Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Sistema hidropónico de un Flexible bajo costo para evaluar las respuestas de la planta a moléculas pequeñas en condiciones estériles

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57800
* These authors contributed equally

Summary

Un sistema hidropónico simple, versátil y de bajo costo en vitro con éxito fue optimizado, permitiendo experimentos a gran escala bajo condiciones estériles. Este sistema facilita la aplicación de productos químicos en una solución y su eficiente absorción por las raíces para estudios moleculares, bioquímicos y fisiológicos.

Abstract

Una amplia gama de estudios en biología vegetal se realizan utilizando cultivos hidropónicos. En este trabajo se presenta un sistema de crecimiento hidropónico en vitro diseñado para evaluar las respuestas de la planta a productos químicos y otras sustancias de interés. Este sistema es altamente eficiente en la obtención de plántulas homogéneas y saludables del C3 y C4 modelo especie Arabidopsis thaliana y Setaria viridis, respectivamente. El cultivo estéril evita algas y contaminación por microorganismos, que son factores limitantes para el normal crecimiento y desarrollo en hidroponia. Además, este sistema es escalable, lo que permite la recolección del material vegetal a gran escala con menor daño mecánico, así como la cosecha de las partes individuales de una planta si se desea. Se proporciona un protocolo detallado que demuestra que este sistema tiene un conjunto fácil y de bajo costo, ya que usa pipeta racks como la principal plataforma para el crecimiento de las plantas. La viabilidad de este sistema fue validada utilizando plántulas de Arabidopsis para evaluar el efecto de la droga AZD-8055, un inhibidor químico de la blanco de la rapamicina (TOR) quinasa. Inhibición de TOR eficiente fue detectada tan pronto como 30 minutos después de un tratamiento de AZD-8055 en raíces y brotes. Además, las plantas tratadas por AZD-8055 muestran el fenotipo esperado de exceso de almidón. Hemos propuesto este sistema hidropónico como un método ideal para que investigadores de planta con el objetivo de monitorear la acción de la planta de inductores o inhibidores, así como para evaluar flujos metabólicos utilizando compuestos de isótopos de etiquetado que, en general, requiere el uso de costosos reactivos.

Introduction

Las ventajas de plantas utilizando hidroponía han sido ampliamente reconocidas en la producción de plantas grandes y uniformes, permitiendo experimentos reproducibles1,2,3. En este sistema, la composición de la solución nutritiva puede ser adecuadamente controlada y reciclada a lo largo de todas las etapas de desarrollo y crecimiento de las plantas. Además, las raíces no están sujetos a estreses abióticos, como puede suceder en plantas cultivadas en suelo, tales como nutrientes agua y hambre deficiencia4. Como plantas cultivadas hidropónico presentes características morfológicas y fisiológicas bastante similares a las cultivadas en suelo, este sistema ha sido ampliamente empleado en la investigación porque permite el monitoreo del crecimiento de la raíz/vástago y su cosecha sin lesiones de2,5.

Debido a la posibilidad de cambiar la composición y concentración de la solución nutritiva, la mayoría de la investigación usando condiciones hidropónicas se ha realizado para caracterizar las funciones de micro y macronutrientes1,3 ,6,7,8. Sin embargo, este sistema ha demostrado para ser muy útil para una amplia gama de aplicaciones en Biología Vegetal, tal como aclarar las funciones de las hormonas y productos químicos en las plantas. Por ejemplo, el descubrimiento de strigolactones como una nueva clase de hormonas9 y el fenotipo de crecimiento acelerado por brassinosteroid aplicación10 fueron realizados bajo condiciones hidropónicas. Por otra parte, este sistema permite que los experimentos con isótopos marcados (por ejemplo, 14N /15N y 13CO2)11,12 para evaluar su incorporación a las proteínas y metabolitos por espectrometría de masas.

