Summary
एक सरल, बहुमुखी, और कम इन विट्रो hydroponic प्रणाली में लागत सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था, बाँझ स्थितियों के तहत बड़े पैमाने पर प्रयोग को सक्षम करने. इस प्रणाली के एक समाधान में रसायनों के आवेदन की सुविधा और उनके आणविक, जैव रासायनिक, और शारीरिक अध्ययन के लिए जड़ों द्वारा कुशल अवशोषण ।
Abstract
संयंत्र जीव विज्ञान में अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला hydroponic संस्कृतियों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । इस काम में, एक इन विट्रो hydroponic विकास प्रणाली रसायनों और ब्याज के अंय पदार्थों को संयंत्र प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए डिजाइन प्रस्तुत किया है । यह प्रणाली क्रमशः सी३ और सी४ मॉडल प्रजातियों Arabidopsis थालियाना और Setaria viridisके सजातीय और स्वस्थ अंकुर प्राप्त करने में अत्यधिक दक्ष है. बाँझ खेती शैवाल और सूक्ष्मजीवों संदूषण, जो संयंत्र सामान्य वृद्धि और हीड्रोपोनिक्स में विकास के लिए कारकों को सीमित करने के लिए जाना जाता है से बचा जाता है । इसके अलावा, इस प्रणाली स्केलेबल है, मामूली यांत्रिक क्षति के साथ एक बड़े पैमाने पर संयंत्र सामग्री की फसल को सक्षम करने, साथ ही एक संयंत्र के व्यक्तिगत भागों की फसल अगर वांछित । एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन है कि इस प्रणाली के एक आसान और कम लागत विधानसभा है, क्योंकि यह पौधों को उगाने के लिए मुख्य मंच के रूप में पिपेट रैक का उपयोग करता है, प्रदान की जाती है । इस प्रणाली की व्यवहार्यता दवा AZD-८०५५, rapamycin (टो) कळेनासे के लक्ष्य का एक रासायनिक अवरोधक के प्रभाव का आकलन करने के लिए Arabidopsis अंकुर का उपयोग कर मान्य किया गया था । टो निषेध कुशलतापूर्वक जड़ों और शूटिंग में एक AZD-८०५५ उपचार के बाद के रूप में 30 मिनट के रूप में जल्दी पता लगाया गया था । इसके अलावा, AZD-८०५५-इलाज संयंत्रों की उंमीद स्टार्च अतिरिक्त phenotype प्रदर्शित । हम संयंत्र के लिए एक आदर्श विधि के रूप में इस hydroponic प्रणाली का प्रस्ताव शोधकर्ताओं के लिए संयंत्र उत्प्रेरण या अवरोधकों की कार्रवाई पर नजर रखने के लक्ष्य, साथ ही साथ चयापचय प्रवाह का आकलन आइसोटोप लेबलिंग यौगिकों जो, सामान्य में, महंगा के उपयोग की आवश्यकता है अभिकर्मकों.
Introduction
हीड्रोपोनिक्स का उपयोग कर पौधों को उगाने के फायदे व्यापक रूप से बड़े और समान पौधों के उत्पादन में मांयता प्राप्त किया गया है, reproducible प्रयोगों1,2,3को सक्षम करने से । इस प्रणाली में, पोषक समाधान की संरचना ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है और संयंत्र के विकास और विकास के सभी चरणों के साथ पुनर्नवीनीकरण । इसके अलावा, जड़ों अजैव तनाव के अधीन नहीं हैं, के रूप में मिट्टी में हो सकता है पौधों, जैसे पोषक तत्वों भुखमरी और पानी की कमी4। के रूप में पौधों hydroponically वर्तमान रूपात्मक और शारीरिक काफी मिट्टी में कल्चरित लोगों के समान लक्षण हो, इस प्रणाली को मोटे तौर पर अनुसंधान में कार्यरत है, क्योंकि यह जड़ की निगरानी/ चोटों2,5.
