Summary
En simpel, alsidig og billig in vitro- hydroponiske system var med held optimeret, aktivering storskalaforsøg under sterile forhold. Dette system letter anvendelsen af kemikalier i en løsning og deres effektive absorption af rødder for Molekylær, biokemiske og fysiologiske undersøgelser.
Abstract
En bred vifte af undersøgelser i Plantebiologi udføres ved hjælp af hydroponiske kulturer. I dette arbejde præsenteres en in vitro- hydroponiske vækst system designet til at vurdere plante svar til kemikalier og andre stoffer af interesse. Dette system er yderst effektive i at opnå homogen og sunde planter af C3 og C4 model arter Arabidopsis thaliana og Setaria viridis, henholdsvis. Steril dyrkning undgår alger og mikroorganisme forurening, som er kendt for begrænsende faktorer for planternes normale vækst og udvikling i hydroponics. Hertil kommer, er dette system skalerbar, aktivering høsten af plantemateriale i stor skala med mindre mekaniske skader, samt høst af enkelte dele af en plante, hvis det ønskes. En detaljeret protokol demonstrerer, at dette system har en nem og billig forsamling, som det anvender pipette stativer som den vigtigste platform for dyrkning af planter, er fastsat. Muligheden for dette system blev valideret ved hjælp af Arabidopsis stiklinger til at vurdere effekten af lægemidlet AZD-8055, en kemisk hæmmer til målet på rapamycin (TOR) kinase. TOR hæmning var effektivt opdaget så tidligt som 30 min efter en AZD-8055 behandling i rødder og skud. Desuden vises AZD-8055-behandlede planter den forventede stivelse-overskydende fænotype. Vi foreslog dette hydroponiske system som en ideel metode til plante forskere med det formål at overvåge virkningen af plante induktorer eller hæmmere, samt at vurdere metaboliske strømme ved hjælp af isotop-mærkning forbindelser, som generelt kræver brugen af dyre reagenser.
Introduction
Fordele af voksende planter ved hjælp af hydroponics har været bredt anerkendt i produktion af store og ensartede planter, giver reproducerbare eksperimenter1,2,3. I dette system, kan sammensætningen af den ernæringsmæssige løsning være ordentligt kontrolleret og genanvendt langs alle stadier af planternes vækst og udvikling. Derudover udsættes rødderne ikke for abiotiske understreger, som kan ske i jord-dyrkede planter, såsom næringsstof sult og vand mangel4. Som planter dyrkes hydroponically nuværende morfologiske og fysiologiske træk nogenlunde svarende til de dyrkes i jord, er dette system blevet bredt ansat i forskning fordi det giver mulighed for overvågning af root/skyde vækst og deres høst uden skader2,5.
På grund af muligheden for at ændre sammensætning og koncentration af de næringssalte løsning, de fleste af forskningen ved hjælp af hydroponiske betingelser er blevet udført for at karakterisere funktionerne af mikro- og makronæringsstoffer1,3 ,6,7,8. Men dette system har vist sig for at være meget nyttigt for en bred vifte af applikationer i Plantebiologi, såsom at belyse funktionerne af hormoner, og kemikalier i planter. For eksempel, opdagelsen af strigolactones som en ny klasse af hormoner9 og accelereret vækst fænotype udløst af brassinosteroid ansøgning10 blev udført på hydroponiske betingelser. Desuden, dette system giver mulighed for eksperimenter med mærket isotoper (f.eks., 14N /15Nielsen og 13CO2)11,12 at evaluere deres inkorporering i proteiner og metabolitter ved massespektrometri.
I betragtning af betydningen af dette system i planteforskning, et stort antal af hydroponiske kulturer er designet i de sidste par år, herunder systemer, der bruger (i) overføringen af stiklinger fra plader til hydroponiske containere3, 13; (ii) rockwool, der begrænser adgangen til de tidlige stadier af roden udvikling2,14,15; (iii) polyethylen granulat som flydende kroppen, hvilket gør en ensartet gennemførelse af små molekyler/behandlinger vanskeligt16; eller (iv) et reduceret antal planter9,17. Mængden af hydroponiske tanke beskrevet i mange af disse protokoller er normalt store (små mængder spænder fra 1-5 L, op til 32 L)18, som gør anvendelse af kemikalier ekstremt dyre. Selvom nogle undersøgelser beskrive en hydroponiske dyrkning under aseptiske forhold8,er19, samling af systemet normalt ganske besværligt, bestående af den perfekte tilpasning af nylon masker i plast eller glas containere5,8,17,20.
På grund af betydningen af Arabidopsis thaliana som en model plante, er størstedelen af hydroponics systemer designet til denne arter1,2,8,14,18, 19 , 20. ikke desto mindre, der er et par undersøgelser rapporteringsfunktioner hydroponiske vækst af andre plantearter med en forbehandling af frø til at forbedre deres spireevne og synkronisering satser in vitro-8,16 . For at arbejde på en stor skala, udviklede vi en protokol til at oprette en enkel og billig vedligeholdelse hydroponiske system, der gør det muligt for sterile forhold til dyrkning af planter, herunder A. thaliana og andre arter, såsom græs Setaria viridis. Metoden beskrevet her er velegnet til forskellige eksperimenter, som sætteplante vækst kan maksimeres, synkroniseret og nemt overvåges. Desuden, dette system har mange fordele som: (i) sin forsamling er ligetil og dets komponenter kan genbruges; (ii) det giver mulighed for nem anvendelse af forskellige kemikalier i det flydende miljoe; (iii) frøplanter spire og vokse direkte i dyrkningsmediet uden brug af overføringen til hydroponics system; (iv) skyde og root udvikling/vækst kan blive nøje overvåget og planter er høstet uden skader; og (v), det gør det muligt at arbejde på en stor skala, fastholde fysiologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af flydende og fast kultur medier
- Forberede en flydende medium med halv styrke Murashige og Skoog (MS) medium med vitaminer [0.0125 mg/L af cobalt(II) chlorid pentahydrat, 0.0125 mg/L af copper(II) sulfat pentahydrat, 18.35 mg/L af ethylendiamintetraacetat jern natrium, 3.10 mg/L borsyre, 0.415 mg/L af kaliumiodid, 8.45 mg/L af mangan sulfat monohydrat, 0,125 mg/L af natrium molybdat dihydrat, 4,30 mg/L af zinksulfat en, 166.01 mg/L af calciumchlorid, 85 mg/L af kalium dihydrogen fosfat, 950 mg/L kaliumnitrat, 90.27 mg/L af magnesium-sulfat, 825 mg/L af ammoniumnitrat, 1 mg/L af glycin, 50 mg/L af myo-inositol, 0,25 mg/L af nikotinsyre, 0,25 mg/L, pyridoxin hydroklorid, og 0,05 mg/L af thiamin-hydrochlorid] suppleret med 0,25 g/L MES, og ph indstilles til 5.8 med 10 M KOH.
- Tilføje 10 g/L af agar til at gøre en halv styrke MS-solid medium. Autoklave medium ved 121 ° C i 20 min før brug.
2. hydroponiske System montering
Bemærk: Disse trin bør følges omhyggeligt for at opbygge den hydroponiske system.
-
Materielle sterilisation
- Pakke i autoklave taske pipette tip stativer (uden betræk), der skal bruges som minitanks. Autoklave stativer ved 121 ° C i 20 min., 15 psi.
Bemærk: Polypropylen pipette tip rack vi brugte havde følgende dimensioner: 120 mm (længde) x 89 mm (bredde) x 55 mm (højde). Pipette tip flad overflade skal have et område for tilsætning af næringssubstratet. Andre tip stativer kan bruges (Se Tabel af materialer).
Bemærk: I hele proceduren forsamling af hydroponiske system, det er nødvendigt at bruge en laminar flow hood, som skal rengøres og desinficeres med 70% ethanol før brug. Eksperimentatoren skal bære en laboratoriekittel, vaske deres hænder, og enhver udsat hud og desinficere dem med 70% ethanol. Handsker er valgfri, bortset fra drug application. - Rydde alt det tilbehør, der er beskrevet ovenfor (engangs plast kasser, selvklæbende tape, pipetter, saks og pincet) med 70% ethanol før indtastning laminar flow hætte. Hvis hætten tillader, aktivere UV lys i 10 min. før montering af hydroponiske system for at holde arbejdsområdet dekontamineres.
- Pakke i autoklave taske pipette tip stativer (uden betræk), der skal bruges som minitanks. Autoklave stativer ved 121 ° C i 20 min., 15 psi.
-
Minitank montage
- Forsegle den øvre overflade af pipette tip fladt med tape (figur 1B). Hvis det er muligt, lade det under UV-lys til 10 min.
- Tilføj 180 µL af smeltet solid MS kultur medium (lidt varm) til hver brønd med en multikanalpipette (figur 1 c).
Bemærk: Når du forbereder mange kampvogne, bruge en kogeplade til at forhindre, at MS medium solidifying. - Tillad medium at størkne helt (for ca. 30 min).
Bemærk: I perioden størkning UV-lys kan være aktiveret. - Fylde pipette tip rack helt med flydende MS næringssubstratet (fig. 1 d) og sikre, at der er tæt kontakt mellem fast og flydende medier.
- Fjern tape af pipette tip flad overside og passer det på rack omhyggeligt. Den hydroponiske system er nu klar til at modtage de steriliseret frø.
3. frø sterilisation
- Sted 500 Arabidopsis frø i en 1,5 mL microtube. Bruge så mange microtubes som nødvendige ud fra antallet af planter kræves for eksperimentet.
- Vask frøene med 70% ethanol i 2 min. med en blid agitation. Lad frøene bundfælde, så fjerne ethanol omhyggeligt.
- Der tilsættes 1 mL af en 10% natriumhypochlorit løsning indeholdende 2 µL af en Polysorbat 20 vaskemiddel. Agitere løsning for 5 min. Fjern løsningen omhyggeligt.
- Skyl frøene med sterilt, destilleret vand, indtil alle blegemiddel rester er helt fjernet (ca 5 x).
Bemærk: Efter den overflade sterilisation, frøene var nedsænket i sterilt destilleret vand og stratificeret ved 4 ° C i mørke for 5 d til synkronisering af spireevnen.
Bemærk: Frø af Setaria viridis (tiltrædelse A10.1) var forinkubereret i koncentreret svovlsyre i 15 min. (til at bryde den fysiske vækstdvale), vaskes grundigt med sterilt destilleret vand og derefter disinfested med en 5% natriumhypochlorit løsning indeholder 0,1% Polysorbat 20 for 5 min med en blid agitation21. De resterende sterilisation trin var identiske med de beskrevne for Arabidopsis frø.
4. frø ansøgning
- Skære lidt spidsen af en 200 µL tip ved hjælp af en steril skalpel.
- Der afpipetteres Arabidopsis frø i solid næringssubstratet på oversiden af pipette tip flade. Passe på, at mediet ikke løsne fra flat; ellers, frøene bliver nedtonet og planter vil ikke vokse ordentligt (figur 1E).
Bemærk: Brug en steril pincet for Setaria frø (med fosteret placeret opad). - Gemme så mange minitanks som muligt inde en engangs plastik kasse til at opretholde en høj luftfugtighed og holde det fri for mikroorganismer (figur 1F) miljø.
- Forsegle den engangs plastik kasse grundigt ved hjælp af selvklæbende tape til at undgå forurening.
- Placere de hydroponiske systemer i et vækst kammer med de passende vækstbetingelser for anlægget af interesse.
Bemærk: I dette arbejde, blev følgende betingelser anvendes: 75% af fugtighed, og 150 µmol m-2 s-1 irradians og equinoctial betingelser af 12 h lys (21 ° C) / 12t mørke (19 ° C) for Arabidopsiseller 300 µmol m-2 s-1 i irradians og 12 h lys (28 ° C) / 12 h mørke (25 ° C) for Setaria (figur 1 g og 1t).
5. validering af brugen af dette hydroponiske System til at hæmme målet på Rapamycin Kinase
Bemærk: Denne hydroponiske system blev oprindeligt udviklet for at lette administrationen af kemikalier til planter, som generelt er meget dyrt at blive anvendt i storskalaforsøg. Som en proof of concept, var at ATP-kompetitiv inhibitor AZD-8055, som er kendt for at være målrettet mod ATP bindingssted TOR protein kinase22, ansat til at følge undertrykkelsen af TOR aktivitet i stiklinger af A. thaliana Columbia-0 ( Nottingham Arabidopsis Stock centrum, NASC ID: N22681). Her, er den protokol, der bruges kort beskrevet.
- Dyrke frø hydroponically indtil fase 1,04 ifølge BBCH skala23 (til ca 11 d) de klimatiske betingelser beskrevet ovenfor. Erstatte den næringsstof løsning, enten med friske medium indeholdende 0,05% DMSO (kontrol), 2 µM AZD-8055 (TOR hæmmer) fortyndet i DMSO, eller uden behandling (mock), i slutningen af natten (da).
- Høste nogle planter på forskellige tidspunkter efter behandlingen og adskille dem i rødder og skud. Fryse prøverne i flydende kvælstof, male dem til et fint pulver i en robot grinder (Se Tabel af materialer), og gemme pulver ved-80 ° C indtil brug.
- Immunblot mod fosforyleres og ikke-fosforyleret former for 40S ribosomale protein S6 (RPS6) Ifølge Dobrenel et al. 24.
- Bleach intakt plantemateriale til prøven depigmentering, vaske dem i destilleret vand, Fordyb dem i en jodopløsning til 5 min.25og fotografere kimplanter i et stereomikroskop (0,63 X mål, 20 x tilnærmelse og 7,5 x størrelsesorden) for en kvalitativ vurdering af kartoflernes stivelsesindhold.
- Kvantificere stivelsen efter Enzymatisk nedbrydning og måling af de frigivne glukose spektrofotometrisk ved at koble det til en reduktion af NADP+ til NADPH26,27.
- Udføre en total RNA udvinding, en cDNA syntese og kvantitativ RT-PCR assays som beskrevet af Caldana et al. 28 at evaluere niveauet udtryk af gener relateret til forskellige former for belastninger.
- Du kan eventuelt vokse planter på et gartneri substrat i plastic Potter med en 0,1 L kapacitet under lignende klimatiske betingelser [60% fugtighed, 150 µmol m-2 s-1 af irradians og equinoctial betingelser 12t lys (21 ° C) / 12t mørke (19 ° C )] for at sammenligne dem med planter dyrkes hydroponically.
Bemærk: Target gener bruges til gen expression assays blev ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), og TPS5 (At4g17770), og deres udtryk niveauer var normaliseret beskæftiger delta-Ct metode29 ved hjælp af ACT2 (At3g18780) eller PDF2 (At4g04890) som intern reference gener, forudsat at 100% af PCR forstærkning effektivitet på tværs af alle prøver. Oligonukleotid par anvendes til kvantitativ PCR blev: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), og PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TOR kinase er en væsentlig regulator, der integrerer næringsstoffer og energi signalering fremme celledelingen og vækst i alle eukaryoter. Bestræbelser på at belyse TOR funktioner i planter omfatter generation af Arabidopsis transgene linjer, der indeholder TOR betinget undertrykkelse gennem RNA-interferens eller kunstige mikroRNA28,30,31, givet embryo dødbringende Fænotypen af TOR knockout planter32,33,34,35. De fleste af de betingede transgene linjer er under kontrol af estradiol-, dexamethason- eller ethanol-inducerbar initiativtagere, der også gør brug af denne hydroponiske system.
En af de velkendte mål af TOR aktivitet i Arabidopsis er den direkte fosforylering af de ribosomale protein S6 kinase (S6K)34,36,37,38. Ved fosforylering, S6K yderligere phosphorylates 40S ribosomale protein S6 (RPS6), der påvirker de ribosomale protein oversættelse24,39,40. Det er for nylig påvist, at fosforylering af en RPS6 Ser240 site er en god markør for TOR aktivitet24. Immunoblotting assays bekræftet, at snart efter 30 min for drug administration, en betydelig nedgang i Ser240 fosforylering blev observeret i både rødder og skud (figur 2). På de eksperimentelle betingelser anvendes, har AZD-8055 også vist sig for at være en potent TOR inhibitor, som hurtigt undertrykker sin kinase aktivitet.
Gensplejsede Arabidopsis linjer med en reduceret udtryk af TOR genet eller komponenter af TOR sammensat fremlægge en klar stivelse overskydende fænotype28,31. Kvalitativ analyse af stivelse ved hjælp af Lugols løsning afslørede det forventede mønster af stivelse ophobning og nedbrydning under diel cyklus (figur 3). Kimplanter, der ikke har modtaget en ansøgning af DMSO eller AZD-8055 viste ingen større ophobning af stivelse i bladene i slutningen af natten (da), og den stivelse ophobning i kontrol-planter (som modtaget 0,05% DMSO) var i overensstemmelse med litteraturen 41 , 42. Endvidere planter behandlet med AZD-8055 præsenteret en større mængde af resterende stivelse på EN sammenlignet med kontrol frøplanter. Disse resultater viste anvendeligheden af det foreslåede hydroponiske system i stigende stiklinger efterligne fysiologiske tilstande. Dette system også aktiveret bekræftelse af stivelse overskydende fænotype typisk af en undertrykkelse af TOR komplekse komponenter24,28,31.
Stivelsesindhold var også nøjagtigt målt ved hjælp af en følsom metode, viser, at AZD-8055 behandling førte til stiklinger med betydeligt højere indhold af stivelse i slutningen af dagen (ED) og EN i forhold til kontrolelementet DMSO-behandlede planter (figur 4). Stivelse ophobes i bladene i løbet af dagen og er remobilized natten over for at fastholde metaboliske aktivitet, hovedsagelig respiration og kontinuerlig eksport af saccharose til andre anlæg organer41,42. Under normale forhold forbliver kun en lille brøkdel af stivelse (mellem 5% og 10% af beløbet på ED) på EN43,44,45. Disse resultater attesteret, at stivelsen overskydende fænotype observeret under TOR undertrykkelse sker over diel cyklus.
Hydroponically dyrkede planter blev sammenlignet med planter dyrket i et gartneri substrat under meget lignende klimatiske forhold vedrørende udtrykket niveau af den abscisic syre-responderende element-bindende faktor 3 (ABF3) genet (figur 5A ), som direkte korrelerer med interne ABA niveauer, en klasse af hormoner, almindeligt kendt som en markør på grund af sin rolle i flere abiotisk stress svar46,47,48. Selv om planter dyrket i hydroponiske system præsentere en betydelig stigning i niveauet af ABF3, blev udtryk for asparagin syntase 1 (ASN1) ikke påvirket af DMSO eller AZD behandlinger (figur 5B). Dog trehalose fosfat syntase 5 (TPS5) øgedes betydeligt efter 8 h af TOR hæmning (figur 5B). ASN1 og TPS5 reagerer på lavt og højt sukker niveauer49,50,51,52,53,54, henholdsvis, tyder på at disse planter ikke oplever energiske stress.
Figur 1 : Arbejdsgang for montering af hydroponiske system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Effekt af TOR hæmning på RPS6 fosforylering i forskellige væv af Arabidopsis thaliana . Immunoblotting viser overfloden af den samlede og fosforyleres RPS6 i (A) roden og (B) skyde ekstrakter af kimplanter behandlet med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontrol). Værdierne repræsenterer de nøgletal normaliseret af den ikke-fosforyleret protein RPS6. Anti-actin antistof blev brugt som en loading kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Arabidopsis thaliana stiklinger farves med Lugols reagens. Behandlinger med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontrol) blev anvendt på EN (rød pil) og i forhold til at håne stiklinger (no-behandling). Frøbedsplanter var høstet før behandling ansøgning (0 h) og på 12 h (ED) og 24 h (da) efter behandlingen, angivet med sorte pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Effekt af TOR hæmning af stivelsesindhold i Arabidopsis thaliana frøplanter. Stivelse blev målt enzymatisk før (0 h) og på 12 h (ED) eller 24 h (da) efter behandling med 2 µM AZD-8055 (sort) eller 0,05% DMSO (kontrol, hvid). Værdierne vist er den gennemsnit ± standardafvigelse (SE) (n = 4). Væsentlige forskelle mellem frøplanter behandlet med AZD-8055 og DMSO, ved hjælp af Student's t-test, er angivet med en Asterisk: * (P < 0,05) og *** (P < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Udtryk niveau af stress-relaterede gener. (A) sammenligning af ABF3 afskrifter i hydroponically og substrat-vokset Arabidopsis Col-0 frøplanter. (B) sammenligning af ASN1 og TPS5 afskrifter i Arabidopsis frøplanter behandlet med 2 µM AZD-8055 og 0,05% DMSO. De normaliserede udtryk niveauer er vist som 2^(-dCt). Værdierne vist er den gennemsnit ± SE (n = 3). Betydelige forskelle, ved hjælp af Student's t-test, er angivet med en Asterisk: *** (P < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1:denne in vitro- hydroponiske system gør det muligt at synkronisere spiring og opnå homogen frøplanter. Frø af A. thaliana (C3) og S. viridis (C4) var spiret direkte i dette system. (A og C) udplantningsplanterne var ensartet i forhold til den udviklingsstadiet og behandlingen blev anvendt efter 11 d (Arabidopsis) eller 7 d (Setaria). (B og D) vokse rødderne direkte mod den nærende løsning, at lette tilsætning af forskellige stoffer og deres absorption. Disse resultater tyder kraftigt på at dette system giver et optimalt miljø for planternes vækst og kan bruges til at effektivt udføre en bred vifte af assays. Derudover er denne hydroponiske system meget nyttigt for storskalaforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne optimerede hydroponiske struktur gør det muligt for vellykket i vitro kultur af planter. Frøene spire godt på den solide medium på pipette tip flad overflade, en betydelig gevinst i forhold til systemer, hvor frø er gennemblødt med naeringsoploesningen. En stor fordel ved dette system er, at under udvikling sætteplante rødder får direkte kontakt med den flydende medium uden brug af overføringen. Derudover kan kemisk behandling let anvendes i Lage i en reduceret mængde. Luftfugtighed holdes højt, undgå fordampning af naeringsoploesningen og dets opfyldning. Derudover homogen vækst og udvikling under sætteplante indførelse let kan fås, og beluftning er ikke påkrævet, når du arbejder med små tanke og stiklinger på denne udviklingsstadiet1,10,18 . For at sikre, at systemet vil være helt fri for forurenende stoffer, er et kritisk skridt Sterilisation af materiale, der anvendes og intensiv pleje under sin samling. På grund af umulighed at sterilisere nogle komponenter i autoklave (fx, engangs plast kasser), anbefales det kraftigt at først rydde dem med 70% ethanol og derefter anvende en kort periode af UV lys før brug. Vores erfaring undgår brug af UV-lys, efter forsegling flad overflade med tape og under media størkning, også bakterie- og svampeinfektioner forurening. Desuden være forsigtig ikke at røre i medierne, altid i bevægelse pipette stativer af den laterale side.
For at sikre den optimale vækst af planter, er det vigtigt at overvåge det tæt kontakt mellem faste eller flydende medier, at sikre fuldstændig nedsænkning af rødderne efter frø spiring. Solid mediet skal være tilstrækkeligt tætte (10 g/L agar) og helt størknet for ikke at løsne fra den flade overflade og flyde i naeringsoploesningen. Ud over Arabidopsis, kan dette system blive brugt til dyrkning af andre plantearter, så længe frøene er lille nok til at passe wells af flat. I denne forstand var den hydroponiske metode præsenteres her også effektiv for voksende Setaria viridis, en lille græs, der er for nylig opstået som en roman modelsystem til at studere C4 fotosyntese, stress biologi og andre bioenergi afgrøde træk 55. svarende til Arabidopsis, dette system gør det muligt for at producere ensartet voksende Setaria stiklinger med en god rodsystem og på en stor skala (tillægs figur 1), fordi hvert rack understøtter 96 frø, at sikre mange planter pr. biologiske replikat og følgelig tilstrækkeligt materiale til et utal af downstream applikationer. Et højere antal flergangsbestemmelser øger effektiviteten af statistiske test, fører til mere præcise og pålidelige resultater i eksperimentelle undersøgelser56. For eksempel har bruger en vækst kammer med et areal på kun 1,5 m2, vi kunnet vokse 6.000 frøplanter samtidig gør det muligt at udføre tidsmæssige kinetik af svaret på en ønskede behandling. Derudover de høstede prøver kan bruges til flere og supplerende 'omik' analyser der kan kræve en stor mængde væv (f.eks, immunoblotting). Denne hydroponiske struktur er af særlig interesse for grupper med henblik på at analysere forskellige plante organer (f.eks., rødder og skud), fordi det sætter deres nem og hurtig adskillelse.
Et lille antal undersøgelser beskrevet brugen af pipette tip kasser under det oprindelige plante udvikling før en overføring til større hydroponiske tanke11,20, og mere for nylig, en meget lignende system var ansat til at evaluere den amino syre optagelse og omplantning i 5 uger gamle Arabidopsis planter57. Protokollen beskrevet her giver yderligere fordele med hensyn til dyrke planter under sterile forhold.
Selv om dette system blev oprindeligt udviklet til at vokse planter, kunne det også være velegnet til større anlæg. I dette scenario er det værd at nævne, at der skal udvises forsigtighed at placere frøene mere fjernt fra hinanden for at undgå så meget skygge som muligt under vækst. Derudover kan beluftning indføres i stativer til at forebygge hypoksi gennem et godt af pipette tip flade, et fælles problem i undersøiske Arabidopsis rødder vokser i længere perioder. På grund af deres siddende natur, er planter udsat for flere slags abiotiske og biotiske understreger, afhængigt af deres omgivende miljø. Derfor, i betragtning af formålet med undersøgelsen og de udviklingsstadiet, kan det være vigtigt at overvåge hvis planter vokser i dette system lider af en form for stress.
Resultaterne præsenteres her har vist, at denne hydroponiske system er meget nyttigt for anvendelsen af kemikalier til den nærende løsning, især når du arbejder med dyre stoffer, på grund af den lille mængde af pipette tip stativer. Vi har formået at bruge dette system til effektivt undertrykker aktiviteten af TOR kinase af AZD-8055 og bekræftet, at statussen fosforylering af sine downstream mål RPS6 påvirkes allerede efter 30 min. behandling ansøgning. Desuden fører TOR hæmning til stiklinger der indeholder højere stivelse niveauer i løbet af dagen og natten i forhold til kontrol frøplanter. Disse analyser kan nemt ansat til at udvide observationer allerede opnået med transgene linjer, tillader en inducerbar undertrykkelse af de gen-kodning komponenter i KOMMISSORIET komplekse, eller nogen andre pathway af interesse. I sammendrag, den foreslåede hydroponiske system besidder mange fordele, fordi det er meget let og enkel at samle, har en lav pris (de vigtigste komponenter er billige og kan genbruges udførligt), er alsidig (giver mulighed for undersøgelse af intakt stiklinger eller forskellige væv i specifikke eller langs plante udviklingsstadier), og er meget skalerbar, (det tillader dyrkning af et stort antal kimplanter i et meget lille område).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af São Paulo Research Foundation (FAPESP; Giv 12/19561-0) og Max Planck Society. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), og Viviane C. H. da Silva (KAPPER/CNPEM 24/2013) er taknemmelig for stipendiaterne. Forfatterne takke Christian Meyer fra Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles i Frankrig) for generøst at give antistoffer mod RPS6. Forfatterne takke RTV UNICAMP og Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel for deres tekniske support under audio optagelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