Considerando la importancia de este sistema en la investigación de la planta, se ha diseñado un gran número de cultivos hidropónicos en los últimos años, incluidos los sistemas que utilizan (i) la transferencia de plántulas de placas para recipientes hidropónicos3, 13; (ii) lana de roca que limita el acceso a las primeras etapas de desarrollo de raíz2,14,15; (iii) polietileno granulado como el cuerpo flotante, que hace la aplicación homogénea de pequeñas moléculas/tratamientos difícil16; o (iv) un reducido número de plantas9,17. El volumen de los tanques hidropónicos se describe en muchos de los protocolos son generalmente grandes (pequeños volúmenes que van desde 1-5 L, hasta 32 L)18, que hace muy costosa la aplicación de productos químicos. Aunque algunos estudios describen un cultivo hidropónico bajo condiciones asépticas8,19, la Asamblea del sistema suele ser muy laborioso, que consiste en el perfecto ajuste de mallas de nylon en plástico o vidrio envases5,8,17,20.

Debido a la importancia de Arabidopsis thaliana , planta modelo, la mayoría de los sistemas hidropónicos fueron diseñada para esta especie1,2,8,14,18, 19 , 20. sin embargo, hay pocos estudios sobre las características de crecimiento hidropónico de otras especies de plantas con un tratamiento previo de semillas para mejorar su germinación y sincronización de precios en vitro8,16 . Para trabajar en gran escala, hemos desarrollado un protocolo para la creación de un sistema hidropónico de mantenimiento simple y bajo costo que permite a las condiciones de esterilidad para el cultivo de plantas, incluyendo a. thaliana y otras especies como el pasto Setaria viridis. El método descrito aquí es conveniente para diversos experimentos, como el crecimiento de las plántulas puede maximizado, sincronizado y fácilmente controlado. Además, este sistema tiene muchas ventajas como: (i) su montaje es sencillo y sus componentes pueden ser reutilizados; (ii) permite la fácil aplicación de diferentes productos químicos en el medio líquido; (iii) las plántulas germinan y crecen directamente en el medio de cultivo sin necesidad de transferencia para el sistema de hidroponía; (iv) el crecimiento desarrollo de brote y la raíz puede ser supervisado de cerca y las plántulas se cosechan sin daños; y (v) permite trabajar a gran escala, manteniendo las condiciones fisiológicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparación de medios de cultivo líquidos y sólidos

  1. Preparar un medio líquido con medio de Murashige y Skoog (MS) de resistencia media de vitaminas [0,0125 mg/L de cloruro de cobalto (II) pentahidratado, 0,0125 mg/L de cobre (II) sulfato pentahidrato, 18,35 mg/L de sodio férrico ethylenediaminetetraacetate, 3,10 mg/L de ácido bórico, 0,415 mg/L de yoduro de potasio, 8,45 mg/L de manganeso sulfato monohidrato, 0,125 mg/L de molibdato de sodio dihidratado, 4,30 mg/L de sulfato de zinc heptahidratado, 166,01 mg/L de cloruro de calcio, 85 mg/L de fosfato de biácido del potasio, 950 mg/L de nitrato de potasio 90,27 mg/L de sulfato de magnesio, 825 mg/L de nitrato de amonio, 1 mg/L de glicina, 50 mg/L de myo-inositol, 0,25 mg/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de clorhidrato de piridoxina y 0,05 mg/L de clorhidrato de tiamina] complementan con 0,25 g/L de MES y ajustar el pH a 5,8 con 10 M de KOH.
  2. Añadir 10 g/L de agar para hacer un medio MS sólido de resistencia media. Autoclave el medio a 121 ° C durante 20 minutos antes de usar.

2. hidropónico sistema de montaje

Nota: Estos pasos se deben seguir meticulosamente para construir el sistema hidropónico.

