Summary
Här beskriver vi ett protokoll för den ytlig ven decellularization med tvättmedel och recellularization av perfusion av perifert blod och det endothelial mediet.
Abstract
Vaskulär kraftledare används under de flesta vaskulär operationer är allogen eller syntetiska ympkvistar som ofta leder till komplikationer orsakade av immunsuppression och dålig patency. Vävnadsteknik erbjuder en ny lösning för att generera anpassade grafter med en naturlig extracellulär matrix som innehåller mottagarens celler med metoden decellularization och recellularization. Vi visar en detaljerad metod för att utföra decellularization av mänskliga ytlig ven och recellularization av perfusionen i perifert blod. Venen var cell-lösa startas 1% Triton x-100, 1% tri-n-butyl-fosfat (TnBP) och 2 000 Kunitz enheter av deoxyribonuclease (DNase). Triton x-100 och ensamt var perfusion vid 35 mL/min för 4 h medan DNAS var perfusion på 10 mL/min vid 37 ° C i 4 h. Venen tvättades i ultrarent vatten och PBS och sedan steriliseras i 0,1% Perättiksyra. Det var tvättas igen i PBS och konditioneras i endotel medium. Venen var ansluten till en bioreaktor och perfusion med endothelial medium innehållande 50 IE/mL heparin för 1 h. Recellularization utfördes genom att fylla den bioreaktor med färskt blod, utspädd 1:1 i Steen lösning och lägga till endokrin körtel-derived vaskulär endotel tillväxtfaktor (80 ng/mL), basic fibroblast tillväxtfaktor (4 µL/mL) och acetyl salicylsyra (5 µg/mL). Bioreaktor sedan flyttades till en inkubator och perfusion för 48 h på 2 mL/min samtidigt som glukos mellan 3-9 mmol/L. Senare, venen tvättas med PBS, fylldes med endothelial medium och perfusion för 96 h i inkubatorn. Behandling med Triton x-100, ensamt och DNAS decellularized den ytlig ven i 5 cykler. Cell-lösa venen såg vita i motsats till normala och recellularized vener (ljusröd). Den hematoxylin och eosin (H & E) färgning visade förekomst av atomkärnor endast i normal men inte i cell-lösa vener. I recellularized anda visade H & E-färgning närvaron av celler på luminala ytan av venen.
Introduction
Vaskulär conduits krävs för flera kliniska tillstånd som aneurysm, halspulsådern stenos och åderförkalkning som leder till allvarliga vaskulära problem. Kirurger använder autologa, allogena eller syntetiska vaskulär conduits för att återställa funktionella blodtillförseln. Även om användningen av autologt blod fartyg anses fortfarande vara den idealiska strategin, begränsas majorly tillgängligheten hos patienter. Alternativen som allogen eller syntetiska transplantat har djupgående problem med immunsuppressiva behandlingar och dålig patency leder till omoperation1,2, vilket resulterar i stora ekonomiska bördor till länder. Vävnadsteknik av blodkärl syftar till att ge grafter med en naturlig homologi och autologa celler. Således, mottagarens immunsystemet erkänner transplanterade transplantat som jaget och eftersom sådana ett transplantat innehåller naturliga proteiner och celler i den ursprungliga konfigurationen, det kanske fungerar bättre i jämförelse med de aktuella alternativen. Vävnadstekniska organ, såsom urinblåsan3, urinröret4, luftstrupen5och vener6,7, har använts framgångsrikt i kliniken.
Tissue engineering för att producera personlig transplantat kräver ett transplantat från en donator som följt av decellularization och recellularization. Decellularization är en lovande teknik för att ta bort celler från vävnader och organ8,9,10. Decellularization kan utföras genom särskilda fysiska, kemiska och enzymatiska metoder11 eller kombinera dem. På optimal användning av dessa metoder, kan cell-lösa vävnader ha liknande strukturella och funktionella proteiner i en extracellulär matrix som liknar infödda vävnader. Sådana organ besitter inneboende kapacitet att förbättra fastsättning, migration, proliferation och differentiering av inkommande stamceller.
Recellularization är en dynamisk process av sådd celler i transplantatet och mottagarens stamceller kan användas för kliniska transplantationer. Stamceller som för närvarande används för sådana ändamål inkluderar benmärg, mesenkymala och orgel invånare3,5,6. Djur och forskningsinriktade studier har använt stamceller från mesenkymala ursprung som är fostrets och inducerade pluripotenta12,13,14. Denna process kräver en bioreaktor (en kammare som rymmer venen och ger nödvändiga förutsättningar som temperatur, gaser, pH och tryck), celler och kultur media. Utmaningen i recellularization är att uppnå erforderligt antal celler av en viss typ och en sådd strategi genom vilken celler kan nå hela vävnad eller organ. Även om ingen komplett vävnad eller organ strukturellt och funktionellt har genererats och utvärderats hittills, visar flera framsteg på området och de första resultaten de framtida möjlighet15. Den viktigaste funktionen av ven ligger i luminala endotel som styr infiltration av inflammatoriska celler i vävnader och det mellersta muskulatur skikt som hjälper i sammandragning och ger också styrka att hålla blodtrycket16. Studier har visat att under skada, endothelialization sker antingen från anastomos eller från cirkulerande endotelceller stamceller (EPC) i blod17,18,19. Vår strategi för recellularization av vener är beroende av EPCs närvarande i cirkulerande blod.
Vävnadsteknik vener och artärer framfördes av flera grupper efter olika decellularization och recellularization strategier20,21. Vår grupp har också utfört och utvecklat decellularization och recellularization strategier för iliaca och mjölkkörtlar vener6,7. Decellularization utfördes av agitation av venen i Triton X-100, tri-n-butyl fosfat (TnBP) och enzymet deoxyribonuclease (DNase). Recellularization utfördes med hjälp av antingen benmärgen härrör endothelial och smidig muskel celler6 eller perifert blod7. Venerna recellularized av antingen protokollet visade kliniska löfte att tillhandahålla funktionell blodtillförsel i transplantation av pediatriska patienter med extra nedsatt portvenen obstruktion6,7.
För närvarande har vi utvecklat en modifierad version av samma protokoll för den förbättrade och lätt decellularization, recellularization och bioreaktor hantering av liten diameter vener. Det nuvarande decellularization-protokollet krävs perfusion av rengöringsmedel genom venen med trycket istället för agitation med rengöringsmedel. Recellularization protokollet innebär ytterligare ett steg av prekonditionering för att förbättra celladhesion och tillägg av tillväxtfaktorer i cirkulerande blod för att förbättra celladhesion, överlevnad och spridning. Vi har också förbättrat utformningen av den bioreaktor som använder kommersiellt tillgängliga produkter. I detta papper presentera vi en detaljerad beskrivning av det modifierade protokollet för att utföra decellularization och recellularization av mänskliga ytlig venerna.
Protocol
Vävnaden används, och protokollet av detta papper följer de etiska riktlinjerna för Göteborgs universitet.
1. vävnad beredning och förvaring
- Skär den omgivande vävnaden från den Hämtad ytlig ven med kirurgisk pincett och sax.
Obs: Den ytlig ven är dissekerade från nedre extremiteterna av människor av kärlkirurger. Den ytlig ven som används i denna uppsats är en oanvända del efter bypassoperation. - För att förhindra läckage under perfusion, ligera alla sida grenar i ändarna med suturer och pincett.
- Hålla ven i en 50 mL tub som innehåller 40 mL fosfat buffert saltlösning (PBS). Tvätta i venen genom att ändra PBS 2 - 3 gånger att ta bort överflödigt blod. Lagra i venen genom frysning vid-80 ° C.
2. förberedelse av Decellularization uppställningar och Recellularization bioreaktor
Obs: Med sax, klippa kisel rören som visas i tabell 1.
-
Decellularization Setup 1 (för Triton x-100 perfusion och tvätt)
- Till en 2 L kammare (plast badkar), tejpa alla tre bitar av röret A visas i figur 1A.
Obs: Tejpa en tub till ena väggen där kanten vidrör botten av kammaren (tvättmedels inlopp) och de övriga två rören till den motsatta väggen med ett avstånd på 5-10 cm i mellan beroende på längden av venen. Minst 5 cm av dessa rör bör också tejpas till avdelningens golv (ven inlopp och utlopp). - Använd de manliga och kvinnliga Luer-kopplingarna, Anslut i serien tvättmedels inlopp röret till röret B följt av tube F, tube C och slutligen till ven inlopp. Plats röret F i kassetten av den peristaltiska pumpen jag.
- Ta en annan tube C och Anslut ena änden till venens outlet. Placera den andra änden i glasburken med utloppet botten slang som placeras 45 cm ovan kammaren (tvättmedel utlopp) och Tejpa fast den säkra. Ta tube G och tryck in ena änden i glasburken slang utlopp och placera den andra änden i ven kammaren.
Obs: Bilderna av fullständig installation (röda pilar), kammare och flödesriktning (vita pilar) visas i figur 1A.
- Till en 2 L kammare (plast badkar), tejpa alla tre bitar av röret A visas i figur 1A.
-
Decellularization Setup 2 (för ensamt perfusion)
- Ta en 1 L glasburk, och placera ena änden av röret C (tvättmedel intag) i burken tills röret vidrör burkens botten.
- Anslut den andra ändan till röret F följt av tube C. plats i andra änden av röret C i burken tills halv djup (ven inlopp). Placera röret F i kassetten av peristaltiska pumpen jag.
- Ta tube D och placera ena änden i burken (ven utlopp) till halva djupet och den andra ändan i glasburken med botten slangen placeras på en 45 cm höjd från venens inlopp (tvättmedel utlopp). För att säkra, tejpa tvättmedels inlopp och utlopp rör.
- Placera 1 L glasburken på en magnetisk omrörare och håll magneten inuti flaskan.
- Ta tube G och tryck ena änden på slangen utlopp glasburken och placera den andra änden i 1 L glasburk.
Obs: Bilden av fullständig installation (röda pilar), kammare och flöde riktning (vita pilar) visas i figur 1B.
-
Decellularization Setup 3 (för DNAS perfusion)
- Ta en 250 mL-flaska och placera båda ändarna av röret C. plats det mellersta området av röret i kassetten av peristaltiska pumpen II.
Obs: Ena änden av röret är inloppet till lösning och den andra änden av slangen är ansluten till den ven inlopp. Venens outlet lämnas fri i lösning. - Placera hela installationen inklusive vattenpump vid 37 ° C. Bilden av fullständig installation och flödesriktning visas i figur 1 c.
- Ta en 250 mL-flaska och placera båda ändarna av röret C. plats det mellersta området av röret i kassetten av peristaltiska pumpen II.
-
Recellularization bioreaktor
- Håll redo alla delar som visas i figur 2A.
- Som visas i figur 2B, ta 4-port locket och in i varje port, tube H (ven utlopp), rör jag (media inlopp) och tube J (ven inlopp). Sätt den andra änden av röret H i 4th porten (media utlopp).
Obs: Beskåda av 4-port locket uppifrån visas i figur 2 c. För enkel insättning av rör, Klipp kanterna till en skarp spets med en sax. - Böj den andra änden av röret J till en U-form och knyta den med en sutur. Anslut minska kontakterna till inre ändarna av rören H & J.
- Placera 60 mL röret med en platt bas i 250 mL glasflaska och placera den ovan gjorda inställningen i röret som visas i figur 2D. Som visas i figur 2E, Anslut rören K, E och K i serien. Anslut en röret K till venens inlopp och en annan röret K till inloppet till media.
Obs: En schematisk bild av inställning, och flödesriktning ses i figur 2F. - Sterilisera bioreaktor i autoklav.
3. beredning av lösningar
- Lösning 1 (10 x vatten): till 1 L ultrarent vatten, tillsätt 2 g natriumazid och 18,6 g etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA). Rör tills salter löses.
- Lösning 2 (1 x vatten): ta 100 mL lösning 1 och tillsätt 900 mL ultrarent vatten.
- Lösning 3 (5 x Triton x-100): 950 mL av ultrarent vatten, tillsätt 50 mL Triton x-100, 1 g av natriumazid och 9,3 g EDTA. Rör tills upplöst.
- Lösning 4 (1 x Triton x-100): ta 200 mL lösning 3 och lägga 800 mL ultrarent vatten.
- Lösning 5 (1 x TnBP): tillsätt 10 mL av TnBP med en 10 mL pipett till 990 mL lösning 2.
- Lösning 6 (40 Kunitz enheter/mL DNase): lägga till 2,000 Kunitz enheter av DNaseI i 50 mL Dulbeccos fosfat buffert saltlösning som innehåller CaCl2 och MgCl2. Förbereda färska och Använd omedelbart.
- Lösning 7 (PBS): Lägga till 24 g natriumklorid, 0.6 g kaliumklorid, 4,32 g natriumfosfat och 0.72 g kaliumfosfat i 3 L av ultrarent vatten. Rör tills upplöst. Justera pH till 7,4. Sterilisera 1 L PBS i autoklav och förvaras separat.
- Lösning 8 (0,1% Perättiksyra): till 50 mL steril lösning 7, tillsätt 50 µL av Perättiksyra. Förbereda färska och Använd omedelbart.
4. beredning av Endothelial Medium
- Tillsätt 5 mL av L-glutamin, 5 mL anti anti, 50 mL humant AB serum och alla komponenter i extra bolagsstämma-2 tillväxtfaktor kit utom fetalt bovint serum till 500 mL av det MCDB131 mediet under en steril huv.
5. decellularization av ytlig ven
- Tina den mänskliga ytlig ven från-80 ° C rumstemperatur. Frysa igen vid-80 ° C och Tina igen i rumstemperatur.
- Skär en biopsi av 2 mm längd med sax och fixa i formaldehyd för 24-48 h i rumstemperatur. Knyt ändarna på ven till hullingar av en manlig och kvinnlig luerfattningen med en sutur.
- Anslut ven till decellularization setup 1 och fyll 1 L lösning 2. BEGJUTA för 15 min på 35 mL/min. Töm innehållet i installationen.
- Tillsätt 1 L lösning 4 och BEGJUTA för 4 h på 35 mL/min. Töm innehållet i installationen.
- Tillsätt 500 mL lösning 2 och BEGJUTA för 5 min. Töm innehållet i installationen. Upprepa detta steg. Koppla från venen från perfusion setup 1 och Anslut till perfusion setup 2.
- Tillsätt 1 L lösning 5, aktivera omröraren och BEGJUTA för 4 h på 35 mL/min.
Obs: Lösning 5 ser grumlig ut efter svarvning på omröraren och hela perfusion. - Koppla från venen från perfusion setup 2 och tvätta ven utanför och inuti med spruta eller pipett 10 mL 4 förändringar av ultrarent vatten för 5-10 min.
- Anslut venen till perfusion setup 3, tillsätt 50 mL lösning 6 och BEGJUTA på 10 mL/min hos en 37 ° C kammare för 4 h. tömma innehållet i installationen och kopplar från venen i installationen.
- Anslut ven till perfusion setup 1, Fyll 1 L lösning 2 och BEGJUTA över natten på 35 mL/min. Upprepa steg 5,4 till 5,9 4 gånger (för sammanlagt 5 cykler). Ta en biopsi igen som anges i steg 5.2.
Obs: Hoppa över steg 5,8 andra delen i cykler 1 och 3. - Töm innehållet i installationen. Fyll 1 L lösning 2 och BEGJUTA för 24 h vid 35 mL/min. förändring lösning 2 efter 12 h. tömma innehållet i installationen. Fyll 1L av ultrarent vatten och BEGJUTA för 24 h vid 35 mL/min. Byt ultrarent vatten efter 12 h.Empty innehållet i installationen. Fyll 1 L lösning 7 och BEGJUTA för 24 h vid 35 mL/min. förändring lösning 7 efter 12 h.
6. kontroll av Decellularization
- Tvätta de formalinbeständiga biopsier i ultrarent vatten för 15 min. processen i en vävnadsprocessor efter standardprotokoll och bädda in i paraffin22.
- Skär 5 µm sektioner med en mikrotom och fläcken med Meyers hematoxylin och 0,2% alkohol eosin (H & E) följande standardprotokoll22.
- Visa under ett mikroskop för att kontrollera för förlust av atomkärnor i cell-lösa vävnad jämfört med normal vävnad.
7. recellularization
- Sterilisera i venen genom att placera det i en 50 mL tub innehållande 50 mL lösning 8. Agitera på 80 varv per minut (rpm) i shakern för 1 h vid 37 ° C.
- Hantera ven under den laminärt flöden (LAF) skåp från nu på för att upprätthålla sterilitet. Överföra venen med steril pincett till en ny 50 mL tub innehållande 50 mL steril lösning 7 och 500 µL anti anti. Agitera som ovan för 12 h. förändring lösning 7 minst två gånger i mellan.
- Med hjälp av steril pincett, överföra venen till en ny 50 mL tub och tillsätt 50 mL av endothelial media. Agitera som ovan för 11 h.
- Montera den bioreaktor som använder sterila handskar under LAF skåp. Knyt ven till bioreaktor ven inlopp och utlopp med steril suturen och pincett.
- Anslut ven till bioreaktor och fyll den med samma medium. Lägg till heparin på 50 IU/mL och BEGJUTA för 1 h på 2 mL/min i 37 ° C.
- Samla 15-25 mL av färskt blod (beroende på den ven längd) från givaren i heparin belagda vacutainer rör och späd 1:1 med Steen solution. Senare lägga till endokrin körtel-derived vaskulär endotel tillväxtfaktor (EG-VEGF, 80 ng/mL), basic fibroblast tillväxtfaktor (b-FGF, 4 µL/mL) och acetyl salicylsyra (5 µg/mL).
- Flytta bioreaktor till en 37 ° C inkubator med 5% CO2 och BEGJUTA för 48 h på 2 mL/min.
- Ungefär efter 12 h, flytta bioreaktor till en LAF skåp, ta en droppe blod och mäta glukos använder en blodsocker övervaka enheten. Om nivån är mindre än 3 mmol/L, lägga till glukos att föra i intervallet 7-9 mmol/L. Upprepa detta steg varje 8-12 h.
- Efter 48 h, flytta bioreaktor in LAF skåp och rinna blod från bioreaktor. Tillsätt 30 mL steril lösning 7 och BEGJUTA för 5 min. avlopp lösningen. Tillsätt 30 mL steril lösning 7 och BEGJUTA för 5 min. Upprepa två gånger eller tills den röda färgen är förlorad.
Obs: Biopsin kan tas för kontroll av cell fastsättning. Koppla från venen, klippa 5 mm kanter av ven med sax och kassera dem. Ta en biopsi som anges i steg 5.2 och ansluta ven igen till bioreaktor (valfritt steg). - Lägg till 30-45 mL endothelial medium och BEGJUTA för 96 h i inkubatorn på 2 mL/min.
Obs: Tillsätt endothelial medium tills venen är nedsänkt. - Flytta bioreaktor i LAF skåp, koppla bort den recellularized ven, skär 5 mm kanter av ven med sax och kassera. Ta en biopsi som anges i steg 5.2.
8. verifiering av Recellularization
- Följ instruktionerna i avsnitt 6 och utföra H & E färgning. Granska bilderna i Mikroskop för förekomst av celler.
Representative Results
Av en normal ven brutto morfologi är ljus röd (figur 3A). Den röda färgen försvinner i progressiva decellularization cykler (cykel 2, figur 3B; cykel 3, figur 3 c) och av 5th cykeln, det ser blek och vit (figur 3D). Den recellularized ven efter blodgenomströmning (figur 3E) och endotel media perfusion (figur 3F) ser klarröd i färgen. 5 cykler av decellularization behandling bort framgångsrikt cellerna från venen som ingen blå kärnor i den H & E färgning (figur 4B) sågs. Däremot sågs flera kärnor i den normala ven (figur 4A). Förekomsten av kopplade celler på luminala sida ses i H & E färgning i recellularized anda med blod för 48 h (figur 4 c, svarta pilar) och efter perfusion med det endothelial mediet för 96 h (figur 3D, svarta pilar).
Figur 1 : Montering av perfusion uppställningar för decellularization. A) bilden visar den monterade decellularization setup 1 för Triton x-100 och tvätt. De vita pilarna visar flödet sökvägen för lösningar och röda pilar indikerar vikar och avsättningsmöjligheter för ven och lösningar. B) bilden visar den monterade decellularization setup 2 för ensamt perfusion. På samma sätt som i decellularization setup 1, vita pilarna anger flödet sökvägen för lösningar och röda pilar indikerar vikar och avsättningsmöjligheter för ven och lösningar. C) bilden visar den monterade decellularization setup 3 för deoxyribonuclease perfusion. De vita pilarna visar flödet sökvägen för lösningar och röda pilar indikerar vikar för ven och lösningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Beredning och montering av bioreaktor för recellularization. A) bild visar material som krävs för montering i bioreaktor. B) bild av insidan av 4-port cap visar placeringen av minska kopplingar (röda pilar), pekar för att ansluta ven inlopp och utlopp (vita pilar) och arrangemang av rör H, jag och J. Den fria änden av röret H placeras i den bioreaktor återvända media. C) respektive rören går in och ut kan ses från ovansidan av 4 port cap. D) bilden visar den monterade bioreaktor. E) bild visar hela bioreaktor setup med den peristaltiska pumpen. Rören K förlänga anslutningar från bioreaktor till den peristaltiska pumpen. F) den schematiska framställningen av hela bioreaktor perfusion system. Orange pilarna anger flödesriktningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Brutto morfologi av vener under decellularization och recellularization. A) brutto morfologi av normal ven ser klarröd i färgen. Färgen är förlorade med ökande antal decellularization cykler B) cykel 2 och C) cykel 3. D) av 5 cykler, ven ser blek och vit. Venen efter startas med E) blod för 48 h och F) med det endothelial mediet för 96 h ser återigen klarröd i färgen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Karakterisering av cell-lösa och recellularized vener. Den hematoxylin och eosin färgning bild av (A) normal ven innehåller många blå kärnor men de är frånvarande i (B) cell-lösa ven. I samma anda som recellularized med C) blod för 48 h och med D) endothelial medium för 96 h, fastsättning av celler (svarta pilar) på lumen märktes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Tekniken presenteras här för decellularization av ytlig venerna är en lätt, enkel och kostnadseffektiv metod som också kan tillämpas på alla liten diameter vener som navelsträngen och mjölkkörtlar vener. De decellularization lösningarna och deras koncentrationer som används i denna metod är från våra tidigare resultat6,7. Även om vi rekommenderar 5 cykler av decellularization, i vissa vener märkte också vi kompletta decellularization i 3 cykler. Reproducerbara resultat erhölls dock med hjälp av 5 cykler. Tillämpningen av detta protokoll skall vi cell-lösa venerna i varierande längder upp till 30 cm framgångsrikt (opublicerade resultat). Lyft decellularization lösningens utlopp genom 45 cm kommer att skapa ett tryck på 33 mmHg inuti venen. Vår erfarenhet märkte vi detta som ett viktigt steg i decellularizing hela venen jämnt och reproducibly 5 cykler. Valda trycket är 3 gånger högre än normala ytlig ven trycket (5-10 mmHg) men är samma som inkompetent vener (åderbråck)23. Dessutom kan spekulera vi att det höga trycket kommer att skapa en betydande kraft på ven väggar och får därför stöd i effektivare och snabbare cell borttagning.
Eftersom TnBP är ett organiskt lösningsmedel och olöslig i vatten, omrörning tvättmedlet tills det blir molnigt är viktigt; annars flyter tvättmedel. Av samma anledning, för att hålla TnBP blandas i lösning, placerades tvättmedels outlet tube överst i glasburken med slang utloppet. Effektiv borttagning av TnBP från venen efter dess användning i varje cykel kan ses av avsaknaden av flytande TnBP droppar i tvättad vattnet. Vi har också märkt att hoppa över steget DNAS producerade också en cell-lösa vävnad men i några fall, märktes en jämförelsevis hög DNA-innehåll i cell-lösa vävnaden. Som högt tryck och höga flöden inte krävs för effektiv DNAS aktivitet, kan en låg perfusion hastighet (10 mL/min) användas. En annan peristaltiska pumpen användes som dess mindre storlek bidrar till smidig hantering av installationen. Eftersom vi märkt att skador av de flesta celler under decellularization resultat i cykel 2, föreslår vi att hoppa DNAS behandling under cykler 1 och 3 (opublicerade resultat). Även om karakterisering och kvantifiering av extracellulära matrix proteiner inte utfördes i detta manuskript, vår tidigare erfarenhet av liknande decellularization protokoll visade bevarandet av biomekaniska egenskaper, extracellulär matrix struktur och proteiner7. Men våra preliminära kvantifiering experiment med dessa vener produceras ett liknande resultat (opublicerade), kommer att våra redan publicerade resultat stärka detta förtroende.
Recellularization med blod är en bekväm och enkel process över benmärgsceller expanderat som man kan undvika långa cellen expansion gånger, spontana mutationer i utökad celler, kirurgiska invasion och obehag för patienten. Eftersom det är känt att endothelialization kan också uppstå från cirkulerande EPCs, vi hypotesen att perfusion med blod följt av perfusion med endothelial medium kommer räcka för recellularization. Säkerheten för ven vävnader konstruerad med en liknande metod ses från framgångsrika resultaten av transplantation när två sådana vener var implanteras i barn med extra nedsatt portvenen obstruktion7. Vi spekulerar i att tillväxtfaktorerna i cell-lösa extracellulära matrix kommer att möjliggöra fastsättning av cirkulerande EPCs från blod24. Recellularization i venerna efter en liknande protokoll visade celler positivt för VEGF-receptor-2 och kluster av differentiering (CD) 14 på lumen medan CD45 uttrycker celler sågs i adventitia7. Vi har också tänka sig att en kontinuerlig endothelial lagret inte kan observeras i alla fall speciellt när man använder blod från äldre och sjuka patienter eftersom det är känt att sådana individer har minskat antalet cirkulerande stamceller celler25. Vi antar att perfusion med mottagarens eget blod kan dölja många av de antigener som är utsatta på grund av decellularization och kan därför minska risken för inflammatoriska biverkningar när transplanterade i motsats till omplantering endast cell-lösa blodkärl. Dessutom kan blodgenomströmning insättning ökade nivåer av tillväxtfaktorer på lumen och adventitia som i sin tur kan rekrytera ökade antalet cirkulerande stamceller som resulterar i en snabb process av recellularization i vivo.
Fördelarna med den bioreaktor design används i denna studie är komplett autoklavering, enkel montering, kostnadseffektivitet, enkel hantering och minst möjligheten till skada. Vår erfarenhet använder nuvarande design, vener upp till 10 cm i längd var recellularized. Även om vener upp till 25 cm i längd kan också vara recellularized genom att hålla ven i ”U”-formen inuti bioreaktor, detta ska valideras. Bioreaktor design visar att flödesriktningen i venen är mot gravitationen och är utformad som sådant eftersom det är den normala riktningen av flödet för dessa vener hos människor. 12 h perfusionen av endothelial medium steget är att förutsättning venen och öka affinitet för fastsättning av inkommande EPCs. Tillägg av extra heparin och perfusion för 1 h kommer risken att bilda blodproppar i rören under blodgenomströmning.
Volymen av blod som krävs är beroende av längden på venen. Den grundläggande principen vi följer för blodvolym är att venen bör vara nersänkt i blod. Vid hantering av blod-volymer som är större än 45 mL, kan tillfällig blandning krävas för att förhindra cell ackumulering i botten av bioreaktor. Vi lagt till Steen lösning på blod eftersom den innehåller en hög mängd proteiner och komponenter som krävs för att underhålla vävnader friska under organtransplantation26,27. Tillägg av VEGF och b-FGF är fördelaktigt eftersom de är potenta angiogena tillväxtfaktorer28 och deras närvaro inducerar migration, proliferation och differentiering av EPCs29,30,31,32 . Mängden VEGF lagt till bygger på våra tidigare opublicerade resultat där spridningen av EPCs sågs vid 80 ng/mL. Tillägg av acetylsalicylsyra hämmar aktiveringen av trombocyter33 vilket minskar chanserna för deras fastsättning endothelial lagret. Kontinuerlig övervakning och tillsats av glukos kommer också vara fördelaktigt för cellproliferation och förhindra hemolys av röda blodkroppar.
Eftersom det krävs endast ett enkelt blodprov från mottagaren, kan det betraktas som ett enkelt och genomförbart förfarande som kräver mindre teknisk expertis. Även om hela proceduren visas här från början till slut tar 20 dagar, lagra cell-lösa venerna som en från hyllan produkt kommer att förkorta förfarandet till 8 dagar för patienter. Även lagring av cell-lösa vener tekniskt inte bör påverka recellularization effektivitet, måste det utvärderas. Vävnadstekniska vener genereras följande procedur kan användas i kliniken för bypass operationer, ersätter blockerade vener, venös insufficiens leder till åderbråck utan behov av immunsystemet och vilket ger en bättre kvalitet på liv för patienten.
Disclosures
SSH innehar aktier i Verigraft, ett företag som har licensierat tekniken för Vävnadsrekonstruktion blodkärl. De andra författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Professor Anders Jeppsson för hjälp med att ge blod fartyg som används i experiment. Studien finansierades av LUA ALF bidraget till SSH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Port Cap | CPLabSafety | WF-GL45-4Kit | |
| Acetyl salicylic acid | Sigma Aldrich | A5376 | |
| Anti-Anti | Life Technologies | 15240-062 | |
| B-FGF | Lonza | cc-4113B | |
| Blood Glucose monitoring system - Free style Lite | Abbott | 70808-70 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| EGM-2 Growth Factors Kit | Lonza | CC-4176 | |
| EG-VEGF | Peprotech | 100-44 | |
| Glass bottle 250ml | VWR | 2151593 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass bottle 1L | VWR | 2151595 | Any bottle with GL45 cap can be used |
| Glass jar 500ml with bottom hose outlet | Kimble Chase Life Science | 14607 | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Heparin Coated Vacutainer Tubes | Becton Dickinson | 368480 | |
| Human AB Serum | Sigma Aldrich | H3667 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Luer Female with 1/8" ID Barb | Oina | LF-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Female with 3/32" ID Barb | Oina | LF-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 3/32" ID Barb | Oina | LM-1.5PP-QC | For 2X4mm silicon tube |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Luer Male with 5/32" ID Barb | Cole Parmer | EW-45518-06 | For 5X8mm silicon tube |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372-019 | |
| Per acetic acid | Sigma Aldrich | 433241 | |
| Peristaltic pump I | Masterflex | 7524-45 | For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75 |
| Peristaltic pump II | Ismatec | ISM941 | For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Reducing Connector 1.5mmX2.5mm | Biotech | ISM569A | |
| Shaker | Ika | KS4000 i control | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Steen solution | Xvivo | 19004 | |
| Suture | Agnthos | 14817 | |
| Tri-n-butyl Phosphate | AlfaAesar | A16084.AU | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF | |
| Tube 60ml with flat base | Sarstedt | 60596 | |
| Tube A | VWR | 2280706 | Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube B | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup |
| Tube C | VWR | 2280706 | Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3 |
| Tube D | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2 |
| Tube E | VWR | 2280706 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube F | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube G | VWR | 2280713 | Cut 2 pieces, each of 60 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2 |
| Tube H | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube I | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube J | VWR | 2280703 | Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup |
| Tube K | VWR | 2280703 | Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup |
References
- Brockbank, K. G. Effects of cryopreservation upon vein function in vivo. Cryobiology. 31 (1), 71-81 (1994).
- O'Donnell, T. F. Jr, et al. Correlation of operative findings with angiographic and noninvasive hemodynamic factors associated with failure of polytetrafluoroethylene grafts. Journal of Vascular Surgery. 1 (1), 136-148 (1984).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., et al. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
- Olausson, M., et al. In Vivo Application of Tissue-Engineered Veins Using Autologous Peripheral Whole Blood: A Proof of Concept Study. EBioMedicine. 1 (1), 72-79 (2014).
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nature Medicine. 16 (8), 927-933 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Conconi, M. T., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transplant International. 18 (6), 727-734 (2005).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
- Zhang, Z. Y., et al. The potential of human fetal mesenchymal stem cells for off-the-shelf bone tissue engineering application. Biomaterials. 33 (9), 2656-2672 (2012).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Science Reports. 4, 6716 (2014).
- Wiles, K., Fishman, J. M., De Coppi, P., Birchall, M. A. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B Reviews. 22 (3), 208-219 (2016).
- Young, M. R. Endothelial cells in the eyes of an immunologist. Cancer Immunology Immunotherapy. 61 (10), 1609-1616 (2012).
- Graham, L. M., et al. Endothelial cell seeding of prosthetic vascular grafts: early experimental studies with cultured autologous canine endothelium. Archives of Surgery. 115 (8), 929-933 (1980).
- Onuki, Y., et al. Accelerated endothelialization model for the study of Dacron graft healing. Annals of Vascular Surgery. 11 (2), 141-148 (1997).
- Clowes, A. W., Kirkman, T. R., Reidy, M. A. Mechanisms of arterial graft healing. Rapid transmural capillary ingrowth provides a source of intimal endothelium and smooth muscle in porous PTFE prostheses. American Journal of Pathology. 123 (2), 220-230 (1986).
- L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nature Medicine. 12 (3), 361-365 (2006).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Lahti, M. T., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Implantation of completely biological engineered grafts following decellularization into the sheep femoral artery. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1726-1734 (2014).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Pollack, A. A., Taylor, B. E., et al. The effect of exercise and body position on the venous pressure at the ankle in patients having venous valvular defects. Journal of Clinical Investigation. 28 (3), 559-563 (1949).
- Li, F., et al. Low-molecular-weight peptides derived from extracellular matrix as chemoattractants for primary endothelial cells. Endothelium. 11 (3-4), 199-206 (2004).
- van Ark, J., et al. Type 2 diabetes mellitus is associated with an imbalance in circulating endothelial and smooth muscle progenitor cell numbers. Diabetologia. 55 (9), 2501-2512 (2012).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex-vivo lung perfusion. Transplant International. 28 (6), 643-656 (2015).
- Cross, M. J., Claesson-Welsh, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Science. 22 (4), 201-207 (2001).
- Peplow, P. V. Growth factor- and cytokine-stimulated endothelial progenitor cells in post-ischemic cerebral neovascularization. Neural Regeneration Research. 9 (15), 1425-1429 (2014).
- Xiao-Yun, X., Zhao-Hui, M., Ke, C., Hong-Hui, H., Yan-Hong, X. Glucagon-like peptide-1 improves proliferation and differentiation of endothelial progenitor cells via upregulating VEGF generation. Medical Science Monitor. 17 (2), BR35-BR41 (2011).
- Dragoni, S., et al. Vascular endothelial growth factor stimulates endothelial colony forming cells proliferation and tubulogenesis by inducing oscillations in intracellular Ca2+ concentration. Stem Cells. 29 (11), 1898-1907 (2011).
- Sai, Y., et al. Basic fibroblast growth factor is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (4), 688-693 (2014).
- Gallus, A. S. Aspirin and other platelet-aggregation inhibiting drugs. Medical Journal of Asutralia. 142 (1), 41-47 (1985).
