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Bioengineering

मानव Saphenous नसों के लिए Decellularization और Recellularization पद्धति

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57803

Summary

यहां, हम saphenous नस परिधीय रक्त और endothelial माध्यम के छिड़काव द्वारा डिटर्जेंट और recellularization का उपयोग decellularization के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

संवहनी सबसे संवहनी सर्जरी के दौरान इस्तेमाल नाली allogeneic या सिंथेटिक भ्रष्टाचार है कि अक्सर प्रतिरक्षादमन और गरीब प्रत्यक्षता की वजह से जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर रहे हैं । टिशू इंजीनियरिंग एक उपंयास समाधान प्रदान करता है एक प्राकृतिक extracellular प्राप्तकर्ता के decellularization और recellularization की विधि का उपयोग कर कोशिकाओं युक्त मैट्रिक्स के साथ व्यक्तिगत भ्रष्टाचार उत्पंन करते हैं । हम परिधीय रक्त के छिड़काव द्वारा मानव saphenous नस और recellularization के decellularization प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत विधि दिखाते हैं । नस perfusing 1% ट्राइटन एक्स-१००, 1% त्रि-n-butyl-फॉस्फेट (TnBP) और Kunitz (deoxyribonuclease) की २,००० DNase इकाइयों द्वारा किया गया । ट्राइटन X-१०० और TnBP 4 ज के लिए ३५ एमएल/मिनट पर perfused थे जबकि DNase 4 एच के लिए ३७ ° c पर 10 मिलीलीटर/ नस ultrapure पानी और पंजाब में धोया और फिर ०.१% peracetic एसिड में निष्फल था । इसे फिर से पंजाबियों में धोया गया और endothelial मीडियम में इसकी कंडीशनिंग की गई. नस एक प्रतिperfused से जुड़ा था और endothelial मध्यम के साथ ५० IU/एमएल हेपरिन के लिए 1 ज. Recellularization ताजा रक्त, Steen समाधान में पतला 1:1 के साथ प्रतिक्रिया को भरने के द्वारा किया गया था, और अंत में स्रावी ग्रंथि-व्युत्पन्न संवहनी जोड़ने endothelial वृद्धि कारकों (८० एनजी/एमएल), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारकों (4 µ एल/एमएल), और एसिटाइल चिरायता एसिड (5 µ g/एमएल) । इस प्रतिक्रिया के बाद एक मशीन में ले जाया गया था और perfused के लिए ४८ एच में 2 मिलीलीटर/मिनट 3-9 mmol के बीच ग्लूकोज को बनाए रखने/ बाद में, नस पंजाबियों के साथ धोया, endothelial मध्यम और perfused के लिए मशीन में ९६ ज के लिए भर गया था । ट्राइटन एक्स-१००, TnBP और DNase के साथ उपचार 5 चक्रों में saphenous नस को विसेलुलर । सेल् फी को सामां य और सेल् फी नसों (हल् का लाल) के विपरीत सफेद देखा गया । hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला नाभिक की उपस्थिति केवल सामांय में नहीं बल्कि सेलुलर नसों में दिखाया । recellular नस, एच और ई में दाग-नस की चमकदार सतह पर कोशिकाओं की उपस्थिति दिखाई दिया ।

Introduction

संवहनी नाली aneurysms की तरह कई नैदानिक स्थितियों के लिए आवश्यक हैं, मन्या धमनी का रोग और गंभीर संवहनी समस्याओं के लिए अग्रणी atherosclerosis. सर्जन कार्यात्मक रक्त की आपूर्ति को बहाल करने के लिए ऑटोलॉगस, allogeneic या सिंथेटिक संवहनी नाली का उपयोग करें । हालांकि ऑटोलॉगस रक्त वाहिकाओं के उपयोग अभी भी आदर्श दृष्टिकोण माना जाता है, रोगियों में उपलब्धता प्रमुख रूप से सीमित है । ऐसे allogeneic या सिंथेटिक भ्रष्टाचार के रूप में विकल्प immunosuppressive उपचार और गरीब प्रत्यक्षता के लिए1,2, प्रमुख स्वास्थ्य देशों को आर्थिक बोझ में जिसके परिणामस्वरूप के लिए अग्रणी के साथ गहन समस्याओं है । रक्त वाहिकाओं के टिशू इंजीनियरिंग एक प्राकृतिक समरूपता और ऑटोलॉगस कोशिकाओं के साथ भ्रष्टाचारियों प्रदान करना है । इस प्रकार, प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रणाली को स्वयं के रूप में प्रत्यारोपण भ्रष्टाचार पहचानता है और इस तरह के एक भ्रष्टाचार के बाद से प्राकृतिक प्रोटीन और कोशिकाओं मूल विंयास में शामिल है, यह वर्तमान विकल्प की तुलना में बेहतर कार्य हो सकता है । ऊतक इंजीनियर अंगों, जैसे मूत्राशय3, मूत्रमार्ग4, श्वासनली5, और नसों6,7, सफलतापूर्वक क्लिनिक में इस्तेमाल किया गया है ।

ऊतक इंजीनियरिंग व्यक्तिगत भ्रष्टाचार का उत्पादन करने के लिए एक decellularization और recellularization द्वारा पीछा दाता से एक भ्रष्टाचार की आवश्यकता है । Decellularization ऊतकों और अंगों से कोशिकाओं को हटाने के लिए एक होनहार तकनीक है8,9,10. Decellularization विशिष्ट भौतिक, रासायनिक और एंजाइमी तरीकों11 या उंहें संयोजन द्वारा किया जा सकता है । इन तरीकों के इष्टतम उपयोग पर, एक extracellular मैट्रिक्स में समान संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन हो सकता है मूल ऊतकों के समान । इस तरह के अंगों को आंतरिक क्षमता लगाव, प्रवास, प्रसार, और आने वाली स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ाने के अधिकारी ।

Recellularization भ्रष्टाचार में कोशिकाओं बोने की एक गतिशील प्रक्रिया है, और प्राप्तकर्ता स्टेम कोशिकाओं नैदानिक प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में इस तरह के प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा, mesenchymal और अंग निवासियों3,5,6शामिल हैं । पशु और अनुसंधान उंमुख अध्ययन mesenchymal मूल है कि भ्रूण और प्रेरित pluripotent12,13,14से स्टेम कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है । इस प्रक्रिया में एक मध्यस्थ (एक कक्ष है कि नस रखती है और तापमान, गैसों, पीएच, और दबाव की तरह आवश्यक शर्तों प्रदान करता है), कोशिकाओं और संस्कृति मीडिया की आवश्यकता है । recellularization में चुनौती एक विशेष प्रकार के कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या और एक बोने की रणनीति है जिसके द्वारा कोशिकाओं को पूरे ऊतक या अंग तक पहुँच सकते हैं प्राप्त करने के लिए है । भले ही कोई पूरा ऊतक या संरचनात्मक रूप से अंग और कार्यात्मक और उत्पंन किया गया है अब तक मूल्यांकन, क्षेत्र में कई प्रगति और प्रारंभिक परिणाम भविष्य की संभावना दिखा15। नस का प्रमुख कार्य चमकदार endothelium में निहित है जो ऊतकों में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ को नियंत्रित करता है और मध्य चिकनी मांसपेशी परत जो कसना में मदद करता है और रक्त दाब16को धारण करने की शक्ति भी प्रदान करती है । अध्ययनों से यह दर्शाया है कि क्षति के दौरान, endothelialization या तो सम्मिलन से या परिचालित endothelial जनक कोशिकाओं (ईपीसी) से रक्त17,18,19में होता है । शिराओं के recellularization के लिए हमारी कार्यनीति परिचालित रक्त में मौजूद ईपीसी पर निर्भर करती है.

नसों और धमनियों के ऊतक इंजीनियरिंग अलग decellularization और recellularization रणनीतियों20,21के बाद कई समूहों द्वारा किया गया था । हमारे समूह भी प्रदर्शन किया है और श्रोणि और स्तन नसों6,7के लिए decellularization और recellularization रणनीति विकसित की है । Decellularization ट्राइटन एक्स-१००, त्रि-n-butyl फॉस्फेट (TnBP), और एंजाइम deoxyribonuclease (DNase) में नस के आंदोलन द्वारा किया गया था । recellularization या तो अस्थि मज्जा व्युत्पंन endothelial और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं6 या परिधीय रक्त7का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । या तो प्रोटोकॉल द्वारा recellular नसों अतिरिक्त यकृत पोर्टल नस रुकावट6,7के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के प्रत्यारोपण में कार्यात्मक रक्त की आपूर्ति प्रदान करने में नैदानिक वादा दिखाया ।

हम वर्तमान में decellularization, recellularization और छोटे व्यास नसों की हैंडलिंग प्रतिक्रिया के सुधार और आसान प्रदर्शन के लिए एक ही प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण विकसित किया है । वर्तमान decellularization प्रोटोकॉल की जरूरत है डिटर्जेंट के साथ आंदोलन के बजाय दबाव का उपयोग कर नस के माध्यम से डिटर्जेंट की छिड़काव । recellularization प्रोटोकॉल सेल आसंजन में सुधार और कोशिका आसंजन, अस्तित्व और प्रसार में सुधार के लिए रक्त परिचालित में वृद्धि कारकों के अलावा के लिए कंडीशनिंग का एक अतिरिक्त कदम शामिल है । हम भी वाणिज्यिक उपलब्ध उत्पादों का उपयोग कर प्रतिक्रिया के डिजाइन में सुधार हुआ है । इस पत्र में, हम decellularization और मानव saphenous नसों के recellularization प्रदर्शन के लिए संशोधित प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करते हैं ।

Protocol

इस्तेमाल किया ऊतक, और इस पत्र के प्रोटोकॉल गोथनबर्ग विश्वविद्यालय के नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

1. ऊतक तैयार करने और भंडारण

  1. सर्जिकल संदंश और कैंची का उपयोग कर प्राप्त saphenous नस से आसपास के ऊतकों में कटौती ।
    नोट: saphenous नस संवहनी सर्जन द्वारा मनुष्यों के निचले अंग से विच्छेदित है । इस पेपर में इस्तेमाल होने वाली saphenous नस बाईपास सर्जरी के बाद एक यूएन में हिस्सा लिया करती है ।
  2. छिड़काव के दौरान रिसाव को रोकने के लिए, टांके और संदंश के साथ अपने सिरों पर सभी पक्ष शाखाओं ligate ।
  3. ५० मिलीलीटर ट्यूब में नस रखें जिसमें फास्फेट बफर खारा (पंजाब) की ४० मिलीलीटर है । पंजाबियों को बदलकर नस धो 2-3 बार अतिरिक्त रक्त निकालने के लिए । -८० डिग्री सेल्सियस पर ठंड से नस की दुकान ।

2. Decellularization setups और Recellularization प्रतिक्रिया की तैयारी

नोट: कैंची का प्रयोग, सिलिकॉन ट्यूबों में कटौती के रूप में 1 तालिकामें दिखाया गया है ।

  1. Decellularization सेटअप 1 (ट्राइटन X-१०० छिड़काव और वाशिंग के लिए)
    1. एक 2 एल चैंबर (प्लास्टिक टब), टेप ट्यूब के सभी तीन टुकड़े एक के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है ।
      नोट: टेप एक दीवार के लिए एक ट्यूब जहां किनारे कक्ष के नीचे (है डिटर्जेंट प्रवेश) और अंय दो ट्यूबों विपरीत दीवार के बीच में 5-10 सेमी की दूरी के साथ नस की लंबाई पर निर्भर करता है । इन ट्यूबों के कम से कम 5 सेमी भी है चैंबर फर्श (नस प्रवेश और आउटलेट) को टेप किया जाना चाहिए ।
    2. पुरुष और महिला Luer connectors का उपयोग करना, श्रृंखला में है डिटर्जेंट प्रवेश ट्यूब बी ट्यूब एफ, ट्यूब सी और अंत में नस प्रवेश करने के बाद के बाद से कनेक्ट । सिकुड़नेवाला पंप मैं के कैसेट में ट्यूब एफ प्लेस ।
    3. एक और ट्यूब सी ले लो और नस की दुकान के लिए एक छोर कनेक्ट । नीचे नली आउटलेट है कि चैंबर (डिटर्जेंट आउटलेट) और यह टेप के ऊपर ४५ सेमी रखा गया है के साथ ग्लास जार में दूसरे छोर प्लेस सुरक्षित करने के लिए । ट्यूब जी लो और ग्लास जार की नली आउटलेट में एक छोर धक्का और नस चैंबर में दूसरे छोर जगह है ।
      नोट: पूरा सेटअप (लाल तीर), चैंबर, और प्रवाह दिशा (सफेद तीर) की तस्वीरें चित्र 1aमें दिखाए जाते हैं ।
  2. Decellularization सेटअप 2 (For TnBP छिड़काव)
    1. एक 1 एल ग्लास जार लो, और जार में ट्यूब सी (डिटर्जेंट प्रवेश) के एक छोर जगह जब तक ट्यूब छू जार नीचे है ।
    2. ट्यूब सी के बाद ट्यूब एफ के लिए दूसरे छोर से कनेक्ट करें ट्यूब सी के दूसरे छोर आधा गहराई तक जार में (है नस प्रवेश) प्लेस । जगह ट्यूब सिकुड़नेवाला पंप मैं के कैसेट में एफ ।
    3. ट्यूब डी लो और जार (नस की दुकान) में एक छोर आधा गहराई तक और नीचे नली के साथ ग्लास जार में अंय अंत तक एक ४५ सेमी ऊंचाई पर रखा है नस प्रवेश (डिटर्जेंट आउटलेट) । सुरक्षित करने के लिए, है डिटर्जेंट प्रवेश और आउटलेट ट्यूबों टेप ।
    4. एक चुंबकीय सरगर्मी पर 1 एल ग्लास जार प्लेस और बोतल के अंदर चुंबक रखें ।
    5. ट्यूब जी लो और ग्लास जार की नली आउटलेट पर एक छोर धक्का और 1 एल ग्लास जार में दूसरे छोर जगह है ।
      नोट: पूर्ण सेटअप (लाल तीर), चैंबर और प्रवाह दिशा (सफेद तीर) की तस्वीर चित्र 1bमें दिखाया गया है ।
  3. Decellularization सेटअप 3 (For DNase छिड़काव)
    1. एक २५० मिलीलीटर कांच की बोतल ले लो और जगह ट्यूब के दोनों सिरों C. सिकुड़नेवाला पंप द्वितीय के कैसेट में ट्यूब के मध्य क्षेत्र प्लेस ।
      नोट: ट्यूब के एक छोर समाधान प्रवेश और ट्यूब के दूसरे छोर है नस प्रवेश करने के लिए जुड़ा हुआ है । नस के आउटलेट समाधान में मुक्त छोड़ दिया है ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पंप सहित पूरे सेटअप प्लेस । पूर्ण सेटअप और प्रवाह दिशा की तस्वीर चित्रा 1Cमें दिखाया गया है ।
  4. Recellularization प्रतिक्रियाकर्ता
    1. चित्र 2aमें दर्शाए अनुसार सभी भागों को तैयार रखें ।
    2. जैसा चित्र 2 बीमें दिखाया गया है, 4 बंदरगाह टोपी और प्रत्येक बंदरगाह, ट्यूब एच (नस की दुकान), ट्यूब मैं (मीडिया प्रवेश), और ट्यूब जंमू (नस प्रवेश) में डालने ले । 4वें बंदरगाह (मीडिया आउटलेट) में ट्यूब एच के दूसरे छोर डालें ।
      नोट: ऊपर से 4-पोर्ट कैप का दृश्य चित्रा 2cमें दिखाया गया है । ट्यूबों के आसान प्रविष्टि के लिए, एक कैंची के साथ एक तेज बिंदु के किनारों को काट ।
    3. एक यू आकार में ट्यूब जंमू के दूसरे छोर मोड़ और यह एक सीवन के साथ टाई । ट्यूबों के भीतरी छोर को कम करने connectors कनेक्ट एच एंड जे
    4. २५० मिलीलीटर कांच की बोतल में एक फ्लैट आधार के साथ ६० एमएल ट्यूब प्लेस और फिर ऊपर बनाया सेटअप ट्यूब में चित्र 2dमें दिखाया गया के रूप में जगह है । के रूप में चित्रा 2Eमें दिखाया गया है, कनेक्ट ट्यूबों कश्मीर, ई, और कश्मीर श्रृंखला में । एक ट्यूब है नस प्रवेश करने के लिए कश्मीर कनेक्ट और एक और ट्यूब मीडिया प्रवेश के लिए कश्मीर ।
      नोट: योजनाबद्ध आरेख सेटअप, और प्रवाह दिशा चित्रा 2Fमें देखा जाता है ।
    5. autoclaving द्वारा प्रतिक्रियाकर्ता निष्फल ।

3. समाधान की तैयारी

  1. समाधान 1 (10x पानी): ultrapure पानी के 1 एल के लिए, सोडियम azide के 2 ग्राम और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के १८.६ ग्राम जोड़ें । हलचल जब तक लवण भंग कर रहे हैं ।
  2. 2 समाधान (1x पानी): 1 समाधान के १०० मिलीलीटर ले लो और ultrapure पानी की ९०० मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. समाधान 3 (5x ट्राइटन x-१००): ultrapure पानी की ९५० मिलीलीटर के लिए, ट्राइटन एक्स के ५० मिलीलीटर जोड़ें-१००, सोडियम azide के 1 जी, और EDTA के ९.३ ग्राम । हलचल जब तक भंग ।
  4. समाधान 4 (1x ट्राइटन X-१००): 3 समाधान के २०० मिलीलीटर ले लो और ultrapure पानी की ८०० मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. समाधान 5 (1x TnBP): एक 10 मिलीलीटर पिपेट के साथ TnBP के 10 मिलीलीटर जोड़ें समाधान 2 की ९९० मिलीलीटर ।
  6. समाधान 6 (४० Kunitz इकाइयां/एमएल DNase): Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा के ५० मिलीलीटर में DNaseI की २,००० Kunitz इकाइयों को जोड़ें जिसमें CaCl2 और MgCl2शामिल हैं । ताजा तैयार है और तुरंत उपयोग करें ।
  7. समाधान 7 (पंजाब): सोडियम क्लोराइड की 24 ग्राम, पोटेशियम क्लोराइड की ०.६ ग्राम, सोडियम फॉस्फेट की ४.३२ ग्राम, और पोटेशियम फास्फेट की ०.७२ ग्राम ultrapure पानी की 3 एल जोड़ें । हलचल जब तक भंग । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें । आटोक्लेव और स्टोर में अलग से पंजाब के 1 एल निष्फल ।
  8. हल 8 (०.१% Peracetic एसिड): बाँझ समाधान 7 की ५० मिलीलीटर, Peracetic एसिड के ५० µ एल जोड़ें । ताजा तैयार है और तुरंत उपयोग करें ।

4. Endothelial मीडियम की तैयारी

  1. एल के 5 मिलीलीटर जोड़ें-glutamine, विरोधी के 5 मिलीलीटर-विरोधी, मानव एबी सीरम के ५० मिलीलीटर और ईजीएम के सभी घटकों-एक बाँझ डाकू के तहत MCDB131 माध्यम की ५०० मिलीलीटर के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम को छोड़कर 2 विकास कारक किट ।

5. Saphenous नस के Decellularization

  1. मानव saphenous नस-८० ° से कमरे के तापमान पर गल । कमरे के तापमान पर फिर से-८० डिग्री सेल्सियस और गल फिर से फ्रीज ।
  2. 2 मिमी की एक बायोप्सी काटें कैंची का उपयोग कर और कमरे के तापमान पर 24-48 ज के लिए formaldehyde में फिक्स । एक पुरुष और मादा Luer कनेक्टर के नजला को शिराओं के प्रत्येक छोर को सीवन के साथ बाँधें ।
  3. decellularization सेटअप 1 करने के लिए नस कनेक्ट और समाधान 2 के 1 L भरें । ३५ मिलीलीटर पर 15 मिनट के लिए Perfuse/सेटअप की सामग्री खाली है ।
  4. 1 L का समाधान 4 और perfuse के लिए 4 h में जोड़ें ३५ mL/न्यूनतम सेटअप की सामग्री को खाली करें ।
  5. 5 min. setup की सामग्री को खाली करने के लिए समाधान 2 और perfuse की ५०० मिलीलीटर जोड़ें । इस चरण को दोहराएं । छिड़काव सेटअप 1 से नस डिस्कनेक्ट करें और छिड़काव सेटअप 2 से कनेक्ट करें ।
  6. 1 L का समाधान 5 जोड़ें, चमचे पर चालू करें और 4 एच के लिए perfuse पर ३५ मिलीलीटर/
    नोट: 5 समाधान सरगर्मी पर मोड़ और छिड़काव भर के बाद बादल लग रहा है ।
  7. छिड़काव सेटअप 2 से नस डिस्कनेक्ट और नस के बाहर और सिरिंज के साथ अंदर या ultrapure पानी के 4 परिवर्तन में एक 10 मिलीलीटर पिपेट 5-10 मिनट के लिए धो लें ।
  8. छिड़काव सेटअप करने के लिए नस कनेक्ट 3, जोड़ने के ५० मिलीलीटर समाधान 6 और perfuse के लिए एक ३७ ° c कक्ष में 4 ज. सेटअप की सामग्री को खाली करें और सेटअप से नस डिस्कनेक्ट ।
  9. छिड़काव सेटअप 1 करने के लिए नस कनेक्ट, समाधान 2 के 1 एल भरने और रात भर perfuse ३५ मिलीलीटर/दोहराएं चरण ५.४ चरण ५.९ 4 बार (5 चक्रों की कुल के लिए) । चरण ५.२ में कहा गया है के रूप में फिर से एक बायोप्सी ले ।
    नोट: 1 और 3 चक्र में चरण ५.८ दूसरा भाग छोड़ें ।
  10. सेटअप की सामग्री को खाली । भरण 1 L का समाधान 2 और perfuse के लिए 24 ज पर ३५ mL/समाधान 2 के बाद 12 h. सेटअप की सामग्री को खाली करें । ultrapure जल और perfuse के लिए 24 ज के लिए ३५ मिलीलीटर में 1L भरें/12 ज के बाद ultrapure पानी बदलें । सेटअप की सामग्री को खाली करें । भरण 1 L के समाधान 7 और perfuse के लिए 24 ज पर ३५ मिलीलीटर/परिवर्तन समाधान 7 के बाद 12 ज.

6. Decellularization का सत्यापन

  1. धो formalin के लिए ultrapure पानी में फिक्स्ड बायोप्सी 15 min. Process के लिए एक ऊतक प्रोसेसर में निंनलिखित मानक प्रोटोकॉल और तेल में एंबेड22
  2. कट 5 µm एक microtome और मेयेर hematoxylin और ०.२% शराबी eosin (एच एंड ई) के साथ दाग का उपयोग कर वर्गों मानक22प्रोटोकॉल निंनलिखित ।
  3. एक खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए सामांय ऊतक की तुलना में सेलुलर ऊतक में नाभिक के नुकसान के लिए जांच करें ।

7. Recellularization

  1. यह एक ५० मिलीलीटर ट्यूब समाधान 8 के ५० मिलीलीटर युक्त में रखकर नस निष्फल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए शेखर में प्रति मिनट ८० घुमाव (rpm) पर आंदोलन ।
  2. अब से लामिना प्रवाह (एलएएफ) कैबिनेट के तहत नस को संभाल बाँझ बनाए रखने के लिए । एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग कर नस स्थानांतरण ५० मिलीलीटर के बाँझ समाधान 7 और विरोधी विरोधी के ५०० µ एल. आंदोलन के लिए ऊपर के रूप में 12 ज. परिवर्तन समाधान 7 के बीच में कम से दो बार ।
  3. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक नया ५० एमएल ट्यूब करने के लिए नस हस्तांतरण और endothelial मीडिया के ५० मिलीलीटर जोड़ें । 11 एच के लिए ऊपर के रूप में आंदोलन ।
  4. एलएएफ मंत्रिमंडल के तहत बाँझ दस्ताने का उपयोग कर प्रतिक्रिया को इकट्ठा. नस की नस प्रवेश और बाँझ टांका और संदंश के साथ आउटलेट के लिए शिरा टाई ।
  5. नस को परस्पर प्रतिक्रियाकर्ता से कनेक्ट करें और एक ही माध्यम से भरें । ३७ ° c में 2 मिलीलीटर/मिनट में 1 ज के लिए ५० IU/एमएल और perfuse पर हेपरिन जोड़ें ।
  6. ताजा रक्त की 15-25 मिलीलीटर लीजिए (नस की लंबाई पर निर्भर करता है) हेपरिन लेपित vacutainer ट्यूबों में दाता से और Steen समाधान के साथ 1:1 पतला । बाद में, अंत में स्रावी ग्रंथि-व्युत्पन्न संवहनी endothelial वृद्धि कारक जोड़ें (जैसे-वीईजीएफ़, ८० एनजी/एमएल), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (बी-FGF, 4 µ एल/एमएल) और एसिटाइल चिरायता एसिड (5 µ g/एमएल) ।
  7. 5% सह2 और perfuse के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए कदम ४८ एच पर 2 मिलीलीटर/
  8. लगभग 12 घंटे के बाद, एक एलएएफ कैबिनेट के लिए एक प्रतिक्रिया के लिए कदम, रक्त की एक बूंद ले और ग्लूकोज एक रक्त ग्लूकोज की निगरानी डिवाइस का उपयोग कर मापने । यदि स्तर 3 mmol/l से कम है, तो 7-9 mmol/l की श्रेणी में लाने के लिए ग्लूकोज जोड़ें इस चरण को हर 8-12 ज दोहराएँ.
  9. ४८ h के बाद, एलएएफ कैबिनेट में प्रतिप्रतिक्रियाकर्ता को घुमाएं और विरक्ति से प्रतिप्रतिक्रियाकर्ता से पलायन करें । 5 मिनट के लिए बाँझ समाधान 7 और perfuse के 30 मिलीलीटर जोड़ें समाधान नाली । 5 मिनट के लिए बाँझ समाधान 7 और perfuse के 30 मिलीलीटर जोड़ें दो बार या जब तक रक्त लाल रंग खो दिया है दोहराएँ.
    नोट: बायोप्सी सेल लगाव के सत्यापन के लिए लिया जा सकता है । नस को डिस्कनेक्ट करें, कैंची से 5 मिमी किनारों को काट लें और उन्हें त्याग दें । चरण ५.२ में कहा गया के रूप में एक बायोप्सी ले लो और नस फिर से कनेक्ट करने के लिए (वैकल्पिक कदम) प्रतिक्रिया ।
  10. endothelial मध्यम और perfuse के ९६ एच के लिए 2 मिलीलीटर में 30-45 मिलीलीटर जोड़ें/
    नोट: जब तक नस जलमग्न है endothelial मध्यम जोड़ें ।
  11. एलएएफ कैबिनेट में प्रतिज्ञानी कदम, recellular नस डिस्कनेक्ट, कैंची का उपयोग कर नस के 5 मिमी किनारों में कटौती और त्यागें । चरण ५.२ में कहा गया के रूप में एक बायोप्सी ले लो ।

8. Recellularization का सत्यापन

  1. धारा 6 में निर्देशों का पालन करें और एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन । कक्षों की उपस्थिति के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड की जांच करें ।

Representative Results

एक सामांय नस की सकल आकृति विज्ञान प्रकाश लाल (3ए) है । लाल रंग प्रगतिशील decellularization चक्र में खो दिया है (चक्र 2, चित्र 3 बी, चक्र ३ , चित्र3 सी) और 5वें चक्र से, यह पीला और सफेद (चित्रा 3 डी) लग रहा है. ब्लड छिड़काव (फिगर 3E) और endothelial मीडिया छिड़काव (फिगर 3F) के बाद रिसेल् नस रंग में चमकीला लाल दिखता है । decellularization उपचार के 5 चक्र सफलतापूर्वक नस से कोशिकाओं को हटा दिया के रूप में कोई नीली नाभिक में एच एंड ई धुंधला (चित्रा 4B) देखा गया । इसके विपरीत, कई नाभिक सामांय नस (चित्रा 4a) में देखा गया । चमकदार ओर संलग्न कोशिकाओं की उपस्थिति में देखा जाता है एच और ई ४८ ज (चित्रा 4c, काले तीर) के लिए रक्त के साथ recellular नस में धुंधला और ९६ एच के लिए endothelial माध्यम के साथ छिड़काव के बाद (चित्रा 3 डी, काले तीर) ।

Figure 1
चित्रा 1 : decellularization के लिए छिड़काव setups के कोडांतरण । क) ट्राइटन एक्स के लिए इकट्ठे decellularization सेटअप 1 दिखा तस्वीर-१०० और धुलाई । सफेद तीर समाधान के लिए प्रवाह पथ दिखाने के लिए और लाल तीर की सुविधा देता है और नस और समाधान के लिए आउटलेट संकेत मिलता है । ख) TnBP छिड़काव के लिए इकट्ठे decellularization सेटअप 2 दिखा तस्वीर । इसी तरह, decellularization सेटअप 1 में के रूप में, सफेद तीर समाधान के लिए प्रवाह पथ और लाल तीर संकेत देता है और नस और समाधान के लिए दुकानों का संकेत । ग) deoxyribonuclease छिड़काव के लिए इकट्ठे decellularization सेटअप 3 दिखा चित्र । सफ़ेद तीर समाधानों के लिए प्रवाह पथ दिखाते है और लाल तीर नस और समाधानों के लिए अनुमतियां इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : तैयारी और recellularization के लिए प्रतिक्रियाकर्ता के कोडांतरण । एक) प्रतिक्रिया के संयोजन के लिए आवश्यक सामग्री दिखा चित्र । ख) 4 के अंदर के चित्र-पोर्ट के लिए connectors को कम करने के स्थान दिखा टोपी (लाल तीर), अंक नस प्रवेश और आउटलेट (सफेद तीर) और ट्यूबों की व्यवस्था एच, मैं और जे कनेक्ट करने के लिए । ट्यूब एच के नि: शुल्क अंत मीडिया वापस करने के लिए प्रतिक्रियाकर्ता में रखा गया है । ग) संबंधित ट्यूबों में और बाहर जा रहा है 4 बंदरगाह टोपी के ऊपर की ओर से देखा जा सकता है । घ) इकट्ठे प्रतिक्रिया दिखा चित्र । ई) सिकुड़नेवाला पंप के साथ पूरे प्रतिक्रिया सेटअप दिखा तस्वीर । ट्यूबों K सिकुड़नेवाला पंप के लिए प्रतिक्रिया से कनेक्शन का विस्तार । F) पूरी प्रतिक्रियाकर्ता छिड़काव प्रणाली का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । नारंगी तीर प्रवाह की दिशा को इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : decellularization और recellularization के दौरान नसों की सकल आकृति विज्ञान । क) सामांय नस की सकल आकृति विज्ञान रंग में चमकदार लाल दिखता है । रंग decellularization चक्र की बढ़ती संख्या के साथ खो दिया है ख) चक्र 2 और सी) 3 चक्र । घ) 5 चक्र द्वारा, नस पीला और सफेद लग रहा है । ई के साथ perfusing के बाद नस) ४८ एच और एफ के लिए रक्त) ९६ एच के लिए endothelial माध्यम के साथ एक बार फिर रंग में चमकदार लाल लग रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : सेलुलर और recellular नसों का लक्षण वर्णन । hematoxylin और eosin एक की छवि धुंधला ) सामान्य नस कई नीले नाभिक शामिल हैं, लेकिन वे ख में अनुपस्थित रहे हैं ) विसेलुलर नस. नस में सी के साथ recellular ) ४८ के लिए एच और डी के साथ ) ९६ एच के लिए endothelial मध्यम, लुमेन पर कोशिकाओं (काले तीर) के लगाव देखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Discussion

तकनीक saphenous नसों के decellularization के लिए यहां प्रस्तुत एक आसान, सरल और लागत प्रभावी तरीका है कि भी नाल और स्तन नसों की तरह सभी छोटे व्यास नसों के लिए लागू किया जा सकता है । decellularization समाधान और उनके इस पद्धति में इस्तेमाल किया सांद्रता हमारे पिछले परिणाम6,7से कर रहे हैं । भले ही हम decellularization के 5 चक्र की सिफारिश, कुछ नसों में हम भी 3 चक्र में पूरा decellularization देखा । हालांकि, reproducible परिणाम 5 चक्र का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे । इस प्रोटोकॉल को लागू करने, हम अलग लंबाई की नसों में विस्थापित 30 सेमी सफलतापूर्वक (अप्रकाशित परिणाम) । ४५ cm द्वारा decellularization सॉल्यूशन के आउटलेट को उठाने से नस के अंदर ३३ mmHg का दबाव पैदा होगा । हमारे अनुभव में, हम पूरी नस समान रूप से decellularizing और 5 चक्रों में reproducibly में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में इस पर ध्यान दिया । चुना दबाव सामान्य saphenous नस दबाव (5-10 mmHg) की तुलना में 3 गुना अधिक है, लेकिन अक्षम नसों (वैरिकाज़ नसों)23के रूप में एक ही है । इसके अलावा, हम सोचते है कि इस उच्च दबाव नस दीवारों पर एक महत्वपूर्ण शक्ति पैदा करेगा और हो सकता है, इसलिए कुशल और तेजी से सेल हटाने में सहायता ।

चूंकि TnBP एक कार्बनिक विलायक और पानी में अघुलनशील है, डिटर्जेंट क्रियाशीलता जब तक यह बादल बन जाता है महत्वपूर्ण है; अंयथा, डिटर्जेंट फ्लोट जाएगा । एक ही कारण के लिए, समाधान में मिश्रित TnBP रखने के लिए, है डिटर्जेंट आउटलेट ट्यूब नली आउटलेट के साथ ग्लास जार के शीर्ष पर रखा गया था । हर चक्र में इसके उपयोग के बाद नस से TnBP के कुशल हटाने धोया पानी में तैरते TnBP बूंदों के अभाव से देखा जा सकता है । हमने यह भी देखा है कि DNase कदम लंघन भी एक सेलुलर ऊतक का उत्पादन किया, लेकिन कुछ मामलों में, एक अपेक्षाकृत उच्च डीएनए सामग्री में सेलुलर ऊतक देखा गया था । के रूप में उच्च दबाव और उच्च प्रवाह दर कुशल DNase गतिविधि के लिए आवश्यक नहीं हैं, एक कम छिड़काव दर (10 मिलीलीटर/ एक अलग सिकुड़नेवाला पंप अपने छोटे आकार के रूप में इस्तेमाल किया गया था सेटअप के आसान हैंडलिंग में मदद करता है । जब से हम चक्र 2 में decellularization परिणामों के दौरान सबसे कोशिकाओं की है कि नुकसान देखा, हम 1 चक्र और 3 (अप्रकाशित परिणाम) के दौरान DNase उपचार लंघन सुझाव देते हैं । हालांकि लक्षण वर्णन और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन के ठहराव इस पांडुलिपि में प्रदर्शन नहीं किया गया, हमारे समान decellularization प्रोटोकॉल के साथ पिछले अनुभव के यांत्रिक गुणों के संरक्षण दिखाया, extracellular मैट्रिक्स संरचना और प्रोटीन7. हालांकि इन नसों के साथ हमारे प्रारंभिक ठहराव प्रयोगों एक समान परिणाम (अप्रकाशित) का उत्पादन किया, हमारे पहले से ही प्रकाशित परिणाम इस विश्वास को मजबूत करेगा ।

Recellularization रक्त का उपयोग कर अस्थि मज्जा विस्तारित कोशिकाओं पर एक सुविधाजनक और आसान प्रक्रिया है के रूप में एक लंबे सेल विस्तार बार, विस्तारित कोशिकाओं में सहज उत्परिवर्तनों, शल्य चिकित्सा आक्रमण, और रोगी के लिए बेचैनी से बचने कर सकते हैं । चूंकि यह ज्ञात है कि endothelialization भी परिसंचारी ईपीसी से हो सकता है, हम परिकल्पना की है कि endothelial माध्यम से छिड़काव द्वारा पीछा रक्त के साथ छिड़काव recellularization के लिए पर्याप्त होगा । नस ऊतकों की सुरक्षा एक ऐसी ही विधि का उपयोग कर प्रत्यारोपण के सफल परिणामों से देखा जाता है जब दो ऐसी नसों अतिरिक्त यकृत पोर्टल नस रुकावट7के साथ बच्चों में प्रत्यारोपित किया गया । हम अटकलें है कि सेलुलर extracellular मैट्रिक्स में वृद्धि कारकों24रक्त से ईपीसी परिसंचारी के लगाव की अनुमति होगी । एक समान प्रोटोकॉल के बाद नसों के Recellularization वीईजीएफ़ रिसेप्टर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को दिखाया-2 और (सीडी) 14 लुमेन पर क्लस्टर जबकि CD45 एक्सप्रेस कोशिकाओं adventitia7में देखा गया था । हम यह भी कल्पना है कि एक सतत endothelial परत सभी मामलों में नहीं देखा जा सकता है खासकर जब पुराने और रोगग्रस्त रोगियों से रक्त का उपयोग कर के रूप में यह ज्ञात है कि ऐसे व्यक्तियों जनक कोशिकाओं के परिचालित25की संख्या में कमी आई है । हालांकि, हम मांगना है कि छिड़काव प्राप्तकर्ता के अपने रक्त के साथ decellularization की वजह से उजागर कर रहे हैं प्रतिजनों के कई मुखौटा हो सकता है और इस प्रकार के रूप में प्रत्यारोपण के लिए विरोध किया जब प्रत्यारोपण के प्रतिकूल भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की संभावना कम हो सकती है सेलुलर रक्त वाहिकाओं । इसके अलावा, रक्त छिड़काव लुमेन और adventitia पर वृद्धि कारकों के स्तर में वृद्धि जमा कर सकते हैं जो बारी में recellularization की एक तेजी से प्रक्रिया में आने के परिणामस्वरूप जनक कोशिकाओं घूम की बढ़ी हुई संख्या भर्ती कर सकते हैं vivo.

इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है कि प्रतिक्रिया के लिए डिजाइन का लाभ पूरा autoclaving, आसान विधानसभा, लागत प्रभावशीलता, आसान हैंडलिंग और नुकसान की संभावना कम कर रहे हैं । हमारे अनुभव में, वर्तमान डिजाइन का उपयोग कर, लंबाई में 10 सेमी तक नसों recellular थे । भले ही लंबाई में 25 सेमी तक नसों भी "यू" आकार में प्रतिपुष्टि के अंदर नस रखने से recellular जा सकता है, यह मांय किया जाना चाहिए । इस प्रतिक्रिया के डिजाइन से पता चलता है कि नस में प्रवाह की दिशा गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ है और इस तरह के रूप में बनाया गया है क्योंकि यह मानव में इन नसों के लिए प्रवाह की सामान्य दिशा है । endothelial मीडियम स्टेप के 12 ज छिड़काव से नस को कंडीशनिंग करनी होती है और आने वाली ईपीसी के अटैचमेंट के लिए अपनत्व को बढ़ाना होता है । अतिरिक्त हेपरिन और 1 एच के लिए छिड़काव के अलावा रक्त छिड़काव के दौरान ट्यूबों में रक्त के थक्के बनाने के जोखिम को कम करेगा ।

आवश्यक रक्त की मात्रा नस की लंबाई पर निर्भर है । मूल सिद्धांत हम रक्त की मात्रा के लिए का पालन करें कि नस खून में जलमग्न होना चाहिए । हालांकि रक्त मात्रा ४५ मिलीलीटर से बड़ा हैंडलिंग, सामयिक मिश्रण के लिए प्रतिक्रिया के तल में सेल संचय को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है । हम रक्त के लिए है Steen समाधान जोड़ा क्योंकि यह प्रोटीन और अंग प्रत्यारोपण26,27के दौरान स्वस्थ ऊतकों को बनाए रखने के लिए आवश्यक घटकों की एक उच्च राशि शामिल है । वीईजीएफ़ और बी-FGF के अलावा लाभकारी है के रूप में वे शक्तिशाली angiogenic वृद्धि कारक हैं28 और उनकी उपस्थिति प्रेरित प्रवास, प्रसार, और ईपीसी के भेदभाव29,30,31,३२ . वीईजीएफ़ की राशि हमारे पिछले अप्रकाशित परिणामों पर आधारित है जहां ईपीसी के प्रसार ८० एनजी/एमएल में देखा गया था । एस्पिरिन के अलावा प्लेटलेट्स के सक्रियण को रोकता है३३ जिससे endothelial परत के लिए उनके लगाव की संभावना कम । निरंतर निगरानी और ग्लूकोज के अलावा सेल प्रसार और लाल रक्त कोशिकाओं के hemolysis को रोकने के लिए भी फायदेमंद होगा ।

केवल एक साधारण रक्त का नमूना प्राप्तकर्ता से आवश्यक है के बाद से, यह कम तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है एक आसान और संभव प्रक्रिया के रूप में माना जा सकता है । हालांकि, पूरे प्रक्रिया शुरू से ही यहां दिखाया खत्म करने के लिए 20 दिन लगते हैं, एक शेल्फ उत्पाद के रूप में प्रतिसेलुलर नसों भंडारण के रोगियों के लिए 8 दिनों के लिए प्रक्रिया को कम करेगा । हालांकि सेलुलर नसों का भंडारण तकनीकी रूप से recellularization क्षमता को प्रभावित नहीं करना चाहिए, यह मूल्यांकन किया जाना चाहिए । ऊतक इंजीनियर नसों इस प्रक्रिया के बाद उत्पंन बाईपास सर्जरी के लिए क्लिनिक में इस्तेमाल किया जा सकता है, बाधित नसों की जगह, शिरापरक कमी प्रतिरक्षा दमन के लिए की आवश्यकता के बिना वैरिकाज़ नसों के लिए अग्रणी है और इस तरह की एक बेहतर गुणवत्ता प्रदान रोगी के लिए जीवन ।

Disclosures

SSH Verigraft, एक कंपनी है कि ऊतक इंजीनियरिंग रक्त वाहिकाओं की तकनीक लाइसेंस प्राप्त में शेयर रखती है । दूसरे लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रयोग में प्रयुक्त रक्त वाहिकाओं प्रदान करने के साथ मदद के लिए प्रोफेसर ऐंडर्स Jeppsson शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस अध्ययन LUA ALF अनुदान द्वारा SSH को वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Port Cap CPLabSafety WF-GL45-4Kit
Acetyl salicylic acid Sigma Aldrich A5376
Anti-Anti Life Technologies 15240-062
B-FGF Lonza cc-4113B
Blood Glucose monitoring system - Free style Lite Abbott 70808-70
D-Glucose Sigma Aldrich G8769
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
EGM-2 Growth Factors Kit Lonza CC-4176
EG-VEGF Peprotech 100-44
Glass bottle 250ml VWR 2151593 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass bottle 1L VWR 2151595 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass jar 500ml with bottom hose outlet Kimble Chase Life Science 14607
Heparin Leo 387107
Heparin Coated Vacutainer Tubes Becton Dickinson 368480
Human AB Serum Sigma Aldrich H3667
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Luer Female with 1/8" ID Barb Oina LF-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Female with 3/32" ID Barb Oina LF-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 3/32" ID Barb Oina LM-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Male with 5/32" ID Barb Cole Parmer EW-45518-06 For 5X8mm silicon tube
MCDB 131 Life Technologies 10372-019
Per acetic acid Sigma Aldrich 433241
Peristaltic pump I Masterflex 7524-45 For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75
Peristaltic pump II Ismatec ISM941 For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm Biotech ISM569A
Shaker Ika KS4000 i  control
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Steen solution Xvivo 19004
Suture Agnthos 14817
Tri-n-butyl Phosphate AlfaAesar A16084.AU
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF
Tube 60ml with flat base Sarstedt 60596
Tube A VWR 2280706 Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube B VWR 2280706 Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup
Tube C VWR 2280706 Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3
Tube D VWR 2280706 Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2
Tube E VWR 2280706 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube F VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube G VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube H VWR 2280703 Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup
Tube I VWR 2280703 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube J VWR 2280703 Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup
Tube K VWR 2280703 Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup

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मानव Saphenous नसों के लिए Decellularization और Recellularization पद्धति
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Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).More

Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).

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