Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57803
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להצפנה decellularization וריד saphenous באמצעות חומרי ניקוי, recellularization על ידי זלוף של הדם ההיקפיים, המדיום אנדותל.

Abstract

תעלות כלי דם בשימוש במהלך רוב ניתוחי כלי דם הם שתלים allogeneic או סינתטי לעיתים קרובות לגרום לסיבוכים הנגרמת על ידי החיסוני patency המסכן. הנדסת רקמות מציע פתרון חדשניים ליצירת שתלי אישית עם מטריצה חוץ-תאית טבעי המכיל התאים של המטופל באמצעות השיטה של decellularization ושל recellularization. אנו מראים שיטה מפורטת לביצוע decellularization של וריד saphenous אנושי, recellularization על ידי זלוף דם היקפיים. הווריד היה decellularized על-ידי % 1 פרפוזיה טריטון X-100, 1% tri-n-בוטיל-פוספט (TnBP) ו- 2,000 יחידות קוניץ של deoxyribonuclease (DNase). טריטון X-100 ו- TnBP היו perfused ב 35 מ ל/דקה במשך 4 שעות בעוד DNase היה perfused ב- 10 מ ל/דקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. תקחי את שטף מים הנדסה גנטית, PBS, ואז מעוקר ב 0.1% חומצה peracetic. זה היה נשטף שוב ב- PBS, preconditioned בינוני אנדותל. הווריד מחובר מגיב ביולוגי, perfused בינונית אנדותל המכיל 50 IU/mL הפארין עבור ה 1 Recellularization בוצע על ידי מילוי של ביוריאקטור עם דם טרי, 1:1 מדולל בפתרון סטין, והוספת בלוטה אנדוקרינית-derived כלי דם גורמי גדילה אנדותל (80 ng/mL), גורמי גדילה בסיסי פיברובלסט (4 µL/mL), חומצה אצטיל-סליצילית (5 µg/mL). ביוריאקטור היה ואז עבר לגור אינקובטור, perfused במשך 48 שעות ב- 2 מ ל/דקה תוך שמירה על גלוקוז בין 3-9 mmol/ל' מאוחר יותר, הווריד היה נשטף עם PBS, מלא בינונית אנדותל, perfused עבור h 96 בחממה. טיפול עם טריטון X-100, TnBP ו- DNase decellularized וריד saphenous 5 מחזורים. הווריד decellularized נראה לבן בניגוד ורידים רגיל ו- recellularized (אדום בהיר). Hematoxylin & אאוזין (H & E) צביעת הראה הנוכחות של גרעינים רק רגיל אך לא ורידים decellularized. את תקחי את recellularized, H & E מכתים הראה הנוכחות של תאים על-פני luminal הווריד.

Introduction

תעלות כלי דם יש צורך במספר תנאים קליניים כמו מפרצות, היצרות העורק הראשי, טרשת עורקים המובילים לבעיות קשות של כלי הדם. מנתחים להשתמש תעלות כלי דם עצמיים, allogeneic או סינתטיים כדי לשחזר את אספקת הדם פונקציונלי. למרות השימוש של כלי דם עצמיים עדיין נחשב הגישה האידיאלית, זמינות בחולים מוגבל צהובה. החלופות כגון שתלי allogeneic או סינתטי יש בעיות עמוקה עם טיפולים לדיכוי המערכת החיסונית ואת עני patency שמוביל reoperation1,2, וכתוצאה מכך הבריאותיות העיקריים בנטל כלכלי למדינות. הנדסת רקמות של כלי הדם שואפת לספק שתלי הומולוגיה הטבעי של תאים עצמיים. לפיכך, המערכת החיסונית הנמען מזהה השתל מהתורם העצמי, מאחר שתל כזה מכיל חלבונים טבעיים של תאים בתצורה המקורית, זה עשוי לתפקד טוב יותר לעומת החלופות הנוכחי. רקמות מהונדסים איברים, כמו למשל את שלפוחית השתן3, את השופכה4, קנה הנשימה5ו6,ורידים7, בהצלחה שימשו במרפאה.

הנדסת רקמות לייצר שתלים אישית דורשת השתלה מתורם ואחריו decellularization ו recellularization. Decellularization היא טכנולוגיה מבטיח להסיר תאים לרקמות ואיברים8,9,10. Decellularization יכול להתבצע על ידי שיטות ספציפיות פיזי, כימי אנזימטי11 או שילובם. -שימוש אופטימלי של שיטות אלה, רקמות decellularized יכולות להיות דומה חלבונים מבניים ופונקציונליים מטריצה חוץ-תאית דומה לרקמות מקורית. איברים כאלה בעלי יכולת מהותי כדי לשפר את הקובץ המצורף, הגירה, התפשטות, התמיינות של תאי גזע נכנסות.