  1. Esterilización de material
    1. Paquete en la bolsa de autoclave la pipeta racks (sin cubiertas) que se utilizará como minitanks. Autoclave de los estantes en 121 ° C durante 20 min, 15 psi.
      Nota: La rejilla de la punta de pipeta polipropileno utilizamos tenía las siguientes dimensiones: 120 mm (largo) x 89 mm (ancho) x 55 mm (altura). La superficie plana de la punta de pipeta debe tener un área para la adición de medio de cultivo. Pueden utilizarse otros estantes de punta (véase Tabla de materiales).
      Nota: Durante todo el procedimiento de montaje del sistema hidropónico, es necesario utilizar una campana de flujo laminar, que debe limpiarse y desinfectarse con antes del etanol al 70% de uso. El experimentador debe usar una bata, lavarse las manos y expuestas de la piel y desinfectar con etanol al 70%. Los guantes son opcionales, excepto el uso de la droga.
    2. Limpie todos los accesorios descritos anteriormente (cajas de plástico desechables, cinta adhesiva, pipetas, tijeras y pinzas) con etanol al 70% antes de entrar en la campana de flujo laminar. Si permite que la campana, encienda la luz UV durante 10 min antes del montaje del sistema hidropónico para mantener el área de trabajo descontaminado.
  2. Minitank montaje
    1. Sellar la superficie superior de la punta de la pipeta con cinta adhesiva (figura 1B). Si es posible, dejarlo bajo UV luz durante 10 minutos.
    2. Añadir 180 μl fundido sólido MS de medio de cultivo (levemente tibia) a cada pocillo con una pipeta multicanal (figura 1).
      Nota: Cuando prepare muchos tanques, utilice una placa para evitar que el medio MS de solidificación.
    3. Permitir que el medio se solidifique completamente (por aproximadamente 30 min).
      Nota: Durante la solidificación, la luz UV puede ser activada.
    4. Llenar la rejilla de la punta de pipeta completo con medio de cultivo MS líquido (figura 1) y asegúrese de hay estrecho contacto entre el sólido y el medio líquido.
    5. Retire las cintas adhesivas de la superficie superior de la punta plana y colocarlo sobre la parrilla cuidadosamente. El sistema hidropónico está ahora listo para recibir las semillas esterilizadas.

3. esterilización de las semillas

  1. Colocar 500 semillas de Arabidopsis en un microtubo de 1.5 mL. Utilice tantos microtubos como necesaria según el número de plantas necesarias para el experimento.
  2. Lavar las semillas con etanol al 70% por 2 min con una agitación suave. Deje que las semillas establecen, a continuación, retire cuidadosamente el etanol.
  3. Añadir 1 mL de una solución de hipoclorito de sodio al 10% que contiene 2 μl de un detergente de polisorbato 20. Agitar la solución durante 5 minutos Retire con cuidado la solución.
  4. Enjuagar las semillas con agua destilada estéril hasta que todo el residuo de cloro es totalmente eliminada (aproximadamente 5 x).
    Nota: Después de la esterilización superficial, las semillas se sumerge en agua destilada estéril y estratificadas a 4 ° C en la oscuridad durante 5 d sincronizar la germinación.
    Nota: Semillas de Setaria viridis (adhesión A10.1) se incuba en ácido sulfúrico concentrado durante 15 min (romper la latencia física), lavar bien en agua destilada estéril y luego desinfestadas con una solución de hipoclorito de sodio al 5% que contiene 0.1% polisorbato 20 por 5 min con una agitación suave21. Los pasos restantes de la esterilización eran idénticos a los descritos para las semillas de Arabidopsis .

4. semilla aplicación

  1. Cortar un poco la extremidad de una punta de 200 μL con la ayuda de un bisturí estéril.
  2. Pipetear las semillas de Arabidopsis en el medio de cultivo sólido en la superficie superior de la punta plana. Cuidar que el medio no afloje de la plana; de lo contrario, las semillas serán ocultadas y las plantas no crecerán adecuadamente (Figura 1E).
    Nota: Use una pinza estéril para semillas de Setaria (con el embrión ubicado hacia arriba).
  3. Almacenar minitanks tantos como sea posible dentro de una caja de plástico desechable para mantener una humedad alta y mantener el ambiente libre de microorganismos (Figura 1F).
  4. Sello de la caja de plástico desechable con cinta adhesiva para evitar la contaminación.
  5. Coloque los sistemas hidropónicos en una cámara de crecimiento con las condiciones de crecimiento apropiado para la planta de interés.
    Nota: En este trabajo, se utilizaron las siguientes condiciones: 75% de humedad y 150 μmol m-2 s-1 de radiación y las condiciones equinocciales de 12 h luz (21 ° C) / 12 h oscuro (19 ° C) de Arabidopsis, o 300 μmol m-2 s-1 de irradiancia y 12 h de luz (28 ° C) / 12 h. oscuro (25 ° C) Setaria (figura 1 y la 1 H).

