Summary
Differentiering av vitt och beige adipocyter från fettvävnad vaskulär föräldraparets björnar metabola förbättringspotentialen i fetma. Vi beskriver protokoll för en CD34 + CD31 + endotelceller isolering från mänskliga fett och en efterföljande in vitro- expansion och differentiering i vitt och beige adipocyter. Flera efterföljande program diskuteras.
Abstract
Övervikt åtföljs av en omfattande ombyggnad av fettvävnad primärt via fettceller hypertrofi. Extrema fettceller tillväxt resulterar i en dålig reaktion på insulin, lokal syrebrist och inflammation. Genom att stimulera differentiering av funktionella vita fettceller från stamfäder, radikala hypertrofi av fettceller befolkningen kan förhindras och, följaktligen, fettvävnad metabol hälsa kan förbättras tillsammans med en minskning av inflammation. Också, genom att stimulera en differentiering av beige/bruna adipocyter, kroppens totala energiförbrukningen kan ökas, vilket resulterar i viktminskning. Denna strategi kan förhindra utvecklingen av fetma komorbiditet såsom typ 2-diabetes och hjärt-kärlsjukdom.
Detta dokument beskriver isolering, expansion och differentiering av vitt och beige adipocyter från en delmängd av mänsklig fettvävnad endotelceller som samtidigt uttrycker de CD31 och CD34 markörerna. Metoden är relativt billigt och är inte arbetsintensiva. Det kräver tillgång till mänsklig fettvävnad och subkutan depån är lämplig för provtagning. För detta protokoll, färska fettvävnad prover från sjukligt överviktiga patienter [BMI (Kroppsmasseindex) > 35] samlas under fetmakirurgi förfaranden. Använder en sekventiell immunoseparation från stromal vaskulär fraktionen, produceras tillräckligt med celler från så lite som 2 – 3 g fett. Dessa celler kan utökas i kultur under 10 – 14 dagar, kan förvaras i fryst tillstånd och behåller sina adipogena egenskaper med passaging upp till passage 5 – 6. Cellerna behandlas i 14 dagar med en adipogena cocktail med en kombination av humaninsulin och en PPARγ-agonist-rosiglitazon.
Denna metod kan användas för att erhålla bevis på konceptet experiment på molekylära mekanismer som driver adipogena svaren i fett endotelceller eller för screening nya läkemedel som kan förbättra adipogena svar riktas antingen mot vit eller beige/bruna fettceller differentiering. Använder små subkutana biopsier, kan denna metod användas för att sålla bort non-responder ämnen för kliniska prövningar som syftade till att stimulera beige/brun och vit adipocyter för behandling av fetma och komorbiditet.
Introduction
Senaste rönen visar att både möss och människor, kan en delmängd av celler som är bosatta i den fettvävnad vaskulatur göras åtskillnad mellan in i antingen vit eller beige/bruna adipocyter1,2,3. Fenotypen av sådana celler är föremål för kontroverser, med underlagen endotelceller, glatt muskulatur/pericyt eller ett spektrum av mellanliggande fenotyper4,5,6,7. Tillämpningsområdet för utveckla denna metod var att testa den adipogena potentialen av CD34 + CD31 + endothelial celler isolerade från olika fett depåer från överviktiga människor. Andra studier i litteraturen fokuserar på adipogena som är potentiell av den totala stromal vaskulära fraktionen eller kända fettceller föräldraparets2,8,9. Eftersom nuvarande teknik kan rikta särskilt fettvävnad endotelceller för drogen leverans10, är förstå potentialen hos sådana celler att genomgå adipogena induktion mot vit eller beige adipocyter viktigt framtida riktade terapier.
Olika grupper rapporterade kombinationen av CD31 och CD34 markörer som surrogat att isolera endotelceller från mänsklig fettvävnad11,12,13. Typiskt, isolering utförs med två sekventiella steg och ett positivt urval använder magnetiska pärlor. I denna rapport utnyttjades immunoseparation med hjälp av CD34 + magnetiska pärlor kombinerat med CD31 plast pärlor. Vi hittade denna teknik överlägsen den sekventiella magnetiska immunoseparation när det gäller bevarandet av typiska kullersten endothelial morfologi. Dessutom var vi kunna generera tillräckligt med celler krävs för expansion och adipogena induktion från så lite som 1 – 2 g fett. Ett litet urval biopsi av underhudsfett är tillräckligt för att producera den erforderliga mängden av celler för nedströms tillämpningar. Denna aspekt är potentiellt viktigt, särskilt om denna metod kommer att utnyttjas för screening för en lyhördhet för adipogena induktion hos försökspersoner.
