Summary
הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.
Abstract
השמנת יתר מלווה של שיפוץ נרחב של רקמת שומן בעיקר דרך adipocyte היפרטרופיה. צמיחה adipocyte קיצוניים גורמת תגובה המסכן אינסולין, היפוקסיה המקומי של דלקת. על ידי המרצת את הבידול של adipocytes לבן פונקציונלי של אבות, היפרטרופיה הרדיקלית של האוכלוסייה adipocyte ניתנת למניעה, כתוצאה מכך, ניתן לשפר את הבריאות המטבולית של רקמת שומן יחד עם הפחתה של דלקת. כמו כן, על ידי גירוי של הבידול של חום בז/adipocytes, הוצאות האנרגיה של הגוף הכולל ניתן להגדיל, וכתוצאה מכך ירידה במשקל. גישה זו יכולה למנוע ההתפתחות של השמנת יתר morbidities שיתוף כגון סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם.
מאמר זה מתאר את הבידוד הרחבה, הבידול של adipocytes לבן ובייז של תת-קבוצה של רקמת שומן אנושי תאי אנדותל המבטאים במשותף את סמני CD34 ו- CD31. השיטה הוא זול יחסית ואינו מהגידולים. זה דורש גישה אנושית רקמת שומן ומתאים בתחנה תת עורית הדגימה. עבור פרוטוקול זה, רקמת שומן טריים דגימות מן הנבדקים חולנית [אינדקס מסת הגוף (BMI) > 35] נאספים במהלך הליכי ניתוח בריאטרי. שימוש של immunoseparation רציפים של השבר בכלי הדם סטרומה, מספיק תאים מיוצרים מ קטנה כמו 2-3 גרם של שומן. תאים אלה ניתן להרחיב בתרבות במשך 10-14 ימים, יכול להיות cryopreserved, שומרים על תכונותיהם adipogenic עם passaging עד מעבר 5-6. התאים מטופלים במשך 14 ימים עם קוקטייל באמצעות שילוב של אינסולין אנושי ואגוניסט-רוזיגליטזון את PPARγ adipogenic.
מתודולוגיה זו יכול לשמש להשגת הוכחת הרעיון ניסויים על המנגנונים המולקולריים לנהוג adipogenic תגובות בתאי האנדותל אדיפוז, או לסינון תרופות חדשות זה יכולה לשפר את adipogenic של תגובה מכוונת גם כלפי לבן או adipocyte חום בז/בידול. באמצעות ביופסיות תת-עורי קטן, מתודולוגיה זו ניתן לסנן נושאים שאינם-למגיב לניסויים קליניים שמטרתם לעורר adipocytes בז/חום ולבן לטיפול של השמנת יתר, שיתוף morbidities.
Introduction
לאחרונה מעידים כי הן בעכברים ובבני אדם, קבוצת משנה של תאים המתגוררים להערכת רקמת שומן יכול להיות מובחן גם2,1,adipocytes לבן או חוםבז/3. פנוטיפ תאים כאלה היא נושא למחלוקת, עם ראיות התומכות תאי אנדותל, שריר חלק/pericyte או קשת של פנוטיפים ביניים4,5,6,7. היקף פיתוח מתודולוגיה זו היה לבחון את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + תאי אנדותל מבודד מן המחסנים שומן שונה מבני מהשמנת יתר. מחקרים אחרים בספרות מתמקדים adipogenic הפוטנציאליים של השבר בכלי הדם סטרומה הכולל או של8,92,אבות adipocyte הידוע. מאז הטכנולוגיה הקיימת כיום ניתן לייעד באופן ספציפי רקמת שומן בתאי אנדותל עבור משלוח סמים10, להבין את הפוטנציאל של תאים כאלה לעבור adipogenic אינדוקציה לכיוון adipocytes לבן או בז הוא חשוב טיפולים ממוקדים בעתיד.
קבוצות שונות דיווחו על השילוב של סמני CD34 ו- CD31 כתחליף בידוד תאי אנדותל של רקמת שומן אנושי11,12,13. בדרך כלל, הבידוד מתבצעת באמצעות שני שלבים רציפים ומבחר חיובי באמצעות beads מגנטי. בדו ח זה, immunoseparation באמצעות CD34 + beads מגנטי בשילוב חרוזי פלסטיק CD31 היה מנוצל. מצאנו שיטה זו נעלה immunoseparation מגנטי רציפים ביחס לשימור מורפולוגיה אנדותל המרוצף טיפוסי. כמו כן, הצלחנו לייצר מספיק תאים הדרושים עבור אינדוקציה הרחבה, adipogenic החל מ קטנה כמו 1-2 גרם של שומן. ביופסיה מדגם קטן של שומן תת עורי מספיקה כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תאים עבור יישומים במורד הזרם. היבט זה חשוב שעשוי להיות, במיוחד אם תשתמש בשיטה זו להקרנה על היענות אינדוקציה adipogenic של ניסויים.
בניגוד למערכות אחרות דיווחו בספרות, שיטה זו משתמשת רק שני מרכיבים אינדוקציה adipogenic CD34 + CD31 + תאים: אגוניסט PPARγ — רוזיגליטזון —, אינסולין אנושי. חשוב מכך, כמות האינסולין משמש נופל בטווח נורמלי/גבוהה של מחזורי אינסולין post-absorptive בני14. מידת ההיענות לאינסולין של ה תאי במבחנה, נמדד על ידי זרחון Akt, לא לתאם את יכולתם להגיב אינדוקציה קוקטייל. מעניין, באמצעות תנאים קוקטיילים ו ניסיוני זה אינדוקציה, שילוב של לבן, חום בז/תאים התקבלו כפי שנקבע בהתאם לגודלו, מספרים של השומנים תאיים טיפות, הביטוי של סמנים מולקולריים. פרוטוקול זה אינדוקציה פשוטה וחסכונית יחד עם הערכה כמותית של פנוטיפ של התאים למשיב (לבן לעומת בז) מאפשר הקרנה של סוכנים פוטנציאלי יכול לשנות את האיזון של בז הבדיל : לבן adipocytes.
