Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la DÉCELLULARISATION de veine saphène à l’aide de détergents et recellularization par la perfusion de sang périphérique et du médium endothélial.
Abstract
Vasculaires conduites utilisées au cours de la plupart des chirurgies vasculaires sont des greffes allogéniques ou synthétiques qui conduisent souvent à des complications causées par l’immunosuppression et de faible perméabilité. Génie tissulaire offre une solution originale pour générer des greffes personnalisés avec une matrice extracellulaire naturelle contenant des cellules du destinataire à l’aide de la méthode de DÉCELLULARISATION et recellularization. Nous montrons une méthode détaillée pour l’exécution de DÉCELLULARISATION de la veine saphène humaine et recellularization par la perfusion de sang périphérique. La veine a été DECELLULARISE par perfusion 1 % X-100 de Triton, 1 % n-butyl-triphosphate (TnBP) et 2 000 unités de Kunitz de désoxyribonucléase (DNase). Triton X-100 et TnBP ont été perfusés à 35 mL/min pendant 4 h, alors que la DNase était perfusé à 10 mL/min à 37 ° C pendant 4 h. La veine a été lavée à l’eau ultrapure et PBS et puis stérilisée dans 0,1 % d’acide peracétique. Il a été lavé à nouveau dans du PBS et préconditionné dans un milieu endothélial. La veine a été connectée à un bioréacteur et perfusée avec endothélial milieu contenant 50 UI/mL héparine pendant 1 h. Recellularization a été réalisée en renseignant le bioréacteur avec du sang frais, dilué 1:1 en solution de Steen, ajoutant dérivé de glande endocrine vasculaire les facteurs de croissance endothéliales (80 ng/mL), facteurs de croissance basique des fibroblastes (4 µL/mL) et l’acide acétyl salicylique (5 µg/mL). Le bioréacteur a ensuite emménagé dans un incubateur et perfusé pendant 48 h à 2 mL/min, tout en maintenant la glycémie entre 3 à 9 mmol/L. Plus tard, la veine a été lavée avec du PBS, emplie d’une matière endothéliale et perfusée pendant 96 h dans l’incubateur. Traitement avec Triton X-100, TnBP et DNase decellularized la veine saphène dans 5 cycles. La veine DECELLULARISE regardé blanche contrairement aux veines normales et recellularized (lumière rouge). L’hématoxyline et éosine (H & E) coloration ont montré la présence de noyaux qu’en normal, mais pas dans les veines DECELLULARISE. Dans la veine recellularized, H & E-coloration ont montré la présence de cellules sur la surface luminale de la veine.
Introduction
Des gaines vasculaires sont nécessaires pour plusieurs conditions cliniques comme les anévrismes, sténose de l’artère carotide et l’athérosclérose entraînant de sérieux problèmes vasculaires. Chirurgiens utilisent des gaines vasculaires synthétiques, autologues ou allogéniques pour rétablir l’approvisionnement en sang fonctionnelle. Bien que l’utilisation de navires de sang autologues est toujours considéré comme l’approche idéale, la disponibilité chez les patients est majorly limitée. Les alternatives comme les greffes allogéniques ou synthétiques ont des problèmes profonds avec des traitements immunosuppresseurs et mauvaise perméabilité menant à réopération1,2, entraînant fardeaux économiques majeurs pour la santé au pays. Génie tissulaire des vaisseaux sanguins vise à fournir des greffons avec une homologie de naturelle et de cellules autologues. Ainsi, le destinataire système immunitaire reconnaît le greffon transplanté en soi et comme une telle greffe contient les protéines naturelles et les cellules dans la configuration d’origine, il pourrait fonctionner mieux en comparaison avec les solutions de rechange actuelles. Tissulaire génétiquement modifié, organes, tels que la vessie3, l' urètre4, le5de la trachée et veines6,7, ont été utilisées avec succès dans la clinique.
Tissus techniques pour produire des greffons personnalisés nécessite une greffe d’un donneur suivie DÉCELLULARISATION et recellularization. DÉCELLULARISATION est une technologie prometteuse pour éliminer les cellules de tissus et organes8,9,10. DÉCELLULARISATION peut être effectuée par des méthodes physiques, chimiques et enzymatiques spécifiques11 ou en les combinant. À une utilisation optimale de ces méthodes, DECELLULARISE tissus peuvent avoir des protéines structurales et fonctionnelles similaires dans une matrice extracellulaire semblable aux tissus natifs. Ces organes possèdent la capacité intrinsèque d’augmenter la fixation, la migration, la prolifération et différenciation des cellules de tige entrants.
Recellularization est un processus dynamique d’ensemencement des cellules dans le greffon, et bénéficiaire des cellules souches peut être utilisés pour la transplantation clinique. Cellules souches actuellement utilisées à ces fins comprennent la moelle osseuse, mésenchymateuse et orgue résidents3,5,6. Animal et des études axées sur la recherche ont utilisé des cellules souches mésenchymateuses origines qui sont pluripotentes foetale et induits12,13,14. Ce processus exige un bioréacteur (une chambre qui contient la veine et fournit les conditions nécessaires comme la pression, le gaz, pH et température), cellules et milieux de culture. Le défi de recellularization est d’obtenir le nombre requis de cellules d’un type particulier et une stratégie de semis par lequel les cellules peuvent atteindre tout tissu ou un organe. Même si aucun tissu complet ou un organe structurellement et fonctionnellement a été généré et évaluée jusqu'à présent, plusieurs avancées dans le domaine et les premiers résultats montrent la possibilité future de15. La touche de fonction de la veine se trouve dans l’endothélium luminale qui contrôle l’infiltration de cellules inflammatoires dans les tissus et la couche intermédiaire de muscle lisse qui contribue à la constriction et fournit également la force pour maintenir la pression artérielle,16. Des études ont démontré que, lors de dommages, endothélialisation se produit depuis l’anastomose ou circuler les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) dans sang17,18,19. Notre stratégie pour recellularization des veines s’appuie sur l’EPCs présents dans le sang circulant.
Génie tissulaire des veines et des artères a été interprété par plusieurs groupes suivant différents DÉCELLULARISATION et recellularization stratégies20,21. Notre groupe a également joué et élaboré des stratégies DÉCELLULARISATION et recellularization pour les veines iliaques et mammaire6,7. DÉCELLULARISATION a été réalisée par l’agitation de la veine dans Triton X-100, tri-n-butyl phosphate (TnBP) et l’enzyme désoxyribonucléase (DNase). La recellularization a été réalisée à l’aide de la moelle osseuse provenant de cellules musculaire lisse et endothéliales6 ou circulants7. Les veines recellularized par un protocole prometteuses clinique en proposant l’approvisionnement en sang fonctionnelle dans la transplantation des patients pédiatriques extra hépatique veine obstruction6,7.
Nous avons actuellement mis au point une version modifiée du protocole même pour l’exécution améliorée et facile de manipulation DÉCELLULARISATION, recellularization et bioréacteur de veines de petit diamètre. Le protocole actuel de DÉCELLULARISATION nécessaires à perfusion de détergents dans la veine à l’aide de pression au lieu de l’agitation avec des détergents. Le protocole de recellularization comporte une étape supplémentaire du préconditionnement pour améliorer l’adhérence cellulaire et l’addition de facteurs de croissance dans la circulation sanguine pour améliorer l’adhésion cellulaire, la survie et la prolifération. Nous avons également amélioré la conception du bioréacteur à l’aide de produits disponibles dans le commerce. Dans cet article, nous présentons une description détaillée du protocole modifié pour exécuter DÉCELLULARISATION et recellularization des veines saphènes humaines.
Protocol
Le tissu utilisé, et le protocole de cette étude suit les directives éthiques de l’Université de Göteborg.
1. stockage et préparation du tissu
- Couper le tissu environnant de la veine saphène Récupérée à l’aide de ciseaux et pinces chirurgicales.
Remarque : La veine saphène est disséquée de la jambe de l’homme par les chirurgiens vasculaires. La veine saphène, utilisée dans le présent document constitue une partie non utilisée après pontage aorto-coronarien. - Pour éviter les fuites pendant la perfusion, ligaturer toutes les branches secondaires à leurs extrémités avec des sutures et des forceps.
- Maintenir la veine dans un tube de 50 mL contenant 40 mL de solution saline de tampon au phosphate (PBS). Laver la veine en changeant de PBS 2 - 3 fois pour enlever le sang excédentaire. Stocker la veine par congélation à-80 ° C.
2. préparation des configurations DÉCELLULARISATION et Recellularization bioréacteur
Remarque : À l’aide de ciseaux, couper les tubes de silicium comme indiqué dans le tableau 1.
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Configuration 1 de DÉCELLULARISATION (pour perfusion X-100 Triton et lavage)
- Pour un 2 L de la chambre (baignoire en plastique), bande tous les trois morceaux de tube A comme le montre la Figure 1 a.
NOTE : Tape un tube à un mur où le bord touche le fond de la chambre (entrée de détergent) et les deux autres tubes pour le mur opposé avec une distance de 5 à 10 cm entre les deux selon la longueur de la veine. 5 cm au moins de ces tubes devraient également être collée sur le fond de la chambre (entrée et sortie de la veine). - En utilisant les connecteurs Luer mâles et femelles, se raccordent en série d’entrée de la lessive, tube à tube B suivie de tube F, tube C et enfin à l’entrée de la veine. Place le tube F dans la cassette de la péristaltique pompe I.
- Prenez un autre tube C et connectez une extrémité à la prise de la veine. Placez l’autre extrémité dans le bocal en verre avec son raccord de fond qui se trouve à 45 cm au-dessus de la chambre (prise de détergent) et le coller pour garantir. Prendre le tube G et poussez une extrémité dans le raccord de la fiole de verre et placez l’autre extrémité dans la chambre de la veine.
NOTE : Les images d’installation complète (flèches rouges), chambre et direction de l’écoulement (flèches blanches) sont montrées dans la Figure 1 a.
- Pour un 2 L de la chambre (baignoire en plastique), bande tous les trois morceaux de tube A comme le montre la Figure 1 a.
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DÉCELLULARISATION Setup 2 (perfusion pour TnBP)
- Prendre un pot de verre de 1 L et placez une extrémité du tube C (détergent inlet) dans le bol jusqu'à ce que le tube touche le fond du bocal.
- Branchez l’autre extrémité de tube F suivi de tube C. Place l’autre extrémité du tube C dans le bocal jusqu'à la moitié de profondeur (entrée de la veine). Placer le tube F dans la cassette de pompe péristaltique j’ai.
- Prendre le métro D et placez une extrémité dans le pot (sortie de la veine) jusqu'à la moitié de profondeur et l’autre extrémité dans le bocal en verre avec le tuyau inférieur placé à une hauteur de 45 cm de l’entrée de la veine (sortie de détergent). Pour sécuriser, ruban tubes d’entrée et de sortie de la lessive.
- Placer le bocal en verre 1 L sur un agitateur magnétique et garder l’aimant à l’intérieur de la bouteille.
- Prendre le tube G et poussez une extrémité sur la sortie du tuyau de la fiole de verre et placez l’autre extrémité dans pot de verre de 1 L.
Remarque : L’image d’installation complète (flèches rouges), chambre et flux de direction (flèches blanches) est montrée dans la Figure 1 b.
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Installation de DÉCELLULARISATION 3 (perfusion de DNase)
- Prendre une bouteille de verre de 250 mL et placer les deux extrémités du tube C. Place la zone centrale du tube dans la cassette de pompe péristaltique II.
Remarque : Une extrémité du tube est l’entrée de la solution et l’autre extrémité du tube est connectée à l’entrée de la veine. Sortie de la veine est laissé libre en solution. - Placer l’installation entière y compris pompe à 37 ° C. L’image de terminer l’installation et de la direction de l’écoulement est montré dans la Figure 1.
- Prendre une bouteille de verre de 250 mL et placer les deux extrémités du tube C. Place la zone centrale du tube dans la cassette de pompe péristaltique II.
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Bioréacteur à recellularization
- Préparez toutes les pièces comme illustré à la Figure 2 a.
- Comme illustré à la Figure 2 b, retirez le capuchon 4 ports et insérer dans chaque port, tube H (sortie de la veine), tube j’ai (entrée de médias) et tube J (entrée de la veine). Insérez l’autre extrémité du tube H dans le port deth 4 (média).
NOTE : La vue sur le cap 4 ports du haut est montrée dans la Figure 2. Pour une insertion facile des tubes, couper les bords avec un ciseau pointu. - Plier l’autre extrémité du tube J en forme de U et attachez-le avec une suture. Branchez les connecteurs réductrices aux extrémités intérieures des tubes H & J.
- Placer le tube de 60 mL avec une base plate dans la bouteille en verre 250 mL et ensuite placer la configuration faite ci-dessus dans le tube comme sur la Figure 2D. Comme illustré à la Figure 2E, raccorder les tubes K, E et K en série. Raccorder un tube K à l’entrée de la veine et un autre tube K à l’entrée des médias.
Remarque : Le schéma de l’installation et la direction de l’écoulement est vu dans la Figure 2F. - Stériliser le bioréacteur à l’autoclave.
3. préparation des Solutions
- Solution 1 (10 x eau) : pour 1 L d’eau ultrapure, ajouter 2 g d’azide de sodium et 18,6 g d’acide tétraacétique (EDTA). Remuer jusqu'à ce que les sels sont dissous.
- Solution 2 (1 eau x) : prélever 100 mL de solution 1 et ajouter 900 mL d’eau ultrapure.
- Solution 3 (5 x Triton X-100) : À 950 mL d’eau ultrapure, ajouter 50 mL de Triton X-100, 1 g de l’azide de sodium et 9,3 g d’EDTA. Remuer jusqu'à dissolution.
- Solution 4 (1 x X-100 Triton) : prendre 200 mL de la solution 3 et ajouter 800 mL d’eau ultrapure.
- Solution 5 (1 x TnBP) : ajouter 10 mL de TnBP avec une pipette de 10 mL à 990 mL de solution 2.
- Solution 6 (40 Kunitz unités/mL DNase) : ajouter 2 000 Kunitz unités de DNase i dans 50 mL de Phosphate tampon Saline de Dulbecco contenant CaCl2 et MgCl2. Préparer fraîche et utiliser immédiatement.
- Solution 7 (PBS) : Ajouter 24 g de chlorure de sodium, 0,6 g de chlorure de potassium, 4,32 g de phosphate de sodium et 0,72 g de phosphate de potassium à 3 L d’eau ultrapure. Remuer jusqu'à dissolution. Ajuster le pH à 7,4. Stériliser 1 L de PBS dans l’autoclave et stocker séparément.
- Solution 8 (0,1 % d’acide peracétique) : À 50 mL de solution stérile 7, ajouter 50 µL d’acide peracétique. Préparer fraîche et utiliser immédiatement.
4. préparation du milieu endothéliale
- Ajouter 5 mL de L-glutamine, 5 mL d’anti-anti, 50 mL de sérum humain de AB et de tous les composants du kit de facteur de croissance de EGM-2 sauf la sérum de veau fœtal à 500 mL de milieu MCDB131 sous hotte stérile.
5. DÉCELLULARISATION de veine saphène
- Dégelez la veine saphène humaine de-80 ° C à la température ambiante. Congeler à nouveau à-80 ° C et décongeler à nouveau à la température ambiante.
- Couper une biopsie de 2 mm de longueur à l’aide de ciseaux et fixer en formaldéhyde pendant 24 à 48 heures à température ambiante. Nouez chaque extrémité de la veine pour les barbes d’un raccord Luer mâle et femelle avec une suture.
- Connecter la veine à la configuration de DÉCELLULARISATION 1 et remplissez 1 L de solution 2. Perfuse pour 15 min à 35 mL/min. Versez le contenu de la configuration.
- Ajouter 1 L de solution 4 et perfuse pour 4 h à 35 mL/min. Versez le contenu de la configuration.
- Ajouter 500 mL de la solution 2 et perfuse pour 5 min. Versez le contenu de la configuration. Répétez cette étape. Déconnecter la veine de la configuration 1 de perfusion et raccorder à l’installation de perfusion 2.
- Ajouter 1 L de solution 5, tourner sur l’agitateur et perfuse de 4 h à 35 mL/min.
NOTE : Solution 5 ressemble nuageuse après avoir sur l’agitateur et tout au long de la perfusion. - Déconnecter la veine du programme d’installation de perfusion 2 et lavez la veine extérieur et l’intérieur avec une seringue ou une pipette de 10 mL à 4 changements de l’eau ultrapure pendant 5-10 min.
- Connecter la veine de l’installation de perfusion 3, ajouter 50 mL de solution 6 et perfuse à 10 mL/min dans une chambre de 37 ° C pour 4 h. vider le contenu de la configuration et déconnecter la veine de l’installation.
- Connecter la veine à la configuration de perfusion 1, remplissez 1 L de la solution 2 et perfuse du jour au lendemain à 35 mL/min. répéter l’étape 5.4 étape 5,9 4 fois (pour un total de 5 cycles). Prendre une biopsie à nouveau comme indiqué dans l’étape 5.2.
Remarque : Skip étape 5.8 deuxième partie en cycles 1 et 3. - Vider le contenu de la configuration. Verser 1 L de la solution 2 et perfuse pendant 24 h à 35 mL/min. solution de changement 2 après 12 h. vider le contenu de la configuration. Verser 1L de l’eau ultrapure et perfuse pendant 24 h à 35 mL/min. changement de l’eau ultrapure après 12 h.Empty le contenu de la configuration. Verser 1 L de solution 7 et perfuse pendant 24 h à 35 mL/min. solution de changement 7 après 12 h.
6. vérification de DÉCELLULARISATION
- Laver le formol fixé biopsies en eau ultrapure pour 15 min. processus dans un traitement de tissus, suite de protocoles standard et incorporer dans la paraffine,22.
- Couper 5 µm sections à l’aide d’un microtome et tache avec hématoxyline et 0,2 % alcoolique éosine Meyer (H & E) suite de protocoles standard22.
- Découvre sous un microscope pour vérifier la perte des noyaux dans le tissu DECELLULARISE par rapport aux tissus normaux.
7. recellularization
- Stérilisez la veine en la plaçant dans un tube de 50 mL contenant 50 mL de solution 8. Agiter à 80 tours par minute (tr/min) dans le shaker pendant 1 h à 37 ° C.
- Gérer la veine sous l’enceinte à flux laminaire (LAF) désormais de maintenir la stérilité. Le transfert de la veine à l’aide d’une pince stérile dans un nouveau tube de 50 mL contenant 50 mL de solution stérile 7 et 500 µL d’anti-anti. Agiter comme ci-dessus pendant 12 h. 7 Solution changement au moins deux fois entre les deux.
- À l’aide d’une pince stérile, la veine de transfert dans un nouveau tube de 50 mL et ajouter 50 mL de médias endothéliale. Agiter comme ci-dessus pour 11 h.
- Assembler le bioréacteur à l’aide de gants stériles dans les forces armées libanaises du cabinet. Lier la veine pour du bioréacteur veine entrée et sortie avec suture stérile et forceps.
- Branchez la veine sur le bioréacteur et remplir avec le même milieu. Ajouter l’héparine à 50 UI/mL et perfuse pendant 1 h à 2 mL/min à 37 ° C.
- Collecter 15 à 25 mL de sang frais (selon la longueur de la veine) d’un donneur en tubes vacutainer héparinés et diluer 1:1 avec la solution de Steen. Plus tard, ajouter dérivé de glande endocrine vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF-EG, 80 ng/mL), facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-b, 4 µL/mL) et l’acide acétyl salicylique (5 µg/mL).
- Placez le bioréacteur dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 et perfuse pendant 48 h à 2 mL/min.
- Environ après 12 h, déplacer le bioréacteur à un LAF armoire, prenez une goutte de sang et mesurer la glycémie à l’aide d’un dispositif de surveillance du glucose en sang. Si le niveau est inférieur à 3 mmol/L, ajouter le glucose à mettre de l’ordre de 7 à 9 mmol/L. répéter cette étape toutes les 8 à 12 h.
- Après 48 h, déplacer le bioréacteur dans les forces armées libanaises armoire et drainer le sang de bioréacteur. Ajouter 30 mL de solution stérile 7 et perfuse pour 5 min. égoutter la solution. Ajouter 30 mL de solution stérile 7 et perfuse pendant 5 min. de répéter deux fois ou jusqu'à ce que la couleur rouge sang est perdue.
Remarque : La biopsie peut être prise pour la vérification de la fixation des cellules. Déconnecter la veine, couper les bords de 5 mm de la veine avec des ciseaux et jetez-les. Prendre une biopsie, comme indiqué dans l’étape 5.2 et reconnecter la veine pour le bioréacteur (étape facultative). - Ajouter 30 à 45 mL de milieu endothéliale et perfuse pendant 96 h dans l’incubateur à 2 mL/min.
NOTE : Ajouter endothéliale moyenne jusqu'à ce que la veine est immergée. - Déplacer le bioréacteur dans l’armoire de la LAF, déconnecter la veine recellularized, couper 5 mm des bords de la veine à l’aide de ciseaux et jeter. Prendre une biopsie, comme indiqué dans l’étape 5.2.
8. vérification des Recellularization
- Suivez les instructions dans la section 6 et effectuer une coloration H & E. Examiner les lames au microscope la présence de cellules.
Representative Results
La morphologie d’une veine normale est lumière rouge (Figure 3 a). La couleur rouge est perdue dans les cycles de DÉCELLULARISATION progressive (cycle 2, Figure 3 b, cycle 3, Figure 3) et de la 5ème cycle, il semble pâle et blanc (Figure 3D). La veine recellularized après la perfusion sanguine (Figure 3E) et de la perfusion de médias endothéliales (Figure 3F) semble rouge vif dans la couleur. Les 5 cycles de traitement DÉCELLULARISATION correctement supprimé les cellules de la veine comme sans noyaux bleus coloration H & E (Figure 4 b) ont été observés. En revanche, plusieurs noyaux ont été observés dans la veine normale (Figure 4 a). La présence de cellules attachées sur la face luminale est vu dans la coloration H & E dans la veine recellularized de sang pendant 48 heures (Figure 4, flèches noires) et après perfusion avec le milieu endothélial pendant 96 h (Figure 3D, flèches noires).
Figure 1 : Assemblage de configurations de perfusion pour DÉCELLULARISATION. A) la photo montrant la configuration DÉCELLULARISATION assemblé 1 pour Triton X-100 et lavage. Les flèches blanches montrent la voie d’acheminement pour les solutions et les flèches rouges indiquent les entrées et sorties des veines et des solutions. B) l’image montrant la configuration de DÉCELLULARISATION assemblé 2 pour perfusion TnBP. De même, comme dans la configuration 1 de DÉCELLULARISATION, flèches blanches indiquent la voie d’acheminement pour les solutions et les flèches rouges indiquent les entrées et sorties des veines et des solutions. C) la photo montrant la configuration de DÉCELLULARISATION assemblé 3 pour perfusion désoxyribonucléase. Les flèches blanches montrent la voie d’acheminement pour les solutions et les flèches rouges indiquent les entrées pour la veine et de la solutions. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation et montage du bioréacteur pour recellularization. A) photo montrant les matériaux requis pour assembler le bioréacteur. B) photo de l’intérieur du capuchon 4 ports montrant l’emplacement des connecteurs (flèches rouges), de réduire points à relier la veine entrée et de sortie (flèches blanches) et de disposition des tubes, H, I et J. L’extrémité libre du tube H est placée dans le bioréacteur pour renvoyer des médias. C) les tubes respectifs va dedans et dehors peuvent être vu à partir du haut du cap de port 4. D) photo montrant le bioréacteur assemblé. E) photo montrant la configuration de bioréacteur ensemble avec la pompe péristaltique. Les tubes K étendent les connexions entre le bioréacteur et la pompe péristaltique. F) la représentation schématique du système de perfusion de bioréacteur ensemble. Les flèches orange indiquent la direction du flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Brut de morphologie des veines pendant DÉCELLULARISATION et recellularization. A) la morphologie générale de veine normale semble rouge vif dans la couleur. La couleur est perdue avec un nombre croissant de cycles DÉCELLULARISATION B) le cycle 2 et C) cycle 3. D) par 5 cycles, la veine semble pâle et blanc. La veine après perfusion avec E) sang pendant 48 h et F) avec le milieu endothélial pendant 96 h ressemble rouge une fois de plus vif dans la couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation des veines DECELLULARISE et recellularized. L’hématoxyline et éosine coloration image de A) veine normale contient plusieurs noyaux bleus, mais ils sont absents dans B) veine DECELLULARISE. Dans la veine recellularized avec C) sang pendant 48 h et avec D) endothéliale moyenne pendant 96 h, fixation des cellules (flèches noires) chez lumen a été remarqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
La technique présentée ici pour DÉCELLULARISATION des veines saphènes est une méthode facile, simple et rentable qui peut également être appliquée à toutes les veines de petit diamètre comme des veines ombilicales et mammaires. Les solutions de DÉCELLULARISATION et leurs concentrations utilisées dans cette méthode sont de notre précédent résultats6,7. Même si nous recommandons de 5 cycles de DÉCELLULARISATION, dans certaines veines nous avons remarqué également DÉCELLULARISATION complete en 3 cycles. Cependant, des résultats reproductibles ont été obtenues à l’aide de 5 cycles. Application de ce protocole, nous DECELLULARISE veines de différentes longueurs jusqu'à 30 cm avec succès (inédit de résultat). Sortie de la solution DÉCELLULARISATION de levage par 45 cm créera une pression de 33 mm Hg à l’intérieur de la veine. Dans notre expérience, nous avons remarqué cela comme une étape clé dans la decellularizing de la veine toute uniformément et reproductible en 5 cycles. La pression choisie est 3 fois plus élevée que la pression de la veine saphène interne normale (5 à 10 mmHg), mais est que le même qu’incompétents les veines (varices)23. En outre, nous croyons que cette haute pression créera une force importante sur les parois de la veine et qu’il peut, par conséquent, favoriser cellulaire efficace et plus rapide élimination.
Étant donné que TnBP est un solvant organique et insoluble dans l’eau, en remuant le détergent jusqu'à ce qu’il devienne trouble est important ; dans le cas contraire, le détergent flottera. Pour la même raison, pour garder TnBP mélangé en solution, tube de sortie de la lessive a été placé en haut de la Jarre de verre avec son raccord. Élimination efficace des TnBP de la veine après que son utilisation lors de chaque cycle peut être vu par l’absence de flottement TnBP gouttelettes dans l’eau de lavage. Nous avons également remarqué que sauter l’étape de DNase a également produit un tissu DECELLULARISE, mais dans certains cas, une teneur relativement élevée en ADN dans le tissu DECELLULARISE a été remarquée. Haute pression et des débits élevés ne sont pas requis pour une activité DNase efficace, un taux de perfusion faible (10 mL/min) peut être employé. Une pompe péristaltique différente a été utilisée comme sa petite taille permet une manipulation facile de l’installation. Étant donné que nous avons remarqué qu’un dommage de la plupart des cellules pendant résultats DÉCELLULARISATION au cycle 2, nous vous suggérons de sauter traitement DNase pendant les cycles 1 et 3 (résultats non publiés). Même si la caractérisation et la quantification des protéines de la matrice extracellulaire n’ont pas été effectuées dans ce manuscrit, notre expérience précédente avec des protocoles de DÉCELLULARISATION similaires a montré la conservation des propriétés biomécaniques, matrice extracellulaire protéines et structure7. Bien que nos expériences préliminaires de quantification avec ces veines produit un résultat similaire (inédit), nos résultats déjà publiés permettra de renforcer cette confiance.
Recellularization en utilisant le sang est un processus facile et pratique sur des cellules de moelle osseuse élargi tel qu’on peut éviter les longs temps d’expansion cellulaire, des mutations spontanées dans les cellules élargis, invasion chirurgicale et l’inconfort pour le patient. Comme il est connu qu’endothélialisation peut également résulter d’EPCs en circulation, nous avons supposé que la perfusion de sang suivie d’une perfusion avec endothéliale moyenne sera suffisant pour recellularization. La sécurité des tissus de veine à l’aide d’une méthode similaire est vu de bons résultats de la transplantation lorsque deux de ces veines ont été implantés dans les enfants avec obstruction de la veine porte hépatique supplémentaire7. Nous croyons que les facteurs de croissance dans la matrice extracellulaire DECELLULARISE permettra la fixation de l’EPCs de circulation du sang,24. Recellularization des veines selon un protocole similaire a montré des cellules positives pour les récepteurs VEGF-2 et cluster de différenciation (CD) 14 sur la lumière tout en CD45 cellules exprimant ont été observés chez adventice7. On imagine aussi qu’une couche endothéliale continue n’est pas observables dans tous les cas surtout lors de l’utilisation de sang de patients plus âgés et malades que l'on sait que ces personnes ont diminué de nombres de circulation de cellules progénitrices25. Cependant, nous postulons que la perfusion avec le propre du bénéficiaire sang peut masquer plusieurs des antigènes qui sont exposés en raison de DÉCELLULARISATION et peuvent donc diminuer les risques d’effets indésirables inflammatoires lorsque transplantés par opposition à transplanter seulement DECELLULARISE des vaisseaux sanguins. En outre, la perfusion sanguine peut déposer des niveaux accrus de facteurs de croissance sur la lumière et adventice, qui à son tour peut recruter un nombre accru de circulation entraînant un processus rapide de recellularization in vivodes cellules progénitrices.
Les avantages de la conception de bioréacteurs utilisés dans cette étude sont autoclave complet, facile à assembler, rapport coût/efficacité, maniabilité et risque moins de dommages. Dans notre expérience, à l’aide de la conception actuelle, veines jusqu'à 10 cm de longueur ont été recellularized. Même si les veines jusqu'à 25 cm de longueur peuvent également être recellularized en gardant la veine en forme de « U » dans le bioréacteur, cela doit être validé. La conception de bioréacteur montre que le sens d’écoulement dans la veine est contre la gravité et qu’il est conçu comme tel parce que c’est le sens normal de circulation pour ces veines chez les humains. La perfusion de 12 h de l’étape endothéliale moyenne est de préconditionner la veine et augmente l’affinité pour la fixation de l’EPCs entrants. Ajout d’héparine supplémentaire et la perfusion pendant 1 h réduira le risque de formation de caillots de sang dans les tubes au cours de la perfusion sanguine.
Le volume de sang nécessaire dépend de la longueur de la veine. Le principe fondamental que nous suivons pour le volume sanguin est que la veine doit être immergée dans le sang. Lors de la manipulation des volumes sanguins supérieure à 45 mL, le mélange occasionnels peut-être être nécessaires pour prévenir l’accumulation de cellules dans le fond du bioréacteur. Nous avons ajouté la solution de Steen au sang car il contient une grande quantité de protéines et composants requis pour maintenir les tissus sains au cours de l’organ transplantation26,27. Ajout du VEGF et b-FGF est bénéfique car ils sont de facteurs de croissance angiogéniques puissant28 et leur présence induit la migration, la prolifération et la différenciation de l’EPCs29,30,31,32 . Le montant du VEGF ajouté repose sur nos résultats inédits antérieurs où la prolifération des CPE a été observée à 80 ng/mL. Ajout de l’aspirine inhibe l’activation des plaquettes33 , réduisant ainsi les chances de leur attachement à la couche endothéliale. Une surveillance continue et l’addition de glucose sera aussi bénéfiques pour prévenir l’hémolyse des globules rouges et de la prolifération cellulaire.
Étant donné qu’un échantillon de sang simple est requis auprès du bénéficiaire, on peut considérer comme une procédure simple et réalisable, nécessitant une expertise technique moins. Même si, toute la procédure ci-contre du début à la fin prend 20 jours, stockant les veines DECELLULARISE comme un sur étagère produit raccourcira la procédure à 8 jours pour les patients. Bien que le stockage des veines DECELLULARISE techniquement ne devrait pas affecter l’efficacité de la recellularization, elle doit être évaluée. Veines tissulaire générées suite à cette procédure peuvent être utilisés à la clinique pour les chirurgies de pontage, remplaçant les veines obstruées, insuffisance veineuse, conduisant à des varices sans la nécessité d’une immunodépression et permettant ainsi une meilleure qualité de vie du patient.
Disclosures
SSH est titulaire partage en Verigraft, une entreprise qui a obtenu une licence de la technologie des vaisseaux sanguins en génie tissulaire. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le professeur Anders Jeppsson pour aider à fournir des vaisseaux sanguins utilisés dans les expériences. Cette étude a été financée par l’octroi de LUA ALF à SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
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