Recellularization הוא תהליך דינאמי של זריעה תאים לתוך השתל, תאי גזע הנמען יכול לשמש עבור השתלת קליניים. תאי גזע בשימוש כיום למטרות כאלה כוללים מח העצם, mesenchymal איבר תושבים3,5,6. חיה ולימודי מחקר מונחה השתמשו בתאי גזע ממוצא mesenchymal שאינם pluripotent עוברית, מושרה12,13,14. תהליך זה דורש מגיב ביולוגי (חדר מחזיקה את הווריד ומספק את התנאים הנדרשים כמו טמפרטורה, גזים, pH לחץ), תאים ומדיה תרבות. האתגר של recellularization הוא כדי להשיג את המספר הנדרש של תאים של סוג מסוים של אסטרטגיה זריעה שבו תאים יכולים להגיע כל רקמה או איבר. למרות אין איבר או רקמה מלאה מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית יש כבר נוצר, מוערכים עד עכשיו, מספר הפיתוחים בשדה ואת תוצאות ראשוניות להראות את האפשרות העתידית15. הפונקציה מפתח של הווריד טמון אנדותל luminal השולטת חדירה של תאים דלקתיים ברקמות, השכבה האמצעית שריר חלק, מסייע לתעוקה ומספק גם את הכוח להחזיק את לחץ הדם16. מחקרים הראו כי במהלך נזק, endothelialization מתרחשת השקה או מלהסתובב אנדותל ובתאים (EPCs) דם17,18,19. האסטרטגיה שלנו עבור recellularization של ורידים מסתמך על EPCs ההווה במחזור הדם.

הנדסת רקמות של ורידים, עורקים בוצע על ידי מספר קבוצות עוקב אחר decellularization ו- recellularization אסטרטגיות20,21. הקבוצה שלנו יש גם לבצע ופיתח אסטרטגיות decellularization ו- recellularization ורידים iliac ואת החלב6,7. Decellularization בוצע על ידי חרדה הווריד ב טריטון X-100, tri-n-בוטיל פוספט (TnBP), וכן אנזים deoxyribonuclease (DNase). Recellularization בוצעה באמצעות מח עצם נגזר אנדותל וחלק שרירים תאים6 או דם היקפיים7. הורידים recellularized על-ידי פרוטוקול גם הראו הבטחה קליניים במתן אספקת דם תפקודי השתלת של ילדים חולים עם6,חסימה נוספת וריד שער7.

כיום פותחו גירסה שונה של פרוטוקול זהה עבור ביצועים משופרים וקל של decellularization, recellularization, ביוריאקטור טיפול ורידים בקוטר קטן. פרוטוקול decellularization הנוכחי נדרש זלוף של דטרגנטים דרך הווריד של באמצעות הלחץ במקום עצבנות עם דטרגנטים. פרוטוקול recellularization כרוך צעד נוסף של preconditioning לשיפור הידבקות תאים ותוספת של גורמי גדילה במחזור הדם לשיפור הידבקות תאים, הישרדות והתפשטות. גם שיפרנו את העיצוב של ביוריאקטור שימוש במוצרים זמינים מסחרית. בנייר זה, אנו מציגים תיאור מפורט של פרוטוקול שונה עבור ביצוע decellularization ו- recellularization של האדם הורידים saphenous גדולות.

Protocol

הרקמה בשימוש, הפרוטוקול של המאמר עוקב אחר ההנחיות האתית של אוניברסיטת גטבורג.

1. רקמות הכנה ואחסון

  1. חותכים את הרקמה שמסביב של וריד saphenous שאוחזרו באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
    הערה: וריד saphenous הוא גזור מן האיבר התחתון של בני אדם על ידי מנתחים כלי הדם. וריד saphenous בשימוש הנייר הזה הוא חלק משולחים שאינם בשימוש לאחר ניתוח מעקפים.
  2. כדי למנוע דליפה במהלך זלוף, מאתרים ומפסיקים את כל הענפים בצד שלהם הקצוות עם התפרים וחדים.
  3. שמור את הוריד שפופרת 50 מ ל המכיל 40 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS). לשטוף את הווריד על-ידי שינוי PBS 2 - 3 פעמים כדי להסיר את עודף דם. לאחסן את הווריד על ידי הקפאת ב-80 מעלות צלזיוס.

2. הכנת Decellularization כיוונונים, ביוריאקטור Recellularization

הערה: באמצעות מספריים, חותכים את צינורות סיליקון כפי שמוצג בטבלה 1.

