Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Published: July 3, 2018 doi: 10.3791/57796
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

Summary

Denna artikel beskriver specifika metoder för att få biokemiska mängder rengöringsmedel-solubilized TRPV1 för spektroskopisk analys. De kombinera protokollen ger biokemiska och biofysiska verktyg som kan anpassas för att underlätta strukturella och funktionella studier för däggdjur jonkanaler i membranet-kontrollerad miljö.

Abstract

Polymodal jonkanaler transduce flera stimuli av olika naturer Alloster förändringar; dessa dynamiska konformationer är utmanande att avgöra och förbli i stort sett okända. Senaste framstegen inom singel-particle kryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) sprider ljus på strukturella drag hos agonist bindningsställen och aktivering mekanism av flera jonkanaler, är scenen inställd för en dynamisk djupanalys av deras gating mekanismer med spektroskopiska metoder. Spektroskopiska tekniker såsom elektron paramagnetiska resonans (EPR) och dubbel elektron-elektron resonans (hjort) har huvudsakligen begränsats till studiet av prokaryota jonkanaler som kan renas i stora mängder. Kravet på stora mängder funktionell och stabil membranproteiner har försvårat studiet av däggdjur jonkanaler med hjälp av dessa metoder. EPR och rådjur erbjuder många fördelar, inklusive fastställandet av strukturen och dynamiska förändringar av mobila protein regioner, om än i låg upplösning, som kan vara svårt att få av röntgenkristallografi eller cryo-EM, och övervakning reversibel gating övergång (dvsstängd, öppen, sensibiliserade och okänsliggjorda). Här tillhandahåller vi protokoll för att erhålla milligram för funktionella tvättmedel-solubilized övergående receptor potentiella ering kanal underfamilj V medlem 1 (TRPV1) som kan vara märkt för EPR och rådjur spektroskopi.

Introduction

Senaste framstegen inom singel-particle kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), har däggdjur ion kanal strukturer erhållits i en enastående takt. Särskilt, har strukturella studier av polymodal jonkanaler, såsom den transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), gett ytterligare förståelse av dess aktivering mekanismer1,2,3, 4 , 5. dynamisk information om jonkanaler som är inbäddade i membranet miljö krävs dock att förstå deras polymodal Usenets och drog-bindande mekanismer.

Electron paramagnetiska resonans (EPR) och dubbel elektron-elektron resonans (hjort) spektroskopier har gett några av de mest slutgiltiga mekanistiska modellerna för ion kanaler6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. dessa tillvägagångssätt har varit främst begränsad till en undersökning av prokaryota och archeal ion kanaler som ger en stor mängd tvättmedel-renade proteiner när i ökad utsträckning hos bakterier. Med utvecklingen av eukaryota membranet proteiner produktion i insekt och däggdjursceller för funktionella och strukturella karakterisering14,15,16är det nu möjligt att få biokemiska mängder av tvättmedel-renade proteiner för spektroskopiska studier.

EPR och rådjur signalerna uppkommer en paramagneticspin etikett (SL) (dvs., methanethiosulfonate) till en enda-cysteinrest i proteinet. Spin-etiketterna rapportera tre typer av strukturell information: rörelse, accessibilities och avstånd. Den här informationen för att avgöra om rester är begravda inom proteinet eller är utsatt för membran eller vattenlösning miljö i apo och ligand-bundna staterna13,17,18,19. I samband med en högupplöst struktur (om tillgängligt), ger uppgifter om EPR och rådjur en uppsättning begränsningar för att få fram dynamiska modeller i deras infödda miljö medan övervakning reversibel Usenets övergången (dvsstängd, öppen, sensibiliserad, och okänsliggjorda). Dessutom kunde flexibla regioner som kan vara svårt att avgöra av röntgenkristallografi eller cryo-EM erhållas genom att använda dessa miljömässiga datamängder för att tilldela sekundära konstruktioner samt läge inom protein20. Cryo-EM erhållits i lipid nanodiscs förutsatt värdefull information om den gating Ion kanaler3,21,22,23,24, 25; spektroskopiska metoder kunde dock dynamisk information från konfirmerande påstår (t.ex., termiska förändringar) som kan vara svårt att avgöra med hjälp av cryo-EM.

Många svårigheter måste övervinnas för att genomföra EPR och rådjur, inklusive brist på proteinfunktion när du tar bort alla cystein restsubstanser (särskilt riklig i däggdjur kanaler), låg protein avkastning, protein instabilitet under reningen och efter spin märkning , och protein aggregation i rengöringsmedel eller liposomer. Här har vi utformat protokoll att övervinna dessa kritiska hinder och erhållit information om rådjur och EPR spectra för ett däggdjur sensoriska receptorer. Syftet här är att beskriva metoder för uttryck, rening, märkning, och beredning av en funktionell minimal cystein-mindre råtta TRPV1 (eTRPV1) konstruera för spektroskopiska analyser. Denna metod är lämplig för dessa membranproteiner som behålla sin funktion trots avlägsnande av cystein rester eller som innehåller cystein bilda disulfide-obligationer. Denna samling av protokoll kan anpassas för spektroskopisk analys av andra däggdjur jonkanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TRPV1 mutagenes

Obs: En minimal TRPV1-konstruktion för spektroskopianalyser26 byggdes från kanalen fullängds cystein-mindre TRPV127 metoden polymeras-kedjereaktion (PCR) (figur 1). Denna cystein-mindre minimal TRPV1 konstruktion (kallad eTRPV1 nedan) består av rester 110-603 och 627-764. eTRPV1 har klonats i pMO (en pcDNA3.1-baserade vektor) för funktionell analys och i en rekombinant givare vector28 innehållande 8 x histidin-maltos-bindande protein (MBP)-tobak etch virus (TEV) för uttryck och rening (figur 2A). eTRPV1 enda–cystein mutanter genererades med hjälp av plats-riktad mutagenes. Vektor- och kanal sekvenser anges i den kompletterande fil 1: kompletterande metoder.

