Summary
Burada, deterjanlar ve recellularization tarafından periferik kan ve endotel orta perfüzyon kullanarak safen ven decellularization için bir protokol açıklayın.
Abstract
Vasküler kanalların çoğu vasküler cerrahi sırasında kullanılan kez immünosupresyon ve zavallı a_ılabilinirse neden komplikasyonlara yol allojenik veya sentetik Greftler vardır. Doku mühendisliği doğal hücre dışı matriks decellularization ve recellularization yöntemini kullanarak alıcının hücreleri içeren kişiselleştirilmiş Greftler oluşturmak için yeni bir çözüm sunuyor. Biz insan safen ven ve recellularization decellularization periferik kan perfüzyon tarafından gerçekleştirmek için detaylı bir yöntemi gösterir. Ven ventriküler 1 oranında decellularized Triton X-100, % 1'tri-n-butil-fosfat (TnBP) ve 2.000 Kunitz birimleri deoksiribonükleaz (DNaz). DNaz 10 mL/dk 4 h için 37 ° C'de periosteum iken Triton X-100 ve TnBP 35 mL/dk 4 h için derin. Ven Ultrasaf Su ve PBS yıkanmış ve % 0.1 Perasetik asit sterilize edilmiştir. Tekrar PBS içinde yıkanmış ve endotel ortamda preconditioned. Damar bir biyoreaktör bağlı ve periosteum ile endotel orta 50 IU/mL içeren doldurmak biyoreaktör taze kan ile Steen çözüm seyreltilmiş 1:1 ve endokrin bezi kaynaklı eklemek için 1 h. Recellularization heparin gerçekleştirildi vasküler endotelyal büyüme faktörleri (80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörleri (4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL). Biyoreaktör sonra bir kuluçka taşındı ve glikoz 3-9 mmol/l arasında koruyarak 2 mL/dk 48 h için derin Daha sonra damar endotel orta ile dolu ve PBS ile yıkanmış kuluçka 96 h için derin. Triton X-100, TnBP ve DNaz ile tedavi 5 döngülerle safen ven decellularized. Decellularized ven normal ve recellularized damarlar (ışık kırmızı) aksine beyaz baktım. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama çekirdeği varlığı sadece normal ama decellularized damarlar gösterdi. Recellularized şekilde, H & E boyama ven luminal yüzeyinde hücreleri varlığını gösterdi.
Introduction
Vasküler kanallar gibi anevrizma, karotid arter stenoz ve ateroskleroz ciddi vasküler sorunlar için önde gelen birkaç klinik koşulları için gereklidir. Cerrahlar otolog, allojeneik veya sentetik vasküler kanallar fonksiyonel kan akımı geri yüklemek için kullanın. Otolog kan damarları kullanımı hala ideal yaklaşım olarak kabul rağmen hastalarda oldukça sınırlı olduğunu. Allojenik veya sentetik Greftler gibi alternatifleri immünsüpresif tedaviler ve zavallı açıklık reoperation1,2önemli sağlık ülkelere ekonomik yükleri kaynaklanan, önde gelen derin sorunları var. Doku mühendisliği kan damarlarının doğal Homoloji ve otolog hücrelerin Greftler sunmayı amaçlamaktadır. Böylece, alıcı bağışıklık sistemi transplante greft kendini olarak tanır ve böyle bir greft doğal proteinler ve özgün yapılandırmayı hücrelerde içerdiğinden, daha iyi geçerli alternatifleri ile karşılaştırıldığında işlev. Mesane3, üretra4, nefes borusu5ve damarlar6,7, başarıyla klinikte kullanılmış gibi doku organları, mühendislik.
Kişiselleştirilmiş Greftler üretmek için doku mühendisliği bir greft decellularization ve recellularization ardından bir donörden gerektirir. Decellularization hücreleri doku ve organların8,9,10' dan kaldırmak için umut verici bir teknolojidir. Decellularization belirli fiziksel, kimyasal ve enzimatik Yöntemler11 veya bunları birleştirerek tarafından gerçekleştirilebilir. Bu yöntemlerin en uygun kullanımı decellularized dokularda benzer yapısal ve işlevsel proteinler bir hücre dışı matriks yerli dokulara benzer olabilir. Böyle organları eki, geçiş, yayılması ve gelen kök hücre farklılaşma geliştirmek iç kapasitesine sahip.
Recellularization hücre greft tohum dinamik bir süreçtir ve alıcı kök hücre klinik ekimi için kullanılabilir. Şu anda bu tür amaçlar için kullanılan kök hücreler kemik iliği, mezenkimal ve organ sakinleri3,5,6içerir. Hayvan ve araştırma odaklı çalışmalar fetal ve indüklenmiş pluripotent12,13,14vardır mezenkimal kökenli kök hücrelerden kullandık. Bu işlem bir biyoreaktör (damarı tutar ve sıcaklık, gazlar, pH ve basınç gibi gerekli koşulları sağlayan bir odası) gerektirir hücreleri ve Kültür medya. Recellularization mücadelesine hücreleri belirli bir türü ve hangi tarafından bütün doku veya organ hücreleri ulaşabilirsiniz tohum bir strateji gerekli sayıda elde etmektir. Rağmen hiçbir tam doku veya organ yapısal ve işlevsel olarak yapılmış oluşturulan ve şimdiye kadar birkaç gelişmeler alan ve ilk sonuçları gelecekteki olasılığı15göster değerlendirildi. Ven tuşu fonksiyonu iltihabi hücre infiltrasyonu doku ve daralma içinde yardımcı olur ve kan basıncı16tutmak için güç sağlar orta düz kas katmanı içine denetler luminal endotel yatıyor. Çalışmalar sırasında hasar, anastomoz veya dolaşan endotelyal progenitor hücreler (EPCs) kan17,18,19endothelialization oluştuğunu göstermiştir. Bizim strateji recellularization damarlar için kan dolaşan mevcut EPCs kullanır.
Doku mühendisliği damarları ve arterler farklı decellularization recellularization stratejileri20,ve21takip çeşitli gruplar tarafından gerçekleştirildi. Grubumuz aynı zamanda gerçekleştirilen ve iliak ve meme damarlar6,7için decellularization ve recellularization stratejiler geliştirdi. Decellularization Triton X-100, tri-n-butil fosfat (TnBP) ve enzim deoksiribonükleaz (DNaz) damarda ajitasyon tarafından gerçekleştirildi. Recellularization kemik iliği türetilmiş endotel ve düz kas hücreleri6 veya periferik kan7kullanılarak gerçekleştirildi. Ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı6,7ile fonksiyonel kan akımı pediatrik hastalarda ekiminde sağlanmasında klinik vaat iki protokolü tarafından damarları recellularized.
Biz şu anda küçük çaplı damarlar decellularization, recellularization ve biyoreaktör işlenmesi kolay ve geliştirilmiş performans için aynı iletişim kuralını değiştirilmiş bir versiyonu geliştirdik. Geçerli decellularization iletişim kuralı deterjanlar ajitasyon deterjanlar ile yerine basınç uygulayarak ven yoluyla perfüzyon gerekli. Recellularization Protokolü Önkoşullanma hücre adezyon ve ek hücre adezyon, hayatta kalma ve yayılmasını önleme geliştirmek için kan dolaşan içinde büyüme faktörlerinin artırmak için ek bir adım içerir. Piyasada bulunan ürünleri kullanarak Biyoreaktör Tasarımı da iyileştirilmiştir. Bu yazıda, biz decellularization ve recellularization insan safen damar gerçekleştirmek için değiştirilmiş bir protokol ayrıntılı bir açıklama mevcut.
Protocol
Doku kullanılan ve bu kağıt Protokolü Göteborg Üniversitesi etik kuralları izler.
1. doku hazırlık ve depolama
- Cerrahi forseps ve makas kullanarak alınan safen ven çevre dokudan kesin.
Not: Safen ven insanlar alt ekstremite damar cerrahları tarafından disseke. Bu yazıda kullanılan safen ven bypass cerrahisi sonra un kullanılan bir parçasıdır. - Perfüzyon sırasında kaçağı önlemek için kendi amaçları dikişler ve forseps ile tüm yan şubelerinde ligate.
- Ven fosfat tampon salin (PBS) 40 mL içeren bir 50 mL tüp içinde tutun. Ven aşırı kan kaldırmak için PBS 2 - 3 kez değişiklik yaparak yıkayın. Ven-80 ° C'de dondurarak saklamak
2. Decellularization kurulumları ve Recellularization biyoreaktör hazırlanması
Not: makas kullanarak, Tablo 1' de gösterildiği gibi silikon tüpler kesti.
-
Decellularization kurulumu 1 (Triton X-100 perfüzyon ve yıkama)
- Bir 2 L (plastik küvet) odası, tüp Şekil 1A' gösterildiği gibi A tüm üç adet bant.
Not: teyp nerede odası (deterjan'ın giriş) alt kenarına dokunur bir duvar için bir tüp ve diğer iki tüp ven uzunluğuna bağlı olarak 5-10 cm arasında bir mesafe ile karşı duvara. En az 5 cm Bu tüpler de odası 's yere (damar'ın giriş ve çıkış) bantlanmış. - Erkek ve dişi radarı bağlayıcılar, kullanarak bağlan serisinde tüp için tüp B F, tüp C tüp tarafından takip deterjan'ın giriş ve sonunda damar giriş için. Yer ve peristaltik kaset tüpüne F ben pompa.
- Başka bir tüp C al ve bir ucunu damar'ın prize bağlayın. Diğer ucunu 45 cm (deterjan çıkış) odası yerleştirilir alt hortum çıkış ile cam kavanoza yerleştirin ve güvenliğini sağlamak için Kaydet. Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış itmek ve diğer ucunu ven odanın içine yerleştirin.
Not: Tüm kurulum (kırmızı oklar), odası ve akış yönünü (beyaz ok) resimlerini Şekil 1Aile gösterilir.
- Bir 2 L (plastik küvet) odası, tüp Şekil 1A' gösterildiği gibi A tüm üç adet bant.
-
Decellularization kurulum 2 (için TnBP perfüzyon)
- 1 L cam sürahi alıp tüp jar'ın alt dokunuyor kadar tüp C (deterjan giriş) bir ucunu kavanoza yerleştirin.
- Tüp F tüp tarafından C. yer tüp C diğer ucunu kavanozun içine yarım Derinlik (damar'ın giriş) kadar takip için diğer ucunu bağlayın. Tüp F peristaltik pompa kaset yerleştirin ben.
- Tüp D alın ve bir ucu kavanoza (damar'ın çıkış) yarım derinlik ve diğer ucunu cam kavanoza kadar damar'ın giriş (deterjan çıkış) 45 cm yükseklikten yer alt hortumu ile yerleştirin. Güvenliğini sağlamak için deterjan'ın giriş ve çıkış boruları teyp.
- 1 L cam sürahi bir manyetik karıştırıcı yerleştirin ve mıknatıs şişe içinde tutmak.
- Tüp G alın ve bir ucu cam kavanoz hortum çıkış üzerine itmek ve diğer ucunu 1 L cam sürahi yerleştirin.
Not: Resim tam kurulumu (kırmızı oklar), Şekil 1Badımında odası ve akış yönünü (beyaz ok) gösterilir.
-
Decellularization Kur 3 (için DNaz perfüzyon)
- 250 mL Cam şişe alın ve her iki ucunda da tüp C. yer tüp ortasındaki alanı peristaltik pompa II kaset yerleştirin.
Not: Tüp bir ucunu çözüm giriş ve tüp diğer ucunu damar'ın koya bağlı. Damar'ın çıkış çözümde serbest bırakılır. - Pompa 37 ° C'de dahil olmak üzere tüm kurulum yerleştirin Kurulumu tamamlamak ve akış yönünde resmi Şekil 1 ciçinde gösterilir.
- 250 mL Cam şişe alın ve her iki ucunda da tüp C. yer tüp ortasındaki alanı peristaltik pompa II kaset yerleştirin.
-
Recellularization biyoreaktör
- Tüm parçaları Şekil 2Agösterildiği gibi hazır tutun.
- Şekil 2Biçinde gösterildiği gibi 4-port kapağını ve her bağlantı noktasına takın, H (damar'ın çıkış) Tüp, tüp ben (medya giriş) ve J (damar'ın giriş) tüp. Tüp H diğer ucunu (medya çıkış) 4th bağlantı noktasına bağlayın.
Not: 4-port kapağı üstten görünüm Şekil 2Ciçinde gösterilir. Tüpler, sivri bir makas ile kenarları kesilmiş kolay ekleme için. - Diğer ucunu ise tüp J U şekle viraj ve dikiş ile kravat. Azalan bakiyeli bağlayıcılar tüpler H & J. iç ucuna bağlayın
- 60 mL tüp düz taban ile 250 mL Cam şişe içine yerleştirin ve yukarıda yapılan Kur Şekil 2Bolarak gösterildiği gibi tüp içine yerleştirin. Şekil 2Eiçinde gösterildiği gibi tüplerde K, E ve K serisi bağlayın. Bir tüp K damar'ın giriş ve medya giriş için başka bir tüp K bağlayın.
Not: Kurulum ve akış yönü Şematik diyagramı Şekil 2Fiçinde görülür. - Biyoreaktör tarafından ısıyla sterilize.
3. hazırlık çözümleri
- Çözüm 1 (10 x su): için 1 L Ultrasaf Su, 2 g sodyum azid ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 18.6 g ekleyin. Tuz eriyene kadar karıştırın.
- Çözüm 2 (1 x su): 100 mL çözeltisi 1 alın ve 900 mL ultrasaf su ekleyin.
- Çözüm 3 (Triton X-100 x 5): Triton X-100 50 mL, 1 g sodyum azid ve 9.3 g EDTA Ultrasaf Su 950 mL için ekleyin. Eriyene kadar karıştırın.
- Çözüm 4 (Triton X-100 x 1): 200 mL çözüm 3 alın ve 800 mL ultrasaf su ekleyin.
- Çözüm 5 (1 x TnBP): TnBP 10 mL 10 mL pipet ile çözüm 2 990 mL için ekleyin.
- Çözüm 6 (40 Kunitz adet/mL DNaz): DNaseI, 2.000 Kunitz eklemek biriminde Dulbecco'nın fosfat tampon CaCl2 ve MgCl2içeren serum 50 mL. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.
- Çözüm 7 (PBS): 24 g sodyum klorür, potasyum klorür 0.6 g, 4,32 g sodyum fosfat ve potasyum fosfat 0,72 g için 3 L ultrasaf su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın. PH 7.4 için ayarlayın. 1 litre PBS Otoklav içinde sterilize ve ayrı ayrı saklayın.
- Çözüm 8 (% 0,1 Perasetik asit): 50 mL steril çözüm 7, 50 µL Perasetik asit ekleyin. Taze hazırlamak ve hemen kullanın.
4. endotel orta hazırlanması
- L-glutamine, 5 mL 5 mL anti-anti, insan AB serumu 50 mL ve 500 ml steril bir başlık altında MCDB131 orta fetal Sığır serum dışında EGM-2 büyüme faktörü kitinin tüm bileşenleri de ekleyin.
5. safen ven decellularization
- İnsan safen ven-80 ° c oda sıcaklığında erimek. Tekrar-80 ° C'de donmasına ve yine oda sıcaklığında erimek.
- Biyopsi makas kullanarak 2 mm uzunlukta Kes ve formaldehit oda sıcaklığında 24-48 h için düzeltin. Damar dikiş ile erkek ve dişi radarı bağlayıcı barbs için her iki ucuna bağla.
- Ven decellularization Kur 1 bağlanmak ve çözüm 2 1 litre doldurun. 15 dk 35 mL/dak., boş için kurulum içeriğini sıvı.
- Çözüm 4 1 litre ekleyin ve 4 35 mL/dak. s kurulum içeriğini boşaltmak için sıvı.
- Çözüm 2 500 mL ekleyin ve 5 dk. boş için kurulum içeriğini sıvı. Bu adımı yineleyin. Ven perfüzyon kurulumundan 1 çıkarıp perfüzyon kurulum 2 takın.
- Çözüm 5 1 litre ekleyin, karıştırıcı üzerinde açmak ve 35 mL/dk 4 h için sıvı.
Not: Çözüm 5 dönüm karıştırıcı ve perfüzyon boyunca sonra bulanık. - Ven perfüzyon kurulumundan 2 kesin ve 5-10dk Ultrasaf Su 4 değişiklikleri damar'ın iç ve dış şırınga veya 10 mL pipet ile yıkayın.
- Perfüzyon Kur 3 damar bağlanmak, çözüm 6 50 mL ekleyin ve 10 mL/dk 37 ° C odasında 4 h kurulum içeriğini boş ve damar kurulumundan kesmek için sıvı.
- Ven perfüzyon Kur 1 bağlanmak, çözüm 2 1 litre doldurmak ve gecede 35 mL/dak. tekrarlamak adım 5.4 ile adım 5,9 4 kez (için toplam 5 döngüleri), sıvı. Adım 5.2 belirtildiği gibi tekrar biyopsi alın.
Not: Atla adım 5.8 ikinci bölümü döngülerle 1 ve 3. - Belgili tanımlık tertibat içeriğini temizleyin. Çözüm 2 1 litre doldurun ve sıvı 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için 2'den sonra 12 h. Kur içeriğini temizleyin. 1 L ultrasaf su doldurun ve 35 mL/dak değişiklik Ultrasaf Su 24 h için kurulum içeriğini sonra 12 h.Empty sıvı. Çözüm 7 1 L doldurun ve sonra 12 saat 7 24 h 35 mL/dak değişikliği çözüm için sıvı.
6. Decellularization doğrulanması
- Biyopsi standart protokolleri takip bir doku işlemci işlem 15 dakika süreyle Ultrasaf Su sabit formalin yıkayın ve parafin22embed.
- Bir microtome kullanma 5 µm bölümlerine kesmek ve leke Meyer Hematoksilen ve % 0,2 alkollü eozin (H & E) ile aşağıdaki standart protokolleri22.
- Çekirdekler için normal doku karşılaştırıldığında decellularized doku kaybı olup olmadığını denetlemek için mikroskop altında görüntüleyin.
7. recellularization
- Ven çözüm 8 50 mL içeren bir 50 mL tüp içinde yerleştirerek sterilize. Shaker 37 ° C'de 1 h için (devir/dakika) dakikada 80 rotasyonlar, kışkırtmak
- Laminar akış (SMD) andan itibaren kısırlık korumak için kabin altında ven başa. 50 mL steril çözüm 7 ve 500 µL anti-anti, içeren yeni bir 50 mL tüp için steril forseps kullanarak ven aktarın. Yukarıdaki gibi 12 h. değişiklik çözüm 7 en az iki kez arasında için tahrik.
- Steril forseps kullanarak, yeni bir 50 mL tüp ven aktarmak ve endotel medya 50 mL ekleyin. Yukarıdaki gibi 11 h için tahrik.
- SMD Kabin altında steril eldiven kullanarak biyoreaktör bir araya getirin. Ven biyoreaktör'ın damar giriş ve çıkış steril dikiş ve forseps ile için kravat.
- Ven biyoreaktör ve dolgu aynı orta ile bağlayın. 50 IU/mL heparin ekleyin ve 2 mL/dk 37 ° c 1 h için sıvı
- Heparin kaplı tüp tüpler donörden 15-25 mL taze kan (bağlı olarak damar'ın uzunluğu) toplamak ve Steen çözüm ile 1:1 oranında seyreltin. Daha sonra endokrin bezi kaynaklı vasküler endotelyal büyüme faktörü (EG-VEGF, 80 ng/mL), temel fibroblast büyüme faktörü (FGF-b, 4 µL/mL) ve asetil salisilik asit (5 µg/mL) ekleyin.
- 37 ° C kuluçka %5 CO2 biyoreaktör taşımak ve 2 mL/dk 48 h için sıvı.
- Yaklaşık 12 h sonra biyoreaktör bir LAF dolap, hareket bir damla kan al ve kullanarak izleme cihazı bir kan şekeri glukoz ölçümü. Düzeyi daha az 3 mmol/L ise, glikoz getirmek için eklemek 7-9 mmol/l yineleme aralığı içinde bu adım her 8-12 h.
- 48 h sonra biyoreaktör LAF kabin taşımak ve biyoreaktör kandan drenaj. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. drenaj çözüm sıvı. 30 mL steril çözüm 7 ekleyin ve 5 dk. tekrar iki kez veya kan kırmızı renk kaybolur kadar sıvı.
Not: Hücre ek doğrulama için biyopsi alınabilir. Damarı kesmek, ven 5 mm kenarları makasla kesmek ve onları atın. 5.2. adımda belirtildiği gibi bir biyopsi almak ve damar yeniden biyoreaktör (isteğe bağlı adım) bağlanın. - Endotel orta 30-45 mL ekleyin ve 2 mL/dk kuluçka 96 h için sıvı.
Not: endotel orta damarı batık kadar ekleyin. - Biyoreaktör LAF kabinin taşımak, recellularized damar bağlantısını kesin, makas kullanarak ven 5 mm kenarları kesilmiş ve atmak. Biyopsi 5.2. adımda belirtilen şekilde alın.
8. Recellularization doğrulanması
- 6 bölümündeki yönergeleri izleyin ve H & E boyama gerçekleştirmek. Slaytları hücrelerin varlığı için mikroskop altında incelemek.
Representative Results
Normal bir damar brüt morfolojisi ışıktır kırmızı (Şekil 3A). Kırmızı renk ilerici decellularization döngülerle kaybolur (döngüsü 2, Şekil 3B; 3, döngüsü Şekil 3 c) ve 5th döngüsü tarafından görünüyor soluk ve beyaz (şekil 3D). Recellularized damar kan perfüzyon (Şekil 3E) ve endotel medya perfüzyon (Şekil 3F) sonra parlak kırmızı renkte görünüyor. (Şekil 4B) H & E boyama içinde yok Mavi çekirdeği görüldüğü decellularization tedavi 5 döngüleri damar hücreleri başarıyla kaldırıldı. Buna ek olarak, birkaç çekirdek normal şekilde (Şekil 4A) görüldü. Luminal tarafındaki ekli hücrelerin varlığı recellularized ven kan 48 h (Şekil 4 c, siyah ok) ve sonra 96 h (şekil 3D, siyah oklar) endotel orta ile perfüzyon ile H & E boyama içinde görülür.
Resim 1 : Perfüzyon kurulumları için decellularization montajı. A) birleştirilmiş decellularization kurulumu 1 Triton X-100 için gösteren ve yıkama resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. B) TnBP perfüzyon monte decellularization kurulum 2 gösteren resim. Benzer şekilde, decellularization Kur 1, olduğu gibi beyaz ok çözümleri için akış yolunu göstermek ve kırmızı oklar giriş ve çıkışları ven ve çözümler için gösterir. C) deoksiribonükleaz perfüzyon monte decellularization Kur 3 gösteren resim. Beyaz ok çözümleri için akış yolu gösterme ve kırmızı oklar alıcılar ven ve çözümler için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Hazırlık ve recellularization için biyoreaktör montajı. A) resim gösteren malzemeler biyoreaktör montajı için gerekli. B) bağlayıcılar (kırmızı oklar), azaltmak amacıyla yerleşim gösteren 4-port kap içine resmini puan damar giriş ve çıkış (beyaz ok) ve düzeni tüpler H, ben ve J. bağlanmak için Ücretsiz Tüp H sonuna medya dönmek için biyoreaktör yerleştirilir. C) ve dışarı gidiyor ilgili tüpler 4 bağlantı noktası kap üst taraftan görülebilir. D) monte biyoreaktör gösteren resim. E) bütün biyoreaktör Kur peristaltik pompa ile gösteren resim. Tüpler K biyoreaktör bağlantılarından peristaltik pompa uzatın. F) bütün biyoreaktör perfüzyon sistemi şematik gösterimi. Turuncu oklar, akış yönünü gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Decellularization ve recellularization sırasında damarlar morfolojisi brüt. A) normal damar brüt morfolojisi parlak kırmızı renkte görünüyor. Rengi decellularization devir sayısının artması ile kaybolur B) 2 döngüsü ve C) 3 döngüsü. D) 5 tarafından devir, damar görünüyor soluk ve beyaz. E ile ventriküler sonra ven) kan 48 h ve F) endotel ortamı için 96 h ile bir kez daha parlak kırmızı renkte görünüyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Decellularized ve recellularized damarlar karakterizasyonu. Hematoksilen ve görüntü boyama eozin A) normal damar içeren birçok mavi çekirdeği ama yok bunlar içinde B) decellularized damar. İle recellularized ven C) kan ile ve 48 h için D) 96 h, ek hücre (siyah oklar) lümen, endotel orta olduğunu fark ettim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Safen damarlar decellularization için burada sunulan teknik umbilikal ve meme damarlar gibi tüm küçük çaplı damarlar için uygulanabilir kolay, basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Decellularization çözümleri ve bu yöntemde kullanılan onların konsantrasyonları bizim önceki sonuçları6,7' den vardır. Decellularization 5 döngüleri öneririz rağmen bazı damarlarda biz de 3 kür tam decellularization fark ettim. Ancak, tekrarlanabilir sonuçlar 5 döngüleri kullanarak elde edilmiştir. Bu iletişim kuralı uygulayarak, biz uzunlukları değişen damarları decellularized 30 cm'ye kadar başarıyla (yayınlanmamış sonuç). Decellularization çözümün çıkış tarafından 45 cm kaldırma 33 mmHg ven içinde basınç oluşturur. Deneyim, biz bütün damar düzgün decellularizing ve tekrarlanarak 5 döngüleri önemli bir adım olarak bu fark. Seçilen basınç normal safen ven basınç (5-10 mmHg) 3 kat daha yüksek ama yetersiz olduğu (varis)23damarlar. Ayrıca, bu yüksek basınç önemli bir güç damar duvarlarında oluşturur ve bu nedenle, verimli ve daha hızlı hücre kaldırılmasına yardımcı olabilir spekülasyon.
TnBP bir organik çözücü ve suda çözünmez olduğundan, deterjan bulutlu hale gelinceye kadar karıştırarak önemlidir; Aksi takdirde, deterjan yüzer olacak. Aynı nedenle, hortum çıkış ile cam kavanoz üstündeki deterjan'ın çıkış tüp çözümde, karışık TnBP tutmak için yerleştirildi. TnBP verimli kaldırılması damardan sonra onun kullanım her döngüsünde TnBP damlacıkları yıkanmış suda yüzen yokluğu tarafından görülebilir. Ayrıca DNaz adım atlama da decellularized bir doku üretti ama birkaç durumlarda, decellularized doku nispeten yüksek bir DNA içeriği fark etmişsinizdir. Yüksek basınç ve yüksek akış oranları verimli DNaz etkinlik için gerekli değildir, bir düşük perfüzyon oranı (10 mL/dak) kullanılabilir. Onun küçük boyutta kurulumu kolay İşlemede yardımcı olarak farklı peristaltik pompa kullanıldı. Çoğu hücre hasarı dönemi 2 sonuçlarında decellularization sırasında fark ettik beri DNaz tedavi döngüleri 1 ve 3 (yayınlanmamış sonuç) sırasında atlama öneririz. Karakterizasyonu ve miktar hücre dışı matriks proteinleri bu el yazması yapıldı değil olsa bile, bizim önceki deneyim benzer decellularization protokollerle biyomekanik özellikleri korunması gösterdi, hücre dışı matriks7yapısı ve proteinler. Bu damarlar ile bizim ön miktar deneyler (yayınlanmamış) benzer bir sonuç üretilen rağmen zaten yayınlanmış sonuçlarımız bu güven güçlendirecektir.
Bir önlemek uzun hücre genişletme kez, genişletilmiş hücreleri, cerrahi işgali ve rahatsızlık spontan mutasyonlar hasta için kan kullanarak recellularization bir rahat ve kolay kemik iliği genişletilmiş hücrenin üzerine işlemdir. Bu bilinen beri endothelialization da EPCs dolaşan oluşabilir, biz o perfüzyon ile endotel orta perfüzyon ardından kan ile olan recellularization için yeterli olacaktır. İki tür damarlar ile ekstra hepatik portal damar tıkanıklığı7çocuk içine implante edildi Emanet benzer bir yöntemle mühendislik ven dokuların nakli başarılı sonuçlarından görülür. Decellularized hücre dışı matriks içinde büyüme faktörleri EPCs kan24dolaşan eki verecektir spekülasyon. Recellularization benzer bir protokol sonrası damar hücreleri VEGF reseptör-2 ve farklılaşma (CD) 14 lümen CD45 ifade hücreleri adventitia7' de görüldü ise küme için olumlu gösterdi. Ayrıca sürekli endotel katman her durumda bu kişilerin progenitör hücre25dolaşan numaraları azalma Bilindiği gibi özellikle büyük ve hastalıklı hastalardan kan ne zaman istimal gözlenen değil ki hayal. Ancak, biz bu perfüzyon ile alıcının kendi önermeyi kan yüzünden decellularization maruz kalır ve böylece olumsuz inflamatuar reaksiyonları sadece dikim yerine nakledilen olasılığını azaltmak antijenleri pek çok maske decellularized kan damarları. Buna ek olarak, kan perfüzyon büyüme faktörleri lümen ve hangi sırayla recellularization vivo içindehızlı bir işlemde ortaya çıkan progenitör hücre dolaşımdaki artan numaraları işe olabilir adventitia, daha yüksek düzeyde yatırabilirsiniz.
Bu çalışmada kullanılan biyoreaktör tasarım avantajı tam Isıyla, kolay montaj, maliyet-etkililik, kolay kullanım ve en az zarar olasılığı vardır. Deneyim, dakikada 10 cm uzunluğunda recellularized geçerli Tasarım, damarları kullanarak. Düz-se bile kadar damarları 25 cm uzunluğunda de recellularized damar "U" şeklinde biyoreaktör içinde tutarak, bu doğrulanması gerektiğini. Biyoreaktör Tasarımı ven akış yönünü yerçekimine karşı ve normal insanlarda bu damarlar için akış yönünü olduğundan bu nedenle tasarlanmıştır gösterilmiştir. Endotel orta adım 12 h perfüzyon ven yaygõn ve gelen EPCs eki benzeşim artırmak olduğunu. İlave heparin ve perfüzyon 1 h için eklenmesi kan pıhtıları kan perfüzyon sırasında tüplerde şekillendirme riskini düşürür.
Gerekli kan kan hacmi damarın uzunluğuna bağlıdır. Damar içinde kan sokulmasına biz kan hacmi için takip temel ilkedir. Kan 45 mL büyük birimler işlerken, ara sıra karıştırma biyoreaktör alt hücre birikimi önlemek için gerekli olabilir. Biz Steen'ın çözüm yüksek miktarda protein ve dokuların sağlıklı organ nakli26,27sırasında korumak için gerekli bileşenler içerdiğinden kan için ekledi. VEGF ve b-FGF ek olarak onlar güçlü anjiogenik büyüme faktörleri28 ve geçiş, yayılmasını önleme ve EPCs29,30,31,32 farklılaşma varlıklarını indükler faydalıdır . Eklendi VEGF miktarı EPCs yayılması 80 ng/mL nerede görülmüş önceki yayınlanmamış sonuçlarımız temel alır. Aspirin ilavesi böylece endotel tabakası kendi eki olasılığını azaltarak trombosit33 aktivasyonu engeller. Sürekli izlenmesi ve glikoz ilavesi de hücre çoğalması ve hemoliz kırmızı kan hücrelerinin önlenmesi için faydalı olacaktır.
Sadece basit kan örneği alıcıdan gelen gerekli olduğu için daha az teknik uzmanlık gerektiren bir kolay ve uygulanabilir prosedür olarak kabul edilebilir. Burada bitirmek için baştan gösterilen tüm prosedürü 20 gün alır rağmen, decellularized damarlar olarak saklamak bir raftan ürün hastalar için 8 gün yordamına kısaltacaktır. Decellularized damarlar depolanmasını Teknik olarak recellularization verimliliği etkilememelidir rağmen değerlendirilmelidir. Aşağıdaki yordamı oluşturulan doku mühendisliği damarları tıkalı damarlar, varis bağışıklık suppression gerek kalmadan önde gelen ve böylece daha iyi bir kalite sağlayan venöz yetmezlik yerine bypass ameliyatları için klinikte kullanılabilir hayat hasta için.
Disclosures
SSH tutar Verigraft, kan damarlarının mühendislik doku teknolojisini lisanslı bir şirket hisse. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Profesör Anders Jeppsson kan damarlarının deneylerde kullanılan sağlama konusunda yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma finanse LUA ALF hibe SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