5. validar el uso de este sistema hidropónico para inhibir la cinasa del blanco de rapamicina

Nota: Este sistema hidropónico fue inicialmente desarrollado para facilitar la administración de productos químicos a las plantas, que, en general, son muy costosas para su aplicación en experimentos a gran escala. Como una prueba de concepto, el inhibidor competitivo ATP AZD-8055, que se sabe para apuntar específicamente el sitio de unión del ATP de la TOR proteína quinasa22, fue empleado para siga la represión de la actividad de TOR en plántulas de a. thaliana () Colombia 0 El centro de Nottingham Arabidopsis Stock, NASC ID: N22681). Aquí, brevemente se describe el protocolo utilizado.

  1. Crecer hidropónico semillas de hasta etapa 1.04 según el BBCH escala23 (para aproximadamente 11 d) bajo las condiciones climáticas descritas anteriormente. Reemplazar la solución nutritiva, ya sea con fresco medio que contiene 0,05% DMSO (control), 2 μm AZD-8055 (inhibidor de la TOR) diluido en DMSO, o sin tratamiento (mofa), el final de la noche (EN).
  2. Algunas plántulas en diferentes momentos de la cosecha después del tratamiento y separarlos en raíces y brotes. Congelar las muestras en nitrógeno líquido, muele a un polvo fino en un molino robótico (véase Tabla de materiales) y almacenar el polvo a-80 ° C hasta su uso.
  3. Immunoblot contra fosforiladas y no fosforilados formas de 40S ribosomal de la proteína S6 (RPS6) según Dobrenel et al. 24.
  4. Bleach plántulas intactas para la despigmentación de la muestra, lavar en agua destilada, sumergirlos en una solución de yodo por 5 minutos25y fotografiar las plántulas en un estereomicroscopio (0.63 X objetivo, aproximación de x 20 y 7.5 magnitud x) para un evaluación cualitativa del contenido de almidón.
  5. Cuantificar el almidón después de la degradación enzimática y medición de la glucosa liberada mediante espectrofotometría por acoplamiento a la reducción de NADP+ a NADPH26,27.
  6. Realizar una extracción de RNA total, una síntesis del cDNA, y ensayos de RT-PCR cuantitativa de Caldana et al. 28 evaluar el nivel de expresión de genes relacionados con distintos tipos de tensiones.
  7. Opcionalmente, crecer las plántulas en sustrato hortícola en macetas de plástico con una capacidad de 0.1 L bajo condiciones climáticas similares [60% de humedad, 150 μmol m-2 s-1 de la irradiación y condiciones equinocciales de 12 h luz (21 ° C) / 12 h oscuro (19 ° C )] con el fin de compararlas con las plantas de semillero hidropónico cultivados.
    Nota: Los genes blanco utilizados para los ensayos de expresión genética fueron ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340) y TPS5 (At4g17770) y sus niveles de expresión se normalizaron empleando el método de delta-Ct29 usando ACT2 (At3g18780) o PDF2 (At4g04890) como los genes de referencia interna, asumiendo el 100% de eficiencia de amplificación de PCR a través de todas las muestras. Los pares de oligonucleótidos utilizados para la PCR cuantitativa fueron: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) y PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La quinasa TOR es un regulador importante que integra nutrientes y energía de señalización promover la proliferación celular y crecimiento en todos los eucariotas. Esfuerzos por aclarar las funciones de TOR en plantas incluyen la generación de líneas transgénicas de Arabidopsis que contiene represión condicional TOR a través de ARN de interferencia o microRNA artificiales28,30,31, dado el fenotipo letal embrión de TOR nocaut plantas32,33,34,35. La mayoría de las líneas transgénicas condicionales está bajo el control de estradiol, dexametasona, o promotores inducible por etanol, que también podrían hacer usan de este sistema hidropónico.

Uno de los objetivos conocidos de la actividad de TOR en Arabidopsis es la fosforilación directa de la proteína ribosomal S6 kinasa (S6K)34,36,37,38. A fosforilación, S6K además fosforila la proteína ribosomal S6 de 40S (RPS6), que afectan a la proteína ribosomal traducción24,39,40. Recientemente, se ha demostrado que la fosforilación de un sitio RPS6 Ser240 es un buen marcador de actividad de TOR24. Immunoblotting análisis confirman que pronto después de 30 min de la administración de la droga, se observó una disminución significativa en la fosforilación Ser240 en raíces y brotes (figura 2). Bajo las condiciones experimentales utilizadas, AZD-8055 también ha demostrado ser un inhibidor potente de TOR, que rápidamente reprime su actividad quinasa.