שיטה זו מספקת גם בגישה translational להבנת המנגנון הבסיסי של adipogenesis של אבות אנדותל כלי הדם ברקמת שומן אנושי. באמצעות טכניקה ספציפית בידוד/בידול זו, החוקרים שניתן לחקור מסלולים שונים אחראים adipogenesis בקבוצת משנה של תאי אנדותל כלי הדם מן המחסנים שומן שונות אצל בני אדם רזה והשמנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה המוסדית של לוח סקירה בבית הספר לרפואה במזרח וירג'יניה אישרה אוסף של דוגמאות רקמת שומן אנושי השתמשו במחקר ומחקר. הסכמה בכתב מושכלת נאסף מן המטופלים.
1. הכנת מאגרי מדיה, כלי נגינה
- להכין פתרון Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 מ"מ נתרן כלורי, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ מ מגנזיום גופרתי, 0.4 מ מ אשלגן פוספט dibasic, גלוקוז בעובי 5.5 מ מ, 1 מ מ אדנוזין, לערבב אנטיביוטיקה/antimycotic 0.01% (50 µg/mL הפניצילין, 50 µg/mL סטרפטומיצין, 30 µg/mL של גנטמיצין, ng/mL 15 של שהוא גוסס) ו- 10 מ מ HEPES (ה-pH = 7.4). פתרון זה מוכן טרי כל זמן עיכול ואוסף רקמות.
- להכין פתרון collagenase טריים: 1 מ"ג/מ"ל של collagenase, הקלד 1, KRBSS; לעשות 3 מ"ל/גרם של שומן. לחמם את הפתרון collagenase ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים לפני העיכול רקמות.
- הכנת מאגר בידוד תאי CD34: 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1 מ מ EDTA סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- הכן Adipogenesis מדיה: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין, µL/mL 1.25 של אינסולין אנושי (µg 5/mL או מו 144/mL) ו- µL/mL 0.36 של 2.8 מ"מ רוזיגליטזון (1 מיקרומטר).
- להכין 0.3% שמן אדום O (אורו) מניות פתרון (משקל/נפח) על ידי המסת 0.3 g של אורו לתוך 100 מ של אלכוהול איזופרופיל.
2. אדיפוז השבר בכלי הדם סטרומה בידוד
הערה: המחקר כללו עמית חתך הרוחב של שמנים בצורה חולנית סוג 2 סוכרת (T2D), שאינו חולה סוכרת הנושאים, בגילאי 18-65 שנים, שעברו ניתוח בריאטרי Sentara מטבולית, מרכז אובדן משקל של הניתוח (קבוצה הרפואי Sentara, נורפולק, וירג'יניה). לקבלת פטור כלל מחלה אוטואימונית כולל סוכרת סוג 1, מצבים הדורשים טיפול לדיכוי המערכת החיסונית כרונית, תרופות אנטי דלקתיות, thiazolinendiones, השימוש בטבק פעיל, זיהומים חריפה או כרונית או היסטוריה של ממאירות שטופלו תוך 12 החודשים האחרונים. T2D היה מוגדר של גלוקוז בצום של 126 מ"ג/ד"ל או גדול, של גלוקוז של 200 מ"ג/ד"ל או יותר לאחר בדיקת עמידות גלוקוז 2 h או את השימוש בתרופות antidiabetic.
- לאסוף אדם עם פגיעה (OM) ואת רקמת השומן התת עורית (SC) (ב) ניסויים שעברו ניתוח בריאטרי.
- שמור את אום ו- SC AT נפרד מבחנות שמכילות של האנק Buffered תמיסת מלח עם 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר מיד לאחר החילוץ רקמות.
- בזהירות לנקות ולהסיר והחלק שהותירה נצרבו של הרקמה באמצעות מספריים ניגבה אתנול 70% ופינצטה כאשר המדגם מגיע במעבדה אחרי החילוץ רקמות.
- שוקל את רקמת שומן, למחיצות זה לתוך 5 g (או פחות) aliquots לעיכול collagenase.
- דק מינצ 5 גר' AT ב 5 מ של פתרון collagenase ב בקבוקון נצנוץ בטמפרטורת החדר, באמצעות שני זוגות מספריים.
- להוסיף נוספים של 10 מ"ל של פתרון collagenase הרקמה טחון על סך 15 מ"ל.
- לעכל את הדגימות עבור h 1, 37 ° C, באמבט מים ברעידות רציפה.
- חותכים את הקצה מזרק 20 mL כדי להפוך קצה קהה.
- גזור ריבוע 9 ס מ x 9 ס מ מ רשת מיקרומטר 250 ודחף אותו באמצע הדרך לתוך צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות המזרק הקהה.
- יוצקים את הדגימות לתוך מזרק הקהה 20 מ"ל ו מסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 250 לתוך הצינור חרוט 50 מ ל כדי להפריד בין adipocytes וסטרומה תאים לכלי הדם מרקמות מעוכל.
הערה: אין להשתמש יותר מ 5 g של AT למחזור חרוט 50 מ ל, רשת השינוי לקבל צפופים עקב עודף חומר מעוכל שהותירה. - לשטוף את המבחנה נצנוץ עם 10 מ"ל של KRBBS, שפוך את זה דרך המסנן כדי לאסוף תאים שיורית.
- דגירה הדגימות המסוננת עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: השלב זה חשוב לאפשר adipocytes כדי לצוף בחלק העליון של הצינור חלק מהתאים וסקולרית סטרומה להתיישב על החלק התחתון של הצינור. - לנצל מזרק 20 מ ל ו- 20 G x 6 במחט pipetting להסיר את שכבת סטרומה השבר בכלי הדם. ולהעביר אותו ל צינור חרוטי נקי 50 מ.
- להוסיף 10 מ של KRBBS ולאפשר את הדוגמאות כדי לשבת על הספסל במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 2.12 – 2.14 פעמיים.
הערה: השלבים יבטיח כי אין שום זיהום של תאי סטרומה כלי דם עם adipocytes צף. - למנוע שברים וסקולרית סטרומה שני מחסני על הקרח לשם עיבוד נוסף, כפי שמתואר את השלבים שלהלן.
הערה: אל תשאירו את התאים על קרח לשעה יותר כמו זה עשוי להשפיע על הכדאיות תא. Adipocytes יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך או משמש טרי לניסויים.
3. בידוד תאי אנדותל רקמת שומן
- ספין שברים וסקולרית סטרומה (SVF) ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
- הסר את הדגימות לצנטריפוגה ולאחר יוצקים בזהירות את תגובת שיקוע; שמור בגדר המכילות את התאים SVF.
- Resuspend בעדינות את כדורי תא ב 5 מ של PBS.
הערה: אם יותר מ- 5 גר' דיפו AT היה מעובד aliquots מרובים (ראה שלב 2.4), מאגר כדורי תא ביחד. - ספין הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
- להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS, ולספור את התאים.
הערה: כאן, מונה אוטומטי תא הניתן שימש לספירת תאים. הכדאיות תא היה מתקבל על ידי ערבוב µL 12 תא השעיה עם 12 µL של פתרון יודיד כתום/propidium (AO/PI) acridine (ראה טבלה של חומרים). המספר הממוצע של תאים לגרם של AT עבור כל דיפו: (א) דיפו אום: 1.69 x ± 4.51 x 10 105 4; (ב) SC דיפו: 1.24 x5 10 ± 6.45 x 104. הכדאיות של התאים שניכם מחסני היה > 90%. - גלולה הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
הערה: פרוטוקול בחירת CD34 immunomagnetic (ראה טבלה של חומרים) הותאמה עבור שלבי 3.7-3.15. - Resuspend בגדר ב µL 100 CD34 בידוד המאגר.
הערה: ספירת התאים הכולל לדרוש אמצעי האחסון re-השעיה הבאים: (א) < 2 x 107 תאים: resuspend בגדר ב 100 µL; (ב) 2 x 108–5 x 108 תאים: resuspend בגדר ב 1 מ"ל. שלבים 3.9-3.16, הכרכים של ריאגנטים פעם היו מוקטן עבור < 2 x 107 תאים. - להוסיף 10 µL של CD34 קוקטייל, דגירה המדגם למשך 15 דקות, בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים 5 µL של beads מגנטי, דגירה המדגם למשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 2.5 מ ל CD34 בידוד מאגר כל מדגם ולמקם את הדגימות לתוך המגנט, למשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
- היפוך המגנט עבור 5 s כדי יוצקים את המאגר בידוד.
- הסר את הדגימות של המגנט, חזור על השלבים 4 x 3.10 ו- 3.11.
- הסר את הצינורית של המגנט ולהוסיף 2 מ"ל CD34 בידוד המאגר.
- גלולה התאים ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
- Resuspend תא כדורי ב 1 מ"ל CD34 בידוד מאגר ולספור את התאים.
הערה: כאן, הוא המספר הממוצע של תאים לגרם של AT: (א) דיפו אום: 4.75 x ± 3.36 x 10 104 4; (ב) SC דיפו: 1.06 x4 10 ± 9.53 x 103. פרוטוקול immunobead פלסטיק CD31 הותאמה עבור שלבים 3.16 – 3.34 (ראה טבלה של חומרים). - גלולה תאים ב x 500 g למשך 5 דקות, resuspend בגדר µL 250 של מאגר B, µL 250 שטיפת המאגר.
- Resuspend ביסודיות את החרוזים CD31 על ידי vortexing ברכבת התחתית.
- הוסף 20 µL של CD31 חרוזים.
הערה: עקב בתא סכום שנחשב > עונה 1 פרק 106, אמצעי האחסון המידה לפי הקלט של היצרן. - דגירה הדגימה עם נדנדה למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר.
- לצרף מסננת צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
הערה: הפתח גדול יותר של מסננת חייב להיות על העליונה. - לפני ההפרדה תא, להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר כדי equilibrate את מסננת. החל את התערובת שנוצר תחת צעד 3.16. מסננת.
- לשטוף את מסננת עם 5 מ של שטיפת מאגר בתנועה סיבובית על הנפח הכולל של 20 מ. לצרף במחבר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל וסגור את נעל-סכינים סטריליים.
- לצרף את מסננת המחבר. להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר לאורך החומה של מסננת. להוסיף 1 מ"ל מופעל מאגר D לאורך החומה של מסננת. מערבולת המדגם בעדינות, דגירה זה 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר. להפריד את התאים החרוזים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 x.
הערה: למנוע יצירת בועות אוויר. - . לפתוח את המנעול-סכינים סטריליים ולאפשר את התאים מנותקת לזרום לתוך הצינור חרוט 50 מ. לשטוף את מסננת 10 x עם 1 מ"ל של מאגר לשטוף בכל פעם.
- למחוק את המחבר ואת מסננת, centrifuge את הדגימות ב x 300 גרם במשך 10 דקות, ב 4 º C. Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של מדיה EGM-2 מלאה לתרבות.
הערה: המספר הממוצע של תאים לגרם של AT בנקודה זו היא: (א) דיפו אום: 5.92 x ± 4.27 x 10 103 3; (ב) SC דיפו: 4.12 x3 10 ± 2.1 x 103. הכדאיות של תאים בשני מחסני היה מעל 90%.
4. אינדוקציה של Adipogenesis בתאי האנדותל מבודד
- לגדל תאי 6-ובכן שטופלו תרביות רקמה צלחות עם מדיה מלאה EGM-2 ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. החלף את המדיה כל 3-4 ימים עד התאים מגיעים למפגש 80-90%.
הערה: הכפלת האוכלוסייה היא בין 2-3 ימים. - להרחיב את התאים על ידי ציפוי אותם על צלחות פטרי 100 מ מ, לפצל את התאים פעם 1:3. בשלב זה, התאים הם על מעבר 2.
- ספירת התאים באמצעות תא אוטומטי מונה (ראה טבלה של חומרים).
- תאי זרע כ 100 – 200,000 לוחות 6-ובכן הבטחת בארות כפולים לכל דיפו ותרבות אותם מוחלט מדיה EGM-2 במשך יומיים.
- האחות את כל התקשורת צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ של DMEM/F12 עם 5% FBS ו- µg/mL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין עבור הפקד תאים ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של מדיה Adipogenesis (ראה שלב 1.4) עבור התאים טיפול.
- דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified חממה של2 CO 13 יום, החלפת המדיה המתאימים כל 3-4 ימים.
הערה: תאים יתחילו לצבור שומנים לאחר 4 ימים של טיפול. - לנהל את אורו, הנילוס אדום מכתים לפי שיטות שפורסמו15–17.
- כדי לבודד תאים לחילוץ RNA, התקשורת להסיר לוחות השראה 6-ובכן, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- להוסיף 350 µL של guanidium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון (ראה טבלה של חומרים) כל טוב, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 5 – 10 דקות.
- לגרד את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תא ולהעביר את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL.
הערה: הדגימות ניתן לאחסן במקפיא-80 ° C עבור החילוץ-RNA ועיבוד נוסף במועד מאוחר יותר. - תמצית ה-mRNA מדגימות באמצעות הוצאה RNA מותאם פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
- לבצע תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) כדי להעריך בביטוי הגן באמצעות את הגששים הבאים: אדיפונקטין, UCP-1 ו- CIDEA (ראה טבלה של חומרים).
הערה: כאן, RT-PCR פרוצדורות בוצעו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי הבאים: דנטורציה (95 ° C; 15 s), חישול, והסיומת (60 ° C; 1 דקות) מחזורים 40. הדגימות לידי ביטוי גנים עם ערכים CT > 35 נחשבו בלתי מורגשת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול שלנו שואפת לספק גישה במבחנה כדי לקבוע את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + כלי דם תאים מחסני שונים של רקמת שומן אנושי. תרשים זרימה מפושטת מוצג איור 1A. הצעד הראשון באמצעות מבחר חיובית של CD34 לבטא תאים תוצאות > 95% CD34 + תאים באוכלוסייה של תאים מבודדים טרי (איור 1 א'). חשוב לציין, סמן זה אובד לאחר התאים מתורבתים לכמה קטעים. מאחר CD34 נפוצות סמן אבות hematopoietic ו- hematopoietic מגוונת, השלב הבא הנדרשים לצורך הקמת מכשול ההפרדה של אבות אנדותל היא בחירת חיובי של CD31 + תאים מחוץ CD34 + תא האוכלוסייה (איור 1 א'). למרות CD31 הוא סמן תאי אנדותל, ניתן למצוא אותו גם על קבוצות משנה של תאים hematopoietic. אנו נותחו מספר הכנות של שניהם עם פגיעה ו התת-עורית השומן על ידי cytometry זרימה, באופן עקבי נמצא כי CD34 + CD31 + תאים שאינם מבטאים את סמן CD45 (איור 1B, לוחות העליון). בדרך כלל, < % 1 של התאים הראה CD45 חיוביות, מתוך האוכלוסייה בתא סכום. תוצאה זו הובילו אותנו למסקנה כי אנחנו ככל הנראה להשיג הכנה כמעט ללא אבות hematopoietic. כדי לקבוע אם התאים אקספרס בסמן תאי גזע adipocyte CD24, אנחנו ניתח תאים עם פגיעה וגם תת עורית מחסני ומצא כי כמעט אין תאים הביע דה מרקר CD24 דיפו עם פגיעה (איור 1B, לוחות התחתון), פחות מ 5% התאים הביע את סמן בתחנה תת עורית (לא מוצג). לסיכום, באמצעות מתודולוגיה זו ההפרדה, שאנחנו המתקבל תאי CD34 + CD31 + CD45-CD24 מחסני עם פגיעה וגם תת עורית של הנושאים כרסתן.
שימוש של חרוזי פלסטיק מצומדת עם נוגדנים CD31, השגנו התאים מוצג המורפולוגיה אנדותל המרוצף במהלך פסקאות מוקדמות, לעומת תאים מופרדים באמצעות החרוזים מגנטי מצומדת נוגדן CD31 מוצגים בצורת כישור פנוטיפ mesenchymal מיד לאחר הפירוד (איור 2 א). לבסס עוד יותר את זהות אנדותל CD34 + CD31 + תאים, ביצענו שני מבחני פונקציונלי: ספיגה של DiI-Ac-LDL ומטריצה קרום המרתף (המכונה מטריקס לכאן בזמן שנסעתי) צינור היווצרות בתוך חוץ גופית. CD34 + CD31 + התאים היו מודגרות עם DiI-Ac-LDL, הרוב הגדול של התאים היו חיוביות הקליטה (איור 1C). כפקד חיובית, השתמשנו קו microvascular התא הראשי אנדותל רקמת שומן אנושי (HAMVEC) זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים , איור 1C). בדקנו גם אם CD34 + CD31 + תאים שומרים על תפקידם אנדותל לאחר culturing על-ידי קביעת יכולת תאים כאלה ליצור מבנים כלי דמוי ספונטנית במבחנה, ב- 3D-מטריצה. לאחר מעברים, CD31 + CD34 + 3 מבנים כלי דמוי צינורי צורות במטריצה מקביל לקו הראשי תאי אנדותל אדם HAMVEC (איור 1D).
לאחר ההרחבה של התאים עבור 2-3 קטעים, החלפנו את התאים EGM-2 המדיה מלאה המכילה גורמי גדילה pro-אנגיוגנזה לתוך המדיה DMEM/F12 בתוספת 5% FBS רוזיגליטזון (1µM), אינסולין (144 מו/mL). שמירה על שהתאים EGM-2 להשלים את המדיה באופן דרמטי מופחת בידול adipogenic שלהם. כמו כן, תוספת של דקסאמתאזון ו- 3-isobuthyl-1-methylxanthine לתקשורת לא שינתה את הקצב, מידת הצטברות שומנים בדם ועוד תוספת של indomethacin משמעותית הצטברות שומנים בדם (נתונים לא מוצג). על סמך ניסויים מוקדמים אלו, החלטנו להשתמש רק רוזיגליטזון, אינסולין עבור אינדוקציה adipogenic. אחרי 14 יום של תרבות בתקשורת adipogenic התאים היו קבועים, מוכתם שמן אדום O או הגרעינים, הנילוס אדום היו counterstained עם דאפי (איור 2B). הדמויות, מוצגים להחליפן בתמונות של תאים מבודדים לזווג תת עורית (SC) (איור 2B, לוחות העליון), עם פגיעה רקמת שומן (OM) (איור 2B, לוחות התחתון) של שלושה ניסויים עם מדד מסת גוף בין 37-45 kg/m2. אנא שימו לב כי התגובה אינדוקציה משתנה מאוד בין הנושאים לבין מחסני של אותו נושא. כפי שראינו בתמונה פלורסנט ב איור 2B, אוכלוסייה מעורבת של unilocular (חצים אדומים), multilocular (החצים הלבנים) השומנים המכילים תאים, כמו גם תאים אינם מצטברים שומנים (חיצים צהובים) נמצאים בדרך כלל. היחס בין המספרים של תאים אלה הוא גם מאוד משתנה עם הנושא וגם בתחנה המוצא. כימות של אחוז השומנים המכילים תאים (מבוסס על הגישה החיובית שמן אדום O) התאים הכולל (מבוסס על הגרעינים שהוכתמו דאפי) הראו הבדל משמעותי בין מחסני SC ו אום של אותו הפרט, עם תאי ממחסן SC להיות קשובים יותר אינדוקציה adipogenic (איור 2C). ההסבר הטרוגניות בתגובה בין הנושאים את מחסני של אותו נושא לא ברור. עם זאת, אנחנו משערים כי היא ככל הנראה קשורות לאופי האוכלוסייה תא שנושא את טביעת האצבע של ויוו פנוטיפ/הסביבה, לא לאור ההשתנות בפרוטוקול בידוד פנימי.
כדי לאשר התאים שעברו את הבידול להבשיל adipocytes, מדדנו בביטוי הגן של אדיפונקטין סמן את פאן-adipocyte, את סמני בראון/בז UCP-1 ו- CIDEA בתאים לאחר 13 ימי אינדוקציה adipogenic בהשוואה תאי בקרה בלתי מושרה. הביטוי אדיפונקטין היה גדל עד 10,000-fold בתאים הבדיל בהשוואה הפקדים (איור דו-ממדי). בביטוי הגן של CIDEA, UCP1 היה רק לזיהוי בתאים בעקבות הגירוי adipogenic (איור דו-ממדי). בפרט, הביטוי UCP-1 היה משתנה מאוד, המשקף את הפרופורציות שונים של הלבן: חום / בז תאים בתוך האוכלוסייה התא. הביטוי של הגן משק RPL27 היה עקביות במידה ניכרת בין הדגימות עם CT ערכים הנעים בין 18 – 20 מחזורים, אין הבדלים משמעותיים נמצאו בין התאים שעברו את הבידול adipogenic ו פקדים ללא טיפול. אנחנו זוהה גם ביטוי חלבון UCP-1 את התאים מוצג על פנוטיפ רב locular, בדפוס punctated מרמז על לוקליזציה מיטוכונדריאלי (2E איור). החלבון UCP-1 לא היה לזיהוי בתאים אינם מצטברים שומנים או תאים עם מספר, טיפות קטן מאוד שאינם סביר לחלוטין הבדיל adipocytes (2E איור).
התבוננות שלנו כי הפוטנציאל adipogenic CD34 + CD31 + תאים ספציפיים דיפו, מאוד משתנה בין נושאים שונים מתבקש אותנו לחפש עבור פוטנציאל מתאמים עם BMI, גיל ו- HbA1c. בין הדגימות 28 נבדק, לא מצאנו כל מתאמים משמעותי בין adipogenic פוטנציאליים, גיל או BMI; עם זאת, מצאנו קורלציה שלילית משמעותית בין HbA1c הצטברות השומנים בתאים ממחסן אום (איור 3 א). ממצא זה מצביע על קשר אפשרי עם הסביבה hyperglycemic כרונית ומגיע בעתיד לפתוח בחקירה. זה גם עולה כי CD34 + CD31 + תאים סביר לבצע את החתימה ויוו יכולתם להגיב אינדוקציה adipogenic. אנו גם מראים כי תאים אלה להציג רמות מגוונות של Akt זרחון בעקבות של גירוי האינסולין במבחנה (איור 3B, העליון). עם זאת, השתנות בתגובה לא לתאם עם היכולת שלהם עוברים התמיינות adipogenic כפי שמוצג על ידי ההכתמה שמן אדום O תמונות של הדגימות תואמות (איור 3B, התחתון).
איור 1: הפרדה ואפיון של CD34 + CD31 + תאים רקמת שומן אנושי. (א) תרשים זרימה זו מראה השלבים העיקריים של בידוד ובידול. לאחר הבחירה חיובית תוך שימוש CD34 beads מגנטי, > 95% של תאים מבודדים טרי, לפני השלב השני הבחירה, הם CD34 +. (B) הזה cytometry זרימה נציג מראה חלוץ מגרש פזורים מגודרת לאוכלוסיה תא חי; דוגמה מוכתם על ערוץ FITC (BluFl2); CD45 מכתים של מדגם מייצג עם פגיעה על העליונה. התחתון מציג אותו רצף כפי שמוצג למעלה, אבל עבור התאים (שאושרו על-ידי Alexafluor 647) CD24 מדגם עם פגיעה. (ג) אלה micrographs נציג להציג ספיגה של DiI-Ac-LDL (אדום) על-ידי CD34 + CD31 + תאים בעקבות 4 שעות של דגירה במבחנה (החלונית העליונה). תפיסה דומה נמצא בקו התא הראשי microvascular תא אנדותל רקמת שומן אנושי (HAMVEC) (פאנל התחתונה). הגרעינים מוצגים כחול מאת דאפי. (D) אלה micrographs נציג להציג מערך צינור במבחנה CD34 + CD31 + תאים נזרע במטריצה-3D. CD34 + CD31 + תאים (פסקה 3) היו נזרע ב- 24-ובכן צלחות בעקבות של צביעת עם FITC-calcein, מודגרות במשך 4 שעות בתקשורת מלאה תאי אנדותל. התאים היו עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. HAMVEC, נזרע על צפיפות זהה, נעשה שימוש לשם השוואה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Adipogenic אינדוקציה וסמנים תאי CD34 + CD31 +. הצג micrographs (א) אלה נציג ההבדלים מורפולוגיות בין CD34 + CD31 + תאים מבודדים באמצעות מבחר חיובית עם CD31 + beads מגנטי לעומת CD31 + חרוזי פלסטיק. התאים היו עם תמונה-מעבר 1 לאחר הבידוד. ההגדלה בשימוש הוא 100 X. (B) הלוחות הללו הם micrographs הנציגה של שמן אדום O צבעונית CD34 + CD31 + תאים לזווג תת עורית (SC) ודוגמאות עם פגיעה הקרביים (OM) של 3 נושאים שונים. התאים בתרבית במשך 2-3 קטעים בתקשורת מלאה EGM-2, אז החליף במדיה DMEM/F12 עם 5% FBS מטופלים עם אינסולין (144 מו/mL) והוא רוזיגליטזון (1 מיקרומטר) למשך 14 ימים, עם המדיה השתנתה כל 3 ימים. ההגדלה בשימוש הוא 100 X. התמונה פלורסנט נציג מציגה adipo השומנים אדום טיפות (ירוק), דאפי גרעיני מכתים (כחול). אנא שימו לב כי שילוב של תאים המכילים שומנים unilocular (חץ אדום), שומנים multilocular טיפות (חץ לבן) או תאים המציגים אין הצטברות שומנים בדם (חץ צהוב). ההגדלה בשימוש הוא 200 X, סולם בר = 50 מיקרומטר. (ג) בלוח זה פוטנציאל של כימות של adipogenic לידי ביטוי כמו שמן אדום O (אורו) תאים חיוביים מנורמל ל הכולל גרעינים שהוכתמו דאפי. CD34 + CD31 + תאים מחסני אום, -SC של אותו נושא להראות הבדל משמעותי ב- adipogenic פוטנציאליים על ידי מבחן t של סטודנט לזווג (n = 7). סמנים (D) בביטוי הגן של adipocyte בוגרת (אדיפונקטין UCP-1, CIDEA) נמדדה על ידי RT-PCR התאים לאחר 14 ימים האינדוקציה adipogenic, תאי בקרה. הנתונים מבוטא קיפול-שינוי עבור הביטוי ג'ין אדיפונקטין. הביטוי של CIDEA ו- UCP-1 לא היה לזיהוי הדגימות שליטה. הערכים מייצגים ΔCt מנורמל כדי RPL27 כמו גן משק בית. הערכים CT עבור RLP27 היו בין 18 – 20 מחזורים על כל הדגימות כלולים בניתוח (n = 3-5 נושאים). הנתונים מבוטאים אומר ± SD. מבחן t של סטודנט לזווג שימש ניתוח סטטיסטי של הנתונים. p < 0.05 דוחה את ההיפותזה. (E) לוח זה מציג את הביטוי חלבון UCP-1 CD34 + CD31 + תאים לאחר 13 ימי אינדוקציה עם אינסולין והוא רוזיגליטזון. Immunocytochemistry באמצעות נוגדן UCP-1 polyclonal האדם הראה ביטוי סלקטיבי של UCP-1 adipocytes רב locular. הזיהוי הושג באמצעות rhodamine מצומדת (אדום) משני נוגדן דאפי צביעת עבור גרעינים (כחול). ההגדלה גדולה בשיבוץ מראה את הסימן האדום punctated המתאים UCP-1 (חץ אדום) כמו גם מספר טיפות השומנים (LD) בגדלים שונים סביב גרעין התא (N). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מתאם בין adipogenic בידול, HbA1c במבחנה אינסולין איתות. ספירמן (A) (ללא פרמטרי) פירסון (פרמטרית) מקדמי המתאם עבור התאים אום, -SC, בהתאמה, שימשו כדי לקבוע את הקשר בין HbA1c לבין הצטברות שומנים בדם (n = 20). ההיפותזה נדחתה בשל p < 0.05. (B) בחלק העליון, סופג המערבי מציג את Akt phosphorylated (ירוק), הביטוי Akt (אדום) הכולל CD34 + CD31 + תאים מגורה במבחנה עם 5 nM אינסולין למשך 30 דקות לפני אינדוקציה adipogenic (n = 8). בחלק התחתון, שמן אדום O צביעת של התאים אותו בעקבות של אינדוקציה adipogenic למשך 14 ימים מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המוקד של מאמר זה נועד לספק מתודולוגיה עבור בידוד, הרחבה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאי אנדותל של מחסני מהבטן, תת עורית של רקמת שומן אנושי.
מתודולוגיות דווחו על בידוד תאי אנדותל של מיטות נימי הדם השונים של מכרסמים או בני אדם המערבות טכניקות בעיקר באמצעות נוגדנים CD31 או fluorescently עם התווית או מצמידים beads מגנטי18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. אתגר גדול עבור השימוש טכניקות אלה הבידוד האוניברסלית הוא את הטרוגניות של אוכלוסיית תאי אנדותל מיטות כלי דם שונים לבין סיכון גבוה של זיהום עם fibroblasts ותאים ציור קיר כלי הדם. עם זאת, ליטושים של טכניקות בידוד כדי להימנע כזה מציג כבר דווח על24. באמצעות טכניקות אלה, בעיקר תאי אנדותל בוגרת מבודדים מן הרקמות. רקמת שומן הוא מאגר גדול של גזע/ובתאים, כולל אבות אנדותל25,26. על כמה מסמכים דיווח הטיהור של תאי אנדותל של רקמת שומן אנושי באמצעות שילוב של CD34 + ו- CD31 + נוגדנים11,27. תאים המבטאים משני סמנים הם אוכלוסייה מעורבת של תאי אנדותל בוגר לאבות אנדותל11,28,29. בכמה עיתונים הזרע האחרונות מדווחים כי תת קבוצה קטנה של אנדותל (CD31 +) או ציור קיר (PDGFRβ +) תאים אדיפוז להערכת מקור עשיר של adipocyte-אבות-5,-30. אלו תאים דם עם adipogenic פוטנציאלי יכול לייצר adipocytes לבן או חום/בז, משויכים אנגיוגנזה פעיל להערכת אדיפוז5. ממצאים אלה עשויים לספק הזדמנויות טיפוליות חדשות כדי לשפר את הביצועים מטבולית ההשמנה ו/או לגרום לירידה במשקל על ידי יצירת adipocytes לבן ו/או תרמוגנית של אבות כלי הדם. לכן, עניין לזהות מתודולוגיה עבור בידוד קל וכלכלי, הרחבה, הערכה של הפוטנציאל adipogenic של תאי אנדותל כלי הדם של רקמת שומן אנושי.
CD34 + CD31 + תאים אנושיים תת עורית, עם פגיעה רקמת שומן הקרביים מחסני בעבר מאופיינים בהתבסס על הפוטנציאל שלהם האנגיוגנזה, הייצור של מתווכים דלקתיים, סמני הזדקנות ביולוגית שלהם, אחרים פונקציות11 , 31. עם זאת, אין שום ראיה שפורסמו על הפוטנציאל adipogenic של תאים כאלה. פרסומים קודמים שהפרידו CD34 + CD31 + תאים באמצעות beads מגנטי לדווח על נתונים מתאי איחדו בין מספר רב של נושאים (10 או יותר)11. מאמר זה מדווח בפעם הראשונה פרוטוקול על הבידוד מוצלח ועל הרחבת CD34 + CD31 + תאי מתורמים אנושי אחד מתוך שני מחסני תת עורית, עם פגיעה. אנחנו מבודדים והתרחבה תאים מ קטנה כמו 2-3 גרם של רקמת שומן. CD34 + CD31 + תאים ייצג 3 – 5% של תאים SVF הכולל ומוצג > 90% הכדאיות לאחר הבידוד. תאים אלה היו מאוד proliferative והציג מגוון רחב של תגובות כלפי הבידול adipogenic בעקבות גירוי של במבחנה עם רוזיגליטזון, אינסולין. מחקרים קודמים משמש רק בתאי גזע אדיפוז או לשבר כלי הדם סטרומה הכולל של רקמת שומן אנושי לבדיקת adipogenic תגובות4,32,33,34. מחקר שנערך אחת בשימוש המתלים תא בודד מן microvasculature של רקמת שומן אנושי, אך לא ברור אם היו adipocytes הבדיל הקיר או אנדותל הטבע3.
Immunophenotyping נוספים CD34 + CD31 + תאים באמצעות cytometry זרימה הראה חוסר סמנים CD45 ו CD24 ללא קשר שלהם דיפו המוצא שלהם. חשוב, אנחנו הראו כי לאחר 3 קטעים בתרבות, CD31 + CD34 + תאים משמרים שלהם הפונקציונליות של אנדותל הפגינו על ידי ההצטברות של acetylated LDL מערך צינור במבחנה ב- 3D-מטריצה. כמו כן, adipocytes הבדיל ייצג אוכלוסייה מעורבת של תאים בז/חום ולבן, בהתבסס על המורפולוגיה שלהם סמנים מולקולריים, כולל ביטוי חלבון UCP-1. מחקרים קודמים בעכברים הראו כי להערכת רקמת שומן יכול להיות מקור של שניהם לבנים,5,adipocytes חום30 ו נתונים עדכניים יותר הראה תוצאה דומה ביחס הבידול של לבן והן מבחינה תפקודית תאים בז תרמוגנית האנושי להערכת אדיפוז3.
שלא כמו רוב הפרסומים בשימוש קוקטיילים adipogenic המכילים מרכיבים מרובים עבור הבידול adipocyte מתוך מגוון של אבות במבחנה, מצאנו כי רוזיגליטזון, אינסולין כל אלה מספיקים לה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאים. בעוד אנו מודעים כי רוזיגליטזון לבד יכול לגרום הצטברות שומנים בדם בשאינה-שומן בתאי35, חתימה מולקולרית עבור פאן-adipocyte וסמנים בראון/בז adipocyte, כולל חלבון UCP-1 ביטוי בתאי בחר, מאשרת את בוגרת פנוטיפ adipocyte של חלק מהתאים הבדיל. שלנו adipogenic שני-המרכיב קוקטייל מפשט את פרוטוקול פרוצדורלי והופכת אותו חסכונית יותר.
הבחנה חשובה היתה התגובה adipogenic CD34 + CD31 + תאים היה משתנה מאוד עם נושא התורם, אדיפוז דיפו. למרות הבדלים ספציפיים דיפו adipogenic התגובות של אדיפוז בתאי גזע או אבות וסקולרית סטרומה היה דיווח בעבר32,34, ההשתנות הנושא של תגובה כזו היא תצפית הרומן. . הדגימות האנושי 20 ניתח, 3 SC ותאים אום 7 לא הגיב ל אינדוקציה adipogenic. התגובות הכי חזקים הראה > 90% של התאים מגיבים אינדוקציה לדוגמאות 4 מ- SC ו עבור 2 דגימות מן המפרך מעניין, מצאנו כי התגובה נמצא ביחס שלילי עם HbA1c, לא לתאם עם התגובה חוץ גופית גירוי האינסולין בתאים מובחן. אנו טוענים כי ההבדל בתגובה ואינו הפארמצבטית המסכן של הטכניקה, אבל מעדיף משקף את טביעת האצבע בודדים של תאים המחקים ויוו תגובות. שימור זה ההפרש התגובה דורש אימות, עשוי לייצג שיטת הקרנה קלה יחסית ההיענות לטיפולים שמטרתם לעורר adipogenesis ויוו. להבין עוד יותר את מקור ההשתנות בודדים ב- adipogenic פוטנציאליים, immunophenotyping נוספים יש צורך לזהות את subpopulations תא בתוך CD34 + CD31 + האוכלוסייה שיש פונקציה קדמון adipocyte ספציפיים.
המגבלות של פרוטוקול זה נמנים על אפיון לא שלם של אוכלוסיות תאים; הרחבת ממושך יחסית ושעות בידול (2 שבועות + 2 שבועות); מגבלות אפשריות כדי לגשת דגימות האנושי והצורך לעיבוד מיידי של רקמות שנאספו טרי; מחסור בנתוני פונקציונלי עבור התאים הבדיל הנוכחי. ישנם מספר יתרונות של מתודולוגיה זו כוללת פרוטוקול לא מהגידולים הדירים; תאים זה סביר שומרים טביעות אצבע של שלהם פנוטיפ ויוו ; ההרחבה של תאים כמויות קטנות מאוד של רקמות עם עלויות נמוכות יחסית; האפשרות cryopreserve התאים ולשמר שלהם חתימה adipogenic בעקבות מחדש תרבות; אפשרות לייצר מאגרים של תאים אלה, כך הם יכולים לשמש בעתיד הקרנה או למטרות אחרות.
פרוטוקול זה, על CD34 + CD31 + תאים מתקבל בתוצאה הסופית יכול לשמש כפלטפורמה translational ללימודי מכניסטית והן לסינון למטרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בקי מרקז, למתאמת הקלינית במרכז Bariatric Sentara, על הסיוע עם התהליך של החולה ההקרנה ואני מסכים. מחקר זה נתמך על ידי R15HL114062 כדי Dobrian ד לימור קלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