संरचना और पोषक समाधान की एकाग्रता को बदलने की संभावना के कारण, अनुसंधान के अधिकांश hydroponic शर्तों का उपयोग करने के लिए सूक्ष्म और macronutrients के कार्यों की विशेषताएं प्रदर्शन किया गया है1,3 ,6,7,8. हालांकि, इस प्रणाली को पौधों में हार्मोन और रसायनों के कार्यों स्पष्ट करने के लिए के रूप में संयंत्र जीव विज्ञान में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बहुत उपयोगी साबित हो गया है । उदाहरण के लिए,9 हार्मोन के एक नए वर्ग के रूप में strigolactones की खोज और त्वरित वृद्धि phenotype brassinosteroid आवेदन10 द्वारा ट्रिगर hydroponic शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, इस प्रणाली को लेबल आइसोटोप के साथ प्रयोग सक्षम बनाताहै (उदा., 14n/15n और 13CO2)11,12 प्रोटीन और चयापचयों में उनके निगमन का मूल्यांकन करने के लिए द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री ।
संयंत्र अनुसंधान, hydroponic संस्कृतियों की एक उच्च संख्या में इस प्रणाली के महत्व को ध्यान में रखते हुए पिछले कुछ वर्षों में डिजाइन किया गया है, सिस्टम का उपयोग करें कि (i) प्लेटों से hydroponic कंटेनरों3 के अंकुरों की स्थानांतरण सहित, 13; (ii) rockwool कि जड़ विकास के प्रारंभिक चरण के लिए उपयोग की सीमा2,14,15; (iii) पॉलीथीन अस्थाई शरीर है, जो छोटे अणुओं के सजातीय आवेदन करता है के रूप में दानेदार/ या (iv) पौधों की एक कम संख्या9,17। उन प्रोटोकॉल के कई में वर्णित hydroponic टैंक की मात्रा आमतौर पर बड़े है (छोटे 1-5 एल से लेकर मात्रा, ३२ एल तक)18, जो रसायनों के आवेदन बेहद महंगा पड़ता है । हालांकि कुछ अध्ययनों अपूतित शर्तों8,19के तहत एक hydroponic खेती का वर्णन करते हैं, प्रणाली के विधानसभा आमतौर पर काफी श्रमसाध्य है, प्लास्टिक या ग्लास में नायलॉन जाल का सही समायोजन से मिलकर कंटेनरों5,8,17,20।
एक मॉडल संयंत्र के रूप में Arabidopsis थालियाना के महत्व के कारण, हीड्रोपोनिक्स प्रणालियों के बहुमत इस प्रजाति के लिए डिजाइन किए गए थे1,2,8,14,18, 19 , 20. फिर भी, वहां रहे है कुछ अध्ययनों के बीज के एक उपचार के साथ अंय प्रजातियों के पौधे की hydroponic वृद्धि की रिपोर्ट के लिए उनके अंकुरण और तुल्यकालन दरों में सुधार के लिए इन विट्रो8,16 . आदेश में एक बड़े पैमाने पर काम करने के लिए, हम एक सरल और कम लागत रखरखाव hydroponic प्रणाली की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है कि पौधों को उगाने के लिए बाँझ शर्तों को सक्षम बनाता है, सहित एक. थालियाना और घास Setaria के रूप में अंय प्रजातियों, viridis। यहां वर्णित विधि विभिंन प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, के रूप में अंकुर वृद्धि को बड़ा किया जा सकता है, सिंक्रनाइज़, और आसानी से नजर रखी । इसके अलावा, इस प्रणाली के रूप में कई फायदे हैं: (i) अपनी विधानसभा सीधा है और इसके घटकों reused किया जा सकता है; (ii) यह तरल माध्यम में विभिन्न रसायनों के आसान आवेदन की अनुमति देता है; (iii) अंकुरित अंकुरण और संस्कृति माध्यम में सीधे हीड्रोपोनिक्स प्रणाली को स्थानांतरण की आवश्यकता के बिना बढ़ता है; (iv) गोली और जड़ विकास/विकास बारीकी से निगरानी की जा सकती है और अंकुरों को बिना नुकसान के काटा जाता है; और (v) यह एक बड़े पैमाने पर काम करने के लिए संभव बनाता है, शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. तरल और ठोस संस्कृति मीडिया की तैयारी
- विटामिन के साथ आधा शक्ति Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम का उपयोग कर एक तरल माध्यम तैयार [०.०१२५ मिलीग्राम/एल के कोबाल्ट (द्वितीय) क्लोराइड pentahydrate, ०.०१२५ मिलीग्राम/तांबे के एल (द्वितीय) सल्फेट pentahydrate, १८.३५ मिलीग्राम/एल के ethylenediaminetetraacetate घाट सोडियम, ३.१० मिलीग्राम/ बोरिक एसिड, ०.४१५ मिलीग्राम/एल के पोटेशियम आयोडाइड, ८.४५ मिलीग्राम/एल के मैंगनीज सल्फेट मोनोहाइडे, ०.१२५ मिलीग्राम/एल के सोडियम molybdate डाईहाइड्रेट, ४.३० मिलीग्राम/l के जस्ता सल्फेट heptahydrate, १६६.०१ मिलीग्राम/l की कैल्शियम क्लोराइड, ८५ mg/l की पोटेशियम dihydrogen फॉस्फेट, ९५० mg/l की पोटेशियम नाइट्रेट, मैग्नीशियम सल्फेट के ९०.२७ मिलीग्राम/८२५ मिलीग्राम/अमोनियम नाइट्रेट के एल, 1 mg/l के glycine, ५० mg/l के myo-inositol, ०.२५ mg/l की कोर्टेक्स अम्ल, ०.२५ mg/l की pyridoxine हाइडरोक्लॉराइड, और ०.०५ mg/l की thiamine हाइडरोक्लॉराइड] के साथ पूरक ०.२५ g/l के एमईएस, और 10 एम KOH के साथ ५.८ के लिए पीएच समायोजित करें ।