Líneas transgénicas de Arabidopsis con una expresión reducida del gen TOR o componentes del TOR complejo presentan un fenotipo exceso de almidón claro28,31. Análisis cualitativo de almidón utilizando solución de Lugol reveló el patrón esperado de acumulación de almidón y degradación durante el ciclo diel (figura 3). Plántulas que no recibieron una aplicación de DMSO o AZD-8055 no demostraron una mayor acumulación de almidón en las hojas al final de la noche (EN), y la acumulación de almidón en las plantas control (que recibió 0.05% DMSO) era constante con la literatura 41 , 42. Además, las plantas tratadas con AZD-8055 presentaron una mayor cantidad de almidón restante en el at en comparación con las plantas control. Estos resultados indican la utilidad del sistema propuesto hidropónica en el cultivo de plántulas imitando las condiciones fisiológicas. Este sistema también permitió la confirmación del fenotipo de exceso de almidón de una represión de los complejos componentes de TOR24,28,31.

Contenido de almidón también con precisión se midió utilizando una metodología sensible, demostrando que el tratamiento de AZD-8055 llevó a las plantas de semillero que contiene niveles significativamente más altos de almidón al final del día (ED) y EN comparación con el control tratados con DMSO plantas (figura 4). Almidón se acumula en las hojas durante el día y es removilizado durante la noche para sostener la actividad metabólica, principalmente la respiración y la continua exportación de sacarosa a otra planta órganos41,42. En condiciones normales, sólo una pequeña fracción de almidón (entre 5% y 10% de la cantidad en el ED) sigue siendo el EN43,44,45. Estos resultados atestiguan que el almidón sobrante fenotipo observado bajo la represión de TOR se produce en el ciclo diel.

Plantas cultivadas hidropónico se compararon con las plántulas cultivadas en un sustrato hortícola bajo condiciones climáticas muy similares con respecto a la expresión nivel del factor de unión a elemento sensible al ácido abscísico 3 gene (ABF3) (figura 5A ), que directamente se correlaciona con interna ABA los niveles, una clase de hormonas conocido como marcador debido a su papel en múltiples estreses respuestas46,47,48. Aunque las plántulas cultivadas en sistema hidropónico mostró un aumento significativo en el nivel de ABF3, la expresión de la asparragina sintetasa 1 (ASN1) no fue afectada por los tratamientos de DMSO o AZD (figura 5B). Sin embargo, trehalosa fosfato sintasa 5 (TPS5) aumentó significativamente después de 8 h de la inhibición de TOR (figura 5B). ASN1 y TPS5 responden a bajas y altas de azúcar los niveles49,50,51,52,53,la54, respectivamente, sugiriendo que estas plantas no estaban experimentando estrés energético.

