Summary
Her, beskriver vi en protokol for saphenous vene decellularization ved hjælp af vaske-og rengøringsmidler og recellularization af perfusion af perifert blod og i endothelial medium.
Abstract
Vaskulære ledningsanlæg anvendes under de fleste vaskulære operationer er allogene eller syntetisk podning, der fører ofte til komplikationer som følge af immunosuppression og fattige passage. Vævsmanipulering tilbyder en roman løsning til at generere tilpassede podninger med en naturlig ekstracellulære matrix, som indeholder modtagerens celler ved hjælp af metoden til decellularization og recellularization. Vi viser en detaljeret metode til at udføre decellularization af den menneskelige saphenous vene og recellularization ved perfusion af perifert blod. Venen var decellularized af perfusing 1% Triton X-100, 1% tri-n-butyl-phosphat (TnBP) og 2.000 Kunitz andele i deoxyribonuclease (DNase). Triton X-100 og TnBP var perfunderet 35 mL/min. for 4 h mens DNase var perfunderet på 10 mL/min. ved 37 ° C i 4 timer. Venen blev vasket i ultrarent vand og PBS og derefter steriliseret i 0,1% pereddikesyre. Det blev vasket igen i PBS og klargjort i endothelial medium. Venen var tilsluttet en bioreaktor og perfunderet med endotel medium indeholdende 50 IE/mL heparin for 1 h. Recellularization blev udført ved at udfylde den bioreaktor med frisk blod, fortyndet 1:1 i Steen løsning, og tilføjelse af endokrin kirtel-afledte vaskulære endotel vækstfaktor (80 ng/mL), basic fibroblast vækstfaktorer (4 µL/mL) og acetyl-salicylsyre (5 µg/mL). Bioreaktor blev derefter flyttede ind i en inkubator og perfunderet for 48 h 2 mL/min. samtidig opretholde glukose mellem 3-9 mmol/L. Senere, blev i venen vasket med PBS, fyldt med endotel medium og perfunderet for 96 timer i rugemaskinen. Behandling med Triton X-100, TnBP og DNase decellularized den saphenous vene i 5 cyklusser. Den decellularized vene kiggede hvid i modsætning til normale og recellularized vener (lyserød). Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning viste tilstedeværelsen af kerner, kun i normal, men ikke i decellularized vener. I den recellularized vene viste H & E-farvning tilstedeværelsen af celler om det luminale overflade af venen.
Introduction
Vaskulære ledningsnet er påkrævet for flere kliniske tilstande som aneurismer, carotis arterie stenose og åreforkalkning fører til alvorlige vaskulære problemer. Kirurger bruge autologe, allogene eller syntetiske vaskulære ledningsanlæg for at genoprette funktionelle blodforsyningen. Selv om brugen af autologe blodkar er stadig betragtes som den ideelle fremgangsmåde, er tilgængelighed i patienter majorly begrænset. Alternativer såsom allogene eller syntetisk podning har dybtgående problemer med immunosuppressive behandlinger og fattige passage fører til reoperation1,2, resulterer i større sundhed økonomiske byrder for lande. Vævsmanipulering af blodkar, der sigter mod at give podninger med en naturlig homologi og autologe celler. Således modtager immunsystemet genkender den transplanterede graft som selvet og da sådan en graft indeholder naturlige proteiner og celler i den oprindelige konfiguration, det kunne fungere bedre i forhold til de aktuelle alternativer. Tissue Engineering organer, såsom blære3, urinrøret4, luftrøret5og vener6,7, har været med succes brugt i klinikken.
Tissue engineering til at producere personlige grafts kræver en graft fra en donor, efterfulgt af decellularization og recellularization. Decellularization er en lovende teknologi at fjerne celler fra væv og organer8,9,10. Decellularization kan udføres af specifikke fysiske, kemiske og enzymatiske metoder11 eller ved at kombinere dem. På optimal udnyttelse af disse metoder, kan decellularized væv har lignende strukturelle og funktionelle proteiner i en ekstracellulære matrix svarer til native væv. Sådanne organer besidder den iboende evne til at forbedre vedhæftet fil, migration, spredning og differentiering af indgående stamceller.
Recellularization er en dynamisk proces, såning celler i podekvisten, og modtager stamceller kan bruges til klinisk transplantation. Stamceller i øjeblikket anvendes til sådanne formål omfatter knoglemarven, mesenchymale og orgel beboere3,5,6. Dyr og forskningsorienteret undersøgelser har brugt stamceller fra mesenchymale oprindelse, føtal og inducerede pluripotente12,13,14. Denne proces kræver en bioreaktor (en afdeling, der holder venen og giver de nødvendige betingelser som temperatur, gasser, pH og tryk), celler og kultur medier. Udfordringen i recellularization er at opnå det nødvendige antal celler af en bestemt type og en seeding strategi som celler kan nå hele væv eller organ. Selvom ingen komplet væv eller organ strukturelt og funktionelt er blevet genereret og evalueret indtil nu, flere fremskridt i feltet og de første resultater viser i fremtidige mulighed for15. Den vigtigste funktion af venen ligger i den luminale endothelium, der styrer infiltration af inflammatoriske celler i væv og det midterste glat muskel lag, der hjælper i konstriktion og giver også styrke for at holde blodtrykket16. Undersøgelser har vist, at under skader, endothelialization opstår enten fra anastomose eller cirkulerende endotelceller stamceller (EPCs) i blodet17,18,19. Vores strategi recellularization vener afhængig EPCs stede i cirkulerende blod.
Vævsmanipulering af vener og arterier blev udført af adskillige grupper efter forskellige decellularization og recellularization strategier20,21. Vores gruppe har også udført og udviklet decellularization og recellularization strategier for iliaca og brystkirtler vener6,7. Decellularization blev udført af agitation af vene i Triton X-100, tri-n-butyl-phosphat (TnBP) og enzymet deoxyribonuclease (DNase). Recellularization blev udført ved hjælp af enten knoglemarv afledt endotel og glat muskel celler6 eller perifert blod7. Venerne recellularized af enten protokol viste kliniske løfte at give funktionelle blodforsyning i transplantation af pædiatriske patienter med ekstra leverens portåren obstruktion6,7.
I øjeblikket har vi udviklet en modificeret version af den samme protokol til forbedret og nem udførelse af decellularization, recellularization og bioreaktor håndtering af små diameter vener. Den nuværende decellularization protokol kræves perfusion af detergenter gennem vene med tryk i stedet for agitation med vaske-og rengøringsmidler. Recellularization-protokollen indebærer et ekstra skridt af forkonditionering for at forbedre celle vedhæftning og tilsætning af vækstfaktorer i cirkulerende blod for at forbedre celle vedhæftning, overlevelse og spredning. Vi har også forbedret design af bioreaktor ved hjælp af kommercielt tilgængelige produkter. I dette papir præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af den ændrede protokol for at udføre decellularization og recellularization af menneskelige saphenous vener.
Protocol
Væv, der anvendes, og protokollen af dette papir følger de etiske retningslinjer fra Göteborgs Universitet.
1. Vævscentre tilberedning og opbevaring
- Skær det omgivende væv fra den hentede saphenous vene ved hjælp af kirurgiske pincet og saks.
Bemærk: Den saphenous vene er dissekeret fra de lavere lemmer af mennesker af karkirurger. Den saphenous vene anvendes i dette papir er en un-anvendte del efter bypass operation. - For at forhindre lækage under perfusion, ligate alle sidegrene i enderne med suturer og pincet.
- Holde venen i en 50 mL tube indeholder 40 mL af fosfat buffer saltvand (PBS). Vask venen ved at ændre PBS 2 - 3 gange at fjerne overskydende blod. Gemme venen ved frysning ved-80 ° C.
2. forberedelse af Decellularization opsætninger og Recellularization bioreaktor
Bemærk: Ved hjælp af saks, klippe silicium rør som vist i tabel 1.
-
Decellularization installation 1 (For Triton X-100 perfusion og vask)
- Til en 2 L kammer (plastik badekar), tape alle tre stykker af rør A, der er vist i figur 1A.
Bemærk: Tape et rør til en væg hvor kanten rører bunden af salen (vaskemiddels inlet) og de andre to rør til den modsatte væg med en afstand på 5-10 cm i mellem afhængigt af længden af venen. Mindst 5 cm af disse rør bør også være tapede til kammerets gulv (vene indløb og udløb). - Ved hjælp af de mandlige og kvindelige Luer stik, Tilslut i serien den vaskemiddel inlet tube til tube B efterfulgt af tube F, tube C og endelig at vene indløb. Sted rør F i kassette i den peristaltiske pumpe jeg.
- Tage et andet rør C og Forbind den ene ende til den vene outlet. Placer anden enden i glaskrukke med bunden slange stikkontakt, der er placeret 45 cm over kammer (vaskemiddel outlet) og tape det til at sikre. Tage tube G og skubbe ene ende i en slange stikkontakt i en glaskrukke og Placer anden enden ind i venen kammeret.
Bemærk: Billeder af hele opsætningen (røde pile), kammer og flowretning (hvide pile) er vist i figur 1A.
- Til en 2 L kammer (plastik badekar), tape alle tre stykker af rør A, der er vist i figur 1A.
-
Decellularization Setup 2 (For TnBP perfusion)
- Tage en 1 L glaskrukke, og placere ene ende af røret C (vaskemiddel inlet) i krukken, indtil røret rører den jar bunden.
- Tilslut anden enden til tube F efterfulgt af tube C. sted anden enden af røret C i krukken indtil halv dybde (vene fjorden). Placere røret F i kassette af peristaltiske pumpe jeg.
- Tage tube D og placere ene ende i jar (vene outlet) indtil halv dybde og anden enden i en glaskrukke med bunden slangen placeret på en 45 cm højde fra den vene inlet (vaskemiddel outlet). For at sikre, tape det vaskemiddel indsugnings- og udstødningsporte rør.
- Placer 1 L glaskrukke på en magnetomrører og holde magneten inde i flasken.
- Tage tube G og skubbe ene ende på slange outlet af glaskrukke og placere anden enden i 1 L glaskrukke.
Bemærk: Billedet af hele opsætningen (røde pile), kammer og flow retning (hvide pile) er vist i figur 1B.
-
Decellularization Setup 3 (For DNase perfusion)
- Tage en 250 mL glasflaske og placere begge ender af røret C. sted det midterste område af røret i kassette af peristaltiske pumpe II.
Bemærk: Ene ende af røret er løsning fjorden og anden enden af røret er tilsluttet den vene indløb. Den vene outlet er frit i løsning. - Placere hele setup herunder pumpen ved 37 ° C. Billede af hele opsætningen og flowretning er vist i figur 1 c.
- Tage en 250 mL glasflaske og placere begge ender af røret C. sted det midterste område af røret i kassette af peristaltiske pumpe II.
-
Recellularization bioreaktor
- Holde klar alle delene som vist i figur 2A.
- Som vist i figur 2B, tage 4-port cap og indsætte i hver havn, tube H (vene outlet), rør jeg (media fjorden) og tube Jørgensen (vene inlet). Indsæt anden enden af røret H i de 4th port (medie).
Bemærk: Visningen af 4-port cap fra toppen er vist i figur 2 c. For nem isætning af rør, Skær kanterne til en skarp punkt med en saks. - Bøje anden enden af røret Jørgensen til en U form og binde det med en sutur. Tilslut de reducerende stik til de indvendige ender af rør H & J.
- Placer 60 mL rør med en flad base i 250 mL glasflaske og derefter placere ovenfor lavet opsætningen ind i røret, som vist i figur 2D. Som vist i figur 2E, Tilslut rør K, E og K i serien. Tilslut en tube K til den vene indløb og et andet rør K til media indløb.
Bemærk: Den skematisk diagram af setup, og flowretning ses i figur 2F. - Sterilisere bioreaktor ved autoklavering.
3. forberedelse af løsninger
- Løsning 1 (10 x vand): til 1 L ultrarent vand, tilsættes 2 g natriumazid og 18.6 g ethylendiamintetra syre (EDTA). Rør indtil salte er opløst.
- Løsning 2 (1 x vand): tage 100 mL opløsning 1 og tilføje 900 mL i ultrarent vand.
- Løsning 3 (5 x Triton X-100): 950 mL i ultrarent vand, tilføje 50 mL Triton X-100, 1 g af natriumazid og 9,3 g af EDTA. Rør indtil opløst.
- Løsning 4 (1 x Triton X-100): tage 200 mL af opløsning 3 og tilføje 800 mL i ultrarent vand.
- Løsning 5 (1 x TnBP): der tilsættes 10 mL af TnBP med 10 mL pipette til 990 mL af opløsning 2.
- Løsning 6 (40 Kunitz enheder/mL DNase): tilføje 2.000 Kunitz enheder af DNaseI i 50 mL Dulbeccos fosfat Buffer saltvand indeholder CaCl2 og MgCl2. Forberede friske og bruge med det samme.
- Opklaring 7 (PBS): Tilføje 24 g natriumchlorid, 0,6 g kaliumchlorid, 4.32 g natrium fosfat og 0,72 g kalium fosfat til 3 L ultrarent vand. Rør indtil opløst. PH indstilles til 7,4. Sterilisere 1 L PBS i autoklave og gemme separat.
- Løsning 8 (0,1% pereddikesyre): til 50 mL steril opløsning 7, tilføje 50 µL af pereddikesyre. Forberede friske og bruge med det samme.
4. forberedelse i Endothelial Medium
- Der tilsættes 5 mL af L-glutamin, 5 mL af anti-anti, 50 mL af human serum, AB og alle komponenter i EGM-2 vækstfaktor kit undtagen føtal bovint serum til 500 mL af MCDB131 medium under en steril hætte.
5. decellularization af Saphenous vene
- Optø den menneskelige saphenous vene fra-80 ° C ved stuetemperatur. Fryse igen ved-80 ° C og tø igen ved stuetemperatur.
- Skære en biopsi af 2 mm længde ved hjælp af saks og fix i formaldehyd i 24-48 timer ved stuetemperatur. Binde enderne af vene til modhager for en mandlig og kvindelig Luer stik med en sutur.
- Tilsluttes decellularization setup 1 venen og fylde 1 liter løsning 2. Perfuse for 15 min. ved 35 mL/min. tømme indholdet af opsætningen.
- Tilføj 1 L opløsning 4 og perfuse for 4 h på 35 mL/min. tømme indholdet af opsætningen.
- Tilsættes 500 mL 2 og perfuse for 5 min. tømme indholdet af opsætningen. Gentag dette trin. Afbryde venen fra perfusion opsætning 1 og forbinde perfusion setup 2.
- Tilføje 1 L opløsning 5, tænde omrøreren og perfuse i 4 timer ved 35 mL/min.
Bemærk: Løsning 5 ser overskyet efter omrøreren og hele perfusion. - Afbryde venen fra perfusion setup 2 og vaske venen udenfor og indeni med sprøjte eller 10 mL pipette i 4 ændringer af ultrarent vand i 5-10 min.
- Tilsluttes perfusion setup 3 venen, tilsættes 50 mL 6 og perfuse på 10 mL/min. i et 37 ° C kammer for 4 h. tømme indholdet af installations og afbryde venen fra opsætningen.
- Tilsluttes perfusion opsætning 1 venen, fylde 1 L opløsning 2 og perfuse natten over ved 35 mL/min. Gentag trin 5.4 til trin 5.9 4 gange (i alt 5 cyklusser). Tage en biopsi igen som angivet i trin 5.2.
Bemærk: Spring trin 5,8 anden del i cyklus 1 og 3. - Tøm indholdet af opsætningen. Fyld 1 L opløsning 2 og perfuse i 24 timer ved 35 mL/min. ændring løsning 2 efter 12 h. tømme indholdet af opsætningen. Fyld 1L ultrarent vand og perfuse i 24 timer ved 35 mL/min. ændring i ultrarent vand efter 12 h.Empty indholdet af opsætningen. Fyld 1 L opløsning 7 og perfuse i 24 timer ved 35 mL/min. ændring løsning 7 efter 12 h.
6. kontrol af Decellularization
- Vaske formalin fast biopsier i ultrarent vand i 15 min. proces i et væv processor efter standardprotokoller og integrere i paraffin22.
- Skær 5 µm sektioner ved hjælp af en mikrotom og pletten med Meyers hæmatoxylin og 0,2% alkoholholdige eosin (H & E) efter standardprotokoller22.
- Se under et mikroskop for at kontrollere, om tab af kerner i decellularized væv sammenlignet med normale væv.
7. recellularization
- Sterilisere venen ved at placere det i en 50 mL tube indeholder 50 mL af opløsning 8. Agitere på 80 omdrejninger per minut (rpm) i shaker i 1 timer ved 37 ° C.
- Håndtere vene under laminar flow (LAF) kabinet fra nu af at opretholde sterilitet. Overføre venen ved hjælp af steril pincet til en ny 50 mL tube indeholder 50 mL af sterile løsning 7 og 500 µL af anti-anti. Gnub som ovenfor i 12 h. ændring løsning 7 mindst to gange i mellem.
- Brug steril pincet, overføre venen til en ny 50 mL tube og tilsættes 50 mL i endothelial medier. Gnub som ovenfor i 11 h.
- Samle bioreaktor bruger sterile handsker under LEIV kabinet. Binde vene til bioreaktor vene luftindtag og -udtag med steril sutur og pincet.
- Forbind venen til bioreaktor og fyld med samme medium. Tilføje heparin på 50 IE/mL og perfuse for 1 h 2 mL/min. i 37 ° C.
- Indsamle 15-25 mL af frisk blod (afhængigt af den vene længde) fra donor i heparin belagt vacutainer rør og fortyndes 1:1 med Steen løsning. Senere, tilføje endokrine kirtel-afledte vaskulær endotel vækstfaktor (EG-VEGF, 80 ng/mL), basic fibroblast vækstfaktor (b-FGF, 4 µL/mL) og acetyl-salicylsyre (5 µg/mL).
- Flytte bioreaktor til 37 ° C kuvøse med 5% CO2 og perfuse i 48 timer ved 2 mL/min.
- Ca 12 h, flytte bioreaktor til en LEIV kabinet, tage en dråbe blod og måle glukose ved hjælp af en blodglucose overvågning enhed. Hvis niveauet er mindre end 3 mmol/L, tilføje glukose til at bringe i rækken af 7-9 mmol/L. Gentag dette trin hver 8-12 h.
- Efter 48 h, flytte bioreaktor til LEIV kabinet og dræne blodet fra bioreaktor. Der tilsættes 30 mL steril opløsning 7 og perfuse i 5 min. afløb løsningen. Der tilsættes 30 mL steril opløsning 7 og perfuse i 5 min. Gentag to gange eller indtil den blodrøde farve er tabt.
Bemærk: Biopsi kan tages for verifikation af celle vedhæftet fil. Afbryde venen, skåret 5 mm kanter af venen med saks og kassere dem. Tage en biopsi, som anført i trin 5.2 og tilsluttes bioreaktor (Valgfrit trin) venen igen. - Tilføj 30-45 mL i endothelial medium og perfuse for 96 timer i inkubator på 2 mL/min.
Bemærk: Tilføje endotel medium indtil venen er neddykket. - Flytte bioreaktor ind i LEIV kabinettet, Afbryd den recellularized vene, skåret 5 mm kanter af venen ved hjælp af saks og kassér. Tage en biopsi, som anført i trin 5.2.
8. verifikation af Recellularization
- Følg vejledningen i afsnit 6 og udføre H & E farvning. Undersøge dias under et mikroskop for tilstedeværelsen af celler.
Representative Results
Brutto morfologi af en normal vene er lys rød (figur 3A). Den røde farve er tabt i progressive decellularization cyklusser (cyklus 2, figur 3B, cykle 3, figur 3 c) og af de 5th cyklus, det ser bleg og hvid (figur 3D). Den recellularized vene efter blod perfusion (figur 3E) og endotel media perfusion (figur 3F) ser lyse rødt i farve. 5 cyklusser af decellularization behandling fjernet med held cellerne fra venen, da ingen blå kerner i H & E farvning (figur 4B) blev set. Derimod sås flere kerner i den normale vene (figur 4A). Tilstedeværelsen af tilknyttede celler om det luminale side ses i H & E farvning i den recellularized vene med blod for 48 h (figur 4 c, sorte pile) og efter perfusion med i endothelial medium for 96 timer (figur 3D, sorte pile).
Figur 1 : Samling af perfusion opsætninger for decellularization. A) billede viser samlet decellularization setup 1 for Triton X-100 og vask. De hvide pile viser strømningsbane løsninger og røde pile angiver indgange og udgange for vene og løsninger. B) billedet viser samlet decellularization setup 2 for TnBP perfusion. Ligeledes decellularization i installation 1 hvide pile angiver strømningsbane løsninger og røde pile angiver indgange og udgange for vene og løsninger. C) billedet viser samlet decellularization setup 3 for deoxyribonuclease perfusion. De hvide pile viser strømningsbane løsninger og røde pile angiver fjorde for vene og løsninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Forberedelse og montering af bioreaktor for recellularization. A) billede viser materialeudgiften til at samle bioreaktor. B) billede af indersiden af 4-port cap viser placeringen af at reducere stik (røde pile), point for at forbinde vene indløb og udløb (hvide pile) og arrangement af rør H, I og J. Den frie ende af røret H er placeret i bioreaktor returnere medier. C) de respektive rør går ind og ud kan ses fra oversiden af 4 port cap. D) billede, der viser de forsamlede bioreaktor. E) billede, der viser hele bioreaktor setup med den peristaltiske pumpe. Rør K udvide forbindelser fra bioreaktor til den peristaltiske pumpe. F) den skematisk gengivelse af hele bioreaktor perfusion system. De orange pile angiver retningen af flow. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Brutto morfologi af vener under decellularization og recellularization. A) brutto morfologi af normale vene ser lyse rødt i farve. Farven er tabt med stigende antal decellularization cyklusser B) cyklus 2 og C) cykle 3. D) af 5 cyklusser, vene ser bleg og hvid. Vene efter perfusing med E) blod for 48 h og F) med i endothelial medium for 96 timer ser igen lyse rødt i farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Karakterisering af decellularized og recellularized vener. Hæmatoxylin og eosin pletter billede af A) normale vene indeholder mange blå kerner, men de er fraværende i B) decellularized vene. I den vein recellularized med C) blod for 48 h og med D) endotel medium til 96 timer, fastgørelse af celler (sorte pile) på lumen blev bemærket. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Teknikken præsenteret her for decellularization af saphenous vener er en let, enkel og omkostningseffektiv metode, der også kan anvendes til alle små diameter vener som navlestrengen og brystkirtler vener. Decellularization løsninger og deres koncentrationer anvendes i denne metode er fra vores tidligere resultater6,7. Selv om vi anbefaler 5 cyklusser af decellularization, i visse vener bemærkede vi også komplet decellularization i 3 cyklusser. Men reproducerbare resultater blev opnået ved hjælp af 5 cyklusser. Anvendelsen af denne protokol, vi decellularized vener af varierende længder op til 30 cm med succes (ikke-offentliggjorte resultat). Løft decellularization løsning outlet 45 cm vil skabe et tryk på 33 mmHg inde i venen. Vores erfaring bemærket vi dette som et vigtigt skridt i decellularizing hele venen ensartet og reproducerbar 5 cyklusser. Den valgte pres er 3 gange højere end det normale saphenous vene pres (5-10 mmHg) men er den samme som inkompetente vener (åreknuder)23. Derudover spekulere vi at denne højtryk vil skabe en betydelig kraft på vene vægge og kan derfor støtte i effektive og hurtigere celle fjernelse.
Da TnBP er et organisk opløsningsmiddel og uopløseligt i vand, omrøring vaskemiddel, indtil det bliver overskyet er vigtigt; ellers, vaskemiddel vil flyde. Af samme grund, for at holde TnBP blandet i løsning, blev den vaskemiddel outlet rør placeret øverst på glaskrukke med slange stikkontakt. Effektiv fjernelse af TnBP fra venen efter dens skik i hver cyklus kan ses ved fravær af flydende TnBP dråber i vasket vandet. Vi har også bemærket at springe DNase skridt også produceret en decellularized væv, men i nogle få tilfælde blev bemærket, en forholdsvis høj DNA indhold i det decellularized væv. Som højt tryk og høj strømningshastigheder ikke er påkrævet for effektiv DNase aktivitet, kan en lav perfusion sats (10 mL/min.) anvendes. En anden peristaltisk pumpe blev brugt som dens mindre størrelse hjælper i let håndtering af opsætningen. Da vi har bemærket, at beskadigelse af de fleste celler under decellularization resultater i cyklus 2, foreslår vi springe DNase behandling under cyklus 1 og 3 (ikke-offentliggjorte resultat). Selv om karakterisering og kvantificering af ekstracellulære matrix proteiner ikke blev udført i dette manuskript, vores tidligere erfaringer med lignende decellularization protokoller viste bevarelsen af biomekaniske egenskaber, ekstracellulær matrix struktur og proteiner7. Selvom vores foreløbige kvantificering eksperimenter med disse vener produceret et lignende resultat (upubliceret), vil vores allerede offentliggjorte resultater styrke denne tillid.
Recellularization ved hjælp af blod er en praktisk og nem proces over knoglemarv udvidet celler, så man kan undgå lange celle ekspansion gange, spontane mutationer i udvidet celler, kirurgisk invasion og ubehag for patienten. Da det er kendt, at endothelialization kan også opstå fra cirkulerende EPCs, vi hypotese at perfusion med blod efterfulgt af perfusion med endotel medium vil være tilstrækkeligt for recellularization. Sikkerheden af vene væv manipuleret ved hjælp af en lignende metode er set fra vellykkede resultater af transplantation når to sådanne vener blev implanteret i børn med ekstra leverens portåren obstruktion7. Vi spekulere, at vækstfaktorerne i decellularized ekstracellulære matrix vil tillade udlæg i cirkulerende EPCs fra blod24. Recellularization af venerne efter en lignende protokol viste celler positiv for VEGF receptor-2 og klynge af differentiering (CD) 14 på lumen mens CD45 udtrykker celler sås i adventitia7. Vi også forestille sig, at en kontinuerlig endotel lag ikke kan overholdes i alle tilfælde navnlig hvor benytter blod fra ældre og syge patienter, som det er kendt, at sådanne personer har faldt antallet af cirkulerende stamfader celler25. Men vi postulere at perfusion med modtagerens egne blod kan maskere mange af de antigener, der er udsat på grund af decellularization og således kan mindske risikoen for inflammatoriske bivirkninger når transplanteret i modsætning til omplantning kun decellularized blodkar. Derudover kan blod perfusion deponere forhøjede niveauer af vækstfaktorer på lumen og adventitia, som igen kan rekruttere øgede antallet af cirkulerende stamceller resulterer i en hurtig proces af recellularization i vivo.
Fordelene ved den bioreaktor design anvendes i denne undersøgelse er komplet autoklavering, nem montering, omkostningseffektivitet, nem håndtering og mindst muligheden for skader. Vores erfaring, ved hjælp af de aktuelle design, vener op til 10 cm i længden var recellularized. Selvom vener op til 25 cm i længden kan også være recellularized ved at holde venen i "U" form inde bioreaktor, dette skal valideres. Bioreaktor designet viser at retning af flow i venen er mod tyngdekraften og er designet som sådan, fordi det er den normale retning af strømmen til disse vener i mennesker. 12 h perfusion af i endothelial medium skridt er forudsætning venen og øge affinitet for fastgørelse af indgående EPCs. Tilføjelse af ekstra heparin og perfusion for 1 h vil sænke risikoen for dannelse af blodpropper i rør under blod perfusion.
Mængden af blod kræves er afhængig af længden af venen. Det grundlæggende princip, vi følger for blodvolumen er, at venen bør være neddykket i blodet. Mens håndtering blod diskenheder større end 45 mL, kan lejlighedsvis blanding være forpligtet til at forhindre cell ophobning i bunden af bioreaktor. Vi tilføjet Steens løsning til blod da det indeholder en høj mængde af proteiner og komponenter, der kræves til at opretholde væv sund under orgel transplantation26,27. Tilsætning af VEGF og b-FGF er gavnligt, da de er potent angiogene vækstfaktorer28 og deres tilstedeværelse inducerer migration, spredning og differentiering af EPCs29,30,31,32 . Mængden af VEGF tilføjet bygger på vores tidligere ikke-offentliggjorte resultater hvor spredning af EPCs blev set på 80 ng/mL. Tilsætning af acetylsalicylsyre hæmmer aktivering af trombocytter33 dermed mindske chancerne for deres vedhæftet fil i endothelial lag. Løbende overvågning og tilsætning af glucose vil også være gavnligt for celledelingen og forhindre hæmolyse af røde blodlegemer.
Da der kræves kun en simpel blodprøve fra modtageren, kan det betragtes som en nem og gennemførlig procedure kræver mindre teknisk ekspertise. Selvom hele proceduren vises her fra start til slut tager 20 dage, opbevaring decellularized venerne som en fra hylden produkt vil forkorte proceduren for 8 dage for patienter. Selv om opbevaring af decellularized vener teknisk ikke bør påvirke recellularization effektivitet, skal det evalueres. Væv-manipuleret vener genereret efter denne procedure kan bruges i klinikken til bypass operationer, udskiftning blokeret vener, venøs insufficiens fører til åreknuder uden behov for immunsuppression og dermed give en bedre kvalitet af liv for patienten.
Disclosures
SSH besidder aktier i Verigraft, et selskab, der har licenseret teknologien i tissue engineering blodkar. Andre forfattere har intet at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Professor Anders Jeppsson for hjælp med at levere blodkar, der anvendes i eksperimenter. Undersøgelsen blev finansieret af LUA ALF tilskud til SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