  1. Design mutagenes grundfärger med onlineverktyg29.
  2. Blanda i en 0,2 mL tub: 5 μL 10 x reaktion buffert, 1 μL av dNTP mix (100 mM), 1 μL varje 10 μM framåt och bakåt oligonukleotider, 1 μL av 100 ng/μl eTRPV1 mall DNA26, 1,5 μL av DMSO, 1 μL av mutagenes enzym , och 38,5 μl avjoniserat vatten. Snurra blandningen innan du placerar rören i termocyklern.
  3. Utför PCR mutagenes.
    1. Utföra a denaturering vid 95 ° C i 2 min, (b) denaturering vid 95 ° C i 20 s, (c) glödgning vid 60 ° C för 10 s och d töjning vid 68 ° C under 4 minuter (30 s per 1 kb). Upprepa steg b till d för 18 cykler, och sedan utför töjning vid 68 ° C i 5 min och underhålla reaktionen vid 4 ° C tills vidare användning.
  4. Tillsätt 2 μL av Dpnjag enzym till reaktion; Blanda och sedan Inkubera vid 37 ° C i 30 min.
  5. Utföra omvandlingen
    1. Tina E. coli behöriga celler på is.
    2. Till ett nedkylda 14mL sterilt rör, lägga 75 μL av behöriga celler och 10 μL av Dpnjag-behandlade PCR-blandning. Blanda försiktigt.
    3. Inkubera reaktion på is för 30 min. underhåll tuben vid 42 ° C i 45 s och omedelbart placera det på is för 2 min. plattan blandningen på Luria buljong (LB)-agarplatta som innehåller carbenicillin (0,2 mg/mL). Inkubera plattan över natten vid 37 ° C.
    4. Skörda minst tre enda kolonier från plattan och Inokulera varje i 4 mL LB som innehåller carbenicillin (0,2 mg/mL) med ett 14-mL sterilt rör. Inkubera kulturer över natten vid 37 ° C och skaka vid 250 rpm.
    5. Snurra ner över natten kulturer vid 8000 x g i 10 min och extrahera DNA följa instruktionerna för kommersiellt tillgängliga mini förberedelser kit.
    6. Kontrollera förekomsten av singel-cystein mutanter av standard automatiserad DNA-sekvensering (se Tabell för material).