  1. הגדרת decellularization 1 (עבור טריטון X-100 זלוף, כביסה)
    1. כדי בשנה השנייה קאמרית (אמבטיה מפלסטיק), להקליט את כל שלוש חתיכות של שפופרת A כפי שמוצג באיור 1A.
      הערה: קלטת שפופרת אחת על קיר אחד שבו הקצה נוגע בתחתית התא (כניסת של דטרגנט) וצינורות שני אחרים לקיר הנגדי עם מרחק של 5-10 ס מ בין בהתאם לאורך הווריד. גם צריך להיות מודבק לפחות 5 ס מ של צינורות אלה רצפת החדר (הווריד של כניסת ולשקע).
    2. השימוש המחברים סכינים סטריליים זכר ונקבה, להתחבר בסדרה כניסת של הנוזל צינור אל הרכבת התחתית B ואחריו צינור F, שפופרת C, ולבסוף לים וריד. המקום הצינור F לתוך בקלטת של סחרור משאבה אני.
    3. . קח עוד צינור C, חבר קצה אחד לשקע הווריד. מניחים בצד השני צנצנת הזכוכית עם השקע הצינור התחתון ממוקם 45 ס מ מעל התא (דטרגנט outlet) והדבק כדי לאבטח. קח צינור G ו לדחוף קצה אחד לשקע צינור של צנצנת הזכוכית ולמקם את הקצה השני אל החדר וריד.
      הערה: התמונות של השלמת ההתקנה (חצים אדומים), הקאמרית כיוון הזרימה (החצים הלבנים) מוצגים איור 1A.
  2. הגדרת decellularization 2 (עבור TnBP זלוף)
    1. לקחת צנצנת זכוכית 1 ליטר, ולמקם קצה אחד של הצינור C (כניסת דטרגנט) לתוך הצנצנת עד הצינור נוגעת התחתון של הצנצנת.
    2. חבר את הקצה השני צינור F ואחריו צינור ג מקום הקצה השני של הרכבת התחתית C לתוך הצנצנת עד עומק חצי (כניסת של הווריד). למקם את צינור F הקלטת של משאבת סחרור אני.
    3. קח צינור D, למקם את קצה אחד הצנצנת (outlet של וריד) עד עומק חצי ואת הקצה השני לתוך צנצנת הזכוכית עם הצינור התחתון ממוקם בגובה 45 ס מ מ כניסת של הווריד של (דטרגנט עודפים). כדי לאבטח, קלטת צינורות כניסת ו עודפים של הנוזל.
    4. מניחים את צנצנת הזכוכית 1 ליטר על פגים ולשמור את המגנט שבתוך הבקבוק.
    5. קח צינור G ו לדחוף קצה אחד על גבי הצינור לשקע של צנצנת הזכוכית ומניחים בצד השני לתוך צנצנת זכוכית 1 ליטר.
      הערה: התמונה של השלמת ההתקנה (חצים אדומים), כיוון קאמרית וזרימה (החצים הלבנים) מוצג איור 1B.
  3. הגדרת decellularization 3 (עבור DNase זלוף)
    1. קח בקבוק זכוכית 250 מ ל, למקם את שני הקצוות של שפופרת ג מקום האזור האמצעי של הצינור בקלטת של משאבת סחרור II.
      הערה: קצה אחד של הצינור הוא הים פתרון, בקצה השני של הצינור מחובר כניסת של הווריד של. אאוטלט של הוריד נותר חופשי בתמיסה.
    2. למקם את כל הארגון כולל משאבת ב 37 º C. התמונה של השלמת ההתקנה, כיוון הזרימה מוצג באיור 1C.
  4. Recellularization ביוריאקטור
    1. שמור מוכן כל החלקים כפי שמוצג באיור 2A.
    2. כפי שמוצג באיור 2B, לקחת את הכובע ארבע יציאות להכניס כל יציאה, צינור H (outlet של וריד), צינור אני (המדיה כניסת) ו צינור J (כניסת של הווריד). הכנס את הקצה השני של הצינור H ליציאתה 4 (אמצעי התקשורת).
      הערה: התצוגה של הכיפה ארבע יציאות מלמעלה מוצג באיור 2C. להכנסה נוחה של צינורות, חותכים את הקצוות כדי ליצור קצה חד עם מספריים.
    3. לכופף את הקצה השני של הצינור J לצורת U, תקשור את זה. בתפר. להתחבר המחברים להפחית הקצוות הפנימיים של צינורות H & ג'יי
    4. להכניס את הצינור 60 מ עם בסיס שטוח בתוך בקבוק הזכוכית 250 מ ל ולאחר מכן מקם את ההתקנה עשוי לעיל לתוך הצינור כפי שמוצג באיור 2D. כפי שמוצג באיור 2E, מחברים צינורות K, E ו- K בסדרה. מחברים צינור אחד K כניסת של הווריד צינור אחר K לים מדיה.
      הערה: תרשים סכמטי של תוכנית ההתקנה, כיוון הזרימה הוא ראה ב 2F איור.
    5. לחטא את ביוריאקטור על-ידי autoclaving.

3. אופן ההכנה של פתרונות

  1. פתרון 1 (10 x מים): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 2 g של אזיד הנתרן ו- g 18.6 של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA). מערבבים עד מלחים הם התפרקה.
  2. פתרון 2 (1 x מים): לקחת 100 מ של פתרון 1 ולהוסיף 900 מ ל מים הנדסה גנטית.
  3. פתרון 3 (5 x טריטון X-100): עד 950 מ"ל של מים הנדסה גנטית, להוסיף 50 מ של טריטון X-100 1g של אזיד הנתרן, 9.3 גר' EDTA. מערבבים עד התפרקה.
  4. פתרון 4 (1 x טריטון X-100): לקחת 200 מ של פתרון 3 ולהוסיף 800 מ ל מים הנדסה גנטית.
  5. פתרון 5 (1 x TnBP): להוסיף 10 מ של TnBP עם פיפטה 10 מ"ל 990 מ של פתרון 2.
  6. פתרון 6 (40 קוניץ יחידות/mL DNase): להוסיף קוניץ 2,000 יחידות של DNaseI 50 מ של Dulbecco פוספט מאגר מלוחים המכילים CaCl2 ו- MgCl2. להכין טרי ולהשתמש מיד.
  7. פתרון 7 (PBS): להוסיף 24 גר' נתרן כלורי, 0.6 גרם אשלגן כלורי, g 4.32 של סודיום פוספט ו- g 0.72 של אשלגן פוספט 3 לליטר מים הנדסה גנטית. מערבבים עד התפרקה. להתאים את ה-pH ל 7.4. לחטא 1 ליטר ל- PBS ב החיטוי ולאחסן בנפרד.
  8. פתרון 8 (0.1% חומצה Peracetic): 50 מ של פתרון סטרילי 7, להוסיף 50 µL של חומצה peracetic. להכין טרי ולהשתמש מיד.

4. הכנת אנדותל בינוני

  1. הוסף 5 מ לגלוטמין, 5 מ של אנטי אנטי, 50 מ של AB בנסיוב אדם ואת כל הרכיבים של EGM-2 ערכת פקטורי גדילה חוץ עוברית סרום שור עד 500 מ"ל של המדיום MCDB131 תחת כיסוי סטרילי.

5. decellularization של וריד Saphenous

  1. הפשרת וריד saphenous אנושי מ-80 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר. להקפיא שוב ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר שוב בטמפרטורת החדר.
  2. ביופסיה של 2 מ מ אורך באמצעות מספריים לחתוך ותקן בפורמלין במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר. לקשור כל סוף הווריד כדי לחלקים של מחבר סכינים סטריליים זכר ונקבה בתפר.
  3. לחבר את הווריד להתקנת decellularization 1 ומלא 1 ליטר של פתרון 2. Perfuse במשך 15 דקות ב- 35 מ ל לדקה לרוקן את התוכן של ההתקנה.
  4. להוסיף 1 ליטר של פתרון 4, perfuse עבור 4 h ב- 35 מ ל לדקה לרוקן את התוכן של ההתקנה.
  5. להוסיף 500 מ"ל של פתרון 2, perfuse עבור 5 דק. לרוקן את התוכן של ההתקנה. חזור על שלב זה. נתק את הווריד מהגדרת זלוף 1 וחבר להתקנת זלוף 2.
  6. להוסיף 1 ליטר של פתרון 5, להפעיל את קדירות, perfuse במשך 4 שעות-35 mL/min.
    הערה: פתרון 5 נראה מעונן לאחר המפנה על בחישה את וברחבי זלוף.
  7. נתק את הווריד זלוף ההתקנה 2 ולשטוף את הווריד של מחוץ ובתוך עם מזרק או פיפטה של 10 מ"ל 4 שינויים של הנדסה גנטית מים למשך 5-10 דקות.
  8. לחבר את הווריד להתקנת זלוף 3, להוסיף 50 מ של פתרון 6, perfuse ב- 10 מ ל/דקה בתוך תא 37 ° C 4 h לרוקן את התוכן של ההתקנה, נתק את הווריד של ההתקנה.
  9. לחבר את הווריד להתקנת זלוף 1, מילוי 1 ליטר של פתרון 2, perfuse בין לילה-35 מ ל לדקה חזור על שלב 5.4 לשלב 5.9 4 פעמים (עבור סכום כולל של 5 מחזורים). לקחת ביופסיה שוב כפי שנקבע בשלב 5.2.
    הערה: לדלג על שלב 5.8 החלק השני במחזורים 1 ו- 3.
  10. רוקן את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של פתרון 2 ו perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי פתרון 2 אחרי ה 12 לרוקן את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של המים הנדסה גנטית, perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי המים הנדסה גנטית לאחר 12 h.Empty את התוכן של ההתקנה. מילוי 1 ליטר של פתרון 7, perfuse עבור 24 שעות-35 מ ל לדקה שינוי פתרון 7 אחרי 12 שעות.

6. אימות של Decellularization

  1. לשטוף את פורמלין קבוע ביופסיות במים הנדסה גנטית למשך 15 דקות תהליך בתוך מעבד רקמות בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, להטביע פרפין22.
  2. לחתוך 5 מיקרומטר למקטעים באמצעות מיקרוטום של הכתם עם hematoxylin ו- 0.2% אלכוהוליים אאוזין מאייר (H & E) בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים22.
  3. הצג תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם אובדן של גרעינים ברקמת decellularized בהשוואה הרקמות.

7. recellularization

  1. לחטא את הווריד על-ידי הצבתו בשפופרת 50 מ ל המכיל 50 מ של פתרון 8. להתסיס ב 80 סיבובים לדקה (סל ד) שייקר עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. להתמודד עם הווריד של תחת זרימה שכבתית (נולדנו) ארון מעכשיו לשמור על עקרות. העבר בעזרת מלקחיים סטרילי צינור 50 מ ל המכיל 50 מ של פתרון סטרילי 7 ו- 500 µL של אנטי-נגד. להתסיס לעיל עבור 12 ח' 7 פתרון שינוי לפחות פעמיים שביניהם.
  3. בעזרת מלקחיים סטרילי, להעביר את הווריד צינור 50 מ"ל ולהוסיף 50 מ של מדיה אנדותל. להתסיס לעיל עבור 11 h.
  4. להרכיב את ביוריאקטור שימוש בכפפות סטריליות תחת נולדנו הקבינט. לקשור את הווריד של ביוריאקטור כניסת הווריד, שקע עם תפר סטרילי וחדים.
  5. לחבר את הווריד ביוריאקטור, מילוי עם המדיום אותו. להוסיף הפארין 50 IU/mL ו- perfuse עבור h 1-2 mL/min ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. לאסוף 15-25 מ של דם טרי (תלוי באורך של הוריד) מהתורם הפארין מצופה האגירה צינורות ו לדלל 1:1 עם פתרון סטין. מאוחר יותר, הוסף בלוטה אנדוקרינית-derived כלי הדם צמיחה אנדותל (EG-VEGF, 80 ng/mL), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (b-FGF, µL 4/mL), חומצה אצטיל-סליצילית (5 µg/mL).
  7. לעבור את ביוריאקטור חממה 37 ° C עם 5% CO2 , perfuse במשך 48 שעות-2 mL/min.
  8. כ לאחר 12 שעות, לעבור את ביוריאקטור נולדנו ארונית, לקחת טיפת דם ומדידת גלוקוז באמצעות של הגלוקוז בדם פיקוח על המכשיר. אם הרמה היא פחות מ 3 mmol/L, להוסיף גלוקוזה להביא בטווח של 7-9 mmol/ל' חזור על צעד זה כל h 8-12.
  9. לאחר 48 שעות, להעביר את ביוריאקטור נולדנו הקבינט, לנקז את הדם מן ביוריאקטור. להוסיף 30 מ של פתרון סטרילי 7, perfuse עבור 5 דק סוחטים הפתרון. להוסיף 30 מ של פתרון סטרילי 7, perfuse עבור 5 דק חוזר פעמיים או עד צבע אדום blood אובד.
    הערה: ניתן לקחת הביופסיה לאימות של הקובץ המצורף התא. נתק את הווריד, לחתוך קצוות הווריד של 5 מ מ עם מספריים ולמחוק אותם. לקחת ביופסיה כאמור בשלב 5.2 וחבר את הווריד שוב ביוריאקטור (שלב אופציונלי).
  10. להוסיף 30-45 מ"ל של מדיום אנדותל, perfuse עבור h 96 בחממה ב 2 mL/min.
    הערה: הוסף אנדותל בינוני עד הווריד שקוע.
  11. להעביר את ביוריאקטור לתוך הארון נולדנו, נתק את הווריד recellularized, לגזור קצוות 5 מ מ בעזרת מספריים וזורקים. לקחת ביופסיה כאמור בשלב 5.2.

8. אימות של Recellularization

  1. ההוראות בסעיף 6 ולבצע H & E מכתים. לבחון את השקופיות תחת מיקרוסקופ נוכחות של תאים.

Representative Results

המורפולוגיה ברוטו של וריד נורמלי הוא האור האדום (איור 3 א). צבע אדום הולך לאיבוד decellularization מתקדמת מחזורים (מחזור 2, איור 3B; מחזור 3, איור 3C) על ידי מחזורth 5, וזה נראה חיוור ולבן (דמות תלת-ממד). הווריד recellularized לאחר הדם זלוף (איור 3E) זלוף מדיה אנדותל (איור 3F) נראה אדום בהיר בצבע. 5 מחזורי הטיפול decellularization בהצלחה להסיר את התאים הווריד כפי אין גרעינים כחול ב H & E ההכתמה (איור 4B) נראו. לעומת זאת, מספר גרעינים נראו בווריד נורמלי (איור 4A). הנוכחות של תאים המצורף בצד luminal נתפסת ב H & E מכתימה את תקחי את recellularized עם דם במשך 48 שעות (איור 4C, חצים שחורים) ואחרי זלוף עם המדיום אנדותל עבור h 96 (דמות תלת-ממד, חצים שחורים).

Figure 1
איור 1 : ייצור הייעודיות זלוף decellularization. A) התמונה שתציג את ההגדרה decellularization התאספו 1 עבור טריטון X-100 ושטיפת. החצים הלבנים הצגת הנתיב זרימה לפתרונות ולציין חצים אדומים אינלטס ועודפים וריד ופתרונות. B) התמונה מראה את הכיוונון שהורכב decellularization 2 עבור TnBP זלוף. באופן דומה, כמו decellularization התקנה 1, החצים הלבנים לציין את הנתיב זרימה עבור פתרונות, חיצים אדומים מציינים אינלטס ועודפים וריד ופתרונות. C) התמונה מראה את הכיוונון שהורכב decellularization 3 עבור deoxyribonuclease זלוף. החצים הלבנים הצגת הנתיב זרימה לפתרונות ולציין חצים אדומים אינלטס וריד ופתרונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 2
איור 2 : הכנה והרכבה של ביוריאקטור עבור recellularization. A) מראה החומרים הנדרשים להרכבת ביוריאקטור את התמונות. B) תמונה של החלק הפנימי של ארבע יציאות קאפ מציג את המיקום של הפחתת מחברים (חצים אדומים), נקודות חיבור כניסת הווריד, אאוטלט (החצים הלבנים), סידור צינורות H, אני, ג'יי בסוף חינם tube H ימוקם את ביוריאקטור להחזיר מדיה. C) ניתן לראות הצינורות המתאימים עולה ויורד מן הצד העליון של הכובע יציאה 4. D) תמונה המציגה את ביוריאקטור מורכבים. E) תמונה המציגה את הגדרת ביוריאקטור שלם עם המשאבה ממברנות. הצינורות K להאריך חיבורים ביוריאקטור המשאבה ממברנות. F) ייצוג סכמטי של מערכת זלוף ביוריאקטור כל. החיצים כתום לציין את כיוון הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 3
איור 3 : ברוטו המורפולוגיה של ורידים במהלך decellularization, recellularization. A) המורפולוגיה ברוטו של וריד רגילה נראה אדום בהיר בצבע. הצבע אובד עם מספר גדל והולך של מחזורים decellularization B) מחזור 2, C) מחזור 3. D) על ידי 5 מחזורים, וריד נראה חיוור ולבן. הווריד לאחר פרפוזיה עם E) דם במשך 48 שעות ו- F) עם המדיום אנדותל עבור 96 h נראה אדום בהיר שוב בצבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : אפיון של ורידים decellularized, recellularized. Hematoxylin של eosin צביעת תמונה של א) וריד נורמלי מכיל גרעינים כחולים רבים אך הם נעדרים ב B) וריד decellularized. את תקחי את recellularized עם C) דם במשך 48 שעות ועם D) בינוני אנדותל עבור h 96, מצורף של תאים (חיצים שחורים) על לומן היה לב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Discussion

הטכניקה המובאת כאן עבור decellularization של הורידים saphenous גדולות היא שיטה קלה, פשוטה וחסכונית, באפשרותך גם להחיל על כל ורידים בקוטר קטן כמו ורידים הטבור ואת החלב. הפתרונות decellularization וריכוזי שלהם בשימוש בשיטה זו הם שלנו6,הקודם תוצאות7. אף-על-פי מומלץ 5 מחזורים של decellularization, בורידים מסוימים גם הבחנו decellularization מלאה ב- 3 מחזורים. עם זאת, תוצאות לשחזור התקבלו באמצעות 5 מחזורים. יישום פרוטוקול זה, אנחנו decellularized ורידים באורכים משתנים עד 30 ס מ בהצלחה (לא פורסם התוצאה). הרמה outlet של הפתרון decellularization 45 ס מ ייצור בלחץ של 33 מ מ כספית בתוך הווריד. מניסיוננו, שמנו לב זה כצעד מפתח ב decellularizing את הווריד כל בצורה אחידה, reproducibly 5 מחזורים. הלחץ שבחרת הוא גבוה פי 3 מאשר הלחץ הרגיל וריד saphenous (5-10 מ מ כספית) אבל שכמו פסול כלי הדם (ורידים)23. בנוסף, אנו משערים כי זו בלחץ גבוה תיצור כח משמעותי על קירות וריד, עשויים, לכן, לסייע בהסרת התאים באופן יעיל ומהיר.

מאז TnBP הממס אורגני מסיס במים, לערבב הנוזל עד שיהפוך מעונן חשובה; אחרת, הנוזל יצוף. מאותה סיבה, כדי לשמור על TnBP מעורבת בפתרון, הונח צינור עודפים של הנוזל בראש צנצנת הזכוכית עם השקע צינור. הסרה יעילה של TnBP מ הווריד לאחר השימוש בבכל מחזור ניתן לראות בגלל היעדר צף TnBP טיפות במים שטף. יש לנו גם לב כי דילוג על השלב DNase גם הפיק רקמה decellularized, אבל במקרים אחדים, תוכן ה-DNA יחסית גבוהה בתוך הרקמה decellularized היה לב. כפי בלחץ גבוה, זרימה גבוהה המחירים אינם נדרשים לפעילות DNase יעיל, עשוי לשמש שיעור נמוך זלוף (10 מ ל/דקה). משאבה סחרור שונות שימש כמו גודלו קטן עוזר בטיפול קל של ההתקנה. מאז ששמנו לב את הנזק של רוב התאים במהלך decellularization תוצאות במחזור 2, אנו מציעים דילוג על טיפול DNase במהלך מחזורי 1 ו- 3 (תוצאה שלא פורסמו). אף-על-פי אפיון של כימות של מטריצה חוץ-תאית חלבונים לא בוצעו כתב יד זה, ניסיון העבר שלנו עם פרוטוקולים decellularization דומה הראה על שימור נכסים ביו-מכני, מטריצה חוץ-תאית המבנה של חלבונים7. למרות ניסויים כימות הראשוני שלנו עם ורידים אלה הפיק תוצאה דומה (לא פורסם), התוצאות שפורסמו כבר שלנו יחזק את הביטחון הזה.

Recellularization דם הוא תהליך קל ונוח על תאים במח העצם מורחבת ככל אחד יכול להימנע זמן תא הרחבה פעמים, מוטציות ספונטניות תאים מורחבת, הפלישה כירורגית ו אי נוחות לחולה. כיוון שידוע כי endothelialization יכול להתרחש גם מלהסתובב EPCs, שיערנו כי זלוף בדם ואחריו זלוף בינונית אנדותל יהיה מספיק עבור recellularization. הבטיחות של וריד רקמות מהונדסים באמצעות שיטה דומה נראה מתוצאות מוצלחת של השתלת כאשר שני ורידים כאלה שהיו מושתלים לתוך ילדים עם הפרעה נוספת וריד שער7. אנו משערים כי הגורמים צמיחה decellularized מטריצה חוץ-תאית יאפשר את הקובץ המצורף של מחזורי EPCs מן הדם24. Recellularization של ורידים בעקבות פרוטוקול דומה הראתה. תאי חיובי עבור VEGF קולטן-2 ואשכול של בידול (CD) 14-לומן תוך CD45 התאים מבטאים נראו ב- adventitia7 אנו גם לדמיין כי שכבת אנדותל רציף לא ייבחנו בכל המקרים במיוחד בעת שימוש דם מחולים מבוגרים וחולים כפי שהוא מוכר כי אנשים כאלה פחתו מספרים של מחזורי תאים קדמון25. עם זאת, אנחנו בקביעתו כי זלוף עם האישי של המטופל דם עשוי להסוות רבים של אנטיגנים נחשפים בגלל decellularization, ובכך עשויה להקטין את הסיכויים של תגובות דלקתיות שליליות כאשר מושתלים בניגוד משתילים רק decellularized כלי הדם. בנוסף, הדם זלוף יכול להפקיד רמות גבוהות של גורמי גדילה לומן, adventitia אשר בתורו יכול לגייס מספר רב יותר של מחזורי ובתאים וכתוצאה מכך תהליך מהיר של recellularization ויוו.

היתרונות של עיצוב ביוריאקטור השתמשו במחקר זה הם autoclaving מלאה, הרכבה קלה, משתלמת, טיפול קל, את האפשרות לפחות של נזק. מניסיוננו, באמצעות העיצוב הנוכחי, הורידים עד 10 ס מ אורך היו recellularized. למרות הוורידים עד 25 ס מ אורך גם יכול להיות recellularized על ידי שמירה על הווריד של במצב "U" בתוך ביוריאקטור, זה לאמת. העיצוב ביוריאקטור מראה הכיוון של זרימה בווריד נגד כוח המשיכה תוכנן כך כי זה הכיוון הרגיל של הזרימה עבור ורידים אלה בבני אדם. זלוף 12 שעות של צעד בינוני אנדותל היא precondition את הווריד, להגדיל את הזיקה עבור החזקה של EPCs נכנסות. תוספת של הפארין נוספת זלוף עבור 1 h תפחית את הסיכון של יצירת קרישי דם בתוך הצינורות במהלך הדם זלוף.

נפח הדם הנדרש תלוי אורך הווריד. העיקרון הבסיסי שנעקוב אחרי עבור נפח הדם היא כי הווריד צריך להיות שקוע בתוך הדם. תוך כדי טיפול גדול יותר 45 מ ל דם כרכים, ערבוב מזדמן יידרש כדי למנוע הצטברות תאים בתחתית ביוריאקטור. הוספנו לפתרון של סטין דם כיוון שהוא מכיל כמות גבוהה של חלבונים, הרכיבים הדרושים כדי לשמור על רקמות בריא במהלך26,של השתלת איברים27. תוספת של VEGF ו- b-FGF מועיל כפי הם גורמי גדילה האנגיוגנזה חזק28 ומשרה את נוכחותם ההעברה, התפשטות, הבידול של EPCs29,30,31,32 . הכמות של VEGF הוסיף מבוסס על תוצאות שלא פורסמו הקודמת שלנו איפה ההתפשטות של EPCs נראתה ב- 80 ng/mL. תוספת של אספירין מעכב את ההפעלה של טסיות33 ובכך להקטין את הסיכוי שלהם מצורף שכבת אנדותל. ניטור רציף, תוספת של גלוקוז גם יהיה מועיל התפשטות תאים ולמניעת המוליזה של כדוריות דם אדומות.

מאז רק דגימת דם פשוטה נדרש מן הנמען, זה יכול להיות נחשב הליך קל של ריאלי הדורש מומחיות טכנית פחות. למרות, כל התהליך המוצג כאן מההתחלה לסיים לוקח 20 ימים, אחסון הורידים decellularized כמו מהמדף מוצר יקטין את ההליך כדי 8 ימים עבור חולים. למרות אחסון של ורידים decellularized טכנית לא תשפיע על היעילות recellularization, זה חייב להיות מוערך. רקמות מהונדסים ורידים שנוצר בעקבות הליך זה יכול לשמש במרפאה לניתוח מעקפים, החלפת חסמים ורידים, אי ספיקה ורידית מובילים דליות ורידים ללא צורך דיכוי המערכת החיסונית, ובכך לספק איכות טובה יותר של החיים עבור המטופל.

Disclosures

SSH מחזיק מניות ב- Verigraft, חברה יש רישיון הטכנולוגיה של רקמות הנדסת כלי הדם. המחברים האחרים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות פרופסור אנדרס Jeppsson על העזרה במתן כלי דם בשימוש הניסויים. מחקר זה מומן על ידי המענק LUA אלף ל SSH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Port Cap CPLabSafety WF-GL45-4Kit
Acetyl salicylic acid Sigma Aldrich A5376
Anti-Anti Life Technologies 15240-062
B-FGF Lonza cc-4113B
Blood Glucose monitoring system - Free style Lite Abbott 70808-70
D-Glucose Sigma Aldrich G8769
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
EGM-2 Growth Factors Kit Lonza CC-4176
EG-VEGF Peprotech 100-44
Glass bottle 250ml VWR 2151593 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass bottle 1L VWR 2151595 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass jar 500ml with bottom hose outlet Kimble Chase Life Science 14607
Heparin Leo 387107
Heparin Coated Vacutainer Tubes Becton Dickinson 368480
Human AB Serum Sigma Aldrich H3667
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Luer Female with 1/8" ID Barb Oina LF-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Female with 3/32" ID Barb Oina LF-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 3/32" ID Barb Oina LM-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Male with 5/32" ID Barb Cole Parmer EW-45518-06 For 5X8mm silicon tube
MCDB 131 Life Technologies 10372-019
Per acetic acid Sigma Aldrich 433241
Peristaltic pump I Masterflex 7524-45 For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75
Peristaltic pump II Ismatec ISM941 For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm Biotech ISM569A
Shaker Ika KS4000 i  control
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Steen solution Xvivo 19004
Suture Agnthos 14817
Tri-n-butyl Phosphate AlfaAesar A16084.AU
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF
Tube 60ml with flat base Sarstedt 60596
Tube A VWR 2280706 Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube B VWR 2280706 Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup
Tube C VWR 2280706 Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3
Tube D VWR 2280706 Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2
Tube E VWR 2280706 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube F VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube G VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube H VWR 2280703 Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup
Tube I VWR 2280703 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube J VWR 2280703 Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup
Tube K VWR 2280703 Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
  2. O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
  3. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  4. Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
  5. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  6. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
  7. Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
  8. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
  9. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
  10. Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
  13. Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
  14. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
  15. Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
  16. Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
  17. Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
  18. Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
  19. Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
  20. L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
  21. Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  23. Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
  24. Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
  25. van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
  26. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  27. Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
  28. Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
  29. Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
  30. Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
  31. Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
  32. Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
  33. Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 137 הנדסת רקמות Decellularization Recellularization רפואה רגנרטיבית EPCs כלי דם
Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar Kuna, V., Xu, B.,… More

Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter