Summary
Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.
Abstract
Adipositas wird begleitet von einer umfangreichen Umbau des Fettgewebes in erster Linie über Adipocyte Hypertrophie. Extreme Adipocyte Wachstum führt ein schlechtes ansprechen auf Insulin, lokale Hypoxie und Entzündungen. Durch die Stimulierung der Differenzierung der funktionalen weiße Fettzellen aus Vorläuferzellen, radikale Hypertrophie der Adipocyte Bevölkerung verhindert werden kann und infolgedessen die metabolische Gesundheit des Fettgewebes verbessert werden kann, sowie eine Reduzierung der die Entzündung. Auch kann durch die Stimulierung einer Differenzierung der Adipozyten Beige/braun, der Ganzkörper-Energieaufwand erhöht werden, was zu Gewichtsverlust. Dieser Ansatz könnte die Entwicklung von Fettleibigkeit Komorbiditäten wie Diabetes Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verhindern.
Dieses Papier beschreibt die Isolation, Erweiterung und Differenzierung der weiße und Beige Adipozyten aus einer Teilmenge von menschlichen Fettgewebe Endothelzellen, die die CD31 und CD34-Marker Co Ausdrücken. Die Methode ist relativ billig und nicht arbeitsintensiv. Es erfordert Zugang zu menschlichen Fettgewebe und das subkutane Depot eignet sich für die Probenahme. Für dieses Protokoll frisches Fettgewebe Proben aus krankhaft übergewichtigen Probanden [Body-mass-Index (BMI) > 35] werden während der bariatrischen Chirurgie Verfahren gesammelt. Mit einem sequentiellen Immunoseparation von den Stromazellen vaskulären Bruch, sind genügend Zellen von weniger als 2 – 3 g Fett hergestellt. Diese Zellen in Kultur über 10 – 14 Tage erweitert werden können, können kryokonserviert werden und behalten ihre Eigenschaften adipogenen mit bis zu 5 – 6 Durchgang passagierung. Die Zellen werden für 14 Tage mit einer adipogenen cocktail mit einer Kombination von Humaninsulin und PPARγ-Agonisten-Rosiglitazon behandelt.
Diese Methode kann verwendet werden, für den Erhalt der Nachweis der Konzept-Experimente an molekularen Mechanismen, die adipogenen Antworten in Endothelzellen Fettzellen zu fahren, oder für das screening von neuer Medikamenten, die die adipogenen verbessern können Antwort geleitet, entweder in Richtung weiß oder Beige/braun Adipocyte Unterscheidung. Mit kleinen subkutanen Biopsien, kann diese Methode zur Bildschirm aus non-Responder Probanden für klinische Studien zielte darauf ab, Beige/braun und weiße Fettzellen für die Behandlung von Adipositas und Komorbiditäten zu stimulieren.
Introduction
Aktuelle Belege dafür, dass sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen eine Teilmenge von Zellen, die ihren Wohnsitz in das Fettgewebe Gefäßsystem in entweder weiß oder Beige/braunen Fettzellen1,2,3unterschieden werden kann. Der Phänotyp dieser Zellen ist ein Thema der Kontroverse, mit Nachweise für Endothelzellen, glatte Muskulatur/Pericyte oder ein Spektrum von intermediate Phänotypen4,5,6,7. Der Umfang der Ausarbeitung dieser Methode war, das adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + Endothelzellen aus verschiedenen Fettdepots von übergewichtigen Menschen isoliert zu testen. Andere Studien in der Literatur konzentrieren sich auf das Potenzial der gesamten Stromazellen vaskulären Fraktion oder der bekannten Adipocyte Stammväter2,8,9adipogenen. Da derzeit vorhandene Technologien speziell Fettgewebe Endothelzellen für Drug Delivery10ausrichten können, ist Verständnis das Potenzial solcher Zellen adipogenen unterziehen Induktion auf weißem oder beigem Adipozyten wichtig für zukünftige gezielte Therapien.
Verschiedene Gruppen berichteten die Kombination von CD31 und CD34-Marker als Surrogate, endotheliale Zellen aus menschlichen Fettgewebe11,12,13zu isolieren. In der Regel erfolgt die Isolierung mit zwei aufeinander folgenden Schritten und eine positive Selektion mit magnetischen Beads. In diesem Bericht wurde Immunoseparation mit CD34 + magnetische Beads mit Plastikperlen CD31 kombiniert eingesetzt. Wir fanden diese Technik besser als die sequentielle magnetische Immunoseparation in Bezug auf die Erhaltung der typischen Kopfsteinpflaster endotheliale Morphologie. Darüber hinaus konnten wir erzeugen genügend Zellen für die Expansion und adipogenen Induktion ab weniger als 1 – 2 g Fett benötigt. Eine kleine Probe-Biopsie des subkutanen Fettgewebes ist genug, um die benötigte Menge an Zellen für downstream-Anwendungen zu produzieren. Dieser Aspekt ist potentiell wichtig, insbesondere dann, wenn diese Methode für das Screening für eine Reaktion auf adipogenen Induktion an Probanden genutzt wird.
Im Gegensatz zu anderen Systemen, die in der Literatur beschrieben, nutzt diese Methode nur zwei Zutaten zur adipogenen Einarbeitung von CD34 + CD31 + Zellen: einem PPARγ-Agonisten — Rosiglitazon – und Humaninsulin. Wichtig ist, fällt die Menge an Insulin verwendet in Normal/Hochton des zirkulierenden post-absorptive Insulin in Menschen14. Der Grad der Ansprechbarkeit auf Insulin von den Zellen in Vitro, gemessen durch Phosphorylierung von Akt, korreliert nicht mit ihrer Fähigkeit zur Reaktion auf die Induktion cocktail. Interessanterweise mit diesem Induktion cocktail und experimentellen Bedingungen, eine Mischung aus weiß und Beige/braunen Zellen stammen wie von der Größe und Anzahl der intrazellulären Lipid Tröpfchen und den Ausdruck von molekularen Markern bestimmt. Dieses einfache und kostengünstige Induktion Protokoll zusammen mit der quantitativen Erfassung des Phänotyps der Responder Zellen (weiße vs. Beige) ermöglicht ein Screening der Agents, die potenziell das Gleichgewicht der differenzierten Beige verändern können : weiße Fettzellen.
Diese Methode bietet auch einen translationalen Ansatz für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der angereizte des vaskulären endothelialen Vorläuferzellen im menschlichen Fettgewebe. Mit dieser speziellen Isolierung/Differenzierung Technik können Ermittler Verhören verantwortlich für angereizte in eine Teilmenge der vaskulären endothelialen Zellen aus verschiedenen Fettdepots in schlanke und übergewichtige Menschen verschiedene Wege.
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Protocol
Das institutionelle Review Board Committee an der Eastern Virginia Medical School genehmigte Forschung und Sammlung von menschlichen Fettgewebe Proben in der Studie verwendet. Informierter Zustimmung wurde von den Patienten gesammelt.
1. Vorbereitung der Puffer, Medien und Instrumente
- Bereiten Sie eine Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered Lösung (KRBBS): 135 mM Natriumchlorid, Kaliumchlorid 5 mM, 1 mM-Magnesium-Sulfat, 0,4 mM Kalium Phosphat Diabas-, 5,5 mM Glukose, 1 mM Adenosin, 0,01 % Antibiotikum/antimykotische Mix (50 µg/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin, 30 µg/mL von Gentamicin, 15 ng/mL Amphotericin) und 10 mM HEPES (pH = 7,4). Diese Lösung wird jeweils für die Gewebe-Sammlung und die Verdauung frisch zubereitet.
- Bereiten Sie eine frische Kollagenase-Lösung: 1 mg/mL der Kollagenbildung, Typ 1, in KRBSS; machen Sie 3 mL/g Fett. Vorwärmen der Kollagenase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad vor der Gewebe-Verdauung.
- Bereiten Sie einen CD34 Zelle Isolation Puffer: 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Bereiten Sie angereizte Medien: DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin, 1,25 µL/mL von Humaninsulin (5 µg/mL oder 144 mU/mL) und 0,36 µL/mL von 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).
- Bereiten Sie eine 0,3 % Öl Rot O (ORO) Stammlösung (Gewicht/Volumen) durch Auflösen von 0,3 g Oro in 100 mL Isopropanol.
2. adipösen Stromazellen vaskulären Bruchteil Isolation
Hinweis: Die Studie umfasste eine Cross-Sectional Kohorte von krankhaft übergewichtige Typ-2-Diabetiker (T2D) und nicht-diabetischen Themen, im Alter von 18 bis 65 Jahren, in der adipositaschirurgie am Sentara Metabolic und Gewicht-Verlust-OP-Zentrum (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Ausschlusskriterien enthalten eine autoimmune-Erkrankung Typ 1 Diabetes Mellitus, einschließlich der Bedingungen erfordern chronische immunsuppressive Therapie, entzündungshemmende Medikamente, Thiazolinendiones, aktiver Tabakkonsum, chronische oder akute Infektionen oder eine Geschichte der Bösartigkeit innerhalb der letzten 12 Monate behandelt. T2D wurde definiert als eine Fastende plasmaglukose von 126 mg/dL oder höher, ein Glukose von 200 mg/dL oder mehr nach eine 2 h-Glukose-Toleranz-test oder dem Einsatz von antidiabetischen Medikamente.
- Sammeln Sie menschliche omentalis (OM) und subkutanem Fettgewebe (SC) (AT) von menschlichen Themen in der adipositaschirurgie.
- Halten Sie den OM und SC AT in separaten Ampullen mit Hank es gepufferte Salzlösung mit 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin bei Raumtemperatur unmittelbar nach Entnahme von Gewebe.
- Sorgfältig reinigen und Entfernen von fibrotische und eingebrannte Abschnitten des Gewebes mit 70 % Ethanol tupfte Scheren und Pinzetten, wenn die Probe im Labor nach der Extraktion des Gewebes kommt.
- Das Fettgewebe wiegen und It in 5 g (oder weniger) aliquoten für die Kollagenase Verdauung zu partitionieren.
- Hacken Sie fein 5 g des AT in 5 mL einer Kollagenase-Lösung in einem Funkeln Fläschchen bei Raumtemperatur, mit zwei Paar der Schere.
- Das Hackfleisch / Gewebe für insgesamt 15 mL eine zusätzliche 10 mL der Kollagenase-Lösung hinzufügen.
- Die Proben für 1 h bei 37 ° C in einem Wasserbad mit kontinuierlichen schütteln zu verdauen.
- Schneiden Sie die Spitze aus einer 20 mL Spritze zu einem stumpfen Ende.
- Schneiden Sie ein Quadrat von 9 x 9 cm von einem Netz von 250 µm und schieben Sie es auf halbem Weg in ein 50 mL konische Röhrchen mit dem stumpfen Ende Spritze.
- Gießen Sie die Proben in die 20 mL Spritze mit stumpfen Ende und den Filter durch die 250 µm-Nylon-Netzgewebe in das 50 mL konische Röhrchen, Adipozyten und Stromazellen vaskuläre Zellen von unverdauten Gewebe zu trennen.
Hinweis: Verwenden Sie mehr als 5 g AT pro 50 mL konische Rohr, nicht, wie das Netz durch überschüssige fibrotische unverdaute Material verstopft wird. - Das Funkeln Fläschchen mit 10 mL KRBBS waschen Sie aus und Gießen Sie ihn durch den Filter verbleibenden Zellen gesammelt.
- Inkubieren Sie die gefilterten Proben für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um die Adipozyten zu schweben an der Oberseite des Rohres und einige der Stromazellen vaskulären Zellen sich auf der Unterseite des Rohres zu ermöglichen. - Nutzen Sie eine 20 mL Spritze und ein 20 x 6 in pipettieren Nadel die Stromale vaskulären Bruch-Schicht zu entfernen und auf einem sauberen 50 mL konische Rohr übertragen.
- Fügen Sie 10 mL KRBBS und lassen Sie die Proben zu sitzen auf der Bank für 5 min bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.12 – 2.14 zweimal.
Hinweis: Diese Schritte werden sichergestellt, dass keine der Stromazellen vaskulären Zellen mit der schwimmenden Adipozyten Verunreinigung. - Halten Sie die Stromale vaskulären Brüche aus beiden Depots auf dem Eis für die Weiterverarbeitung, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
Hinweis: Lassen Sie die Zellen nicht auf Eis für mehr als 1 h, da dies auf die Zellviabilität auswirken kann. Die Adipozyten können in flüssigem Stickstoff für die Langzeitspeicherung Blitz eingefroren oder frisch für Experimente verwendet.
3. Isolation von Fettgewebe Endothelzellen
- Drehen Sie sich die Stromale vaskulären Brüche (SVF) mit 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die Proben aus der Zentrifuge und der Überstand Gießen Sie vorsichtig ab; halten Sie die Tablette mit der SVF-Zellen.
- Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 5 mL PBS.
Hinweis: Wenn mehr als 5 g eines AT-Depots in mehrere Aliquote verarbeitet wurde (siehe Punkt 2.4), bündeln Sie die Zelle Pellets zusammen. - Drehen Sie die Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen des Überstands, Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS und die Zellen zu zählen.
Hinweis: Hier wurde ein automatische Zelle Zähler für Zellzählung verwendet. Die Zellviabilität wurde durch eine Mischung von 12 µL Zellsuspension mit 12 µL einer Acridin Orange/Propidium Jodid (AO/PI) Lösung erzielt (siehe Tabelle der Materialien). Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT für jedes Depot ist: (a) OM-Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC-Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots war > 90 %. - Pellet-Proben bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
Hinweis: Ein CD34 Immunomagnetic Auswahl Protokoll (siehe Tabelle der Materialien) wurde für Schritte 3,7 – 3.15 angepasst. - Das Pellet in 100 µL CD34 Isolierung Puffer aufzuwirbeln.
Hinweis: Die gesamte zellenzahlen erfordern die folgenden Resuspension Bände: (a) < 2 x 107 Zellen: Aufschwemmen das Pellet in 100 µL; (b) 2 x 108– 5 x 108 Zellen: das Pellet in 1 mL aufzuwirbeln. In Schritten 3,9 – 3.16, waren die Mengen der verwendeten Reagenzien für verkleinert < 2 x 107 Zellen. - Fügen Sie 10 µL CD34 cocktail und inkubieren Sie die Probe für 15 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 5 µL des magnetischen Beads und inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur.
- Jede Probe 2,5 mL CD34 Isolierung Puffer hinzu, und legen Sie die Proben in den Magneten für 5 min bei Raumtemperatur.
- Invertieren den Magnet für 5 s, aus der Isolation-Puffer zu gießen.
- Die Proben vom Magneten zu entfernen, und wiederholen Sie die Schritte 3.10 und 3.11 4 X.
- Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten und 2 mL CD34 Isolierung Puffer.
- Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 1 mL CD34 Isolierung Puffer und zählen Sie die Zellen zu.
Hinweis: Hier ist die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT: (a) OM-Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC-Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Ein CD31 Kunststoff Immunobead-Protokoll wurde für Schritte 3.16 – 3,34 angepasst (siehe Tabelle der Materialien). - Pellet-Zellen bei 500 X g für 5 min und das Pellet in 250 µL Puffer B und 250 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.
- Aufschwemmen Sie gründlich CD31 Perlen durch aufschütteln der Röhre.
- Fügen Sie 20 µL CD31 Perlen.
Hinweis: Aufgrund der Ergebniszelle zählt > 1 x 106, das Volumen war nach Vorgaben des Herstellers verkleinert. - Inkubieren Sie die Probe mit Schaukeln für 30 min bei Raumtemperatur.
- Legen Sie ein Sieb auf einen sterilen 50 mL konische Rohr.
Hinweis: Die größere Öffnung des Siebes muss oben sein. - Hinzugeben Sie vor der Zelle Trennung 1 mL Waschpuffer auf das Sieb equilibrate. Übernehmen Sie die Mischung unter Schritt 3.16 in das Sieb erzeugt.
- Waschen Sie das Sieb mit 5 mL Waschpuffer in einer kreisförmigen Bewegung für ein Gesamtvolumen von 20 mL. Legen Sie den Stecker auf einer sterilen 50 mL konische Rohr und schließen Sie den Luer-Lock.
- Legen Sie das Sieb auf den Stecker. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer entlang der Mauer des Siebes. Fügen Sie 1 mL der aktivierten Puffer D entlang der Mauer des Siebes. Die Probe sanft Wirbeln und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 1 mL Waschpuffer. Die Perlen trennen Sie der Zellen durch pipettieren nach oben und unten 10 X.
Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen erzeugen. - Öffnen Sie das Luer-Lock und lassen Sie die freistehenden Zellen in der 50 mL konische Rohr fließen. Waschen Sie das Sieb 10 X mit 1 mL Waschpuffer jedes Mal.
- Entsorgen Sie den Anschluss und Sieb und Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL komplette EGM-2 Medien für Kultur.
Hinweis: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Gramm AT an dieser Stelle ist: (a) OM-Depot: 5,92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC-Depot: 4.12 x 103 ± 2,1 x 103. Die Lebensfähigkeit der Zellen von beiden Depots lag bei über 90 %.
(4) Induktion von angereizte in isolierten Endothelzellen
- Wachsen Sie die Zellen in Zellkultur behandelt 6-Well-Platten mit kompletten EGM-2 Medien in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator. Ersetzen Sie die Medien alle 3 – 4 Tage, bis die Zellen Zusammenfluss von 80 – 90 % erreichen.
Hinweis: Die Verdoppelung der Bevölkerung ist zwischen 2 – 3 Tage. - Erweitern Sie die Zellen durch Ausplattieren sie auf 100 mm Petrischalen und Teilen der Zellen 1:3 einmal. Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen auf Durchgang 2.
- Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer automatischen Zelle entgegenzuwirken (siehe Tabelle der Materialien).
- Ca. 100 – 200.000 Samenzellen in 6-Well-Platten, die doppelte Brunnen für jedes Depot und Kultur, die sie in völliger EGM-2 Medien für 2 Tage zu gewährleisten.
- Aus jedem Wachstumsmedien Aspirieren und ersetzen Sie es mit 2 mL DMEM/F12 mit 5 % FBS und 50 µg/mL von Penicillin/Streptomycin zur Bekämpfung Zellen und ersetzen Sie es mit 2 mL angereizte Medien (siehe Punkt 1.4) für die Behandlung der Zellen.
- Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator für 13 Tage austauschen der jeweiligen Medien alle 3 bis 4 Tage.
Hinweis: Zellen fangen an, nach 4 Tagen Behandlung Lipide ansammeln. - Durchführung von ORO und Nil rote Färbung nach veröffentlichten Methoden15–17.
- Um Zellen für eine RNA-Extraktion zu isolieren, entfernen Sie das Medium aus dem 6-Well Induktionsplatten und waschen Sie ihn mit 1 mL sterile PBS.
- Fügen Sie 350 µL einer Guanidium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Lösung (siehe Tabelle der Materialien), jeweils gut und bei 5 – 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Schaber Zelle und übertragen Sie die Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
Hinweis: Die Proben können im RNA-Gewinnung und Weiterverarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden. - Die Proben unter Verwendung einer angepassten RNA-Extraktion mRNA entziehen (siehe Tabelle der Materialien)-Protokoll.
- Führen Sie eine Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Bewertung der Genexpression mit folgenden Sonden: Adiponectin, UCP-1, und CIDEA (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Hier, RT-PCR-Verfahren wurden durchgeführt mit den folgenden standard-Protokoll: Denaturierung (95 ° C; 15 s), Glühen und Erweiterung (60 ° C, 1 min) für 40 Zyklen. Die Proben, die Gene mit CT -Werte > 35 galten nicht nachweisbar.
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Representative Results
Unser Protokoll bezweckt eine in-vitro- Ansatz zur adipogenen Potenzial von CD34 + CD31 + vaskuläre Zellen aus verschiedenen Depots von menschlichen Fettgewebe zu bestimmen. Abbildung 1Azeigt ein vereinfachtes Flussdiagramm-Diagramm. Der erste Schritt durch eine positive Selektion von CD34 Ausdruck Zellen führt zu > 95 % CD34 + Zellen in der Bevölkerung der frisch isolierten Zellen (Abbildung 1A). Wichtiger ist, ist diese Markierung verloren, nachdem die Zellen für ein paar Passagen kultiviert werden. Da CD34 gemeinsame Marker für diverse hämatopoetischen und nicht hämatopoetischen Vorläuferzellen ist, ist der folgende Schritt für die Trennung von endothelialen Vorläuferzellen die positive Selektion CD31 + Zellen aus der CD34 + Zellpopulation (Abbildung 1A). Obwohl CD31 ein Marker für die Endothelzellen ist, kann es auch für Teilmengen der blutbildenden Zellen gefunden werden. Wir mehrere Zubereitungen aus dem omentalis und subkutane Fett durch Durchflusszytometrie analysiert und immer wieder festgestellt, dass CD34 + CD31 + Zellen CD45-Marker (Abbildung 1 b, Paneele) zum Ausdruck bringen. In der Regel < 1 % der Zellen zeigten CD45 Positivität, aus der gesamten Zellpopulation. Dieses Ergebnis führte uns zu dem Schluss, dass wir wahrscheinlich eine Vorbereitung praktisch frei von hämatopoetischen Vorläuferzellen gewonnen. Um festzustellen, ob die Zellen den Adipocyte Stammzell-Marker CD24 auszudrücken, wir Zellen von omentalis und subkutanen Depots analysiert und festgestellt, dass praktisch keine Zellen CD24 Marker in die omentalis Depot (Abbildung 1 b, untere Verkleidungen) und weniger als 5 % der ausgedrückt die Zellen ausgedrückt die Markierung im subkutanen Depot (nicht dargestellt). Abschließend möchte ich sagen, erhalten mit dieser Trennung Methodik wir CD34 + CD31 + CD45-CD24-Zellen von omentalis und subkutanen Depots von übergewichtigen Probanden.
Mit Kunststoff-Perlen mit einem CD31 Antikörper konjugiert, wir erhalten Zellen, die die gepflasterten endotheliale Morphologie bei frühen Passagen, im Gegensatz zu Zellen getrennt, mit Hilfe der magnetischen Beads konjugiert mit einem CD31 Antikörper, die angezeigt angezeigt ein spindelförmige mesenchymalen Phänotyp sofort nach der Trennung (Abbildung 2A). Um die endotheliale Identität der CD34 + CD31 + Zellen weiter zu untermauern, haben wir zwei funktionale Tests durchgeführt: eine Aufnahme von DiI-Ac-LDL und einer Basalmembran Matrix (bezeichnet als Matrix hereon) Rohr Bildung in Vitro. CD34 + CD31 + -Zellen wurden mit DiI-Ac-LDL inkubiert und die große Mehrheit der Zellen waren positiv für die Aufnahme (Abbildung 1). Als Positivkontrolle, verwendeten wir eine menschliche Fettgewebe mikrovaskuläre Endothelzellen Primärzelle Linie (HAMVEC), die im Handel erhältlich ist (siehe Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 1). Wir prüften auch, ob die CD34 + CD31 + Zellen ihre Endothelfunktion behalten nach Kultivierung durch die Bestimmung der Fähigkeit solcher Zellen, spontane Schiff-ähnlichen Strukturen in Vitro, in einer 3D-Matrix bilden. Nach 3 Durchgänge, CD31 + CD34 + Formen röhrenförmigen Behälter-ähnliche Strukturen in einer Matrix vergleichbar mit einer HAMVEC primären menschlichen Endothelzellen Linie (Abbildung 1).
Nach dem Ausbau der Zellen für 2 – 3 Passagen wechselten wir die Zellen von EGM-2 komplette Medien mit Pro-angiogene Wachstumsfaktoren in DMEM/F12 Medien ergänzt mit 5 % FBS, Rosiglitazon (1µM) und Insulin (144 mU/mL). Aufrechterhaltung der Zellen im EGM-2 komplette Medien dramatisch reduziert ihre adipogenen Differenzierung. Auch eine Zugabe von Dexamethason und 3-Isobuthyl-1-methylxanthin zu den Medien änderte nicht die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Lipid-Ansammlung und eine Ergänzung von Indometacin deutlich reduziert Lipid Akkumulation (Daten nicht gezeigt). Basierend auf diesen Vorversuchen, beschlossen wir, nur Rosiglitazon und Insulin für die adipogenen Induktion verwenden. Nach 14 Tagen der Kultur in adipogenen Medien die Zellen wurden fixiert und gefärbt mit Öl Rot O oder Nil-rot und die Kerne wurden mit DAPI (Abb. 2 b) counterstained. In den Abbildungen sind repräsentative Bilder von Zellen isoliert von gekoppelten subkutaner (SC) (Abbildung 2 b, Paneele) und omentalis (OM) (Abbildung 2 b, untere Verkleidungen) Fettgewebe der drei menschlichen Probanden mit einem BMI zwischen 37-45 kg/m2gezeigt. Bitte beachten Sie, dass die Antwort auf die Induktion zwischen den Fächern und zwischen Depots des gleichen Motivs variiert. Wie gesehen in das fluoreszierende Bild in Abbildung 2 b, eine gemischte Bevölkerung von unilokuläre (rote Pfeile) und multilocular (weisse Pfeile) sind Lipid-haltigen Zellen sowie Zellen, die Lipide (gelbe Pfeile) nicht ansammeln in der Regel vorhanden. Das Verhältnis zwischen der Anzahl dieser Zellen ist auch sehr Variable mit dem Thema und dem Depot des Ursprungs. Eine Quantifizierung des Prozentsatzes der Lipid-haltigen Zellen (basierend auf Öl Rot O Positivität) aus den gesamten Zellen (basierend auf DAPI-gefärbten Kernen) zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen dem SC und OM Depots desselben individuell, mit den Zellen aus dem SC-Depot wird stärker auf die adipogenen Induktion (Abbildung 2). Die Erklärung für die Heterogenität in Reaktion zwischen den Themen und den Depots des gleichen Motivs ist nicht klar. Jedoch spekulieren wir, dass, die wahrscheinlich auf das Wesen der Zellpopulation bezieht, die den Fingerabdruck der in Vivo Phänotyp/Umwelt und nicht aufgrund der Variabilität in der Isolierung Protokoll trägt.
Um zu bestätigen, dass die Zellen die Differenzierung zu Reifen Adipozyten unterzog, messen wir die Genexpression von Pan-Adipocyte Marker Adiponectin und die braun/Beige-Marker UCP-1 und CIDEA in den Zellen nach 13 Tagen der adipogenen Induktion im Vergleich zu UN-induzierte Kontrollzellen. Adiponectin Ausdruck stieg bis zu 10,000-fold in den differenzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 2D). Die Gen-Expression von CIDEA und UCP1 war nur in den Zellen nach der adipogenen Stimulation (Bild 2D) nachweisbar. Insbesondere die UCP-1 Expression war sehr variabel, reflektieren die unterschiedlichen Anteile der weiß: braun / Beige Zellen innerhalb der Zellenbevölkerung. Die Expression des Gens Zimmermädchen RPL27 war bemerkenswert konsistent zwischen den Proben mit CT -Werte zwischen 18 – 20 Zyklen und fanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zellen, die die adipogenen Differenzierung unterzogen und die unbehandelte Kontrollen. Wir haben auch ein UCP-1-Protein-Expression in den Zellen, die die Multi-schotenartige Phänotyp in einem punctated Muster angezeigt, die eine mitochondriale Lokalisierung (Abb. 2E) suggeriert festgestellt. Das Protein UCP-1 war nicht nachweisbar in Zellen, die keine Lipide ansammeln oder in Zellen mit mehreren, sehr kleine Tröpfchen, die wahrscheinlich nicht vollständig differenzierten Adipozyten (Abb. 2E).
Unsere Beobachtung, dass das adipogenen Potenzial der CD34 + CD31 + Zellen Depot-spezifische und hoch Variable unter verschiedenen Themen hat uns dazu veranlasst, für mögliche Zusammenhänge mit dem BMI, Alter und HbA1c zu suchen. Unter den 28 Proben getestet fanden wir keine signifikanten Korrelationen zwischen den potenziellen adipogenen und Alter oder BMI; Wir fanden eine signifikante negative Korrelation zwischen HbA1c und die Lipid-Ansammlung in den Zellen aus dem OM-Depot (Abb. 3A). Dieses Ergebnis zeigt eine mögliche Verbindung mit der chronischen Hyperglykämie Umwelt und zukünftige Untersuchung verdient. Dies zeigt auch, dass die CD34 + CD31 + Zellen wahrscheinlich die in Vivo -Signatur ihrer Fähigkeit zur Bewältigung einer adipogenen Induktions führen. Wir zeigen auch, dass diese Zellen Variable Ebenen der Akt Phosphorylierung nach einer in-vitro- Insulin-Stimulation werden angezeigt (Abbildung 3 b, oben). Diese Variabilität als Reaktion korreliert jedoch nicht gut mit ihrer Fähigkeit, eine adipogenen Differenzierung zu unterziehen, wie gezeigt durch das Öl Rot O Färbung auf den Bildern die passenden Proben (Abb. 3 b, unten).
Abbildung 1: Trennung und Charakterisierung von CD34 + CD31 + Zellen aus menschlichen Fettgewebe. (A) dieses Flussdiagramm-Diagramm zeigt die wichtigsten Schritte der Isolation und Differenzierung. Nach der positiven Selektion CD34 magnetische Beads, mit > 95 % der frisch isolierten Zellen, vor dem zweiten Schritt der Auswahl sind CD34. (B) Dieses repräsentativen Durchflusszytometrie zeigt eine Weiterleitung verstreuten Grundstück eingezäunt für live Zellpopulation; eine ungefärbte Probe auf dem Kanal FITC (BluFl2); und CD45 Färbung omentalis Bildung einer repräsentativen Stichprobe an der Spitze. Unten zeigt die gleiche Reihenfolge wie oben, aber für die CD24 (Alexafluor 647-markierten) Zellen aus der omentalis Probe gezeigt. (C) diese repräsentative mikrographen zeigen eine Aufnahme von DiI-Ac-LDL (rot) von CD34 + CD31 + Zellen nach 4 h der in-vitro- Inkubation (Oberseite). Eine ähnliche Aufnahme fand in einer menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Endothelzellen Primärzelle Linie (HAMVEC) (Bodenplatte). Die Kerne werden durch DAPI blau angezeigt. (D) zeigen diese repräsentative mikrographen eine in-vitro- Rohr-Bildung von CD34 + CD31 + Zellen ausgesät in einer 3D-Matrix. CD34 + CD31 + Zellen (Abschnitt 3) wurden im Anschluss an eine Färbung mit FITC-Calcein 24-Well-Platten eingesät und für 4 h in komplette Endothelzellen Medien inkubiert. Die Zellen wurden mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet. HAMVEC, an der gleichen Dichte ausgesät wurde zum Vergleich herangezogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Adipogenen Induktion und Marker CD34 + CD31 + Zellen. (A) diese Vertreter mikrographen zeigen die morphologischen Unterschiede zwischen CD34 + CD31 + Zellen isoliert durch eine positive Selektion mit CD31 + magnetische Beads vs. CD31 + Kunststoff-Perlen. Die Zellen wurden nach der Isolierung in der Passage 1 abgebildet. 100 X ist die Vergrößerung verwendet. (B) diese Platten sind repräsentative mikrographen Öl rot o gebeizt CD34 + CD31 + Zellen aus gekoppelten subkutaner (SC) und omentalis viszeralen (OM) Proben von 3 verschiedenen Themen. Die Zellen wurden für 2 – 3 Passagen im EGM-2 komplette Medien kultiviert, dann eingeschaltet DMEM/F12 Medien mit 5 % FBS und behandelt mit Insulin (144 mU/mL) und Rosiglitazon (1 µM) für 14 Tage, mit Medien, die alle 3 Tage gewechselt. 100 X ist die Vergrößerung verwendet. Das repräsentative fluoreszierende Bild zeigt Adipo rote Lipid Tröpfchen (grün) und DAPI nuklearen Färbung (blau). Bitte beachten Sie eine Mischung aus Zellen mit unilokuläre Lipide (roter Pfeil), multilocular Lipid Tröpfchen (weißer Pfeil) oder Zellen, die keine Lipid-Ansammlung (gelber Pfeil) zeigen. Die verwendete Vergrößerung beträgt 200 X, Maßstabsleiste = 50 µm. (C) dieses Panel zeigt eine Quantifizierung der adipogenen potential ausgedrückt als Öl Rot O (ORO) positive Zellen auf insgesamt DAPI-gefärbten Kernen normiert. CD34 + CD31 + Zellen von OM und SC Depots des gleichen Motivs zeigen einen signifikanten Unterschied in der adipogenen durch ein gekoppeltes Student t-Test (n = 7). (D) die Genexpression von Reifen Adipocyte Marker (Adiponectin, UCP-1 und CIDEA) wurde durch RT-PCR in den Zellen nach 14 Tagen der adipogenen Induktion und in der Kontrollzellen gemessen. Die Daten werden als Fach-Änderung für die Genexpression von Adiponectin ausgedrückt. Der Ausdruck CIDEA und UCP-1 war nicht nachweisbar in der Kontrollproben. Die Werte stellen ΔCt auf RPL27 als Zimmermädchen gen normalisiert. Die C-T -Werte für RLP27 zwischen 18 – 20 Zyklen für alle Proben, die in die Analyse einbezogen wurden (n = 3 – 5 Personen). Die Daten werden ausgedrückt als ± SD bedeuten Eine gekoppelte Student t-Test wurde für eine statistische Analyse der Daten verwendet. p < 0,05 die Nullhypothese abgelehnt. (E) dieses Panel zeigt die Proteinexpression der UCP-1 in CD34 + CD31 + Zellen nach 13 Tagen der Induktion mit Insulin und Rosiglitazon. Immunocytochemistry mit Hilfe eines humanen polyklonalen Antikörpers der UCP-1 zeigte einen selektive Ausdruck der UCP-1 Multi-schotenartige Adipozyten. Der Nachweis gelang mit Hilfe eines Rhodamin-konjugierten Sekundärantikörper (rot) und DAPI-Färbung für Kerne (blau). Die große Vergrößerung im Einschub zeigt das punctated rote Signal entsprechend UCP-1 (roter Pfeil) sowie mehrere Lipid-Tröpfchen (LD) in verschiedenen Größen, rund um den Zellkern (N). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Korrelation zwischen adipogenen Differenzierung, HbA1c und in-vitro- Insulin-Signal. (Nicht-parametrische) (A) Spearman und Pearson (parametrische) Korrelationskoeffizienten für die OM und SC Zellen bzw. wurden verwendet, um festzustellen, die Korrelation zwischen HbA1c und die Lipid-Ansammlung (n = 20). Die Nullhypothese abgelehnt wurde, für p < 0,05. (B) an der Spitze, eine westliche Beflecken zeigt der phosphorylierten Akt (grün) und der gesamten Akt (rot) Ausdruck in CD34 + CD31 + Zellen stimuliert in Vitro mit 5 nM Insulin für 30 min vor der adipogenen Induktion (n = 8). An der Unterseite zeigt sich ein Öl Rot O Färbung der gleichen Zellen nach der adipogenen Induktion für 14 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Im Mittelpunkt dieses Papiers ist es, eine Methodik für die Isolierung, Expansion und adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelzellen von viszeralen und subkutanen Depots von menschlichen Fettgewebe zur Verfügung zu stellen.
Methoden sind berichtet worden, für die Isolierung von Endothelzellen aus verschiedenen vaskulären Betten von Nagetieren oder Menschen, bei denen in erster Linie Techniken mit CD31 Antikörper eindringmittel beschriftet oder gekoppelt mit magnetischen Beads18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. eine große Herausforderung für den universellen Einsatz dieser Techniken Isolierung ist die Heterogenität der Endothelzellen Bevölkerung in verschiedenen vaskulären Betten und das hohe Risiko einer Kontamination mit Fibroblasten und vaskuläre Wandbild Zellen. Verfeinerungen der ISOLIERUNGSTECHNIKEN, um solche Verschmutzungen zu vermeiden wurden jedoch berichteten24. Mit diesen Techniken sind meist Reifen Endothelzellen Gewebe isoliert. Fettgewebe ist ein großes Reservoir an Stamm/Vorläuferzellen, darunter endotheliale Vorläuferzellen25,26. Ein paar Zeitungen berichteten die Reinigung der endothelial Zellen aus menschlichen Fettgewebe mit einer Kombination von CD34 + und CD31 + Antikörper11,27. Zellen, die die beiden Marken express sind eine gemischte Bevölkerung von Reifen Endothelzellen und endotheliale Vorläuferzellen11,28,29. Mehreren wegweisende Publikationen Berichten, dass eine kleine Teilmenge von Endothelzellen (CD31 +) oder Wandbild (PDGFRβ +) Zellen in das Fettgewebe Gefäßsystem eine reiche Quelle von Adipocyte Stammväter5,30 ist. Diese vaskulären Zellen mit potenziellen adipogenen können weiße oder braun/Beige Fettzellen produzieren und aktive Angiogenese in der adipösen Gefäßsystem5zugeordnet sind. Diese Erkenntnisse können neue therapeutische Möglichkeiten zur Verbesserung der metabolischen Leistung bei Übergewicht und/oder induzieren Gewichtsverlust durch die Generierung von weißen und/oder thermogene Adipozyten aus vaskulären Stammväter vorsehen. Es ist daher von Interesse, eine Methodik für die einfache und wirtschaftliche Isolation, Expansion und Bewertung des Potenzials von vaskulären endothelialen Zellen aus menschlichen Fettgewebe adipogenen zu identifizieren.
Die CD34 + CD31 + Zellen aus menschlichen subkutane und omentalis viszeralen Fettgewebe-Depots zeichneten sich bereits anhand ihrer angiogenen Potenzial, die Produktion von Entzündungsmediatoren, ihre Seneszenz Marker und andere Funktionen11 , 31. Allerdings gibt es keine veröffentlichten Hinweise für das adipogenen Potenzial solcher Zellen. Bisherige Veröffentlichungen, die getrennt CD34 + CD31 + Zellen mit magnetischen Beads Bericht auf Daten aus Zellen, die aus einer Vielzahl von Themen (mindestens 10)11zusammengefasst. Dieses Papier berichtet zum ersten Mal ein Protokoll für den erfolgreichen Isolierung und Ausbau der CD34 + CD31 + Zellen von einzelnen menschlichen Spendern aus den subkutanen und omentalis Depots. Wir isoliert und Zellen von weniger als 2 – 3 g des Fettgewebes erweitert. Die CD34 + CD31 + Zellen dargestellt 3 – 5 % der gesamten SVF Zellen und > 90 % Rentabilität nach der Isolierung. Diese Zellen waren höchst proliferative und zeigte eine Vielzahl von Antworten auf die adipogenen Differenzierung nach einer in-vitro- Stimulation mit Rosiglitazon und Insulin. Frühere Studien nur Fettgewebe Stammzellen oder total Stromazellen vaskulären Bruchteil aus menschlichen Fettgewebe adipogenen Antworten4,32,33,34zum Testen verwendet. Eine kürzlich durchgeführte Studie verwendet einzelne Zellsuspensionen von Microvasculature der menschlichen Fettgewebe, aber es ist unklar, ob die differenzierte Adipozyten Wandbild oder Endothelzellen in Natur3waren.
Zusätzliche Immunphänotypisierung der CD34 + CD31 + Zellen mittels Durchflusszytometrie zeigte ihre mangelnde CD45 und CD24 Marker unabhängig von ihrem Depot Ursprungs. Wichtiger ist, wir zeigten, dass nach 3 Passagen in der Kultur behalten CD31 + CD34 + Zellen ihre Endothelzellen Funktionalität bewiesen durch die Anhäufung von schimmelpilzschäden LDL und einer in-vitro- Rohr-Formation in einer 3D-Matrix. Auch vertreten die differenzierte Adipozyten eine gemischte Bevölkerung von weiß und Beige/braunen Zellen, die aufgrund ihrer Morphologie und molekulare Marker, einschließlich ein UCP-1-Protein-Expression. Frühere Studien an Mäusen zeigten, dass Fettgewebe Gefäßsystem kann eine Quelle der beiden weißen und braunen Fettzellen5,30 und aktuellere Daten ein ähnliches Ergebnis in Bezug auf die Unterscheidung von weiß und funktional zeigten Thermogene Beige Zellen aus menschlichen Fettgewebe Gefäßsystem3.
Im Gegensatz zu den meisten Publikationen, die adipogenen Cocktails mit mehreren Inhaltsstoffen für die Adipocyte Unterscheidung aus einer Reihe von Vorfahren in Vitroverwendet, fanden wir, dass Rosiglitazon und Insulin notwendig und ausreichend für die adipogenen sind Induktion von CD34 + CD31 + Zellen. Während wir sind uns bewusst, dass Rosiglitazon allein eine Lipid-Ansammlung in nicht-Fettgewebe Zellen35, die molekulare Signatur für Pan-Adipocyte und braun/Beige Adipocyte Marker induzieren kann, einschließlich ein Protein UCP-1 bestätigt Ausdruck in den ausgewählten Zellen die Reife Adipocyte Phänotyp einiger der differenzierten Zellen. Unsere zwei-Zutat adipogenen cocktail vereinfacht das prozedurale Protokoll und macht es kostengünstiger.
Eine wichtige Beobachtung war, dass die adipogenen Reaktion der CD34 + CD31 + Zellen sehr unterschiedlich mit dem Thema Spender und adipösen Depot. Depot-spezifische Unterschiede in der adipogenen habe Antworten von Fettgewebe Stammzellen oder Stromazellen vaskulären Stammväter bereits32,34berichtet, ist die Thema Variabilität der solch eine Reaktion eine neuartige Beobachtung. Aus den 20 humanen Proben analysiert, 3 SC und 7 OM Zellen reagierte nicht auf die adipogenen Induktion. Die robustesten Antworten zeigte > 90 % der Zellen reagieren auf die Induktion für 4 Proben von SC und für 2 Proben von OM interessant, wir fanden, dass die Reaktionsfähigkeit negativ mit HbA1c korreliert ist und nicht mit der Antwort auf eine korreliert in Vitro Insulin-Stimulation in undifferenzierten Zellen. Wir argumentieren, dass der Unterschied in der Reaktion nicht wegen der schlechten Reproduzierbarkeit der Technik ist sondern spiegelt den individuellen Fingerabdruck von Zellen, die in Vivo Antworten zu imitieren. Die Erhaltung dieser differenzierte Antwort erfordert weitere Validierung und möglicherweise stellen eine relativ einfache Screening-Methode für die Reaktionsfähigkeit zu Therapien zur angereizte in Vivozu stimulieren. Um die Quelle der individuellen Variabilität in der potenziellen adipogenen besser zu verstehen, muss zusätzliche Immunphänotypisierung Zelle Subpopulationen innerhalb der CD34 + CD31 + Bevölkerung zu identifizieren, die eine spezifische Adipocyte Stammvater Funktion tragen.
Einige der Einschränkungen dieses Protokolls gehören einer unvollständigen Charakterisierung der Zellpopulationen; relativ lange Erweiterung und Differenzierung Zeiten (2 Wochen + 2 Wochen); mögliche Beschränkungen für den Zugang zu humanen Proben und die Notwendigkeit für die sofortige Verarbeitung der frisch gesammelten Gewebe; und eine aktuelle Mangel an Funktionsdaten für die differenzierte Zellen. Es gibt einige Vorteile dieser Methodik, die eine reproduzierbare und nicht arbeitsintensiv Protokoll enthalten; Zellen, die wahrscheinlich behalten den Fingerabdruck des ihre in Vivo Phänotyp; der Ausbau der Zellen von sehr geringen Mengen von Gewebe bei relativ geringen Kosten; die Möglichkeit zum Tiefgefrieren der Zellen und behalten ihre adipogenen Unterschrift nach Re Kultur; und die Möglichkeit, Speicher für diese Zellen zu generieren, so dass sie für zukünftige Screening oder für andere Zwecke verwendet werden können.
Dieses Protokoll und die CD34 + CD31 + -Zellen als Endergebnis können als translationale Plattform für mechanistische Studien und zu screening-Zwecken verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren wollen Becky Marquez, der klinischen Koordinator am Sentara Bariatrisch Zentrum, für ihre Hilfe mit dem Prozess der Patient screening und Zustimmung bestätigen. Diese Forschung wurde durch R15HL114062, Anca D. Dobrian unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
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