Figure 1
Figura 1 : Flujo de trabajo para ensamblar el sistema hidropónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Efecto de la inhibición de TOR en la fosforilación de RPS6 en diversos tejidos de Thaliana de Arabidopsis . Immunoblotting muestra la abundancia de la RPS6 total y fosforilada en la raíz de (A) y (B) sesión de extractos de plantas trataron con 2 μm AZD-8055 o 0.05% DMSO (control). Los valores representan relaciones normalizadas por la proteína no fosforilada RPS6. Anticuerpo anti-actina se utilizó como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Thaliana de Arabidopsis plántulas de tinción con reactivo de Lugol. Tratamientos con 2 μm AZD-8055 o 0.05% DMSO (control) fueron aplicados en el at (flecha roja) y en comparación con los simulacros de las plántulas (sin tratamiento). Plántulas fueron cosechadas antes de la aplicación del tratamiento (0 h) y a las 12 h (ED) y 24 h (EN) después del tratamiento, indicadas por la flechas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Efecto de la inhibición de TOR en el contenido de almidón de Thaliana de Arabidopsis plántulas. Almidón se midió enzimático antes (0 h) y a las 12 h (ED) o 24 h (EN) después del tratamiento con 2 μm AZD-8055 (negro) o 0.05% DMSO (control, blanco). Los valores mostrados son el promedio ± el error estándar (SE) (n = 4). Diferencias significativas entre las plántulas trataron con AZD-8055 y DMSO, usando de Student t-test, se indican con asteriscos: * (P < 0,05) y *** (P < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Nivel de expresión de genes relacionados con estrés. (A) comparación de las transcripciones de ABF3 en hidropónico y cultivado en sustrato Arabidopsis Col-0. (B) comparación de las transcripciones ASN1 y TPS5 en plántulas de Arabidopsis tratados con 2 μm AZD-8055 y 0.05% de DMSO. Los niveles de expresión normalizada se muestran como 2^(-dCt). Los valores mostrados son el promedio ± SE (n = 3). Diferencias significativas, uso de Student t-test, se indican con asteriscos: *** (P < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Complementarios figura 1:esta en vitro sistema hidropónico es posible sincronizar la germinación y obtener plántulas homogéneas. Se germinaron semillas de a. thaliana (C3) y S. viridis (C4) directamente en este sistema. (A y C) las plantas de semillero fueron homogéneos en relación a la etapa de desarrollo y el tratamiento se aplicó después de 11 d (Arabidopsis) o 7 d (Setaria). (B y D) las raíces crecen directamente hacia la solución nutritiva, facilita la adición de diversas sustancias y su absorción. Estos resultados indican fuertemente que este sistema ofrece un ambiente óptimo para el crecimiento vegetal y puede usarse para realizar eficientemente una amplia gama de ensayos. Además, este sistema hidropónico es muy útil para los experimentos a gran escala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Esta estructura optimizada de la hidroponía permite el cultivo exitoso en vitro de plantas. Las semillas germinan bien en el medio sólido en la superficie plana de la punta de pipeta, un considerable aumento en comparación con sistemas donde las semillas se empapan con la solución nutritiva. Una gran ventaja de este sistema es que durante el desarrollo de las plántulas, las raíces directamente en contacto con el medio líquido sin necesidad de transferencia. Por otra parte, tratamiento químico puede aplicarse fácilmente en el medio líquido en un volumen reducido. Humedad se mantiene alta, evitando la evaporación de la solución nutritiva y su reposición. Además, crecimiento homogéneo y desarrollo durante el establecimiento de la plántula pueden obtenerse fácilmente, y aireación no es necesaria cuando se trabaja con pequeños tanques y plantas de semillero en esta etapa de desarrollo1,10,18 . Para garantizar que el sistema estará completamente libre de contaminantes, un paso crítico es la esterilización de los materiales utilizados y cuidados intensivos durante su Asamblea. Debido a la imposibilidad de esterilizar algunos componentes en el autoclave (p. ej., cajas de plástico desechables), se recomienda primero limpiar con etanol al 70% y aplicar luego un corto período de antes de usar luz UV. En nuestra experiencia, el uso de luz UV, después de sellar la superficie con cinta adhesiva y durante la solidificación de medios de comunicación, también evita la contaminación bacteriana y fúngica. Además, tenga cuidado no a los medios de comunicación, siempre en movimiento los estantes de la pipeta por la parte lateral.

Para asegurar el óptimo crecimiento de las plántulas, es importante controlar el contacto entre los medios sólidos y líquidos, asegurando la completa inmersión de las raíces después de la germinación de la semilla. El medio sólido debe ser suficientemente denso (agar 10 g/L) y totalmente solidificada hasta que no se afloje de la superficie plana y flotando en la solución nutritiva. Además de Arabidopsis, este sistema puede utilizarse para el cultivo de otras especies de plantas, como las semillas son lo suficientemente pequeñas para caber los pozos de la plana. En este sentido, el método hidropónico presentado aquí también fue eficiente para el cultivo de Setaria viridis, una hierba pequeña que ha surgido recientemente como nuevo modelo para estudiar la fotosíntesis4 C, biología del estrés y otras características de los cultivos bioenergéticos 55. Similar a Arabidopsis, este sistema permite para producir plántulas de Setaria uniformemente crecientes con un buen sistema radical y a gran escala (suplementario figura 1), porque cada estante Soporta 96 semillas, asegurando muchas plántulas por repetición biológica y, en consecuencia, suficiente material para una miríada de aplicaciones posteriores. Un mayor número de repeticiones aumenta la eficacia de la prueba estadística, conduce a resultados más precisos y confiables en estudios experimentales56. Por ejemplo, utilizando una cámara de crecimiento con un área de sólo 1,5 m2, hemos podido crecer 6.000 plántulas simultáneamente, lo que es posible realizar cinética temporal de la respuesta al tratamiento deseado. Además, las muestras recolectadas se pueden utilizar para múltiples y complementarios 'omicas' analizan que puede exigir una gran cantidad de tejido(por ejemplo, el immunoblotting). Esta estructura hidropónica es de especial interés para grupos con el objetivo de analizar distintos órganos (p. ej., raíces y brotes), ya que permite su fácil y rápida separación.

Un pequeño número de estudios describe el uso de cajas de punta de pipeta durante el desarrollo de la planta inicial antes de una transferencia a grandes tanques hidropónicos11,20, y más recientemente, un sistema muy similar se empleó para evaluar el amino ácido absorción y translocación en 5 semanas de edad de las plantas de Arabidopsis 57. El protocolo descrito aquí proporciona beneficios adicionales en términos de cultivar las plantas en condiciones estériles.

Aunque este sistema fue inicialmente desarrollado para crecer las plantas de semillero, también podría ser conveniente para las plantas más grandes. En este escenario, cabe mencionar que se debe tener cuidado al colocar las semillas más distantes unos de otros para evitar tanta sombra como sea posible durante el crecimiento. Además, la aireación puede ser introducida en las rejillas para prevenir la hipoxia a través de un pozo de la punta plana, un problema común en las raíces de Arabidopsis sumergidos por períodos más largos de crecimiento. Debido a su naturaleza sésil, las plantas son sometidas a varios tipos de estreses bióticos y abióticos, dependiendo de su entorno. Por lo tanto, teniendo en cuenta el objetivo del estudio y la etapa de desarrollo, sería importante controlar si las plantas que crecen en este sistema están sufriendo de algún tipo de estrés.

Los resultados aquí presentados han demostrado que este sistema hidropónico es muy útil para la aplicación de productos químicos a la solución nutritiva, especialmente cuando se trabaja con sustancias costosas, dado el escaso volumen de las rejillas de la punta de pipeta. Hemos tenido éxito en el uso de este sistema para reprimir eficazmente la actividad de la quinasa TOR por AZD-8055 y confirmó que el estado de fosforilación de su destino posterior RPS6 ya se ve afectado después de 30 minutos de aplicación de tratamiento. Además, TOR inhibición conduce a las plantas de semillero que contiene niveles más altos de almidón durante el día y la noche en comparación con las plantas de semillero de control. Tales análisis pueden emplearse fácilmente para ampliar las observaciones ya obtenidas con líneas transgénicas, permitiendo una represión inducible de los componentes de codificación del gene del TOR complejos, o cualquier otra vía de interés. En Resumen, el sistema hidropónico propuesto posee muchas ventajas ya que es muy fácil y simple de montar, tiene un bajo costo (los principales componentes son baratos y pueden ser reutilizados extensivamente), versátil (permite el estudio de plantas intactas o tejidos distintos en específico o a lo largo de etapas del desarrollo de la planta) y es altamente escalable (permite el cultivo de un gran número de plántulas en un área muy pequeña).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación de São Paulo (FAPESP; La concesión 19561/12-0) y la sociedad Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407/14-3), Valeria Mafra (FAPESP; Concesión 14/07918-6), y Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) estamos muy agradecidos por el programa de becas. Los autores agradecen la generosamente proporciona anticuerpos contra RPS6 de Christian Meyer de la Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versalles, Francia). Los autores agradecen RTV UNICAMP y Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza por su apoyo técnico durante el audio grabación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).

Tags

Ciencias ambientales número 138 sistema hidropónico cultivo en vitro moléculas pequeñas Arabidopsis thaliana Setaria viridis pipeta de punta parrilla blanco de rapamicina inhibidor AZD-8055
Sistema hidropónico de un Flexible bajo costo para evaluar las respuestas de la planta a moléculas pequeñas en condiciones estériles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F.,More

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C. M., Mafra, V., da Silva, V. C. H., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter