Summary
여기, 우리 주변 혈액과 내 피 매체의 관류 하 여 세제 및 recellularization를 사용 하 여 saphenous 정 맥 decellularization에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
혈관 도관 대부분 혈관 수술 하는 동안 사용 되는 종종 면역 억제와 가난한 patency로 인 한 합병증으로 이어질 수용자 또는 합성 이식입니다. 조직 공학 decellularization 및 recellularization 메서드를 사용 하 여 받는 사람의 세포를 포함 하는 자연적인 기질과 개인된 이식 생성 하 새로운 솔루션을 제공 합니다. 우리 주변 혈액의 재 관류에 의해 인간의 saphenous 정 맥 및 recellularization의 decellularization를 수행 하기 위한 자세한 방법을 보여줍니다. Perfusing 1%에서 정 맥 decellularized 했다 트라이 톤 X-100, 1% 트라이-n-부 틸-인산 염 (TnBP) 및 deoxyribonuclease (DNase)의 2000 Kunitz 단위. 트라이 톤 X-100 및 TnBP DNase 4 h 37 ° C에서 10 mL/min에 끼얹는다는 하는 동안 4 h 35 mL/min에 끼얹는다 했다. 정 맥 초순와 PBS로 세척 되었고 0.1% 초 산에 멸 균. 그것은 다시 PBS로 세척 되었고 preconditioned 내 피 중간에. 정 맥은 생물에 연결 되었고 끼얹는다 50 IU/mL를 포함 하는 내 피 매체 1 h. Recellularization에 대 한 헤 파 린 신선한 혈액으로 생물, Steen 솔루션, 희석된 1: 1을 작성 하 고 내 분 비 동맥에서 파생 된 추가 의해 수행 됐다 혈관 내 피 성장 인자 (80 ng/mL), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (4 µ L/mL), 및 아 세 틸 살리실산 (5 µ g/mL). 생물에 인큐베이터에 이동 했다 그리고 3-9 mmol/l. 사이 포도 당을 유지 하면서 2 mL/min에서 48 h에 끼얹는다 나중에, 정 맥 PBS로 세척, 내 피 매체 가득 이었고 인큐베이터에서 96 h 끼얹는다. 트라이 톤 X-100, TnBP와 DNase 치료 5 사이클에서 saphenous 정 맥 decellularized. Decellularized 정 맥 백색 정상 및 recellularized 정 맥 (라이트 레드) 달리 보였다. 되며 & 오신 (H & E) 얼룩만 정상 decellularized 정 맥에만 핵의 존재를 보여주었다. Recellularized 정에서 H & E 염색는 정 맥의 luminal 표면에 세포의 존재를 보여주었다.
Introduction
혈관 도관이 동맥 류, 경 동맥 협 착 증 및 심한 혈관 문제로 이어지는 동맥 경화 같은 여러 임상 조건에 대 한 필요 합니다. 외과 "헌, 수용자 또는 합성 혈관 도관"을 사용 하 여 복원 기능 혈액 공급. 만 헌 혈관의 사용은 여전히 이상적인 접근, 환자에서 가용성 majorly 제한 됩니다. 수용자 또는 합성 이식 등 대안 면역 치료와 가난한 patency reoperation1,2, 국가 경제 부담 주요 건강 결과로 이어지는 깊은 문제가 있다. 혈관의 조직 공학 자연 상 동 및 autologous 세포 이식 제공 하는 것을 목표로. 따라서, 받는 사람 면역 시스템 자체도 이식된 이식 인식 하 고 이러한 이식 자연 단백질 및 원래 구성에 있는 셀에 포함 되어 있는, 그것은 현재 대안에 비해 더 나은 작동 수도 있습니다. 3방광, 요도4, 기관5및 정 맥6,7, 성공적으로 사용 되었습니다 병원에서와 같은 조직 기관, 설계.
조직 공학 생산 맞춤된 이식 decellularization 및 recellularization 기증자 로부터 이식을 필요 합니다. Decellularization 조직 및 장기8,,910에서 세포를 제거 하는 유망한 기술 이다. Decellularization 특정 물리적, 화학적 및 효소 방법11 또는 그들을 결합 하 여 수행할 수 있습니다. 이러한 방법의 최적 사용에 decellularized 조직 기질 비슷한 기본 조직에에서 유사한 구조상과 기능적인 단백질을 가질 수 있습니다. 이러한 장기 첨부 파일, 마이그레이션, 확산, 그리고 들어오는 줄기 세포의 분화를 향상 시키기 위해 본질적인 능력 소유.
Recellularization 세포는 이식에 뿌리기의 동적 프로세스 이며 받는 사람 줄기 세포 임상 이식에 사용할 수 있습니다. 현재 이러한 목적을 위해 사용 하는 줄기 세포 골 수, 간 엽 등 장기 거주자3,,56. 동물 및 연구 지향적인 연구 태아 및 유도 만능12,,1314엽 기원에서 줄기 세포를 이용 했다. 이 프로세스에서는 생물 반응 기 (정 맥을 보유 하 고 온도, 가스, pH, 압력과 같은 필요 조건을 제공 하는 챔버), 세포 및 문화 미디어. Recellularization에도 전에 세포의 특정 유형 및 셀 전체 조직 또는 기관에 도달할 수는 시드 전략의 필요한 수를 얻을 것입니다. 비록 완전 한 조직 또는 기관 구조적 및 기능적으로 생성 되었으며 지금까지 평가, 필드와 초기 결과에 여러 발전 미래의 가능성15를 표시 합니다. 정 맥의 핵심 기능 조직 및 수축에 도움이 되 고 또한 혈압16를 힘을 제공 한다 중간 매끄러운 근육 층으로 선 동적인 세포의 침투를 제어 luminal endothelium에 놓여 있습니다. 연구는 손상, 동안 endothelialization 발생 또는 순환 혈액17,,1819에 내 피 조상 세포 (Epc)에서 문 합에서 설명 했다. 혈관의 recellularization에 대 한 우리의 전략 Epc 혈액 순환에 의존 합니다.
정 맥과 동맥의 조직 공학 다른 decellularization 및 recellularization 전략20,21다음 여러 그룹에 의해 수행 되었다. 우리의 그룹은 또한 수행 하 고 장 골과 유 정 맥6,7decellularization 및 recellularization 전략을 개발. Decellularization은 트라이 톤 X-100, 트라이-n-부 틸 인산 (TnBP), 그리고 효소 deoxyribonuclease (DNase)에서 정 맥의 동요에 의해 수행 되었다. recellularization 파생 하는 골 수 내 피와 부드러운 근육 세포6 또는 주변 혈액7를 사용 하 여 수행 되었다. 혈관 중 프로토콜 추가 간 문맥 방해6,7소아 환자 이식에 기능 혈액 공급을 제공 하 임상 약속을 보여주었다 recellularized.
우리는 현재 직경이 작은 혈관의 decellularization, recellularization 및 생물 처리의 향상 된 쉽고 성능에 대 한 동일한 프로토콜의 수정된 된 버전을 개발 했습니다. 현재 decellularization 프로토콜 세제와 동요 대신 압력을 사용 하 여 정 맥을 통해 세제의 관류가 필요 합니다. Recellularization 프로토콜의 늘어진 세포 접착 및 세포 접착, 생존 및 확산 개선을 위한 혈액 순환에 성장 요인의 개선에 대 한 추가 단계를 포함 한다. 우리는 또한 상업적으로 사용할 수 있는 제품을 사용 하 여 생물 반응 기의 디자인을 개량 했다. 이 논문에서는, decellularization와 인간의 saphenous 정 맥의 recellularization를 수행 하기 위한 수정 된 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 선물이.
Protocol
조직을 사용 하 고이 종이의 프로토콜 예테보리 대학교의 윤리 지침을 따릅니다.
1. 조직 준비 및 저장
- 절단 수술 집게와가 위를 사용 하 여 검색 된 saphenous 정 맥에서 주변 조직.
참고: saphenous 정 맥은 해 부의 더 낮은 다리에서 혈관 외과 의사에 의해. 이 문서에 사용 된 saphenous 정 맥 수술 후 취소 사용된 부분입니다. - 관류 동안 누설을 방지 하기 위하여 봉합 및 집게 그들의 끝에 모든 측 지점.
- 포함 하는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 40 mL 50 mL 튜브에 정 맥을 유지. 과잉 혈액을 제거 하려면 PBS 2-3 번을 변경 하 여 정 맥을 씻어. -80 ° c.에 냉동 하 여 정 맥을 저장
2. Decellularization 설정 및 Recellularization 생물의 준비
주: 표 1에서 보는 바와 같이 실리콘 튜브를 잘라가 위를 사용 합니다.
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Decellularization 설치 1 (대 한 Triton X-100 관류 및 세척)
- 2 l (플라스틱 욕조) 챔버, 튜브 A 그림 1A와 같이 모든 세 가지 테이프.
참고: 테이프 가장자리 챔버 (세제의 입구)의 하단을 접촉 한 벽에 1 개의 관 및 정 맥의 길이 따라 사이 5-10 cm의 거리와 반대 벽에 다른 2 개의 관. 이러한 튜브의 적어도 5 cm (정 맥의 입구 및 출구) 챔버의 바닥에도 녹화 한다. - 세제의 유입 튜브 튜브 C F 이어서 튜브 튜브 B 시리즈에서 연결 남성과 여성의 Luer 커넥터를 사용 하 여 마지막으로 정 맥 입구에. 장소는 연동의 카세트로 F 튜브 나 펌프.
- 다른 튜브 C를가지고 가십시오을 한 정 맥의 콘센트에 연결 합니다. 챔버 (세제 콘센트) 위에 45 cm 배치 된 하단 호스 콘센트와 함께 유리 항아리에 다른 쪽 끝을 놓고 테이프를 확보 합니다. 튜브 G를가지고 가십시오 유리 항아리의 호스 콘센트에 한쪽 끝을 밀어 하 고 정 맥 챔버로 다른 쪽 끝을 장소.
참고: 전체 설치 (빨간색 화살표), 챔버, 및 흐름 방향 (흰색 화살표)의 사진은 그림 1A에 표시 됩니다.
- 2 l (플라스틱 욕조) 챔버, 튜브 A 그림 1A와 같이 모든 세 가지 테이프.
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Decellularization 설치 2 (TnBP 대 한 관류)
- 1 L 유리 용기 고 놓고 C 튜브의 한쪽 끝을 (세제 입구) 항아리에 튜브만 지 병의 하단.
- 튜브 튜브 C. 장소 C 튜브의 다른 쪽 끝 항아리에 절반 깊이 (정 맥의 입구)까지 다음 F 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 연동 펌프의 카세트로 튜브 F 장소 나.
- 튜브 D 하 고 정 맥의 입구 (세제 콘센트)에서 45cm 높이 아래쪽 호스 절반 깊이 유리 항아리에 다른 쪽 끝까지 항아리 (정 맥의 콘센트)에 한쪽 끝을 배치. 확보 하기 위해, 세제의 입구 및 출구 관 테이프.
- 자력에 1 L 유리 용기를 놓고 병 안에 자석을 유지 합니다.
- 튜브 G 걸립니다 하 고 유리 항아리의 호스 콘센트에 한쪽 끝을 밀어 1 L 유리 용기에 다른 쪽 끝을 장소.
참고: 그림의 완벽 한 설치 (빨간색 화살표), 약 실 및 흐름 방향 (흰색 화살표) 그림 1B에서 표시 됩니다.
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Decellularization 설치 3 (대 한 DNase 관류)
- 250 mL 유리 병 고 튜브 C. 장소 튜브의 중간 영역의 두 끝 다 연동 펌프 II의 카세트 합니다.
참고: 튜브의 한쪽 끝은 솔루션 입구 그리고 튜브의 다른 쪽 끝은 정 맥의 입구에 연결 된. 정 맥의 콘센트는 솔루션에서 무료로 남아 있습니다. - 37 ° c.에 펌프를 포함 하 여 전체 설치 장소 완전 한 설치 및 흐름 방향 그림 그림 1C에 표시 됩니다.
- 250 mL 유리 병 고 튜브 C. 장소 튜브의 중간 영역의 두 끝 다 연동 펌프 II의 카세트 합니다.
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Recellularization 생물
- 계속 준비 모든 부품 그림 2A와 같이.
- 그림 2B에서 같이, 4-포트 뚜껑을 각 포트에 삽입, H (정 맥의 콘센트) 튜브, 튜브 나 (미디어 입구), 그리고 J (정 맥의 입구) 튜브. 4번째 포트 (언론 매체) 관 H의 다른 쪽 끝을 삽입 합니다.
참고: 위에서 4-포트 캡의 보기는 그림 2C에 표시 됩니다. 튜브의 쉬운 삽입에 대 한 날카로운 포인트는 시저와 가장자리를 잘라. - U 모양으로 관 J의 다른 쪽 끝을 구 부하 고는 봉합과 넥타이. H 조 & 제이 튜브의 내부 끝에 줄이는 커넥터 연결
- 250 mL 유리병에 플랫 베이스와 60 mL 튜브를 놓고 그림 2D와 같이 튜브에 위의 만든된 설치 프로그램을 배치 합니다. 그림 2E같이 튜브 K, E 및 K 시리즈에 연결 합니다. 정 맥의 입구에 1 개의 관 K와 다른 튜브 K 미디어 입구를 연결 합니다.
참고: 설치, 방향과 흐름의 회로도 그림 2 층에 표시 됩니다. - 압력가 마로 소독으로는 생물 반응 기를 소독.
3입니다. 솔루션의 준비
- 해결 방법 1 (10 x 물): 1 L의 초순, 나트륨 아 지 드의 작품 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 18.6 g 2 g 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어입니다.
- 해결 방법 2 (1 x 물): 솔루션 1의 100 mL 고 초순의 900 mL을 추가.
- 해결 방법 3 (Triton X-100 x 5): 초순의 950 mL, 50 mL Triton X-100, 나트륨 아 지 드, 1 g와 EDTA의 9.3 g 추가. 해산 때까지 휘저어.
- 해결 방법 4 (Triton X-100 x 1): 초순 물 800 mL를 추가 하 고 솔루션 3의 200 mL.
- 해결 방법 5 (1 x TnBP): 990 솔루션 2 mL에 10 mL 피 펫과 TnBP의 10 mL를 추가.
- 해결 방법 6 (40 Kunitz 단위/mL DNase): Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 CaCl2 및 MgCl2의 50 mL에 DNaseI의 추가 2000 Kunitz 단위. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다.
- 해결 방법 7 (PBS): 24 g의 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.6 g, 4.32 g의 나트륨 인산 염, 및 칼륨 인산 염의 0.72 g 초순 물 3 L를 추가 합니다. 해산 때까지 휘저어. PH 7.4에 조정 합니다. PBS는 압력솥에서 1 리터를 소독 하 고 별도로 저장 합니다.
- 솔루션 8 (0.1% 초 산): 살 균 솔루션 7의 50 mL, 초 산의 50 µ L 추가. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다.
4입니다. 내 피 매체의 준비
- L-글루타민의 5 mL 5 mL의 방지, 인간의 AB 세럼 50 mL와 멸 균 후드 MCDB131 매체의 500 mL 소 태아 혈 청을 제외한 EGM 2 성장 인자 키트의 모든 구성 요소를 추가 합니다.
5입니다. decellularization Saphenous 정 맥의
- 실 온에서-80 ° C에서 인간의 saphenous 정 맥 동 -80 ° C에 다시 고정 하 고 다시 실 온에서 해 동.
- 잘라가 위를 사용 하 여 2 mm 길이 생 하 고 실 온에서 24-48 h에 대 한 포름알데히드에 수정. 남성과 여성의 Luer 커넥터는 봉합의 가시에 정 맥의 각 끝을 묶어.
- Decellularization 설치 1 정 맥을 연결 하 고 솔루션 2의 1 L를 입력 합니다. 35 mL/분에서 15 분 설정의 내용을 비어에 대 한 perfuse.
- 솔루션 4의 1 패를 추가 하 고 35 mL/분에서 h 4는 설치 프로그램의 내용을 비어에 대 한 perfuse.
- 솔루션 2의 500 mL를 추가 하 고 5 분 설치의 내용을 비어에 대 한 perfuse. 이 단계를 반복 합니다. 관류 설치 1에서에서 정 맥을 분리 하 고 관류 설치 2에 연결.
- 솔루션 5의 1 패를 추가 하 고는 활동가 설정 35 mL/min에서 4 h perfuse.
참고: 솔루션 5 흐린는 활동가 대 고 관류 전역 후 보인다. - 관류 설정 2에서에서 정 맥을 분리 하 고 초순 5-10 분의 4 변화에 정 맥의 외부와 내부 주사기 또는 10 mL 피 펫 세척.
- 관류 설치 3 정 맥을 연결 솔루션 6의 50 mL를 추가 하 고 37 ° C 챔버에 10 mL/min에서 perfuse 4 h. 설치의 내용을 비어 및 설정에서 정 맥을 분리.
- 관류 설치 1 정 맥을 연결, 솔루션 2 1 리터를 하룻밤 35 mL/분 반복 단계 5.4 단계 5.9 4 회 (총 5 사이클)에서 perfuse. 5.2 단계에서 제시 된 대로 다시 생을 가져가 라.
참고: 건너뛰기 사이클 1과 3에에서 5.8 두 번째 부분을 단계. - 설정의 내용이 비어 있습니다. 솔루션 2의 1 L를 perfuse 35 mL/분 변경 솔루션에서 24 h에 대 한 12 헤 후 2 설치 프로그램의 내용을 비어. 1l의 초순 수를 설정의 내용을 12 h.Empty 후 24 h 35 mL/분 변화는 초순에 대 한 perfuse. 7 솔루션의 1 리터와 7 후 12 h 35 mL/분 변경 솔루션에서 24 h에 대 한 perfuse.
6입니다. Decellularization의 확인
- 포 르 말린 고정 초순 15 분 과정 표준 프로토콜에 따라 조직 프로세서에 대 한 생 검을 세척 하 고 파라핀22에 포함.
- 톰을 사용 하 여 5 µ m 섹션을 잘라 얼룩 메이어의 hematoxylin 및 0.2% 알콜 오신 (H & E)와 함께 다음 표준 프로토콜22.
- 정상 조직에 비해 decellularized 조직에서 핵의 손실에 대 한 확인을 현미경으로 볼 수 있습니다.
7입니다. recellularization
- 포함 하는 솔루션 8의 50 mL 50 mL 튜브에 그것을 배치 하 여 정 맥을 소독. 분 (rpm) 당 80 회전에서 37 ° c.에 1 시간에 대 한 셰이 커에 선동
- 층 류 흐름 (LAF) 불 임을 유지 하기 위해 지금부터 캐비닛 아래 정 맥을 처리 합니다. 방지의 살 균 솔루션 7, 500 µ L의 50 mL를 포함 하는 새로운 50 mL 튜브를 무 균 집게를 사용 하 여 정 맥을 전송 합니다. 위의 12 h. 변경 솔루션 7 적어도 두 번 사이 대 한 교 반 하십시오.
- 소독 집게를 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 정 맥을 전송 하 고 내 피 미디어의 50 mL를 추가 합니다. 위의 11 h에 대 한 교 반 하십시오.
- LAF 캐비닛 아래 멸 균 글러브를 사용 하 여 생물을 조립. 생물 반응 기의 정 맥 입구 및 출구 무 균 봉합와 집게를 정 맥을 묶어.
- 생물을 채우기 같은 매체와 정 맥을 연결 합니다. 50 IU/mL에서 헤 파 린을 추가 하 고 37 ° C에 2 mL/min에서 1 h perfuse
- 헤 파 린 코팅 vacutainer 튜브에 기증자에서 신선한 혈액 (정 맥의 길이)에 따라 15-25 mL를 수집 하 고 1:1 스 틴 솔루션을 희석. 나중에, 내 분 비 동맥-유래 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF EG, 80 ng/mL), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF b, 4 µ L/mL)와 아 세 틸 살리실산 (5 µ g/mL)를 추가 합니다.
- 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에는 생물을 이동 하 고 2 mL/min에서 48 h에 대 한 perfuse.
- 약 후 12 h, 캐비닛, LAF는 생물 이동 혈액의 방울 고 혈액 포도 당 감시 장치를 사용 하 여 포도 당을 측정. 수준 미만 3 mmol/L 이면 추가 려 포도 당 7-9 mmol/l. 반복의 범위에이 모든 8-12 h 단계.
- 48 h 후 LAF 캐비닛에 생물을 이동 하 고는 생물에서 혈액을 배출 합니다. 살 균 솔루션 7의 30 mL를 추가 하 고 5 분 드레인 솔루션에 대 한 perfuse. 살 균 솔루션 7의 30 mL를 추가 하 고 두 번 이나 붉은 색 손실 됩니다 때까지 5 분 반복에 대 한 perfuse.
참고: 생 검 셀 첨부 파일의 확인을 위해 취할 수 있습니다. 정 맥, 정 맥의 5mm 가장자리가 위로 잘라 고 그들을 무시. 생 검 단계 5.2에서에서 명시 된 고 생물 (선택 사항)을 다시 정 맥을 연결. - 내 피 매체의 30-45 mL를 추가 하 고 2 mL/min에서 인큐베이터에서 96 h에 대 한 perfuse.
참고: 추가 내 피 중간 정 맥 빠져들 때까지. - LAF 캐비닛에는 생물을 이동, recellularized 정 맥을 분리가 위를 사용 하 여 정 맥의 5mm 가장자리 잘라내어 버리고. 5.2 단계에서 제시 된 대로 생 검을 가져가 라.
8입니다. Recellularization의 확인
- 섹션 6에에서 지시 하 고 H & E 염색을 수행 합니다. 셀의 존재에 대 한 현미경 슬라이드를 검사 합니다.
Representative Results
정상적인 정 맥의 심한 형태는 빛 빨강 (그림 3A). 붉은 색 진보적인 decellularization 주기에서 분실 된다 (주기 2, 그림 3B; 3, 주기 그림 3C) 5번째 사이클에 의해 그것은 창백 하 고 흰색 (그림 3D) 보입니다. Recellularized 정 맥 혈액 관류 (그림 3E)와 내 피 미디어 관류 (그림 3 층) 후 색상에 밝은 빨강을 보인다. Decellularization 치료의 5 주기 성공적으로 제거 세포는 정 맥에서 아니 블루 핵은 H & E 염색 (그림 4B)에서 본 했다. 반면, 여러 핵 정상 정 맥 (그림 4A)에서 볼 수 있었다. Luminal 측에 연결 된 세포의 존재는 혈액 관류 96 h (그림 3D, 검은 화살표)에 대 한 내 피 매체와 전후 48 h (그림 4C, 검은 화살표)에 대 한 recellularized 정 맥에 H & E 염색에 표시 됩니다.
그림 1 : Decellularization에 대 한 설정을 관류의 조립. A) 그림 Triton X-100 조립된 decellularization 설치 1 표시 및 세척. 흰색 화살표 표시 솔루션에 대 한 흐름 경로 이며 빨간색 화살표 후미와 정 맥 및 솔루션에 대 한 콘센트. B) TnBP 관류에 대 한 조립된 decellularization 설치 2를 보여주는 그림. 마찬가지로, decellularization 설치 1에서 흰색 화살표 솔루션에 대 한 흐름 경로 나타내고 빨간색 화살표 표시 후미 및 정 맥 및 솔루션에 대 한 합니다. C) deoxyribonuclease 관류에 대 한 조립된 decellularization 설치 프로그램 3을 보여주는 그림. 와 흰색 화살표 표시 솔루션에 대 한 흐름 경로 빨간색 화살표 표시 정 맥 및 솔루션에 대 한 후미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 준비 및 recellularization에 대 한 생물의 조립. A) 그림을 보여주는 자료는 생물을 조립 하는 데 필요한. B) 정 맥 입구 및 출구 (흰색 화살표) 및 튜브 H, I 및 제이의 배열에 연결할 커넥터 (빨간색 화살표), 감소의 배치를 보여주는 4-포트 캡의 안쪽의 사진 포인트 튜브 H의 무료 끝 반환 미디어 생물에 배치 됩니다. C) 와 외출 각각 튜브 4 포트 캡의 상단 측면에서 볼 수 있습니다. D) 조립된 생물을 보여주는 그림. E) 연동 펌프 전체 생물 설치를 보여주는 그림. K 튜브 연동 펌프에는 생물 반응 기에서 연결을 확장합니다. F) 전체 생물 관류 시스템의 도식 대표. 주황색 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Decellularization 및 recellularization 중 혈관의 형태를 총. A) 정상 정 맥의 심한 형태 컬러로 밝은 빨간색을 보인다. 색상은 decellularization 사이클의 수를 증가 함께 손실 B) 2 주기 및 C) 3 주기. D) 5 주기, 정 맥 보이는 창백한, 흰색. E와 함께 perfusing 후 정 맥) 48 h와 F에 대 한 혈액) 96 h에 대 한 내 피 중간 컬러로 다시 한번 밝은 빨간색 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Decellularized와 recellularized 혈관의. 되며 고 오신 얼룩의 이미지 A) 정상 정 맥 포함 많은 블루 핵 하지만 그들은 결 석 하다에서 B) decellularized 정 맥. 정 맥으로 recellularized에서 C) 혈액 48 h에 대 한 D) 96 h, 루멘에 셀 (검은 화살표)의 첨부 파일에 대 한 내 피 매체 발견 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Saphenous 정 맥의 decellularization에 대 한 여기에 제시 된 기술 또한 탯 줄 고 유 방 정 맥 처럼 모든 직경이 작은 혈관에 적용 될 수 있는 쉽게, 간단 하 고 비용 효율적인 방법입니다. Decellularization 솔루션 및이 방법에 사용 되는 그들의 농도 우리의 이전 결과6,7. 비록 decellularization의 5 주기를 권장 하 고, 특정 혈관에 우리도 눈치 3 주기에서 완전 한 decellularization. 그러나, 재현 결과 5 주기를 사용 하 여 얻은 했다. 우리는 다양 한 길이의 혈관 decellularized이 프로토콜을 적용, 30 cm까지 성공적으로 (되지 않은 결과). 45 m decellularization 솔루션의 콘센트를 리프팅 정 맥 안에 33 mmHg의 압력을 만들 것입니다. 우리의 경험에서 우리 전체 맥락을 균일 하 게 decellularizing에 그리고 reproducibly 5 주기에서 주요 단계로이 나타났습니다. 선택된 압력은 정상적인 saphenous 정 맥 압력 (5-10 mmHg) 보다 3 배 높은 하지만 무능에서와 같이 혈관 (정 맥)23. 또한, 우리는이 높은 압력 정 맥 벽에 큰 힘을 만들 것입니다 하 고 따라서 효율적이 고 빠른 세포 제거에 도움이 있습니다, 사색 한다.
TnBP은 유기 용 매와 물에 불용 성, 흐린 될 때까지 세제를 감동이 중요; 그렇지 않으면, 세제에 플 로트 것입니다. 같은 이유로 TnBP 솔루션, 혼합 계속 세제의 콘센트 튜브가 두었다 호스 콘센트와 함께 유리 항아리의 상단에. 효율적인 제거 후 씻어 물에 TnBP 방울의 부재 모든 주기에 그것의 사용을 볼 수 있습니다 정 맥에서 TnBP의. 우리는 또한 decellularized 조직 생산 또한 DNase 단계를 건너뛰는 하지만 몇 가지 경우, decellularized 조직에서 비교적 높은 DNA 콘텐츠 발견 했다 나타났습니다. 높은 압력 및 높은 흐름 율 효율적인 DNase 활동에 대 한 필요 하지 않습니다, 낮은 관류 속도 (10 mL/min) 사용할 수 있습니다. 그것의 더 작은 크기는 설치의 쉬운 처리에 도움이 됩니다 다른 연동 펌프 사용 했다. 이후 우리는 주기 2에에서 decellularization 결과 중 대부분의 세포의 손상을 발견, 건너뛰는 DNase 1 고 3 (게시 되지 않은 결과) 주기 동안 치료 하는 것이 좋습니다. 특성화 및 정량화의 세포 외 기질 단백질이이 원고 수행 했다, 비록 유사한 decellularization 프로토콜 우리의 이전 경험이 했다 biomechanical 속성의 보존 세포 외 기질 단백질 및 구조7. 비록 이러한 혈관 우리의 예비 정량화 실험 (미 발표) 비슷한 결과 생산, 우리의 이미 게시 된 결과이 신뢰를 강화 것입니다.
Recellularization 혈액을 사용 하 여 하나 긴 셀 확장 시간, 환자에 대 한 확장 된 셀, 외과 침략, 및 불편에 자발적인 돌연변이 피할 수 있다 확장 하는 골 수 세포를 통해 편리 하 고 쉬운 프로세스입니다. 이후 endothelialization도 Epc 순환에서 발생할 수 있습니다, 우리는 혈액 내 피 매체 관류 뒤 그 관류 가설 알려져 있다 recellularization에 대 한 충분 한 될 것입니다. 이러한 두 개의 혈관 여분 간 문맥 방해7자식으로 이식 했다 때 비슷한 메서드를 사용 하 여 설계 하는 정 맥 조직의 안전 이식의 성공적인 결과에서 볼 수 있다. 우리는 decellularized 세포 외 기질에 성장 요인 혈액24에서 Epc를 순환의 첨부 파일을 허용할 것 이다을 추측 한다. 유사한 프로토콜에 따라 혈관의 recellularization 셀 VEGF 수용 체-2와 차별화 (CD) 14 CD45 표현 셀 adventitia7에서 보인 동안 루멘에의 클러스터에 대 한 긍정적인 했다. 우리는 또한 그 지속적인 내 피 층 하지 관찰 수 있습니다 모든 경우에 이러한 개인 조상 세포25순환 수가 감소 알려진 대로 이전 하 고 병에 걸린 환자에서 혈액을 사용 하는 경우에 특히 상상. 그러나 우리는 관류와 받는 사람의 자신의 가정 혈액 항 원 decellularization 때문에 노출 되 고 따라서 불리 한 염증 반응 때 반대만 이식 이식의 기회를 줄일 수 있습니다의 많은 마스크 수 있습니다 decellularized 혈관입니다. 또한, 혈액 관류 루멘에 조상 세포 vivo에서recellularization의 빠른 과정에 인 순환의 증가 숫자를 모집 수 있습니다 adventitia에 성장 요인의 증가 수준을 입금 수 있습니다.
이 연구에 사용 된 생물 반응 기 디자인의 장점은 완전 한 압력가 마로 소독, 쉬운 조립, 비용 효율성, 쉬운 취급 및 손상의 적어도 가능성입니다. 우리의 경험에서는, 현재 디자인, 정 맥 길이 10 cm까지 했다 recellularized를 사용 하 여. 비록 최대 정 맥 길이 25cm는 생물 안에 "U" 모양 정 맥을 유지 하 여 recellularized도 수, 유효성을 검사 해야 합니다. 생물 반응 기 디자인 정 맥에서 흐름의 방향은 중력에 대 한 설계 되었습니다 같은 때문에 인 간에 있는 이러한 혈관에 대 한 흐름의 수직 방향을 보여줍니다. 내 피 중간 단계의 12 h 관류 혈관 precondition 들어오는 Epc의 첨부 파일에 대 한 선호도 증가입니다. 추가 추가 헤 파 린 및 1 시간에 대 한 관류의 혈액 관류 동안 튜브에 혈전 형성의 위험을 낮출 것 이다.
필요한 혈액의 양을 정 맥의 길이에 따라 달라 집니다. 우리 혈액 볼륨에 따라 기본 원리는 정 맥 혈액에 빠져들 수 한다입니다. 45 mL 보다 큰 혈액 볼륨을 처리 하는 동안 가끔 혼합 세포는 생물의 하단에 축적을 방지 하기 위해 요구 수 있습니다. 우리 혈액의 단백질 조직 장기 이식26,27동안 건강 한 유지 하는 데 필요한 높은 금액을 포함 하기 때문에 Steen의 솔루션 추가. 그들은 강력한 신생 성장 인자28 및 마이그레이션, 확산, 및 Epc29,,3031,32의 차별화를 유도 하는 그들의 존재로 VEGF와 b-FGF의 추가 도움이 됩니다. . VEGF 추가 금액은 Epc의 확산 80 ng/mL에서 목격 된 우리의 이전 되지 않은 결과 기반으로 합니다. 아스피린의 혈소판33 내 피 층에 그들의 부착의 기회 감소의 활성화를 억제. 지속적인 모니터링 및 포도의 추가 세포 증식 및 적혈구의 용 혈을 방지 도움이 됩니다.
간단한 혈액 샘플만 받는 이기 때문에, 보다 적게 기술 전문 간단 하 고 가능한 절차로 여겨질 수 있다. 비록, 완료부터 여기 표시 된 모든 절차는 20 일 소요, 저장으로 decellularized 혈관은 선반에서 제품 환자에 대 한 일 절차 단축 됩니다. Decellularized 혈관의 스토리지 기술적으로 미치지 않습니다 recellularization 효율성, 비록 평가 되어야 합니다. 조직 설계 혈관 생성이 절차에 따라 병원에 바이패스 수술, 방해 혈관, 면역 억제를 위한 필요 없이 정을 선도 하 고 따라서 더 나은 품질을 제공 하는 정 맥 불충분을 대체 사용할 수 있습니다. 환자를 위한 생활입니다.
Disclosures
SSH Verigraft, 조직의 혈관 엔지니어링 기술 라이센스는 회사에서에서 주식 보유. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 교수 Anders Jeppsson는 실험에 사용 된 혈관을 제공 하는 방법에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 이 연구를 융자 되었다 SSH LUA ALF 그랜트에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
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