Summary
Qui, descriviamo un protocollo per la vena safena decellularizzazione utilizzando detergenti e ricellularizzazione tramite aspersione del sangue periferico e del mezzo endoteliale.
Abstract
Vascolare conduttori utilizzati durante le maggior parte delle operazioni chirurgiche vascolari sono innesti allogeneic o sintetici che spesso portano a complicazioni causate da immunosoppressione e scarsa pervietà. Ingegneria tissutale offre una nuova soluzione per generare gli innesti personalizzati con una matrice extracellulare naturale contenente cellule del destinatario utilizzando il metodo di decellularizzazione e ricellularizzazione. Vi mostriamo un metodo dettagliato per l'esecuzione di decellularizzazione della vena safena umana e ricellularizzazione per aspersione del sangue periferico. La vena era decellularized irrorante 1% Triton X-100, 1% tri-n-butil-fosfato (biologicamente) e 2.000 Kunitz unità della desossiribonucleasi (DNasi). X-100 Triton e attendersi sono stati irrorati a 35 mL/min per 4 h, mentre dnasi è stata irrorata a 10 mL/min a 37 ° C per 4 h. La vena è stata lavata in acqua ultrapura e PBS e poi sterilizzata in 0,1% di acido peracetico. Era ancora lavata in PBS e condizionato in mezzo endoteliale. La vena è stata collegata a un bioreattore e irrorata con endoteliale mezzo contenente 50 UI/mL eparina per 1 h. ricellularizzazione è stato effettuato compilando il bioreattore con sangue fresco, diluito 1:1 in soluzione di Steen, e aggiunta di ghiandola endocrina-derivata vascolare fattori di crescita endoteliali (80 ng/mL), fattori di crescita di base del fibroblasto (4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL). Il bioreattore fu poi spostato in un incubatore e irrorato per 48 h a 2 mL/min mantenendo glucosio tra 3-9 mmol/L. Più tardi, la vena era lavata con PBS, riempita con il mezzo di endoteliale ed irrorata per 96 h nell'incubatrice. Trattamento con Triton X-100, attendersi e dnasi decellularized La vena safena in 5 cicli. La vena decellularizzata sembrava bianca in contrasto con la normale e recellularized vene (rosso chiaro). L'ematossilina ed eosina (H & E) ha mostrato la presenza di nuclei solo nel normale, ma non nelle vene decellularizzate. Nella vena recellularized, H & E-macchiatura ha mostrato la presenza di cellule sulla superficie luminale della vena.
Introduction
Condotti vascolari sono necessari per parecchie circostanze cliniche come aneurismi, stenosi dell'arteria carotica e aterosclerosi che porta a gravi problemi vascolari. Per ripristinare l'apporto di sangue funzionale i chirurghi utilizzano condotti vascolari autologhi, trapianto allogeneic o sintetici. Anche se l'uso dei vasi sanguigni autologhi è ancora considerato l'approccio ideale, la disponibilità nei pazienti è majorly limitata. Le alternative quali gli innesti allogeneic o sintetiche hanno profondi problemi con trattamenti immunosoppressivi e scarsa pervietà che conduce il rifunzionamento1,2, conseguente salute maggiori oneri economici ai paesi. Ingegneria dei tessuti dei vasi sanguigni mira a fornire gli innesti con un'omologia naturale e cellule autologhe. Così, il sistema immunitario destinatario riconosce l'innesto trapiantato come lo sé e poiché tali un innesto contiene le proteine naturali e cellule nella configurazione originale, potrebbe funzionare meglio rispetto alle alternative attuali. Ingegneria tessutale organi, come la vescica3, l' uretra4, la trachea5e vene6,7, sono stati utilizzati con successo nella clinica.
Tessuto tecnico per produrre innesti personalizzati richiede un innesto da un donatore seguito da decellularizzazione e ricellularizzazione. Decellularizzazione è una tecnologia promettente per rimuovere le cellule da tessuti ed organi8,9,10. Decellularizzazione può essere eseguita dai metodi fisici, chimici ed enzimatici specifici11 o combinandoli. A un uso ottimale di questi metodi, tessuti decellularizzati possono avere simili proteine strutturali e funzionali in una tabella extracellulare simile ai tessuti nativi. Tali organi possiedono la capacità intrinseca di migliorare allegato, migrazione, proliferazione e differenziazione delle cellule staminali in arrivo.
Ricellularizzazione è un processo dinamico di semina di cellule nell'innesto, e cellule staminali destinatario può essere utilizzate per il trapianto clinico. Cellule staminali attualmente utilizzate per tali finalità includono del midollo osseo, mesenchimale e organo residenti3,5,6. Animale e orientata alla ricerca studi hanno utilizzato cellule staminali mesenchimali origini che sono pluripotenti indotte e fetale12,13,14. Questo processo richiede un bioreattore (una sezione che contiene la vena e fornisce le condizioni necessarie come temperatura, gas, pH e pressione), cellule e terreni di coltura. La sfida di ricellularizzazione è quello di ottenere il numero di cellule di un tipo particolare e una strategia di semina mediante il quale le cellule possono raggiungere intero tessuto o organo. Anche se non completa del tessuto o organo strutturalmente e funzionalmente è stato generato e valutato fino ad ora, diversi avanzamenti in campo ed i risultati iniziali mostrano la possibilità futura di15. La funzione del tasto della vena si trova nell'endotelio luminal che controlla l'infiltrazione delle cellule infiammatorie nei tessuti ed al livello medio del muscolo liscio che aiuta a costrizione e fornisce anche la forza per tenere la pressione sanguigna16. Gli studi hanno dimostrato che durante i danni, endotelizzazione si verifica da anastomosi o da cellule progenitrici endoteliali (EPC) in sangue17,18,19di circolazione. La nostra strategia per ricellularizzazione delle vene si basa sulle EPCs presenti nel sangue circolante.
Ingegneria tissutale di vene e arterie è stata eseguita da diversi gruppi che seguono diversi decellularizzazione e ricellularizzazione strategie20,21. Il nostro gruppo ha anche suonato e sviluppato strategie di decellularizzazione e ricellularizzazione per le vene iliache e mammario6,7. Decellularizzazione è stato effettuato dall'agitazione della vena in Triton X-100, tri-n-butil fosfato (biologicamente) e l'enzima desossiribonucleasi (DNasi). Il ricellularizzazione è stato effettuato utilizzando cellule di derivazione midollare muscolo endoteliale e liscio6 o7di sangue periferico. Le vene recellularized da entrambi i protocolli hanno mostrato promessa clinica nella fornitura di sangue funzionale nel trapianto di pazienti pediatrici con ostruzione extra epatica della vena portale6,7.
Attualmente abbiamo sviluppato una versione modificata dello stesso protocollo per le prestazioni migliorate e facile di decellularizzazione, ricellularizzazione e bioreattore manipolazione delle vene di piccolo diametro. L'attuale protocollo di decellularizzazione necessaria perfusione di detergenti tramite la vena usando pressione invece di agitazione con detergenti. Il protocollo di ricellularizzazione comporta un ulteriore passaggio di precondizionamento per migliorare l'adesione delle cellule e l'aggiunta di fattori di crescita nella circolazione sanguigna per migliorare l'adesione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Inoltre abbiamo migliorato il design del bioreattore utilizzando prodotti disponibili in commercio. In questa carta, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo modificato per l'esecuzione di decellularizzazione e ricellularizzazione delle vene safene umane.
Protocol
Il tessuto utilizzato, e il protocollo di questa carta segue le linee guida etiche dell'Università di Göteborg.
1. stoccaggio e preparazione tessuto
- Tagliare il tessuto circostante dalla vena safena estratto utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
Nota: La vena safena viene sezionata da arto inferiore degli esseri umani da chirurghi vascolari. La vena safena utilizzata in questa carta è una parte inutilizzata dopo intervento di bypass. - Per evitare perdite durante l'aspersione, lega i rami laterali alle loro estremità con suture ed il forcipe.
- Mantenere la vena in una provetta da 50 mL contenente 40 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Lavare la vena modificando PBS 2 - 3 volte per rimuovere il sangue in eccesso. Memorizzare la vena di congelamento a-80 ° C.
2. preparazione di decellularizzazione configurazioni e ricellularizzazione bioreattore
Nota: Utilizzando le forbici, tagliare i tubi in silicone come mostrato in tabella 1.
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Installazione di decellularizzazione 1 (per aspersione Triton X-100 e lavaggio)
- A un 2 L da camera (vasca di plastica), nastro tutti i tre pezzi di tubo A come mostrato in Figura 1A.
Nota: Nastro una provetta per una parete dove il bordo tocca il fondo della camera (ingresso di detersivo) e gli altri due tubi a parete opposta con una distanza di 5-10 cm in mezzo a seconda della lunghezza della vena. Almeno 5 cm di questi tubi dovrebbe essere registrata anche al piano della camera (di vena ingresso e uscita). - Utilizzando i connettori Luer maschi e femminili, collegare in serie dell'ingresso di detergente tubo B seguita da tubo F, tubo C e infine verso l'ingresso della vena. Posto il tubo F nel cassetto della peristaltica pompa io.
- Prendere un altro tubo C e collegare un'estremità alla presa di vena. Posizionare l'altra estremità nel vaso di vetro con l'uscita del tubo inferiore che è posto 45 cm sopra la camera (presa di detersivo) e nastro adesivo per fissare. Prendere metropolitana G e inserite un'estremità alla presa del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità della camera della vena.
Nota: Le immagini di installazione completa (frecce rosse), da camera e direzione di flusso (frecce bianche) sono mostrate in Figura 1A.
- A un 2 L da camera (vasca di plastica), nastro tutti i tre pezzi di tubo A come mostrato in Figura 1A.
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Installazione di decellularizzazione 2 (attendersi per aspersione)
- Prendete un vasetto di vetro 1L e inserire un'estremità del tubo C (aspirazione detergente) nel barattolo fino a quando il tubo tocca il fondo del vaso.
- Collegare l'altra estremità al tubo F seguita da tubo C. posto l'altra estremità del tubo C nel vaso fino a metà profondità (ingresso di vena). Inserire la cassetta della pompa peristaltica tubo F io.
- Tubo D di prendere e posizionare un'estremità nel vaso (presa di vena) fino a metà profondità e l'altra estremità nel vaso di vetro con il tubo inferiore posizionato ad un'altezza di 45 cm dall'ingresso di vena (presa di detersivo). Per proteggere, nastro tubi di aspirazione e mandata di detersivo.
- Mettere il barattolo di vetro 1L su un agitatore magnetico e tenere il magnete all'interno della bottiglia.
- Prendere metropolitana G e inserite un'estremità sull'uscita del tubo del vaso di vetro e inserire l'altra estremità nel vaso di vetro di 1 L.
Nota: L'immagine di installazione completa (frecce rosse), camera e flusso di direzione (frecce bianche) è mostrata in Figura 1B.
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Installazione di decellularizzazione 3 (aspersione per DNasi)
- Prendere un flacone di vetro da 250 mL e inserire la cassetta della pompa peristaltica II di entrambe le estremità del tubo C. posto l'area centrale del tubo.
Nota: Un'estremità del tubo è l'insenatura di soluzione e l'altra estremità del tubo è collegata all'ingresso di vena. Presa di vena è lasciato libero in soluzione. - Posizionare l'intero setup tra cui pompa a 37 ° C. L'immagine di installazione completa e la direzione del flusso è illustrato nella Figura 1.
- Prendere un flacone di vetro da 250 mL e inserire la cassetta della pompa peristaltica II di entrambe le estremità del tubo C. posto l'area centrale del tubo.
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Ricellularizzazione bioreattore
- Tenere pronto il tutto come mostrato in Figura 2A.
- Come mostrato nella Figura 2B, prendete il tappo 4-port e inserire ogni porta, H (presa di vena) del tubo, tubo I (ingresso media) e J (ingresso di vena) del tubo. Inserire l'altra estremità del tubo H nella porta 4th (organo di stampa).
Nota: La visualizzazione della PAC 4 porte dall'alto è illustrata nella Figura 2. Per un facile inserimento dei tubi, tagliare i bordi di una punta acuminata con una forbice. - Piegare l'altra estremità del tubo di J in una forma di U e legarla con un filo di sutura. Collegare i connettori riducendo all'estremità interna del tubo H & J.
- Inserire il tubo da 60 mL con una base piatta il flacone di vetro da 250 mL e poi inserire la configurazione fatta sopra il tubo come mostrato in Figura 2D. Come illustrato nella Figura 2E, collegare tubi K, E e K in serie. Collegare un tubo K all'ingresso di vena e un altro tubo K all'entrata del media.
Nota: Il diagramma schematico della installazione e direzione del flusso è visto in Figura 2F. - Sterilizzare in autoclave del bioreattore.
3. preparazione delle soluzioni
- Soluzione 1 (10 x acqua): A 1 L di acqua ultrapura, aggiungere 2 g di sodio azide e 18,6 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Mescolare fino a quando sali disciolti.
- Soluzione 2 (1 x acqua): prendere 100 mL di soluzione 1 e aggiungere 900 mL di acqua ultrapura.
- Soluzione 3 (5 x Triton X-100): A 950 mL di acqua ultrapura, aggiungere 50 mL di Triton X-100, 1 g di sodio azide e 9,3 g di EDTA. Mescolare fino a scioglimento.
- Soluzione 4 (1 x Triton X-100): prendere 200 mL di soluzione 3 e aggiungere 800 mL di acqua ultrapura.
- Soluzione 5 (1 x TnBP): aggiungere 10 mL di attendersi con una pipetta 10ml a 990 mL di soluzione 2.
- Soluzione 6 (40 Kunitz unità/mL DNasi): aggiungere 2.000 Kunitz unità di DNaseI in 50 mL di tampone fosfato salino di Dulbecco contenente CaCl2 e MgCl2. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.
- Soluzione 7 (PBS): Aggiungere 24 g di cloruro di sodio, 0,6 g di cloruro di potassio, 4,32 g di fosfato di sodio e 0,72 g di fosfato di potassio a 3 L di acqua ultrapura. Mescolare fino a scioglimento. Regolare il pH a 7.4. 1 L di PBS in autoclave di sterilizzare e conservare separatamente.
- Soluzione 8 (0,1% acido peracetico): 50 mL di soluzione sterile 7, aggiungere 50 µ l di acido peracetico. Preparare fresco e utilizzare immediatamente.
4. preparazione del mezzo endoteliale
- Aggiungere 5 mL di L-Glutammina, 5 mL di anti-anti, 50 mL di siero umano AB e tutti i componenti del kit di fattore di crescita di EGM-2 tranne siero bovino fetale per 500 mL di terreno MCDB131 sotto una cappa sterile.
5. decellularizzazione di vena safena
- Scongelare la vena safena umana da-80 ° C a temperatura ambiente. Congelare di nuovo a-80 ° C e ancora scongelare a temperatura ambiente.
- Tagliare una biopsia di 2 mm di lunghezza con le forbici e difficoltà in formaldeide per 24-48 h a temperatura ambiente. Fare ogni estremità della vena per gli strali di un connettore Luer maschio e femmina con una sutura.
- Collegare la vena al setup di decellularizzazione 1 e riempire 1 L di soluzione 2. Irrorare per 15 min a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.
- Aggiungere 1 L di soluzione 4 e irrorare per 4 h a 35 mL/min. svuotare il contenuto del setup.
- Aggiungere 500 mL di soluzione 2 e irrorare per 5 min. svuotare il contenuto del setup. Ripetere questo passaggio. Scollegare la vena dal setup di perfusione 1 e connettersi al programma di installazione di aspersione 2.
- Aggiungere 1 L di soluzione 5, accendere l'agitatore e irrorare per 4 h a 35 mL/min.
Nota: La soluzione 5 sembra nuvoloso dopo la svolta sull'agitatore e durante l'aspersione. - Scollegare la vena dal programma di installazione di aspersione 2 e lavare la vena dentro e fuori con siringa o una pipetta 10ml in 4 cambi di acqua ultrapura per 5-10 min.
- Collegare la vena alla installazione di aspersione 3, aggiungere 50 mL di soluzione 6 e irrorare a 10 mL/min in una camera a 37 ° C per 4 h. svuotare il contenuto del setup e scollegare la vena dal setup.
- Collegare la vena al setup di perfusione 1, riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare durante la notte a 35 mL/min. Ripetere il punto 5.4 al passaggio 5.9 4 volte (per un totale di 5 cicli). Prendere una biopsia nuovamente come indicato al punto 5.2.
Nota: Ignora passaggio 5,8 seconda parte nei cicli 1 e 3. - Svuotare il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 2 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 2 dopo 12 h. svuotare il contenuto del setup. Riempire 1L di acqua ultrapura e irrorare per 24 h a 35 mL/min cambia l'acqua ultrapura dopo 12 h.Empty il contenuto del setup. Riempire 1 L di soluzione 7 e irrorare per 24 h a 35 mL/min soluzione modifiche 7 dopo 12 ore.
6. Verifica di decellularizzazione
- Lavare la formalina riparata biopsie in acqua ultrapura per 15 min. di processo in un processatore di tessuti seguendo protocolli standard e incorporare in paraffina22.
- Tagliare 5 µm sezioni utilizzando un microtomo e macchia con hematoxylin e 0,2% alcolica eosina Meyer (H & E) seguire protocolli standard22.
- Mostra al microscopio per verificare la perdita dei nuclei nel tessuto decellularizzato rispetto al tessuto normale.
7. ricellularizzazione
- Sterilizzare la vena collocandolo in un tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione 8. Agitare a 80 giri al minuto (rpm) nello shaker per 1h a 37 ° C.
- Gestire la vena sotto il flusso laminare (LAF) d'ora in avanti per mantenere la sterilità. Trasferire la vena utilizzando pinze sterili per un nuovo tubo da 50 mL contenente 50 mL di soluzione sterile 7 e 500 µ l di anti-anti. Agitare come sopra per 12 h. Change soluzione 7 almeno due volte in mezzo.
- Utilizzando pinze sterili, la vena di trasferimento ad un nuovo tubo 50 mL ed aggiungere 50 mL di media endoteliale. Agitare come sopra per 11h.
- Assemblare il bioreattore utilizzando guanti sterili sotto la LAF armadietto. Legare la vena a vena entrata e di uscita con sutura sterile ed il forcipe del bioreattore.
- Collegare la vena per il bioreattore e riempire con lo stesso mezzo. Aggiungere eparina a 50 UI/mL e irrorare per 1 h a 2 mL/min a 37 ° C.
- Raccogliere 15-25 mL di sangue fresco (a seconda della lunghezza della vena) dal donatore in provette vacutainer eparina rivestito e diluire 1:1 con soluzione di Steen. Successivamente, aggiungere ghiandola endocrina vascolare endoteliale fattore di crescita derivato (EG-VEGF, 80 ng/mL), fattore di crescita di base del fibroblasto (b-FGF, 4 µ l/mL) e acido acetil salicilico (5 µ g/mL).
- Spostare il bioreattore in incubatore a 37 ° C con 5% CO2 e irrorare per 48 h a 2 mL/min.
- Circa dopo 12 h, spostare il bioreattore in un armadietto, LAF prendere una goccia di sangue e misurare il glucosio utilizzando una dispositivo di monitoraggio della glicemia. Se il livello è inferiore a 3 mmol/L, aggiungere glucosio per portare nella gamma di 7-9 mmol/L. Ripetere questo passaggio ogni 8-12 h.
- Dopo 48 h, spostare il bioreattore nella LAF armadietto e drenare il sangue dal bioreattore. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, scarico la soluzione. Aggiungere 30 mL di soluzione sterile 7 e irrorare per 5 min, Ripeti due volte o fino a quando il colore rosso sangue è perso.
Nota: La biopsia può essere presa per la verifica del collegamento della cella. Scollegare la vena, tagliare i bordi di 5 mm della vena con le forbici e gettarli. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2 e connettersi nuovamente la vena del bioreattore (passaggio facoltativo). - Aggiungere 30-45 mL di terreno endoteliale e irrorare per 96 h nell'incubatore a 2 mL/min.
Nota: Aggiungere endoteliale medio fino a quando la vena è sommerso. - Spostare il bioreattore nell'armadietto LAF, scollegare la vena recellularized, tagliare i bordi di 5 mm della vena utilizzando forbici e scartare. Prendere una biopsia come indicato al punto 5.2.
8. Verifica di ricellularizzazione
- Seguire le istruzioni nella sezione 6 ed eseguire colorazione H & E. Esaminare i vetrini al microscopio per la presenza di cellule.
Representative Results
La morfologia lorda di una vena normale è luce rossa (Figura 3A). Il colore rosso si perde nella progressiva decellularizzazione cicli (ciclo 2, Figura 3B; ciclo 3, Figura 3) e dal ciclo 5th , sembra pallido e bianco (Figura 3D). La vena recellularized dopo aspersione del sangue (Figura 3E) e media endoteliale perfusione (Figura 3F) sembra rosso luminoso a colori. I 5 cicli di trattamento di decellularizzazione rimosso con successo le cellule dalla vena come nessun nuclei blu nella macchiatura H & E (fig. 4B) sono stati veduti. Al contrario, parecchi nuclei sono stati veduti nella vena normale (Figura 4A). La presenza di cellule allegate dal lato luminal è visto nella macchiatura di H & E nella vena recellularized con sangue per 48 h (Figura 4, frecce nere) e dopo perfusione con il mezzo endoteliale per 96 h (Figura 3D, frecce nere).
Figura 1 : Montaggio delle configurazioni di perfusione per decellularizzati. A) l'immagine mostrando il programma di installazione di decellularizzazione assemblato 1 per Triton X-100 e lavatrice. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. B) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 2 per aspersione di attendersi. Allo stesso modo, come installazione di decellularizzazione 1, frecce bianche indicano il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano ingressi e uscite per vena e soluzioni. C) la foto che mostra l'installazione di decellularizzazione assemblato 3 per aspersione desossiribonucleasi. Le frecce bianche Visualizza il percorso del flusso per le soluzioni e le frecce rosse indicano insenature per vena e soluzioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Preparazione e montaggio del bioreattore per ricellularizzazione. A) foto che Mostra materiali necessari per il montaggio del bioreattore. B) foto della parte interna del tappo 4 porte mostrando il posizionamento di ridurre connettori (frecce rosse), punti per connetterti vena entrata e uscita (frecce bianche) e disposizione dei tubi H, I e J. L'estremità libera del tubo H viene inserito nel bioreattore per restituire i supporti. C) i rispettivi tubi andando dentro e fuori possono essere visto dal lato superiore di 4 Porto cap. D) foto che mostra il bioreattore assemblato. E) immagine che mostra l'installazione di bioreattore tutta con la pompa peristaltica. I tubi K estendono le connessioni da bioreattore per la pompa peristaltica. F) rappresentazione schematica del sistema di perfusione del bioreattore intero. Le frecce arancioni indicano la direzione del flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Lordo morfologia delle vene durante decellularizzazione e ricellularizzazione. A) la morfologia lorda del vena normale sembra rosso luminoso a colori. Il colore viene perso con un numero crescente di decellularizzazione cicli B) ciclo 2 e C) 3 del ciclo. D) By 5 cicli, la vena sembra pallido e bianco. La vena dopo che irrora con E) sangue per 48 h e F) con il mezzo endoteliale per 96 h sembra ancora una volta brillante rosso a colori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Caratterizzazione delle vene decellularizzate e recellularized. L'ematossilina ed eosina immagine di A) vena normale contiene molti nuclei blu ma sono assenti in B) vena decellularizzata. Nella vena recellularized con C) sangue per 48 h e con D) endoteliale medium per 96 h, collegamento delle cellule (frecce nere) presso lumen è stato notato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La tecnica qui presentata per decellularizzazione delle vene safene è un metodo facile, semplice e conveniente che può essere applicato anche a tutte le vene di piccolo diametro come vene ombelicali e mammarie. Le soluzioni di decellularizzazione e le relative concentrazioni utilizzati in questo metodo vengono dal nostro precedente Risultati6,7. Anche se si consiglia di 5 cicli di decellularizzazione, in alcune vene abbiamo anche notato decellularizzazione completa in 3 cicli. Tuttavia, sono stati ottenuti risultati riproducibili utilizzando 5 cicli. Applicazione del presente protocollo, abbiamo decellularized vene di varie lunghezze fino a 30 cm con successo (risultati non pubblicati). Presa della soluzione decellularizzazione di sollevamento da 45 centimetri creerà una pressione di 33 mmHg all'interno della vena. Nella nostra esperienza, abbiamo notato questo come un passo fondamentale in decellularizing la vena tutta in modo uniforme e riproducibile in 5 cicli. La pressione selezionata è 3 volte superiore rispetto alla pressione normale della vena safena (5-10 mmHg), ma è che lo stesso come incompetente vene (vene varicose)23. Inoltre, speculiamo che questa alta pressione creerà una forza significativa sulle pareti della vena e può, pertanto, aiutare nella rimozione delle cellule più veloce ed efficiente.
Poiché attendersi sono un solvente organico e insolubile in acqua, mescolando il detersivo fino a quando diventa nuvoloso è importante; in caso contrario, il detersivo galleggerà. Per lo stesso motivo, per mantenere attendersi miscelati in soluzione, tubo di uscita di detersivo è stato disposto nella parte superiore del vaso di vetro con l'uscita del tubo. Efficiente rimozione di attendersi dalla vena dopo l'utilizzo in ogni ciclo può essere visto dall'assenza di attendersi gocce nell'acqua lavata di galleggiamento. Abbiamo anche notato che saltando il passaggio della dnasi produsse anche un tessuto decellularizzato ma in alcuni casi, è stato notato un relativamente alto contenuto di DNA nel tessuto decellularizzato. Ad alta pressione e portate elevate non è richieste per attività di dnasi efficiente, può essere utilizzato un tasso di bassa perfusione (10 mL/min). Una pompa peristaltica differente è stata usata come relativo più piccolo formato aiuta in maneggevolezza del setup. Poiché abbiamo notato che il danno della maggior parte delle cellule durante risultati di decellularizzazione nel ciclo 2, ti consigliamo di saltare trattamento dnasi durante i cicli di 1 e 3 (risultati non pubblicati). Anche se la caratterizzazione e la quantificazione delle proteine della matrice extracellulare non sono stati eseguiti in questo manoscritto, la nostra esperienza precedente con protocolli simili di decellularizzazione ha mostrato la conservazione delle proprietà biomeccaniche, matrice extracellulare struttura e proteine7. Anche se i nostri esperimenti preliminari quantificazione con queste vene ha prodotto un risultato simile (non pubblicato), i nostri risultati già pubblicati rafforzerà questa fiducia.
Ricellularizzazione usando il sangue è un processo conveniente e facile sopra cellule del midollo osseo espanso come si può evitare lunghi tempi di espansione delle cellule, mutazioni spontanee in cellule espanse, invasione chirurgica ed il disagio per il paziente. Poiché è noto che endotelizzazione può verificarsi anche da circolanti EPCs, abbiamo supposto che l'aspersione con sangue seguita da perfusione con mezzo endoteliale sarà sufficiente per ricellularizzazione. La sicurezza dei tessuti vena progettati utilizzando un metodo simile è visto da risultati di successo del trapianto quando due tali vene sono state impiantate in bambini con l'ostruzione di vena porta extra7. Speculiamo che i fattori di crescita nella matrice extracellulare decellularizzato permetterà l'attaccamento di circolazione EPCs dal sangue24. Ricellularizzazione delle vene seguendo un protocollo simile ha mostrato le cellule positive per VEGF receptor-2 e cluster di differenziazione (CD) 14 sul lume mentre CD45 che esprimono le cellule sono state vedute nel adventitia7. Immaginiamo anche che un continuo dello strato endoteliale non può essere osservato in tutti i casi, soprattutto quando si utilizza sangue dai pazienti più anziani e malati, come è noto che tali individui hanno fatto diminuire i numeri di circolazione di cellule progenitrici25. Tuttavia, postuliamo che l'aspersione con proprie del destinatario sangue può mascherare molti degli antigeni che sono esposti a causa di decellularizzazione e così possono fare diminuire le probabilità di reazioni avverse infiammatorie quando trapiantate al contrario di trapiantare solo vasi sanguigni decellularizzati. Inoltre, aspersione di sangue possa depositare i livelli aumentati di fattori di crescita sul lume e il adventitia che a sua volta può reclutare numeri aumentati delle cellule progenitrici risultante in un rapido processo di ricellularizzazione in vivodi circolazione.
I vantaggi del design bioreattore utilizzato in questo studio sono completa sterilizzazione in autoclave, facilità di montaggio, economicità, maneggevolezza e la minor possibilità di danni. Nella nostra esperienza, utilizzando il design attuale, vene erano recellularized fino a 10 cm di lunghezza. Anche se le vene fino a 25 cm di lunghezza può anche essere recellularized mantenendo la vena a forma di "U" all'interno del bioreattore, questo deve essere convalidato. Il design di bioreattore dimostra che la direzione del flusso nella vena è contro la gravità ed è progettata come tale perché è la direzione normale del flusso per queste vene in esseri umani. La perfusione di 12h del passo medio endoteliale è presupposto la vena e aumentare l'affinità per il fissaggio di EPCs in arrivo. Aggiunta di eparina supplementare e perfusione per 1 h si abbassa il rischio di formare coaguli di sangue nei tubi durante l'aspersione di sangue.
Il volume di sangue necessaria dipende dalla lunghezza della vena. Il principio di base che seguiamo per volume di sangue è che la vena dovrebbe essere immersa nel sangue. Durante la gestione di volumi di sangue superiori a 45 mL, miscelazione occasionale potrebbe essere necessario per prevenire l'accumulo delle cellule nella parte inferiore del bioreattore. Abbiamo aggiunto la soluzione di Steen a sangue perché contiene una quantità elevata di proteine e componenti necessari per mantenere i tessuti sani durante organo trapianto26,27. Aggiunta di VEGF e FGF-b è vantaggioso in quanto si tratta di fattori di crescita angiogenici potente28 e la loro presenza induce la migrazione, proliferazione e differenziazione delle EPCs29,30,31,32 . La quantità di VEGF aggiunto si basa sui nostri precedenti risultati inediti dove la proliferazione delle EPCs è stato visto a 80 ng/mL. Aggiunta di aspirin inibisce l'attivazione delle piastrine33 diminuendo in tal modo le probabilità del loro attaccamento alla strato endoteliale. Monitoraggio continuo e l'aggiunta di glucosio sarà anche utile per la proliferazione cellulare e prevenire l'emolisi dei globuli rossi.
Poiché solo un campione di sangue semplice è richiesto dal destinatario, può essere considerato come una procedura facile e fattibile, che richiedono competenze meno tecniche. Anche se l'intera procedura mostrata qui dall'inizio alla fine dura 20 giorni, memorizzare le vene decellularizzate come un largo della piattaforma prodotto accorcerà la procedura per 8 giorni per i pazienti. Anche se il deposito delle vene decellularizzate tecnicamente non dovrebbe pregiudicare l'efficienza di ricellularizzazione, esso deve essere valutato. Tessutale vene generate seguendo questa procedura possono essere utilizzate in clinica per interventi chirurgici di bypass, sostituendo vene ostruite, insufficienza venosa, che porta alle vene varicose senza la necessità di immunosoppressione e fornendo così una migliore qualità di vita per il paziente.
Disclosures
SSH detiene quote in Verigraft, una società che ha concesso in licenza la tecnologia dei vasi sanguigni di ingegneria tissutale. Gli altri autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Professor Anders Jeppsson per aiuto con fornire vasi sanguigni utilizzati negli esperimenti. Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione LUA ALF a SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
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