- आधा ताकत MS-ठोस माध्यम बनाने के लिए आगर के 10 ग्राम/ उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए १२१ ° c पर मध्यम आटोक्लेव ।
2. Hydroponic प्रणाली कोडांतरण
नोट: hydroponic सिस्टम बनाने के लिए इन चरणों का सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए ।
-
सामग्री नसबंदी
- आटोक्लेव बैग में पैक पिपेट टिप रैक (कवर के बिना) कि minitanks के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । 20 मिनट, 15 साई के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर रैक आटोक्लेव ।
नोट: पिपेट टिप रैक हम प्रयोग निंनलिखित आयाम था: १२० mm (लंबाई) x ८९ mm (चौड़ाई) x ५५ mm (ऊंचाई) । पिपेट टिप सपाट सतह संस्कृति माध्यम के अलावा के लिए एक क्षेत्र होना चाहिए । अंय टिप रैक इस्तेमाल किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
नोट: hydroponic प्रणाली की विधानसभा प्रक्रिया के दौरान, यह एक लामिना प्रवाह हूड, जो साफ किया जाना चाहिए और ७०% इथेनॉल से पहले का उपयोग करने से संक्रमित का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । प्रयोगकर्ता एक प्रयोगशाला कोट पहनना चाहिए, उनके हाथ धोने और किसी भी उजागर त्वचा, और उंहें ७०% इथेनॉल के साथ विशुद्ध । दस्ताने वैकल्पिक हैं, दवा आवेदन के अलावा । - ऊपर वर्णित सभी सामान (डिस्पोजेबल प्लास्टिक बक्से, चिपकने वाला टेप, पिपेट, कैंची, और चिमटी) लामिना प्रवाह हूड में प्रवेश करने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ साफ । यदि हुड की अनुमति देता है, 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश पर बारी hydroponic प्रणाली के कोडांतरण से पहले क्रम में काम क्षेत्र को दूषित रखने के लिए ।
- आटोक्लेव बैग में पैक पिपेट टिप रैक (कवर के बिना) कि minitanks के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा । 20 मिनट, 15 साई के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर रैक आटोक्लेव ।
-
Minitank कोडांतरण
- चिपकने वाला टेप (आंकड़ा 1b) के साथ पिपेट टिप फ्लैट की ऊपरी सतह सील । यदि संभव हो तो, यह यूवी प्रकाश के तहत 10 मिनट के लिए छोड़ दें ।
- एक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 1C) का उपयोग करने के लिए पिघल ठोस एमएस संस्कृति मध्यम (थोड़ा गर्म) के १८० µ एल जोड़ें ।
नोट: कई टैंक तैयार करते समय एमएस मीडियम को जमना से बचाने के लिए एक चूल्हा का इस्तेमाल करें । - मध्यम पूरी तरह से जमना के लिए अनुमति दें (के बारे में 30 मिनट के लिए) ।
नोट: solidification अवधि के दौरान, यूवी प्रकाश चालू किया जा सकता है । - पिपेट टिप रैक पूरी तरह से तरल एमएस संस्कृति माध्यम (चित्रा 1 d) के साथ भरें और सुनिश्चित करें कि ठोस और तरल मीडिया के बीच घनिष्ठ संपर्क है ।
- पिपेट टिप फ्लैट की ऊपरी सतह के चिपकने वाला टेप निकालें और रैक पर ध्यान से फिट । hydroponic प्रणाली अब निष्फल बीज प्राप्त करने के लिए तैयार है ।
3. बीज नसबंदी
- एक १.५ मिलीलीटर microtube में ५०० Arabidopsis बीज रखें । प्रयोग के लिए आवश्यक पौधों की संख्या के अनुसार आवश्यकतानुसार कई microtubes का प्रयोग करें ।
- एक सौंय आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल के साथ बीज धो लो । बीज को नीचे बसा दें, फिर इथेनॉल को सावधानीपूर्वक निकालें.
- एक polysorbate 20 डिटर्जेंट के 2 µ एल युक्त एक 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए समाधान आंदोलन । समाधान को सावधानीपूर्वक निकालें ।
- सभी ब्लीच अवशेषों को पूरी तरह से हटा दिया है जब तक बाँझ आसुत पानी के साथ बीज कुल्ला (लगभग 5x) ।
नोट: सतह नसबंदी के बाद, बीज बाँझ आसुत पानी में डूबे थे और स्तरीकृत 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 5 डी के लिए अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए.
नोट: Setaria viridis (प्रवेश एक 10.1) के बीज 15 मिनट के लिए केंद्रित सल्फर एसिड में गर्मी (शारीरिक निद्रा तोड़ने के लिए) थे, बाँझ आसुत जल में अच्छी तरह से धोया, और फिर एक 5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ disinfested ०.१% polysorbate 20 एक सौंय आंदोलन21के साथ 5 मिनट के लिए युक्त । शेष नसबंदी कदम Arabidopsis बीज के लिए वर्णित उन लोगों के लिए समान थे ।
4. बीज आवेदन
- थोड़ा एक बाँझ स्केलपेल की सहायता से एक २०० µ एल टिप के उग्रवाद में कटौती.
- पिपेट टिप फ्लैट की ऊपरी सतह पर ठोस संस्कृति माध्यम में Arabidopsis बीज पिपेट । ध्यान रखें कि मध्यम फ्लैट से ढीला नहीं है; अंयथा, बीज छाया हो जाएगा और अंकुर ठीक से विकसित नहीं होगा (चित्रा 1E) ।
नोट: Setaria बीज (ऊपर तैनात भ्रूण के साथ) के लिए एक बाँझ नोचना का उपयोग करें । - एक उच्च आर्द्रता बनाए रखने और सूक्ष्मजीवों (चित्रा 1F) से पर्यावरण को मुक्त रखने के लिए एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक बॉक्स के अंदर संभव के रूप में कई minitanks के रूप में स्टोर.
- प्रयोज्य प्लास्टिक बॉक्स को अच्छी तरह से सील चिपकने वाला टेप का उपयोग करने के लिए संदूषण से बचने ।
- ब्याज के संयंत्र के लिए उचित विकास की स्थिति के साथ एक विकास कक्ष में hydroponic प्रणालियों प्लेस ।
नोट: इस काम में निंनलिखित शर्तों का इस्तेमाल किया गया: ७५% आर्द्रता, और १५० µmol एम-2 एस-1 के विकिरण और विषुव शर्तों के 12 ज लाइट (21 डिग्री सेल्सियस)/12 एच डार्क (19 डिग्री सेल्सियस) के लिए Arabidopsis, या ३०० µmol एम-2 एस-1 के विकिरण और 12 एच लाइट (28 डिग्री सेल्सियस)/ Setaria के लिए 12 एच डार्क (25 डिग्री सेल्सियस) ( चित्रा 1G और 1) ।
5. Rapamycin कळेनासे के लक्ष्य को बाधित करने के लिए इस Hydroponic प्रणाली के उपयोग को मान्य करना
नोट: यह hydroponic प्रणाली शुरू में पौधों को रसायनों के प्रशासन की सुविधा के लिए विकसित किया गया था, जो सामांय में, बड़े पैमाने पर प्रयोगों में लागू किया जा करने के लिए बहुत महंगे हैं । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, एटीपी प्रतिस्पर्धी अवरोधक AZD-८०५५, जो विशेष रूप से कळेनासे22टो प्रोटीन की एटीपी बाध्यकारी साइट को लक्षित करने के लिए जाना जाता है, के अंकुर में टो गतिविधि के दमन का पालन करने के लिए नियोजित किया गया था . थालियाना कोलंबिया-0 ( नॉटिंघम Arabidopsis स्टॉक सेंटर, काम्प्लैक्स आईडी: N22681) । यहां, इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल संक्षेप में वर्णित है ।
- BBCH स्केल23 (के बारे में 11 डी के लिए) के अनुसार चरण १.०४ तक बीज hydroponically ऊपर वर्णित जलवायु परिस्थितियों के तहत बढ़ें । पोषक तत्व समाधान बदलें, ताजा मध्यम से युक्त ०.०५% DMSO (नियंत्रण), 2 µ m AZD-८०५५ (टो अवरोध करनेवाला) DMSO में पतला, या उपचार के बिना (नकली), रात के अंत में (एन).
- उपचार के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर कुछ अंकुर फसल और जड़ों और शूटिंग में उन्हें अलग । तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज, उंहें एक रोबोट चक्की में एक ठीक पाउडर को पीसने ( सामग्री की तालिकादेखें), और पाउडर की दुकान पर-८० ° c उपयोग तक ।
- RPS6 एट अल के अनुसार 40 राइबोसोमल प्रोटीन S6 (Dobrenel) के phosphorylated और गैर phosphorylated रूपों के खिलाफ Immunoblot । 24.
- प्रक्षालन नमूना विवर्णीकरण के लिए बरकरार अंकुर, आसुत जल में उन्हें धोने, 5 मिनट के लिए एक आयोडीन समाधान में उन्हें विसर्जित25, और एक stereomicroscope में अंकुर तस्वीर (0.63 एक्स उद्देश्य, 20x सन्निकटन, और 7.5 x परिमाण) एक के लिए स्टार्च सामग्री का गुणात्मक मूल्यांकन ।
- एंजाइमी क्षरण और जारी ग्लूकोज spectrophotometrically की माप के लिए यह NADP की कमी करने के लिए+ 26,27NADPH के लिए निंनलिखित स्टार्च मात्रा ।
- Caldana एट अल द्वारा वर्णित के रूप में कुल आरएनए निष्कर्षण, एक सीडीएनए संश्लेषण, और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर परख करते हैं । 28 विभिन्न प्रकार के तनावों से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन करने के लिए.
- वैकल्पिक रूप से, समान जलवायु शर्तों के तहत एक ०.१ एल क्षमता के साथ प्लास्टिक के बर्तन में एक बागवानी सब्सट्रेट पर अंकुर बढ़ता है [आर्द्रता के ६०%, १५० µmol एम-2 एस-1 विकिरण के, और 12 ज लाइट (21 डिग्री सेल्सियस)/12 एच डार्क (19 डिग्री सेल्सियस )] क्रम में उनकी तुलना करने के लिए अंकुर उगाए hydroponically.
नोट: जीन अभिव्यक्ति परख के लिए इस्तेमाल किया लक्ष्य जीन ABF3 (At4g34000) थे, ASN1 (At3g47340), और TPS5 (At4g17770), और उनकी अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्यीकृत डेल्टा-सीटी विधि29 का उपयोग कर काम कर रहे थे ACT2 (At3g18780) या PDF2 (At4g04890) आंतरिक संदर्भ जीन के रूप में, सभी नमूनों भर में पीसीआर प्रवर्धन क्षमता का १००% संभालने । मात्रात्मक पीसीआर के लिए इस्तेमाल oligonucleotide जोड़े थे: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), और PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT) ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
टो कळेनासे एक प्रमुख नियामक है जो सभी eukaryotes में सेल प्रसार और विकास को बढ़ावा देने के लिए पोषक तत्व और ऊर्जा सिग्नल को एकीकृत करता है । पौधों में टो कार्यों को स्पष्ट करने के प्रयासों में आरएनए व्यवधान या कृत्रिम microRNA के माध्यम से टो सशर्त दमन युक्त Arabidopsis ट्रांसजेनिक रेखाओं की पीढ़ी शामिल है28,30,31, phenotype को टो नॉकआउट संयंत्रों का भ्रूण घातक रूप दिया३२,३३,३४,३५। सशर्त ट्रांसजेनिक लाइनों के अधिकांश एस्ट्राडियोल के नियंत्रण में हैं-, डेक्समेतएसॉनी-, या इथेनॉल inducible प्रवर्तक, जो भी इस hydroponic प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं ।
Arabidopsis में टो गतिविधि के प्रसिद्ध लक्ष्यों में से एक राइबोसोमल प्रोटीन S6 कळेनासे (S6K)३४,३६,३७,३८के प्रत्यक्ष फास्फारिलीकरण है । फास्फारिलीकरण पर, S6K आगे phosphorylates 40 राइबोसोमल प्रोटीन S6 (RPS6), राइबोसोमल प्रोटीन अनुवाद24,३९,४०को प्रभावित करने । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि एक RPS6 Ser240 साइट के फास्फारिलीकरण टो गतिविधि का एक अच्छा मार्कर24है । Immunoblotting परख की पुष्टि की है कि जल्द ही दवा प्रशासन के 30 मिनट के बाद, Ser240 फास्फारिलीकरण में एक महत्वपूर्ण कमी दोनों जड़ों और गोली मारता है (2 चित्रा) में मनाया गया । प्रायोगिक शर्तों के तहत इस्तेमाल किया, AZD-८०५५ भी एक शक्तिशाली टो अवरोध करनेवाला है, जो तेजी से अपनी कळेनासे गतिविधि दमित होना दिखाया गया है ।
टो जीन या टो परिसर के घटकों की एक कम अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों एक स्पष्ट स्टार्च अतिरिक्त phenotype28,31। स्टार्च का गुणात्मक विश्लेषण Lugol के समाधान का उपयोग diel चक्र (चित्रा 3) के दौरान स्टार्च संचय और क्षरण की उंमीद पैटर्न से पता चला । अंकुर कि DMSO या AZD के एक आवेदन प्राप्त नहीं हुआ-८०५५ रात के अंत में उनकी पत्तियों में स्टार्च का कोई बड़ा संचय दिखाया (एन), और नियंत्रण संयंत्रों में स्टार्च संचय (जो ०.०५% DMSO प्राप्त) साहित्य के अनुरूप था ४१ , ४२. इसके अलावा, AZD-८०५५ के साथ इलाज किया पौधों पर नियंत्रण अंकुर की तुलना में एन पर शेष स्टार्च की एक बड़ी राशि प्रस्तुत की । इन परिणामों ने शारीरिक स्थितियों में नकल उतारने वाले अंकुरों में प्रस्तावित hydroponic प्रणाली की उपयोगिता का संकेत दिया. इस प्रणाली भी स्टार्च अतिरिक्त phenotype टो जटिल24,28,31के एक दमन की खासियत की पुष्टि सक्षम होना चाहिए ।
स्टार्च सामग्री भी सही एक संवेदनशील पद्धति का उपयोग कर मापा गया था, का प्रदर्शन है कि AZD-८०५५ उपचार दिन के दोनों छोर पर स्टार्च के काफी उच्च स्तर युक्त अंकुर के लिए नेतृत्व (ED) और DMSO-इलाज नियंत्रण की तुलना में एन पौधे (चित्रा 4) । स्टार्च दिन के दौरान पत्तियों में जमा होता है और चयापचय गतिविधि को बनाए रखने के लिए रातोंरात जुटाया जाता है, मुख्य रूप से श्वसन और अन्य पादप अंगों को सुक्रोज के निरंतर निर्यात४१,४२. सामांय परिस्थितियों के तहत, केवल स्टार्च का एक छोटा सा अंश (के बीच 5% और 10% की राशि पर ED) EN४३,४४,४५पर रहता है । इन परिणामों का अनुप्रमाणित है कि diel चक्र पर सभी को टो दमन के तहत मनाया स्टार्च अतिरिक्त phenotype होता है ।
Hydroponically उगाए गए पौधों को abscisic अम्ल-उत्तरदायी तत्व-बाइंडिंग फैक्टर 3 (ABF3) जीन की अभिव्यक्ति के स्तर से संबंधित बहुत ही जलवायु परिस्थितियों के तहत एक बागवानी सब्सट्रेट में उगाया अंकुर की तुलना में किया गया (चित्रा 5 ए) ), जो सीधे आंतरिक आबा के स्तर के साथ संबद्ध, व्यापक रूप से एक कई अजैव तनाव प्रतिक्रियाओं में अपनी भूमिका के कारण मार्कर के रूप में जाना जाता हार्मोन के वर्ग४६,४७,४८. हालांकि hydroponic प्रणाली में उगाया अंकुर ABF3के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि पेश किया था, asparagine सिंथेस 1 (ASN1) की अभिव्यक्ति DMSO या AZD उपचार (चित्रा 5B) से प्रभावित नहीं था । हालांकि, trehalose फॉस्फेट सिंथेस 5 (TPS5) टो निषेध (चित्रा 5B) के 8 घंटे के बाद काफी बढ़ गया था । ASN1 और TPS5 कम और उच्च शर्करा के स्तर काजवाब ४९,५०,५१,५२,५३,५४, क्रमशः, सुझाव कि ये पौधे ऊर्जावान तनाव का अनुभव नहीं कर रहे थे ।
चित्रा 1 : hydroponic सिस्टम कोडांतरण के लिए कार्यप्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : के विभिन्न ऊतकों में RPS6 फास्फारिलीकरण पर टो निषेध का प्रभाव Arabidopsis थालियाना . Immunoblotting में कुल और phosphorylated RPS6 की बहुतायत से पता चलता है (क) जड़ और (ख) 2 µ एम AZD-८०५५ या ०.०५% DMSO (नियंत्रण) के साथ इलाज अंकुर का गोली मार अर्क । मान गैर-phosphorylated प्रोटीन RPS6 द्वारा सामान्यीकृत अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं । एंटी-actin एंटीबॉडी एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : Arabidopsis थालियाना Lugol के रिएजेंट के साथ दाग अंकुरित । 2 µ एम AZD-८०५५ या ०.०५% DMSO (नियंत्रण) के साथ उपचार एन (लाल तीर) पर लागू किया गया और नकली अंकुर (कोई उपचार) की तुलना में । अंकुर उपचार आवेदन से पहले काटा गया (0 एच) और में 12 एच (ED) और 24 ज (एन) उपचार के बाद, काले तीर से संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : के स्टार्च सामग्री पर टो निषेध का प्रभाव Arabidopsis थालियाना बनवली. स्टार्च enzymatically पहले मापा गया था (0 एच) और पर 12 एच (ईडी) या 24 एच (एन) के साथ उपचार के बाद 2 µ m AZD-८०५५ (काला) या ०.०५% DMSO (नियंत्रण, सफेद). दिखाया गया मान ± मानक त्रुटि (SE) (n = 4) का मतलब है । विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करके AZD-८०५५ और DMSO के साथ व्यवहार किए गए अंकुरों के बीच महत्वपूर्ण अंतर तारांकन चिह्न द्वारा दर्शाया गया है: * (p < ०.०५) और * * * (p < ०.००१) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : तनाव से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति स्तर । (क) hydroponically में ABF3 टेप की तुलना और सब्सट्रेट-बड़े Arabidopsis कर्नल-0 अंकुर. (ख) 2 µ m AZD-८०५५ और ०.०५% DMSO के साथ इलाज Arabidopsis अंकुरों में ASN1 और TPS5 टेप की तुलना । सामान्यीकृत व्यंजक स्तर 2 ^ (-डीसीटी) के रूप में दिखाए जाते हैं । दिखाया गया मान ± SE (n = 3) मतलब है । विद्यार्थी के t-परीक्षण का उपयोग करके महत्वपूर्ण अंतर, तारांकन चिह्न द्वारा इंगित किए गए हैं: * * * (P < ०.००१) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
अनुपूरक चित्रा 1:यह इन विट्रो hydroponic प्रणाली यह अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए संभव बनाता है और सजातीय अंकुर प्राप्त करते हैं । A. थालियाना (C3) और S. viridis (C4) के बीज इस प्रणाली में सीधे अंकुरित थे । (क और ग) अंकुर विकासात्मक अवस्था के संबंध में सजातीय थे और ११ डी (Arabidopsis) या ७ डी (Setaria) के बाद उपचार लागू किया गया. (बी और डी) जड़ों पोषक समाधान की ओर सीधे बढ़ता है, विभिंन पदार्थों और उनके अवशोषण के अलावा सुविधा । इन परिणामों का दृढ़ता से संकेत मिलता है कि इस प्रणाली के संयंत्र के विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करता है और कुशलतापूर्वक परख की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन किया जा सकता है । इसके अलावा, यह hydroponic प्रणाली बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यह अनुकूलित hydroponic संरचना इन विट्रो में सफल पौधों की संस्कृति सक्षम बनाता है । बीज पिपेट टिप सपाट सतह पर ठोस माध्यम पर अच्छी तरह से अंकुरित, जहां बीज पोषक तत्व समाधान के साथ भिगो रहे है प्रणालियों की तुलना में काफी लाभ । इस प्रणाली का एक बड़ा लाभ यह है कि अंकुर विकास के दौरान, जड़ों स्थानांतरण की आवश्यकता के बिना तरल माध्यम के साथ सीधे संपर्क में मिलता है । इसके अलावा, रासायनिक उपचार एक कम मात्रा में तरल माध्यम में आसानी से लागू किया जा सकता है । आर्द्रता उच्च रखा गया है, पोषक तत्व समाधान और इसकी भरपाई के वाष्पीकरण से परहेज । इसके अलावा, अंकुर स्थापना के दौरान समरूप वृद्धि और विकास आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, और इस विकासात्मक चरण1,10,18 पर छोटे टैंक और अंकुर के साथ काम करते समय वातन की आवश्यकता नहीं है . यह गारंटी देने के लिए कि प्रणाली संदूषणों से पूरी तरह मुक्त होगी, एक महत्वपूर्ण कदम इसकी विधानसभा के दौरान किसी भी सामग्री का इस्तेमाल किया और गहन देखभाल की नसबंदी है । असंभव के कारण आटोक्लेव में कुछ घटकों को निष्फल करने के लिए (जैसे, डिस्पोजेबल प्लास्टिक बक्से), यह दृढ़ता से पहले उंहें ७०% इथेनॉल के साथ स्पष्ट करने की सिफारिश की है और फिर उपयोग करने से पहले यूवी प्रकाश की एक छोटी अवधि लागू होते हैं । हमारे अनुभव में, यूवी प्रकाश का उपयोग, चिपकने वाला टेप के साथ सपाट सतह सील करने के बाद और मीडिया solidification के दौरान, भी बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण से बचा जाता है । इसके अलावा, मीडिया को छूने के लिए नहीं सतर्क हो, हमेशा अपने पार्श्व पक्ष द्वारा पिपेट रैक चलती ।
अंकुरों के इष्टतम विकास का आश्वासन देने के लिए, ठोस और तरल मीडिया के बीच निकट संपर्क पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है, बीज अंकुरण के बाद जड़ों का पूरा विसर्जन सुनिश्चित करना । ठोस माध्यम पर्याप्त रूप से सघन होना चाहिए (10 g/L आगर) और पूरी तरह से जम तो के रूप में सपाट सतह से ढीला नहीं है और पोषक तत्व समाधान में तैर । Arabidopsisके अलावा, इस प्रणाली को अंय प्रजातियों के पौधे उगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जब तक बीज काफी छोटे फ्लैट के कुओं फिट कर रहे हैं । इस अर्थ में, hydroponic विधि यहां प्रस्तुत Setaria viridis, एक छोटी सी घास है कि हाल ही में सी4 प्रकाश संश्लेषण, तनाव जीव विज्ञान, और अंय जैव ऊर्जा फसल लक्षण अध्ययन के लिए एक उपंयास मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है बढ़ती के लिए भी कुशल था ५५. Arabidopsisके समान, यह प्रणाली एक अच्छे रूट सिस्टम के साथ समान रूप से बढ़ते Setaria अंकुरों का उत्पादन करने की अनुमति देती है और बड़े पैमाने पर (अनुपूरक आंकड़ा 1), क्योंकि हर रैक ९६ बीज का समर्थन करता है, यह सुनिश्चित करने के लिए जैविक नकल प्रति कई अंकुर और, फलस्वरूप, अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के असंख्य के लिए पर्याप्त सामग्री । प्रतिकृति की एक उच्च संख्या सांख्यिकीय परीक्षण की क्षमता बढ़ जाती है, प्रयोगात्मक अध्ययन५६में और अधिक सटीक और विश्वसनीय परिणाम के लिए अग्रणी । उदाहरण के लिए, केवल १.५ मीटर2के एक क्षेत्र के साथ एक विकास चैंबर का उपयोग कर, हम एक साथ ६,००० अंकुर विकसित करने में सक्षम थे, यह एक वांछित उपचार के लिए प्रतिक्रिया के लौकिक कैनेटीक्स प्रदर्शन करने के लिए संभव बना. इसके अतिरिक्त, कई और पूरक ' ओमिक्स ' विश्लेषण के लिए काटा नमूनों का इस्तेमाल किया जा सकता है जो ऊतक (जैसे, immunoblotting) की एक बड़ी राशि की मांग कर सकते हैं । इस hydroponic संरचना समूहों के लिए विशिष्ट संयंत्र अंगों का विश्लेषण करने के लिए विशेष रुचि का है (जैसे, जड़ों और गोली मारता है), क्योंकि यह उनके आसान और तेजी से जुदाई सक्षम बनाता है ।
अध्ययनों की एक छोटी संख्या प्रारंभिक संयंत्र विकास के दौरान पिपेट टिप बक्से का उपयोग करने से पहले एक स्थानांतरण से बड़ा hydroponic टैंक11,20, और अधिक हाल ही में वर्णित है, एक बहुत ही प्रणाली के लिए अमीनो का मूल्यांकन कार्यरत था एसिड में और translocation 5 सप्ताह पुराने Arabidopsis ५७पौधों में । यहां वर्णित प्रोटोकॉल बाँझ शर्तों के तहत पौधों की खेती के संदर्भ में अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है ।
हालांकि इस प्रणाली शुरू में अंकुर विकसित किया गया था, यह भी बड़ा पौधों के लिए उपयुक्त हो सकता है । इस परिदृश्य में, यह उल्लेखनीय है कि देखभाल के लिए बीज एक दूसरे से अधिक दूर जगह के रूप में विकास के दौरान संभव के रूप में ज्यादा छायांकन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए लायक है । इसके अलावा, वातन रैक में पेश किया जा सकता है पिपेट टिप फ्लैट, जलमग्न Arabidopsis जड़ों में एक आम समस्या की अच्छी तरह से एक के माध्यम से हाइपोक्सिया को रोकने के लिए लंबी अवधि के लिए बढ़ रही है । उनके sessile प्रकृति के कारण, पौधों अजैव और बायोटिक तनाव के कई प्रकार के अधीन हैं, उनके आसपास के वातावरण पर निर्भर करता है । इसलिए, अध्ययन के उद्देश्य और विकास के चरण पर विचार, यह महत्वपूर्ण हो सकता है अगर इस प्रणाली में बढ़ रही पौधों तनाव के किसी प्रकार से पीड़ित है पर नजर रखने के लिए ।
यहां प्रस्तुत परिणामों से पता चला है कि इस hydroponic प्रणाली बहुत पोषक समाधान करने के लिए रसायनों के आवेदन के लिए उपयोगी है, विशेष रूप से जब महंगी पदार्थों के साथ काम, पिपेट टिप रैक की छोटी मात्रा के कारण । हम इस प्रणाली का उपयोग करने में सफल रहा है के लिए प्रभावी ढंग से AZD-८०५५ द्वारा टो कळेनासे की गतिविधि दमन और पुष्टि की कि इसके बहाव लक्ष्य RPS6 के फास्फारिलीकरण स्थिति पहले से ही प्रभावित है 30 उपचार आवेदन के मिनट के बाद । इसके अलावा, टो निषेध नियंत्रण अंकुर की तुलना में दिन और रात के दौरान उच्च स्टार्च के स्तर युक्त अंकुर की ओर जाता है । इस तरह की परख आसानी से ट्रांसजेनिक लाइनों के साथ पहले से ही प्राप्त टिप्पणियों का विस्तार करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, एक inducible के दमन की अनुमति जीन-टो परिसर, या ब्याज की किसी अंय मार्ग के घटकों एंकोडिंग । संक्षेप में, प्रस्तावित hydroponic प्रणाली कई फायदे के पास क्योंकि यह बहुत आसान है और इकट्ठा करने के लिए आसान है, एक कम लागत (प्रमुख घटक सस्ते होते है और बड़े पैमाने पर पुनः उपयोग किया जा सकता है), बहुमुखी है (बरकरार अंकुर या विशिष्ट ऊतकों के अध्ययन में सक्षम बनाता है , विशिष्ट या साथ में संयंत्र विकासात्मक चरणों), और अत्यधिक स्केलेबल है (यह एक बहुत छोटे क्षेत्र में अंकुर की एक बड़ी संख्या की खेती की अनुमति देता है) ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन (FAPESP द्वारा समर्थित किया गया था; ग्रांट 12/19561-0) और मैक्स प्लैंक सोसायटी । एलियास एफ Araújo (FAPEMIG 14/30594), कैरोलिना सी. मोंटे-Bello (FAPESP; अनुदान 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; अनुदान 14/07918-6), और विवियन सी. एच. डा सिल्वा (CAPES/CNPEM 24/2013) फैलोशिप के लिए आभारी हैं । लेखकों को उदारता RPS6 के खिलाफ एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए Institut जीन पियरे Bourgin (इणरा, Versailles, फ्रांस) से ईसाई मेयेर धंयवाद । लेखकों RTV UNICAMP और एड पाउलो Aparecido de Souza Manoel ऑडियो रिकॉर्डिंग के दौरान उनके तकनीकी समर्थन के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