2. funktionell analys av eTRPV1 och singel-cystein mutanter

  1. HEK293 cell linje transfection 30
    1. Kultur HEK293 celler i 6 - plattor i 2 mL hög glukos medium (DMEM) per brunn (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). Förbered HEK293 celler som är 70 \u2012 80% konfluenta.
    2. Förbereda transfection blandningen i två separata 1,5 mL mikro-centrifugrör.
      1. För reaktion A, lägga till 0,5 µg eTRPV1 eller cystein mutant-innehållande pMO 250 µL av väsentliga minimalmedium (e.g. Opti-MEM). För reaktion B, tillsätt 3 µL transfection reagens till 250 µL av väsentliga minimalmedium. Inkubera varje reaktion under 5 minuter i rumstemperatur (RT).
      2. Blanda reaktioner A och B med en 1 mL pipett. Inkubera blandningen för 45 min på RT.
    3. Ta bort 500 µL av kultur media från den 70-80% konfluenta väl och tillsätt 500 µL av reaktionsblandningen. Lagra plattor över natten för Ca2 + imaging (37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet).
  2. Ca2 + imaging i HEK293 celler 30
    1. Rengöra 12-mm diameter glas coverslips med etanol och vatten och placera dem i en 24-bra platta.
    2. Tillsätt 75 µL av poly-l-lysin i mitten av varje täckglas och förvara plattan för 45 min (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
    3. Ta bort den överskjutande poly-l-lysin och tvätta coverslips tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att ta bort alla överblivna.
    4. När coverslips är redo, fortsätta att lossa cellerna från 6-väl plattan.
    5. Ta bort media och tillsätt 500 µL av varma PBS (37 ° C) för tvätt.
    6. Ta bort PBS, tillsätt 500 µL av trypsin och inkubera i 1 min.
    7. Tillsätt 500 µL av varma kultur media (37 ° C) stoppa matsmältningen reaktionen och blanda med pipetten; undvika bildar bubblor. Justera cellkoncentrationen späda denna resuspension med mer kultur media vid behov.
    8. Utsäde 250 µL av transfekterade HEK293 celler (70% konfluenta) plus 250 µL av kultur media (500 µL slutliga volym per brunn) på den förbehandlade coverslips och låta dem bosätta sig (för fastsättning) för 1-2 h i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet).
    9. Under tiden förbereder en lastning lösning genom att lägga till 0,02% pluronic syra och 1 µM Fluo-4-AM till en Ringers buffert. Blanda lösningen väl.
    10. Ta bort HEK293 kulturmassmedia från brunnen och tillsätt 500 µL av lastning lösningen. Inkubera cellerna för 1 h (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). Tvätta Fluo-4-loaded cellerna två gånger med varma Ringers buffert.
    11. Placera ett täckglas med laddade celler i en 10 mm petriskål i ett Mikroskop skede (med en 10 X mål; 494 nm excitation och 506 nm utsläpp) för att utföra intracellulära Ca2 + mätningar.
    12. Mäta förändringar i fluorescensintensiteten efter startas respektive ligander (t.ex., 10 μM capsaicin) med hjälp av kommersiellt tillgängliga program (se Tabell för material).
  3. mRNA och Xenopus laevis oocyter förberedelse 30
    1. Linjär eTRPV1 och singel-cystein mutanter-innehållande pMO med Pmejag för 1 h vid 37 ° C. Rena DNA följa instruktionerna för kommersiellt tillgängliga rening kit.
    2. Användning linearized och rengöras DNAs för att syntetisera utjämnade RNAs med en kommersiellt tillgänglig kit som är kompatibel med T7 RNA-polymeras.
    3. Ren tak RNAs enligt kommersiellt tillgängliga rening kit. Kvantifiera mängden RNA genom att mäta absorbansen vid 260 nm våglängd.
    4. Överföring 5 \u2012 10 mL X. laevis oocyter (kommersiellt tillgängligt) till en 50 mL konisk rör innehållande 20 mL ND96 lösning (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2; pH 7,4) med 1 mg/mL kollagenas och nutate för 50 min på RT.
    5. Skölj oocyterna i ND96 tills lösningen är klar; lägga till färska kollagenas och skaka i 30 min på RT. undersöka oocyterna i stereo Mikroskop och stoppa matsmältningen när det yttre follikulära lagret (glansigt skikt med röda blodkärl) är frånvarande i de flesta oocyter (90%). Skölj oocyter i ND96 tills lösningen är klar.
    6. Överföring oocyter till en 50 mL polystyren röret med ND96 plus 1 mM CaCl2 och skaka om under 1 h. Under-rötas oocyter kommer att hålla sig till polystyren röret.
    7. Tvätta oocyter med ND96 plus 1 mM CaCl2 och tillägg lösning 50 µg/mL gentamicin och 50 µg/mL tetracyklin.
      Obs: Skydda lösningar som innehåller tetracyklin från ljusexponering.
    8. Välj stora oocyter utan skadade membran och visar en tydlig åtskillnad mellan djur och vegetabiliska polacker. Låt oocyter återvinna för 4 h innan Mikroskop vid 16 ° C.
    9. Använd glas pipetter (Ytterdiameter: 1.11 mm, innerdiameter: 0,5 och längd 8,8 cm) att injicera 1-5 ng mRNA från eTRPV1 och singel-cystein mutanter i oocyter med hjälp av ett nliter-injector system (46 nL/s) och stereo Mikroskop (2 X förstoring). Lagra oocyter vid 16 ° C i ND96 kompletteras med CaCl2 och antibiotika (gentamycin/tetracyklin 1 x).
    10. Efter 72 h, mäta makroskopiska ström använder en två-elektrod spänning-clamp (TEVC) förvärv system31.
    11. Dra borosilikatglas pipetter (0.3 MΩ) och fyll dem med 3 M KCl.
    12. Placera äggcellen i inspelning kammaren med överföring pipett och BEGJUTA bad lösningen (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA och 10 mM HEPES lösning, pH 7,4) på låg hastighet.
    13. Fördjupa båda elektroderna i Bad lösningen att justera deras pipett förskjutningar. Tryck försiktigt pipett elektroderna (borosilikatglas pipetter; Ytterdiameter: 1,5 mm, innerdiameter: 1.10 och längd 10 cm) in i äggcellen tills en liten inbuktning observeras under en stereo Mikroskop (2 X förstoring), samt en förändring i membranpotentialen.
    14. Ändra inställningarna för förstärkare till inspelning läge och mått makroskopiska strömmar samtidigt som en spänning-clamp ramp från -80 till + 80 mV för 1 s. Last perfusion systemet med den lösning som används i steg 2.3.12 vid pH 7,4 (som kontroll) och vid pH 5 Kontrollera eTRPV1 aktivitet.

3. genererar de rekombinant Bacmid och baculoviridae för proteinuttryck

  1. Bacmid
    1. Omvandla 100 μL av DH10Bac E. coli behöriga celler med 7,5 ng av rekombinant givare vektor som innehåller eTRPV1 och/eller singel-cystein mutanter.
    2. Tillsätt 900 μl av SOC media (20 mg/mL trypton, 5 mg/mL jäst extrakt, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4och 20 mM glukos) och inkubera i 6-7 h vid 37 ° C och 225 rpm.
    3. Utsäde 100 µL direkt från blandningen och seriella utspädningar (1/10 och 1/100), i LB-agarplattor som innehåller 100 μg/mL X-gal, 40 μg/mL IPTG, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin och 50 μg/mL kanamycin. Inkubera plattorna under minst 48 timmar vid 37 ° C.
    4. Markera vita kolonier som är 2 mm i diameter, eftersom blå kolonier saknar insatsen av intresse. Använda ett stereo Mikroskop för att verifiera att vita kolonier inte innehåller några blå fläckar.
    5. Skörda minst tre enda kolonier och överföra dem i en 14 mL sterilt rör innehållande 4 mL LB media kompletteras med 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin och 50 μg/mL kanamycin. Inkubera cellerna över natten (~ 16 h) vid 37 ° C och 250 rpm.
    6. Ta 1,5 mL av övernattning kulturer och isolera rekombinant bacmid DNA (se den kompletterande fil 1 för detaljerade protokoll). Lagra bacmid vid 4 ° C i upp till två månader.
      Obs: Förbereda glycerol bestånden av DH10Bac E. coli som innehåller bacmid DNA. Ta 300 μL av kultur och tillsätt 200 μl glycerol på 50% (slutliga glycerol koncentration av 20%). Lagra alikvoten vid-80 ° C tills vidare användning.
    7. Kontrollera förekomsten av eTRPV1 i den rekombinant bacmid med PCR (se kompletterande fil 1 för detaljerade protokoll).
  2. Baculoviridae
    Obs: För detta förfarande, transfect Sf9 insekt celler i ett 6-väl format. Alla belopp och volymer ges på basis av per-väl. Undvika användning av antibiotika.
    1. Tallrik 1 x 106 Sf9 celler i 2 mL insekt cell media. Tillåta celler att fästa för minst 45 min.
    2. Späd 1 μg av rekombinant bacmid DNA i 100 μL av insekt cell media. Blanda försiktigt.
    3. Späd 6 μL transfection reagens (TR) i 100 μL av insekt cell media. Blanda försiktigt.
    4. Kombinera de DNA och TR lösningarna (från steg 3.2.2 och 3.2.3, respektive). Blanda försiktigt och inkubera i 30 min på RT.
    5. Tillsätt 0,8 mL insekt cell media till DNA/TR blandningen. Blanda försiktigt.
    6. Ta bort insekt cell media från Sf9 cellerna och tvätta en gång med 1 mL färsk medium.
    7. Ta bort tvätta medium och tillsätt DNA/TR blandning (3.2.2 \u2012 3.2.5) till cellerna. Inkubera cellerna vid 27 ° C i 5 h (utan upprördhet).
    8. Bort transfection blandningen och ersätter med 2 mL av insekt cell media som innehåller 0,5% fetalt bovint serum (FBS). Inkubera cellerna vid 27 ° C i fem dagar.
      Varning: Förhindra avdunstning av cell media genom att fylla de tomma brunnarna med media och som täcker 6-väl plattan med två lager paraffin film.
    9. Överföra cell kulturmassmedia i en 15 mL centrifugrör. Isolera första passagen (P1) av viral lager genom att snurra röret vid 8000 x g i 15 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till en ren 15 mL centrifugrör och omedelbart spara det vid 4 ° C.
      Obs: Skydda viruset från ljus exponering genom att täcka röret med aluminiumfolie.
    10. För den andra generationen (P2) av viral lager, sätta en 25 mL suspension kultur av insekt cell media på 1 x 106 Sf9 celler/mL innehållande 2% FBS in 125 mL-kolv (vanligt botten och ventilerade). Tillsätt 25 μL av P1 viruset till 25 mL kultur.
    11. Inkubera kulturen vid 27 ° C i 72 h.
    12. För att skörda P2 viral beståndet, överföra kulturen till en ny 50 mL tub och centrifugera det 8000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
    13. Överför supernatanten till en ny 50 mL tub och omedelbart spara det vid 4 ° C.
      Obs: Skydda viruset från ljus exponering genom att täcka röret med aluminiumfolie. Utföra ett småskaligt experiment att titrera P2 virus/Sf9 förhållandet för optimal TRPV1 uttryck (se kompletterande fil 1 för ett detaljerat protokoll, avsnitt 4 med titeln ”småskaligt experiment för P2 virus”.)
    14. Ange en 1-L Sf9 cellkultur fjädring på 2 x 106 celler/mL i insekt cell media kompletteras med 0,5% för storskaliga proteinuttryck, FBS i en 2,8-L borosilikatglas kolv.
    15. Tillsätt 1 mL P2 virus lager 1-L kultur och inkubera det vid 27 ° C i 72 h.
      Obs: På den tredje dagen, cell densiteten bör vara cirka 1,5 till 2,5 x 106 celler/ml.

4. eTRPV1 och singel-cystein Mutant rening

  1. Membran isolering28
    1. Skörden 1-L insekt suspension cellkulturen av spinning på 4500 x g, 4 ° C, för 20 min. väger cellpelleten (det förväntas vara ca 6-9 g).
    2. Återsuspendera cellpelleten i 25 mL iskallt buffert A (36,5 mM sackaros, 2 mM tris(2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) och 50 mM Tris; pH 7,4) i närvaro av proteashämmare (1 mM phenylmethyl sulfonyl fluor (PMSF), 3 μg/mL leupeptin, 3 μg/mL aprotinin och 1 μg/mL pepstatin). Dela upp cell klumpar för att erhålla en homogen suspension och rotera vid 4 ° C i 20 min.
    3. Bryta de celler som använder en manuell (dounce vävnad kvarnen) eller en högtrycks Homogenisatorer. Ta bort cellfragment genom centrifugering vid 8000 x g i 20 min vid 4 ° C.
      Obs: Håll lyserat celler och rören på isen under hela processen.
    4. Samla in supernatanten och centrifugera vid 100 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten membran i en total volym på 20 mL iskallt buffert B (150 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES pH 7,4), kompletterad med proteashämmare (som i steg 4.1.2).
    5. Alikvotens 20 mL membran fjädring i 50 mL rör och flash-frysa i flytande kväve. Lagra prover vid-80 ° C tills vidare användning.
  2. Protein rening26,28
    1. Tina de membran alikvoter på is och tillsätt 3 mL n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per rör (200 mM lager). Vrid röret för 2 h vid 4 ° C.
    2. Centrifugera provet vid 100 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Samla in supernatanten och tillsätt 1 mL ren våt amylose kåda. Rotera blandningen för 2 h vid 4 ° C. Ladda protein/amylose blandningen i gravitation flöde kromatografi kolonner.
      Varning: Tillåt inte kådan torka under tvättar.
    3. Tvätta proteinbundet amylose kådan med 10 gånger de säng volymerna av iskall buffert C (150 mM NaCl, 10% glycerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, 0,5 mM TCEP; pH 7,4). Tvätta med 10 bed volymer av iskall buffert D (150 mM NaCl, 10% glycerol, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/mL asolectin, pH 7,4).
      Obs: Före tvätten, degas buffert D utan tvättmedel eller lipider, rensning med kväve. Efter degasification, lägga till DDM och asolectin.
    4. Eluera eTRPV1 protein med 0,5 mL fraktioner, upp till 5 mL, iskall avgasas buffert D, kompletterat med 20 mM maltos. Om möjligt, utföra tvättar och eluering vid 4 ° C.
    5. Kvantifiera mängden protein genom att mäta absorbansen vid 280 nm våglängd.
      Obs: Detta protokoll ger 0,5-1,0 mg protein per liter av kultur. Protein avkastningen kan variera för varje eTRPV1 singel-cystein mutant. För EPR och rådjur experiment, växa 4 \u2012 6 L av kultur.

5. eTRPV1 Single-cystein Mutant Site-Directed snurra märkning

  1. Koncentrera sig på eTRPV1-innehållande fraktioner med en centrifugal filterenhet (cutoff = 100 kDa) upp till 2 \u2012 2,5 mg/mL för märkning (cykler av 7 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C).
  2. Lägga till en 10-faldig molar överskott (3 gånger, varje 30 min) av (1-oxyl-2,2,5,5-tetra-methylpyrrolidin-3-yl) metyl methanethiosulfonate (MTSSL) spin etikett från 100 mM stamlösning i DMSO till det koncentrerat proteinet (eTRPV1 monomer: MTSSL i 1:10 molar förhållandet) 17. hålla reaktionen i mörkret på RT för 1 h 30 min, följt av natten inkubation vid 4 ° C.
    Obs: I det här steget MBP kunde tas bort genom att lägga till TEV proteas under natten spin-märkning ruvning.
  3. Load spin-märkt eTRPV1 på en storlek utslagning kromatografi kolumn jämviktas i buffert E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7,4), kontrolleras av ett snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system. Samla in fraktioner som innehåller eTRPV1 tetramer.
    Notera: Inkludera inte 10% glycerol i det här steget eftersom det minskar beredning effektivitet.
  4. Kvantifiera mängden protein genom att mäta absorbansen vid 280 nm våglängd.
  5. Utvärdera renheten i provet genom att köra en SDS-PAGE gel (fläck-fri gel, 4 \u2012 20%). Provet är nu redo för spektroskopiska mätningar i lösningen och/eller proteoliposomes.

6. eTRPV1 Spin-märkt enda cystein Mutant beredning

  1. Torka 10 mg av asolectin med en rotationsindunstare under vakuum (≤100 mbar) för 1 h vid 40 ° C. Att göra asolectin liposomer, tillsätt 1 mL buffert F (200 mM NaCl, 5 mM moppar; pH 7,4) och Sonikera blandningen i 15 min eller tills provet är homogen.
  2. Destabilisera liposomer genom att lägga till DDM till en slutlig koncentration på 2 mM och inkubera i 30 min på RT.
  3. Koncentrera sig märkta proteinet vid 2 mg/mL och lägga till den i liposomer med förhållandet 1:5 protein/Lipid (vikt: vikt).
    Varning: Det är viktigt att hålla de ovannämnda protein koncentrationerna, eftersom spin-märkning effektivitet minskar vid låga koncentrationer och hög proteinet kanske fällningen.
  4. Lägg till buffert F för att justera protein/Liposom blandningen i DDM kritiska micelle koncentrationen (CMC) och inkubera över natten vid 4 ° C med försiktig skakning.
  5. Dubbla volymen av protein/Liposom blandningen med buffert F och ta bort rengöringsmedel genom att sekventiellt lägga tre portioner av nonpolar polystyren adsorbent pärlor (30 mg, 50 mg och 80 mg) 1-h mellanrum med försiktig skakning på RT.
  6. Lägg blandningen på ett kolumnfilter (gravitation flöde kromatografi kolumn) ta bort pärlorna och överföra proteoliposomes blandningen till en ultracentrifugen röret. Centrifugera proverna vid 100 000 x g för 1 h vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 30 μL buffert F.
    Obs: Prover är redo för spektroskopiska analyser och injektion i Xenopus oocyter. Om proverna inte kan användas samma dag, flash-frysa dem i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C.
  7. Proteoliposomes -Xenopus äggcellen elektrofysiologi26,publiceringsrättigheter för32
    1. Injicera 50 nL av olika spädningar av spin-märkt proteoliposomes i Xenopus oocyter som beskrivs i avsnitt 2.2.
    2. Utföra TEVC mätningar efter 12 h injektionsstället som beskrivs i avsnitt 2.3.10.
  8. Fortsätt att utföra spektroskopiska mätningar och analys (avsnitt 7).

7. rådjur och EPR spektroskopier

  1. Dubbelrum elektron-elektron resonans (hjort) spektroskopi.
    1. Utför rådjur mätningar i en pulsad EPR spektrometer Q-band frekvens (34 GHz) på och utrustad med en 10-W förstärkare med de döda-tid gratis fyrpulssekvens vid 83° med tillverkaren programvara33.
    2. Tillägg 50 µM av tvättmedel-renat eTRPV1 spin-märkt cystein mutanter i buffert E (steg 5,5) med 30% (v/v) glycerol för cryo-skydd.
    3. Läsa in provet i en sluten kvarts kapillärrör och snurra till botten av röret genom kort låg hastighet centrifugering (100 x g).
    4. Placera kapillärröret i flytande kväve att frysa provet. Proverna kan lagras på denna punkt vid-80 ° C för senare mätning.
    5. Placera provet direkt i mikrovågsugn resonator och låt det åter temperera-83 ° för 10 \u2012 20 min.
    6. Mäta provet med en fyra-pulse rådjur standardprotokoll, (π/2) mw1 – τ1 – (π) mw1 – τ1 – (π) mw2 – τ2 – (π) mw1 – τ2 – echo34. Pulse längderna för (π/2) mw1 och (π) mw1 är 10-20 ns, respektive, och 40 ns för (π) mw2. Ställ in frekvens separationen på 63 MHz.
      Obs: Primära rådjur decay data kan analyseras med en hembyggda programvara (t.ex. i Matlab) som förutsätter en summa av Gaussiska fördelningar att beskriva avstånden mellan spin etiketter19,35.
  2. Continuous-Wave (CW) EPR spektroskopi
    1. Utföra CW EPR experiment på RT på en X-band (9,6 GHz) spektrometer med hjälp av tillverkarens programvara.
    2. Starta instrumentet genom att vrida på med vatten kylmaskin, konsolen och strömförsörjningen magnet. Anslut programvaran till instrumentet, placera instrumentet i samklang och vänta minst 30 min för instrumentet att värma upp.
    3. Ladda 20 µL av provet från steg 5,5 till ett 25-µL glas kapillärrör med hjälp av kapillärkraften och försegla i slutet av röret med tätningsmedel.
    4. Ladda kapillärröret i mikrovågsugn kaviteten och kritiskt par resonator antingen manuellt eller automatiskt med funktionen auto-tune av programvaran.
    5. Samla in de första härledda spectrana standardinstrument villkor: 100 kHz mikrovågsugn modulering, 1,6 G magnetfält modulering och 10 mW-mikrovågseffekt.
    6. För dataanalys och presentation, korrigera spektra mot bakgrund och normalisera dem genom att dividera spektra med peak-to-peak värdet av Dubbelintegral.
    7. Bestämma spin-etikett rörlighet genom att mäta inversen till central-linjebredden på den första derivata Absorptionsspektra (ΔHo-1)36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Funktionell karakterisering av Minimal cystein-mindre TRPV1 konstruera (eTRPV1) och Single-cystein mutanter

Det första steget mot spektroskopiska studier är att ingenjör och karakterisera cystein-mindre protein konstruktioner (figur 2A) som är funktionella och ger biokemiska mängder proteiner. eTRPV1 är funktionell som bestäms av Ca2 + imaging och TEVC (figur 2B-C). Dessutom eTRPV1 ger tillräckliga mängder rengöringsmedel-renat protein för EPR och rådjur experiment (0,5 - 1 mg per liter Sf9 celler)26. Att införa enda cysteines i visst protein regioner kan påverka deras funktion. Figur 2B visar några exempel på singel-cystein mutanter (E651C och A702C) på eTRPV1 som beter sig som vildtyp (WT), eftersom deras fluorescensintensitet ökar när TRPV1-agonist (t.ex., capsaicin) läggs till eTRPV1 innehållande HEK293 celler, som framgår av Ca2 + imaging26. Å andra som A680C det typiska exemplet på en icke-funktionella cystein mutant, fluorescensen är omöjlig att skilja från bakgrunden. A680C mutant var uteslutet för vidare analys. Efter Ca2 + imaging experiment, provas singel-cystein mutanter funktion med TEVC eller patch clamp för att utvärdera deras biofysiska egenskaper. Figur 2 c visar att mutanter recapitulate utåt rättelse kännetecknar TRPV1 när utmanas med pH 5, som bestäms av TEVC26. Funktionella analyser av singel-cystein mutanter är den första kontrollpunkten innan protokollen uttryck och rening.

Biokemisk karakterisering av eTRPV1 och singel-cystein mutanter

Rening protokollet beskrivs ovan ger tvättmedel-solubilized protein som kan vara märkt via cystein kovalent modifiering (t.ex., fluorophores, spin-märkt [SL] metyl-methanethiolsulfonate) längs TRPV1 sekvensen för spektroskopiska analyser. Minimal TRPV1 kanal-innehållande rester av cystein migrera som stabil och monodisperse arter (~ 13,6 mL), som bestäms av storlek-utslagning kromatografi (figur 3). eTRPV1 och singel-cystein spin-märkt mutanter (E651C-SL och A702C-SL) sammanfatta eluering profil och stabiliteten av den minimala TRPV1 konstruktion (figur 3)26. Eluering profilen kan variera mellan olika mutanter, som enda cysteines kan påverka protein stabilitet. I vissa fall bildar mutanter aggregat; och en bråkdel av provet kunde eluera med ogiltiga volym i kolumnen (8-9,5 mL), att minska mängden protein som migrerar som en tetramer (figur 3, botten röd pil). I det här fallet kan cell kulturvolymer skalas upp för att kompensera för det protein som förlorade i den aggregerade fraktionen, eller en kan utesluta denna mutant från ytterligare analys och fortsätta att testa det angränsande rest. Andra exempel är en breddning av den topp som motsvarar tetramer. Huvudtoppar bredare än 3 mL rekommenderas inte för spektroskopisk analys, eftersom de innehåller multi-skingra arter. Biokemisk karakterisering av spin-märkt singel-cystein mutanter är den andra kontrollpunkten innan företaget beredning och spektroskopiska analyser.

Funktionell karakterisering av rekonstituerad Spin-märkt eTRPV1 Single-cystein mutanter

Eftersom EPR och rådjur signalerna är beroende av tillbehöret av en paramagnetiska spin-etikett till en cysteinrest, är det viktigt att kontrollera om platsen för spin-etiketten förändrar proteinfunktion. I området i närheten finns det flera sätt att testa funktionen efter beredning av spin-märkta proteinet, inklusive planar lipid lipidens experiment, patch clamp och TEVC. TEVC tillåter utvärdering av ett stort antal spin-märkt kanaler medan du spelar in makroskopiska strömmar. För att utvärdera funktionaliteten i spin-märkt singel-cystein mutanter, är kanaler ombildade i redan bildade asolectin liposomer. Under detta steg är det viktigt att utesluta 10% glycerol som är närvarande under hela rening, eftersom glycerol minskar effektiviteten i protein beredning i liposomer. Figur 4 visar ett representativt resultat av A702C-SL TRPV1 beredas i asolectin liposomer och microinjected i Xenopus oocyter. Som förväntat, framkallar pH 5 robust utåt tillrättaläggande strömmar37 som blockeras av samtidig tillämpning av TRPV1-antagonist capsazepine (CPZ, blå spår)26. Mutanter som inte behåller funktionaliteten efter spin märkning och beredning bör undantas från ytterligare analys. Funktionell karakterisering av rekonstituerade spin-märkt singel-cystein mutanter är den tredje kontrollpunkten innan företaget spektroskopiska analyser.

Strukturella Dynamics av Spin-märkt eTRPV1 mutanter övervakas av CW-EPR och rådjur

Nitroxide spin etiketter är känsliga för omgivande miljö och flexibiliteten i protein ryggraden som etiketten är kopplad17. Därav, CW-EPR tillåter bestämning av dynamisk regimen av en given spin-märkt cystein; nämligen är positioner utsätts i vattenhaltigt medium eller membranet mer dynamisk än de begränsas till protein-protein interaktioner17. Figur 5A visar position Glu651, Ile679 och Ala702 i TRPV1 valt att övervaka rörlighet parametrar. För att beräkna parametern rörlighet av spin etikett sonden, beräknar en inversen till central-linjebredden på de första derivat Absorptionsspektra (figur 5B, svarta linjen ΔHo−1). Exempelvis visar E651C-SL (figur 5B) en spektral form och rörlighet Radvärde (0,24) vanligt förekommande på dynamiska positioner på den membran gränssnitt26. Å andra I679C-SL och A702C-SL uppvisar breddning av spektra (se streckade linjerna) och en minskning av rörlighet värdena (0,16 och 0.18, respektive; Figur 5B) 26 som överensstämmer med deras begränsade omgivande miljö (protein-protein), enligt den cryo-EM struktur1.

Figur 5 c visar spektra av spin-märkt TRPV1 mutanter efter beredning i asolectin liposomer. Som förväntat, ändras funktionerna för dynamiskt av spectrana för E651C-SL och A702C-SL inte efter beredning, som deras form och rörlighet värden är samma lösning som i en membran miljö26. Å andra illustrerar I679C-SL en bullrig spektrumet. Följaktligen blivit den nedre (blå pil) och högre (röd pil) fältet komponenter mindre uppenbara. Bullriga spectra är inte vanligtvis önskvärd, eftersom de tenderar att underskatta rörligheten för spin-märkt position. Spektrum kan vara produkten av ineffektiva protein beredning i stället för att under-märkning, eftersom I679C-SL signalen i lösning är robust.

RÅDJUR är en summa av oscillerande, sinusformad signal förfaller som innehåller information om avstånd fördelningen av samverkande spin-etiketter38,39. Den perioden och komplexiteten av förfalla återspeglar direkt underliggande avstånd distribution. Avstånd distribution består av antalet strukturella komponenter i provet och sin sjukdom. Därför tid-domän signalen härrör från den tvåpolig andrigidly koppling mellan icke-fast, avlägsen spin etiketter i lösning som brukar orsaka en exponentiell bakgrund förfall, och tillsammans spins inom samma protein19,40. Specifikt, tillåter rådjur bestämning av intra-protein långväga avstånd (20-70 Å) mellan spin-märkta rester19. Figur 6 visar signal förfalla och motsvarande avstånd fördelningen av E651C-SL. Fördelningen av Glu651 visar tre toppar motsvarar 24, 36 och 58 Å26. De två kortare sträckor är förenliga med den stängda TRPV1-strukturen (23 och 32 Å för den Cβ-Cβ avstånd, respektive)1, medan den tredje 58 Å toppen kan motsvara protein aggregering.

Figure 1
Figur 1. Experimentell disposition. Diagram över experimentell dispositionen krävs att uttrycka, rena och rekonstruera eTRPV1 för EPR och rådjur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Funktionell karakterisering av eTRPV1 och singel-cystein mutanter. (A) Schematisk framställning av TRPV1 konstruktioner används för spektroskopisk analys (eTRPV1: cystein-mindre TRPV1 110-603/627-764). (B) HEK293 celler uttrycker WT TRPV1, eTRPV1 och mutanter (lastad med Ca2 +-känsliga Fluo-4-AM) analyserades för capsaicin (10 µM)-framkallat svar med hjälp av fluorescens Ca2 + imaging. Color bar anger relativa förändringar i fluorescensintensiteten, med blått och rött som betecknar den lägsta och högsta cytoplasmiska Ca2 +, respektive. Vita fältet representerar 100 µm. (C) vänster, en subenhet (S5, pore helix, S6 och TRP domän) av TRPV1 tetramer struktur belyser singel-cystein rester (gula sfärer) infördes längs kanalen sekvensen. Höger, ström-spänning relationer bestäms av TEVC inspelningar från Xenopus oocyter uttrycker WT TRPV1, eTRPV1 och singel-cystein mutanter utmanas med pH 5. Bakgrunden strömmar (bkgrd). Modifierad från de ursprungliga figur26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Biokemisk karakterisering av eTRPV1 och singel-cystein mutanter.
Storlek-utslagning kromatografi profil DDM-solubilized eTRPV1 och singel-cystein spin-märkt mutanter efter uttryck och rening från Sf9 celler. Infällt: SDS-PAGE gel visar monomer eTRPV1-MBP fusion proteinet (modifierad från de ursprungliga figur26). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Funktionell karakterisering av en spin-märkt eTRPV1 mutant.
Ström-spänning relationer bestäms av TEVC från Xenopus oocyter microinjected med proteoliposomes innehållande spin-märkt A702C utmanas med pH 5 (röd) och blockeras av capsazepine (CPZ, blå: 40 µM). Bakgrunden strömmar (bkgrd). Modifierad från de ursprungliga figur26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Mobiliteter av spin-märkt eTRPV1 mutanter bestäms av CW-EPR.
(A), två subenheter (S5, pore helix, S6 och TRP domän) av TRPV1 tetramer struktur belyser aminosyra rester (gula sfärer) probed genom webbplats riktad spin-märkning spektroskopier. (B) första derivatan av CW EPR spektra av spin-märkt cystein mutanter i DDM-lösning. (C) första derivatan av CW EPR spektra av spin-märkt cystein mutanter beredas i asolectin liposomer. Spectra erhölls vid pH 7,4 (slutna staten). ΔHo−1 betecknar omfattningen av parametern rörlighet. Den svarta streckade linjen belyser att bredda spektret. Blå och röda pilar betecknar de låga och höga fält komponenterna av spectrana, respektive. EPR spectra var normaliserade till det totala antalet spin etiketter. Modifierad från de ursprungliga figur26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Avstånd fördelning av en eTRPV1 mutant i tvättmedel.
DEER echo (A) och avstånd distribution (B) av spin-märkt mutant E651C; en summa av Gaussians försågs till rådjur data. P(r) betecknar avståndet distribution av de spin par41. Spectra erhölls vid pH 7,4 (slutna staten). Modifierad från de ursprungliga figur26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nuvarande teknik för uttryck och rening av däggdjur membranproteiner har gjort det möjligt att få tillräckliga mängder protein för spektroskopiska studier14,15,16,42. Här har vi anpassat denna teknik för att uttrycka, rena, rekonstruera och utföra spektroskopiska analyser i TRPV1.

Bland de kritiska steg i protokollet, nedan är de som vi har Felsökte för TRPV1 och som kan justeras för andra proteiner. Ändra den DNA-sekvensen för att skapa en mall som ger 0,5 - 1 mg/mL diskmedel-renat protein; mallar som ger mindre än 0,5 mg/mL av protein utmanande, eftersom växer mer än 6 liter insekt celler kulturer skulle krävas per mutant. Proteinet måste vara koncentrerad, inte mindre än 2 mg/mL, utan TCEP effektivisera spin-märkning. Märkning vid låg protein koncentrationer eller i närvaro av TCEP kommer att spår generera bullriga EPR spectra. Även om proteinerna hålls vid 4 ° C under reningen, är det viktigt att utföra spin märkning på RT att förbättra effektiviteten. Under rening och märkning, förbättrar glycerol protein stabilitet. men måste det helt avlägsnas före beredning, eftersom det minskar mängden protein i liposomer och genererar bullriga EPR spectra. Minskande av tvättmedel koncentration under CMC är vanligt under beredning; TRPV1 tenderar dock att fällningen innan införliva i liposomer. För att lösa detta problem, var TRPV1 inkuberas över natten med förformad liposomer exakt på CMC att undvika protein nederbörd och öka mängden kanaler i proteoliposome beredning. TRPV1 är fullt fungerande i asolectin liposomer28; Därför var det föredragna lipid blandningen används i detta protokoll. Det är dock viktigt att fastställa lipid sammansättningen där ett visst protein är funktionella (t.ex., kolesterol) innan du fortsätter med spektroskopiska analyser.

Spektroskopiska metoder såsom EPR och rådjur presentera flera begränsningar, inklusive: ändringar i mallen proteinsekvens som förbättra biokemiska stabilitet kan påverka funktionen26; införande av icke inhemska enda cysteines, liksom spin etiketten, kan inte tolereras väl i vissa regioner av proteinet; att få stora mängder märkta proteiner; och begränsade konfirmerande förändringar vid fastställandet av avstånd med rådjur i tvättmedel miceller. Emellertid kan den sistnämnda begränsningen övervinnas genom att samla spektra, Q-band frekvens, på TRPV1 mutanter beredas i nanodiscs19,43. Fördelen med dessa metoder kommer dock huvudsakligen från mönstret av globala dynamics, accessibilities och avstånd mer än från det absoluta värdet av en viss position.

Temperatur känslighet är en av de mest fascinerande och mindre förstås Usenets mekanismer; Därför skulle använder spektroskopiska metoder, det vara möjligt att fastställa hur membranproteiner översätta värmeenergi till protein rörelse i en miljö med membran. Ännu viktigare, skulle det vara utmanande att bestämma strukturella förändringar under termisk gating använder röntgenkristallografi eller cryo-EM, eftersom dessa tekniker utförs vid minusgrader. Framtida experiment kommer att inriktas mot att fastställa TRPV1 konfirmerande förändringar förenliga med thermal-beroende gating använder EPR, rådjur eller fluorescens. EPR spektroskopi har lämnat detaljerade mekanistiska modeller för prokaryota jonkanaler, så vi förväntar oss att med hjälp av de protokoll som beskrivs ovan, vi kommer att få inblick i mekanismer för aktivering och drog-bindningen av däggdjur jonkanaler som använder spektroskopiska metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är mycket tacksamma att Dr. H. Mchaourab för att ge tillgång till de EPR och rådjur spektrometrar och Dr. T. Rosenbaum för att tillhandahålla fullängds cystein-mindre TRPV1 Plasmiden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 - Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861 (2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040 (2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740 (2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Tags

Biokemi fråga 137 Transient receptor potential vanilloid 1 TRPV1 rening beredning spin-märkning EPR spektroskopi rådjur spektroskopi
Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A.,… More

Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter