y Baculovirus para la expresión de la proteína

  1. Bacmid
    1. Transformar 100 μL de células competentes de e. coli de DH10Bac con 7.5 ng del vector recombinante donante que contiene eTRPV1 o solo-cisteína mutantes.
    2. Agregar 900 μL de medio SOC (triptona, 5 mg/mL de 20 mg/mL levadura extracto, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM MgSO4y 20 mM de glucosa) e incubar de 6-7 h a 37 ° C y 225 rpm.
    3. 100 μl de la mezcla y de diluciones seriadas de la semilla (1/10 y 1/100), en placas de LB-agar con 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicina, tetraciclina μg/mL 10 y kanamicina 50 μg/mL. Incubar las placas durante al menos 48 h a 37 ° C.
    4. Seleccione colonias blancas que son de 2 mm de diámetro, azul colonias carecen del inserto de interés. Utilice un microscopio estéreo para verificar que colonias blancas no contienen ninguna manchas azules.
    5. Cosechar por lo menos tres colonias individuales y transferirlos a un tubo estéril de 14 mL con 4 mL de medio LB suplementado con gentamicina μg/mL 7, 10 de μg/mL tetraciclina y kanamicina 50 de μg/mL. Incube las células durante la noche (~ 16 h) a 37 ° C y 250 rpm.
    6. Tomar 1,5 mL de los cultivos durante la noche y aislante bacmid recombinante ADN (consulte el archivo complementario 1 para protocolo detallado). Almacenar bacmid a 4 ° C hasta por dos meses.
      Nota: Preparar las existencias de glicerol de DH10Bac e. coli que contiene el ADN de bacmid. 300 μL de la cultura y añadir 200 μL de glicerol al 50% (concentración final de glicerol del 20%). Almacenar la alícuota a-80 ° C hasta su uso posterior.
    7. Verificar la presencia de eTRPV1 en la bacmid recombinante mediante PCR (consulte 1 archivo complementario para protocolo detallado).
  2. Baculovirus
    Nota: Para este procedimiento, transfectar células Sf9 de los insectos en un formato 6-bien. Todas las cantidades y volúmenes se dan sobre una base por-bien. Evite el uso de antibióticos.
    1. Placa de 1 x 106 Sf9 células en 2 mL de medio de células de insecto. Permite adjuntar por lo menos 45 min de las células.
    2. Diluir 1 μg de bacmid recombinante ADN en 100 μL de medios de comunicación de células de insecto. Mezclar suavemente.
    3. Diluir 100 μL de media celda insectos 6 μL de reactivo de transfección (TR). Mezclar suavemente.
    4. Combinar las soluciones de ADN y TR (de pasos 3.2.2 y 3.2.3, respectivamente). Mezclar suavemente e incubar 30 min a TA.
    5. Agregar 0,8 mL de medio de células de insecto a la mezcla de ADN/TR; mezclar suavemente.
    6. Quitar los medios de comunicación de insectos de la célula de las células Sf9 y lavar una vez con 1 mL de medio fresco.
    7. Retire el medio de lavado y agregue la mezcla de ADN/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) a las células. Incube las células a 27 ° C durante 5 h (sin agitación).
    8. Retire la mezcla de transfección y reemplazar con 2 mL de medio de insectos de la célula que contiene 0,5% de suero bovino fetal (FBS). Incube las células a 27 ° C durante cinco días.
      PRECAUCIÓN: Evitar la evaporación de los medios de comunicación celular llenando los pozos vacíos de los medios de comunicación y que cubre la placa de la pozo de 6 con dos capas de película de parafina.
    9. Transferencia de los medios de cultivo de células en un tubo de centrífuga de 15 mL. Aislar el primer paso (P1) de la acción viral haciendo girar el tubo a 8.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 mL limpia y almacenarse inmediatamente a 4 ° C.
      Nota: Proteja el virus de exposición a la luz que cubre el tubo con papel de aluminio.
    10. Para la segunda generación (P2) de la acción viral, poner una cultura 25 mL suspensión de medios de comunicación de células de insecto a 1 x 106 Sf9 células/mL que contiene 2% FBS en un matraz de 125 mL (fondo llano y ventilación). Añadir 25 μL del virus P1 a la cultura de 25 mL.
    11. Incubar el cultivo a 27 º C durante 72 h.
    12. Para cosechar la acción viral de P2, la cultura de la transferencia a un nuevo tubo de 50 mL y centrifugar a 8.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    13. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL y almacenarse inmediatamente a 4 ° C.
      Nota: Proteja el virus de exposición a la luz que cubre el tubo con papel de aluminio. Realizar un experimento en pequeña escala para valorar la relación de virus/Sf9 P2 para la óptima expresión de TRPV1 (consulte 1 archivo complementario para un protocolo detallado, sección 4 titulado "Experimento en pequeña escala para virus P2.")
    14. Para la expresión de proteínas a gran escala, establecer un cultivo de suspensión celular de 1-L Sf9 2 x 106 células/ml en medios celulares insectos suplementados con 0.5% FBS en un matraz de vidrio de borosilicato de 2,8 L.
    15. Añadir 1 mL de caldo de virus P2 en la cultura L 1 e incubar a 27 ° C durante 72 h.
      Nota: En el tercer día, densidad celular debe ser en aproximadamente 1.5 a 2.5 x 106 células/mL.

4. eTRPV1 y solo-cisteína mutante purificación

  1. Las membranas aislamiento28
    1. Cosecha de la cultura de suspensión de células de insectos 1-L por spinning x 4.500 g, 4 º C, durante 20 min pesa el precipitado de células (se espera que alrededor de 6-9 g).
    2. Resuspender el precipitado de células en 25 mL de tampón de helada A (sacarosa 36,5 mM, 2 mM tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) y 50 mM Tris; pH 7,4) en presencia de inhibidores de la proteasa (1 mM phenylmethyl sulfonil fluoruro (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinina y 1 pepstatin μg/mL). Desagregación de los grupos de células para obtener una suspensión homogénea y gire a 4 ° C por 20 min.
    3. Romper las células mediante un manual (dounce amoladora de tejido) o un homogeneizador de alta presión. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 8.000 x g por 20 min a 4 ° C.
      Nota: Mantenga las células sometidas a lisis y tubos en hielo durante todo el proceso.
    4. Recoger sobrenadante y centrifugar a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de la membrana en un volumen total de 20 mL de helado Buffer B (150 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES, pH 7,4), suplementado con los inhibidores de la proteasa (como en el paso 4.1.2).
    5. Alícuota 20 mL de la suspensión de la membrana en tubos de 50 mL y flash-congelación en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso posterior.
  2. Proteína purificación26,28
    1. Descongelar las alícuotas de membrana en el hielo y añadir 3 mL de n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) por el tubo (acción de 200 mM). Gire el tubo durante 2 h a 4 ° C.
    2. Centrifugar la muestra a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y agregar 1 mL de resina de amilosa mojado limpio. Gire la mezcla por 2 h a 4 ° C. La mezcla de proteína/amilosa en columnas de cromatografía de flujo de gravedad de la carga.
      PRECAUCIÓN: No permita que la resina se seque durante el lavado.
    3. Lavar la resina unida a las proteínas amilosa con 10 veces las cama volúmenes de helada C Buffer (150 mM NaCl, 10% glicerol, 50 mM HEPES, DDM, 0,1 μg/mL asolectin, TCEP de 0,5 mM de 0.5 mM, pH 7,4). Lavar con 10 volúmenes de cama de helado D Buffer (150 mM NaCl, 10% glicerol, 50 mM HEPES, 0.5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4).
      Nota: Antes de lavar, degas Buffer D sin detergentes o los lípidos, purga con nitrógeno. Después de la desgasificación, añadir DDM y asolectin.
    4. Eluir la proteína eTRPV1 con fracciones de 0,5 mL, hasta 5 mL, de helada desgasificado Buffer D, complementado con maltosa 20 mM. Si es posible, realizar el lavado y elución a 4 ° C.
    5. Cuantificar la cantidad de proteína mediante la medición de la absorbancia a longitud de onda de 280 nm.
      Nota: Este protocolo da 0.5 a 1.0 mg de proteína por litro de cultivo. Rendimiento de proteína puede variar para cada mutante de solo-cisteína eTRPV1. Para los experimentos de EPR y ciervos, crecer 4 \u2012 6 L de la cultura.

5. eTRPV1 solo-cisteína Mutant Site-Directed Spin etiquetado

  1. Concentrar las fracciones que contienen la eTRPV1 utilizando una unidad de filtro centrífugo (corte = 100 kDa) \u2012 2 hasta 2.5 mg/mL para el etiquetado (ciclos de 7.000 x g durante 2 min a 4 ° C).
  2. Agregar un exceso molar 10 veces (3 veces, cada 30 minutos) de la etiqueta de vuelta (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) metil methanethiosulfonate (MTSSL) de una solución stock de 100 mM en DMSO a la proteína concentrada (monómero de eTRPV1: MTSSL en 1:10 cociente molar) 17. mantener la reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h 30 minutos, seguido por la incubación durante la noche a 4 ° C.
    Nota: En este paso, MBP podría eliminarse mediante la adición de proteasa TEV durante la incubación de etiquetado de vuelta durante la noche.
  3. ETRPV1 vuelta-etiqueta de carga en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño equilibrado en búfer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, DDM de 0,5 mM, pH 7,4), controlado por un sistema de proteína rápida (FPLC) de la cromatografía líquida. Recoger fracciones que contiene eTRPV1 tetrámero.
    Nota: No incluyen 10% de glicerol en este paso, ya que reduce la eficacia de la reconstitución.
  4. Cuantificar la cantidad de proteína mediante la medición de la absorbancia a longitud de onda de 280 nm.
  5. Evaluar la pureza de la muestra mediante la ejecución de un gel de SDS-PAGE (gel libre de manchas, 4 \u2012 20%). La muestra está lista para las mediciones espectroscópicas en solución o en proteoliposomes.

6. eTRPV1 marca Spin solo mutante de cisteína reconstitución

  1. Seco 10 mg de asolectin utilizando un evaporador rotatorio bajo vacío (≤ 100 mbar) por 1 h a 40 ° C. Asolectin liposomas, añadir 1 mL de tampón (200 mM NaCl, fregonas de 5 mM, pH 7,4) y someter a ultrasonidos la mezcla por 15 minutos o hasta que la muestra es homogénea.
  2. Desestabilizar los liposomas añadiendo DDM a una concentración final de 2 mM e incubar 30 min a TA.
  3. La proteína marcada se concentran en 2 mg/mL y añadir a los liposomas con una proporción proteína/lípidos de 1:5 (masa: masa).
    PRECAUCIÓN: Es importante mantener las concentraciones de proteínas mencionadas, puesto que vuelta de etiquetado de eficiencia disminuye a bajas concentraciones y en alta que puede precipitar la proteína.
  4. Añadir el tampón de F para ajustar la mezcla de proteína/liposomas a la concentración micelar crítica de DDM (CMC) e incubar durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
  5. Doble del volumen de la mezcla de proteína/liposomas con F de tampón y detergente eliminar añadiendo secuencialmente tres alícuotas de granos del adsorbente poliestireno no polares (30 mg, 50 mg y 80 mg) en intervalos de 1 h con agitación suave a TA.
  6. Coloque la mezcla en un filtro de columna (columna de cromatografía de flujo de gravedad) para quitar los granos y transferir la mezcla proteoliposomes a un tubo de ultracentrífuga. Centrifugar las muestras a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 30 μL de tampón f el.
    Nota: Las muestras están listas para análisis espectroscópico e inyección en oocytes del Xenopus . Si las muestras no pueden usarse el mismo día, flash-freeze les en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus ovocitos electrofisiología del26,32
    1. Inyectar 50 nL de diferentes diluciones de proteoliposomes vuelta-etiqueta en oocytes del Xenopus como se describe en la sección 2.2.
    2. Realizar mediciones de TEVC después de 12 h de la inyección como se describe en la sección 2.3.10.
  8. Proceder a realizar las mediciones espectroscópicas y análisis (sección 7).

7. ciervo y espectroscopías EPR

  1. Doble electrón-Electrón Espectroscopia de la resonancia (el ciervo).
    1. Realizar mediciones de ciervos en un espectrómetro EPR pulsado operando a frecuencia de la banda Q (34 GHz) y equipado con un amplificador de 10 W con la secuencia de cuatro pulsos libre de tiempo muerto en 83° utilizando el software proporcionado por el fabricante33.
    2. Suplemento de 50 μm de mutantes de cisteína spin-labeled purificada de detergente eTRPV1 en tampón (paso 5.5) con 30% (v/v) de glicerol para la cryo-protección.
    3. Cargar la muestra en un tubo capilar de cuarzo sellado y vuelta a la parte inferior del tubo de centrifugación a baja velocidad breve (100 x g).
    4. Coloque el tubo capilar en nitrógeno líquido para congelar la muestra. Las muestras pueden almacenarse en este punto a-80 ° C para la medición posterior.
    5. Colocar la muestra directamente en el resonador de microondas y deje que se vuelva a equilibrar en-83° de \u2012 10 20 min.
    6. Medir la muestra usando un protocolo estándar de venado de cuatro pulsos, mw1 (π/2) – τ1 – mw1 (π) – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1, τ2 – eco34. Las longitudes de pulso para mw1 (π/2) y (π) mw1 son ns 10 y 20, respectivamente y 40 ns para mw2 (π). Establecer la separación en frecuencia a 63 MHz.
      Nota: Datos de caries primaria ciervos pueden ser analizados con un hogar construido software (por ejemplo, en Matlab) que supone una suma de distribuciones Gaussianas para describir las distancias entre spin etiquetas19,35.
  2. Espectroscopia EPR (CW) onda continua
    1. Realizar experimentos de CW EPR en RT en un espectrómetro de banda X (9,6 GHz) mediante el software del fabricante.
    2. Activar el instrumento girando el enfriador de agua, la consola y la fuente de alimentación del imán. Conectarse el instrumento con el software, coloque el instrumento en sintonía y esperar al menos 30 min para el instrumento se caliente.
    3. 20 μl de la muestra de la carga del paso 5.5 en un tubo capilar de vidrio 25 μl mediante acción capilar y sellar el extremo del tubo con sellador.
    4. El tubo capilar la carga en la cavidad del microondas y crítico par el resonador ya sea manualmente o automáticamente mediante la función de sintonización automática del software.
    5. Recoger los primeros espectros derivados bajo condiciones normalizadas: modulación de microondas de 100 kHz, modulación del campo magnético de 1.6 G y potencia de microondas de 10 mW.
    6. Análisis de datos y presentación, corregir los espectros contra el fondo y normalizar dividiendo los espectros por el valor de pico a pico de la integral doble.
    7. Determinar la movilidad de vuelta-etiqueta mediante la medición de la inversa de la anchura de la línea central del primer derivado espectros de absorción (ΔHo-1)36.

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Representative Results

Caracterización funcional de mínimo menos cisteína TRPV1 construir (eTRPV1) los mutantes solo-cisteína

El primer paso para estudios espectroscópicos es Ingeniero y caracterizar construcciones cisteína-menos proteína (figura 2A) que son funcionales y rendimiento bioquímicos cantidades de proteínas. eTRPV1 es funcional determinado por la proyección de imagen de Ca2 + y TEVC (figura 2B-C). Por otra parte, eTRPV1 proporciona cantidades suficientes de proteína purificada de detergente para experimentos EPR y ciervos (0.5 - 1 mg por litro de células Sf9)26. Introducir solo cisteínas en las regiones de la proteína en particular podría afectar su función. Figura 2B muestra algunos ejemplos de mutantes de la solo-cisteína (E651C y A702C) en eTRPV1 que se comportan como tipo salvaje (WT), puesto que su intensidad de la fluorescencia aumenta cuando se agrega TRPV1 agonista (por ejemplo, la capsaicina) a HEK293 que contiene eTRPV1 células, como se muestra por el Ca2 + imagen26. Por otra parte, A680C es el ejemplo típico de un mutante de cisteína no funcional, como la fluorescencia es indistinguible del fondo. El mutante de A680C fue excluido para su posterior análisis. Después de Ca2 + experimentos de imagen, función única-cisteína mutantes se prueba usando abrazadera TEVC o parche para evaluar sus propiedades biofísicas. Figura 2 muestra que mutantes recapitulan la rectificación externa característica de TRPV1 cuando con pH 5, según lo determinado por TEVC26. Análisis funcional de mutantes solo-cisteína es el primer punto de control antes de realizar protocolos de expresión y purificación.

Caracterización bioquímica de la eTRPV1 y solo-cisteína mutantes

El protocolo de purificación descrito produce proteína solubilizada de detergente que puede etiquetarse mediante modificación covalente de la cisteína (p. ej., fluoróforos, etiquetado spin [SL] metil-methanethiolsulfonate) a lo largo de la secuencia de TRPV1 para análisis espectroscópico. TRPV1 mínimos residuos de cisteína que contiene el canal migran como especie estable y monodispersa (~ 13,6 mL), según lo determinado por cromatografía por exclusión de tamaño (figura 3). eTRPV1 y solo-cisteína mutantes marcado con spin (E651C-SL y A702C SL) recapitulan el perfil de elución y estabilidad ofrecido por el mínimo TRPV1 construcción (figura 3)26. El perfil de elución puede variar entre diferentes mutantes, como cisteínas solo podrían afectar la estabilidad de la proteína. En algunos casos, los mutantes forman agregados; y una fracción de la muestra puede eluir el volumen vacío de la columna (8-9.5 mL), reduciendo la cantidad de proteína que migra como un tetrámero (figura 3, flecha inferior rojo). En este caso, se pueden escalar volúmenes de cultivo celular para compensar la proteína perdida en la fracción de agregados, o uno puede excluir a este mutante de análisis y proceder a probar el resto vecino. Otros ejemplos incluyen una ampliación del pico que corresponde al tetrámero. Principales cumbres de más de 3 mL no se recomiendan para análisis espectroscópico, ya que contienen multi-dispersar especies. Caracterización bioquímica de marcado con giro único-cisteína mutantes es el segundo punto de control antes de la reconstitución de la empresa y análisis espectroscópico.

ETRPV1 caracterización de reconstituido Spin-labeled funcional solo-cisteína mutantes

Porque las señales EPR y ciervos se basan en la fijación de una etiqueta de vuelta paramagnética a un residuo de cisteína, es importante verificar si la ubicación de la etiqueta de vuelta altera la función de la proteína. Hay varias maneras para probar la función después de reconstituir la proteína spin-etiquetados, incluyendo experimentos de bicapa lipídica planar, abrazadera del remiendo y TEVC. TEVC permite la evaluación de un gran número de canales etiquetados de vuelta durante la grabación de las corrientes macroscópicas. Para evaluar la funcionalidad de los mutantes solo-cisteína marca spin, canales se reconstituyen en liposomas de forma asolectin. Durante este paso, es importante excluir el glicerol al 10% que está presente en toda purificación, ya que el glicerol disminuye la eficiencia de la reconstitución de la proteína en liposomas. La figura 4 muestra a un representante de TRPV1 SL A702C reconstituida en liposomas asolectin y microinyectados en oocytes del Xenopus . Como era de esperar, pH 5 provoca robusto exterior rectifica corrientes37 bloqueados por la aplicación conjunta de la TRPV1 antagonista capsazepine (CPZ, rastro azul)26. Mutantes que mantener funcionalidad después de su vuelta de etiquetado y reconstitución deben ser excluidos del análisis posterior. Caracterización funcional de reconstituido marcado con giro único-cisteína mutantes es el tercer punto de control antes de realizar análisis espectroscópico.

Estructural marcado con la dinámica del espín eTRPV1 mutantes supervisada por CW-EPR y ciervos

Nitróxido etiquetas de spin son sensibles al entorno y la flexibilidad de la columna vertebral de la proteína a la que la etiqueta es17. Por lo tanto, CW-EPR permite la determinación del régimen dinámico de una cisteína dado vuelta-etiqueta; es decir, son más dinámicos que los limita a las interacciones de proteínas17posiciones expuestas a los medios acuosos o la membrana. Figura 5A se muestra las posiciones Glu651, Ile679 y Ala702 en TRPV1 elegido supervisar parámetros de movilidad. Para calcular el parámetro de movilidad de la sonda de la etiqueta de vuelta, se calcula la inversa de la anchura de la línea central de los primeros espectros de absorción derivados (figura 5B, línea negra ΔHo−1). Por ejemplo, E651C-SL (figura 5B) muestra una línea espectral forma y movilidad valor (0.24) comúnmente se encuentran en posiciones dinámicas en la membrana interfaz26. Por otra parte, I679C SL y A702C SL muestran ensanchamiento de los espectros (ver líneas discontinuas) y una disminución en los valores de movilidad (0.16 y 0.18, respectivamente; Figura 5B) 26 que son coherentes con su entorno restringido (proteínas), según el sistema cryo-EM de1.

Figura 5 muestra el espectro de mutantes de TRPV1 marcado giro después de la reconstitución en liposomas de asolectin. Como era de esperar, las características dinámicas de los espectros de E651C SL y A702C SL no cambió después de la reconstitución, como sus valores de forma y la movilidad son los mismos en solución como en una membrana medio ambiente26. Por otro lado, I679C-SL muestra un espectro de ruido; en consecuencia, los componentes de campo mayor (flecha roja) e inferior (flecha azul) se convierten en las menos obvios. Espectros de ruido no se desean generalmente, ya que tienden a subestimar la movilidad de la posición de la etiqueta de vuelta. Este tipo de espectro podría ser el producto de la reconstitución de proteínas ineficientes en lugar de debajo de etiquetado, ya que la señal de I679C-SL en solución es robusta.

Datos de venado son una suma de sinusoidales, oscilante decae de señal que contiene información sobre la distribución de la distancia de interacción spin-etiquetas38,39. El período y la complejidad de la decadencia refleja directamente la distribución subyacente de la distancia. La distribución de la distancia está compuesto por el número de componentes estructurales presentes en la muestra y su desorden. Por lo tanto, la señal del dominio de tiempo deriva de la dipolar acoplamiento entre etiquetas spin no fijos, distantes en la solución que generalmente causan un decaimiento exponencial de fondo, andrigidly junto con giros dentro de la misma proteína19,40. Específicamente, los ciervos permite la determinación de distancias de largo alcance de intra-proteína (20-70 Å) entre residuos etiquetado vuelta19. La figura 6 muestra el decaimiento de la señal y la correspondiente distribución de distancia de E651C SL. La distribución de Glu651 muestra tres picos correspondientes a 24, 36 y 58 Å26. Las dos distancias más cortas son consistentes con la estructura cerrada de TRPV1 (23 y 32 Å para la Cβ-Cβ distancias, respectivamente)1, mientras que el tercero 58 pico Å podría corresponden a la agregación de la proteína.

Figure 1
Figura 1. Esquema experimental. Diagrama del esquema experimental necesario para expresar, purificar y reconstituir eTRPV1 EPR y ciervos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Caracterización funcional de mutantes eTRPV1 y cisteína solo. (A) representación esquemática de las construcciones de TRPV1 utilizado para análisis espectroscópico (eTRPV1: cisteína-menos TRPV1 110-603/627-764). HEK293 (B) las células expresan TRPV1 WT, eTRPV1 y mutantes (cargados de Ca2 +-sensible Fluo-4-AM) se analizaron para capsaicina (10 μm)-evocó respuestas usando fluorescencia Ca2 + proyección de imagen. Barra de color indica cambios relativos en la intensidad de fluorescencia, con azul y rojo que denota la más baja y más alta citoplásmicas Ca2 +, respectivamente. Barra blanca representa 100 μm. (C) izquierda, (S5, poro helix, dominio S6 y TRP) de una subunidad de la estructura del tetrámero de TRPV1 destacando solo-cisteína residuos (esferas amarillas) que te presenten a lo largo de la secuencia de canales. Relaciones de derecho, voltaje de corriente determinadas por grabaciones TEVC de oocytes del Xenopus expresan TRPV1 WT, eTRPV1 y solo-cisteína mutantes con pH 5. Corrientes de fondo (bkgrd). Modificado del original de la figura26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Caracterización bioquímica de los mutantes eTRPV1 y solo-cisteína.
Perfil de cromatografía por exclusión de tamaño de solubilizado DDM eTRPV1 y solo-cisteína spin-labeled mutantes después de la expresión y purificación de las células Sf9. Inserción: Gel SDS-PAGE que muestra la proteína de fusión eTRPV1-MBP monomérica (modificada del original de la figura26). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Caracterización funcional de un mutante de eTRPV1 etiqueta de vuelta.
Relaciones de tensión de corriente determinaron por TEVC de Xenopus ovocitos microinyectados con proteoliposomes que contienen marcado con spin A702C desafió con pH 5 (rojo) y bloqueado por capsazepine (CPZ, azul: 40 μm). Corrientes de fondo (bkgrd). Modificado del original de la figura26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Movilidades de mutantes eTRPV1 marcado giro determinados por CW-EPR.
(A) dos subunidades (S5, poro helix, dominio S6 y TRP) de estructura tetrámero de TRPV1 destacando los residuos del aminoácido (esferas amarillas) explorados mediante espectroscopías de spin etiquetado sitio-dirigida. (B) primera derivada de espectros de EPR de CW de mutantes spin-labeled cisteína en solución de DDM. (C) primera derivada de espectros de EPR de CW de mutantes de cisteína spin-labeled reconstituidos en liposomas de asolectin. Los espectros fueron obtenidos a pH 7.4 (estado cerrada). ΔHo−1 denota la magnitud del parámetro de movilidad. La línea punteada negra destaca la ampliación de los espectros. Las flechas azules y rojas indican los componentes de campo baja y alta de los espectros, respectivamente. Espectros EPR se normalizaron al número total de etiquetas de la vuelta. Modificado del original de la figura26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Distribución de la distancia de un mutante eTRPV1 en detergente.
Eco de ciervo (A) y distribución de la distancia (B) del mutante de vuelta-etiqueta E651C; una suma de Gaussianas se ajustó a los datos de los ciervos. Reinicio denota la distribución de la distancia de los pares de vuelta41. Los espectros fueron obtenidos a pH 7.4 (estado cerrada). Modificado del original de la figura26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las tecnologías actuales para la expresión y purificación de proteínas de membrana mamíferos han hecho posible obtener una cantidad suficiente de proteína para estudios espectroscópicos14,15,16,42. Aquí, hemos adaptado estas tecnologías para expresar, purificar, reconstituir y realizar análisis espectroscópico en el TRPV1.

Entre los pasos críticos en el protocolo, a continuación son las que nos hemos Troubleshooter para TRPV1 y que puede ajustarse para otras proteínas. Modificar la secuencia del ADN para generar una plantilla que los rendimientos de 0.5 - 1 mg/mL de proteína purificada de detergente; plantillas que producen menos de 0.5 mg/mL de proteína son un reto, ya que crece más de 6 litros de cultivos de células de los insectos sería necesario por mutante. Proteína debe ser concentrado no menos de 2 mg/mL, sin TCEP para aumentar la eficiencia de centrifugado-etiquetado. Etiquetado en concentraciones bajas en proteína o en presencia de TCEP rastros generará ruidos espectros EPR. Aunque las proteínas se mantienen a 4 ° C durante la purificación, es imprescindible realizar etiquetado en RT para mejorar la eficiencia de la vuelta. Durante la purificación y el etiquetado, glicerol mejora la estabilidad de la proteína; sin embargo, debe ser completamente retirado antes de la reconstitución, ya que disminuye la cantidad de proteína en los liposomas y genera ruidos espectros EPR. Disminución de la concentración de detergente por debajo de la CMC es una práctica común durante la reconstitución; sin embargo, el TRPV1 tiende a precipitar antes de incorporar en los liposomas. Para resolver este problema, TRPV1 se incubó toda la noche con liposomas preformados en el CMC para evitar precipitación de la proteína y aumentar la cantidad de canales en la preparación de proteoliposome. TRPV1 es totalmente funcional en asolectin liposomas28; por lo tanto, era la mezcla de lípidos recomendado: utilizada en el presente Protocolo. Sin embargo, es esencial para determinar la composición de lípidos en la que una determinada proteína es funcional (p. ej., colesterol) antes de proceder al análisis espectroscópico.

Espectroscópico se acerca como EPR y ciervos presentan varias limitaciones, incluyendo: cambios en la secuencia de la plantilla de proteína que mejoran la estabilidad bioquímica podrían tener un impacto en la función26; introducción de cisteínas solo no nativos, así como la etiqueta de vuelta, no podría ser bien tolerado en algunas regiones de la proteína; obtención de grandes cantidades de proteínas marcadas; y los cambios conformacionales limitados al determinar distancias con ciervos en micelas de detergente. Sin embargo, la limitación de este último podría superarse por la recogida de los espectros en frecuencia de banda Q, de mutantes de TRPV1 reconstituido en nanodiscs19,43. Sin embargo, la ventaja de estos enfoques principalmente proviene el patrón de la dinámica global, accesibilidad y distancias más del valor absoluto de una determinada posición.

Sensibilidad de temperatura es uno de los más fascinantes y menos entendido bloquea mecanismos; por lo tanto, usando métodos espectroscópicos, es posible determinar cómo las proteínas de membrana traducen energía térmica en movimiento de la proteína en un entorno de membrana. Lo importante, sería un reto para determinar cambios estructurales durante la termal que bloquean utilizando Cristalografía de rayos x o cryo-EM, como estas técnicas se realizan a temperaturas de congelación. Experimentos futuros serán dirigidos hacia la determinación de que TRPV1 conformacional cambia compatible con térmica dependiente compuerta mediante EPR, ciervos o fluorescencia. Espectroscopia EPR ha proporcionado modelos mecanísticos detallados para canales del ion procariotas, por lo que esperar que mediante el uso de los protocolos descritos, obtenemos penetración en los mecanismos de activación y drogas-Unión de canales del ion mamíferos utilizando métodos espectroscópicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos muy agradecidos al Dr. H. Mchaourab para dar acceso a los espectrómetros de EPR y los ciervos y el Dr. T. Rosenbaum para proporcionar el plásmido de TRPV1 cisteína-menos completo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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Bioquímica número 137 vaniloides potencial transitorio del receptor 1 TRPV1 purificación reconstitución etiquetado spin espectroscopia del EPR espectroscopia de ciervos
Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico
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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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