Till skillnad från andra system som rapporterats i litteraturen, den här metoden utnyttjar endast två ingredienser för adipogena induktion av CD34 + CD31 + celler: en PPARγ-agonist – rosiglitazon — och humant insulin. Ännu viktigare, faller mängden insulin används inom intervallet normal/hög cirkulerande post-absorptive insulin i människor14. Graden av lyhördhet för insulin celler in vitro-, mätt med Akt fosforylering, korrelerar inte med deras förmåga att reagera på induktion cocktail. Intressant nog använder denna induktion cocktail och experimentella förhållanden, en blandning av vitt och beige/brun celler erhölls som bestäms av storlek och antal intracellulära lipid droppar och uttrycket av molekylära markörer. Detta enkla och kostnadseffektiva induktion protokoll tillsammans med den kvantitativa utvärderingen av fenotypen av responder cellerna (vit vs beige) möjliggör en screening av agenter som potentiellt kan förändra balansen i differentierade beige : vit adipocyter.
Denna metod erbjuder också en translationell strategi för att förstå de underliggande mekanismerna bakom adipogenesis av vaskulär endotelial stamfäder i mänsklig fettvävnad. Med denna specifika isolering/differentiering teknik, kan utredare förhöra olika vägar ansvarar för adipogenesis i en delmängd av vaskulära endotelceller från olika fett depåer i lean och överviktiga människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella styrelsen granskningskommittén vid östra Virginia Medical School godkände forskning och mänsklig fettvävnad provtagning används i studien. Informerade samtycke inhämtades från patienterna.
1. beredning av buffertar, Media och instrument
- Förbereda en Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered lösning (KRBBS): 135 mM natriumklorid, kaliumklorid 5 mM, 1 mM magnesiumsulfat, 0,4 mM kalium fosfatbuffert dibasiskt, 5,5 mM glukos, 1 mM adenosin, 0,01% antibiotika/antimycotic mix (50 µg/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin, 30 µg/mL gentamicin, 15 ng/mL amfotericin) och 10 mM HEPES (pH = 7.4). Denna lösningen bereds färska varje gång för vävnad insamling och matsmältningen.
- Bered en färsk kollagenas: 1 mg/mL kollagenas, typ 1, i KRBSS; gör 3 mL/g fett. Pre varma kollagenas lösningen vid 37 ° C i ett vattenbad innan den vävnad matsmältningen.
- Förbereda en CD34 Cell isolering buffert: 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1 mM EDTA i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Förbered Adipogenesis Media: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL penicillin/streptomycin, 1,25 µL/mL humant insulin (5 µg/mL eller 144 me/mL) och 0,36 µL/mL 2,8 mM rosiglitazon (1 µM).
- Förbereda en 0,3% olja Red O (ORO) stamlösning (vikt/volym) genom upplösning 0,3 g av ORO i 100 mL isopropanol.
2. fett Stromal vaskulär bråkdel isolering
Obs: I studien ingick en tvärsnitts kohort av sjukligt överviktiga typ 2 diabetiker (T2D) och icke-diabetiker patienter, i åldern 18 – 65 år, som genomgick bariatrisk kirurgi vid Sentara Metabolic och vikt förlust kirurgi Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Uteslutningskriterier ingår en autoimmun sjukdom inklusive diabetes mellitus typ 1, tillstånd som kräver kronisk immunsuppressiv behandling, antiinflammatoriska läkemedel, thiazolinendiones, aktiva tobaksbruk, kroniska eller akuta infektioner eller en historia malignitet behandling inom de senaste 12 månaderna. T2D definierades som ett fasteblodsocker på 126 mg/dL eller högre, en glukos på 200 mg/dL eller högre efter en 2 h glukostolerans test eller användning av antidiabetiska läkemedel.
- Samla in mänskliga omental (OM) och subkutan (SC) fettväv (AT) från mänskliga patienter som genomgick bariatrisk kirurgi.
- Hålla OM och SC AT i separata flaskor innehållande Hanks buffrade saltlösningen med 50 µg/mL penicillin/streptomycin rumstemperatur omedelbart efter vävnad utvinning.
- Noggrant rengöra och ta bort avsnitten fibrotiska och flamberats i vävnaden med 70% etanol penslas sax och pincett när provet anländer till labbet efter vävnad utvinning.
- Väga fettvävnaden och partitionera it till 5 g (eller mindre) alikvoter för kollagenas matsmältningen.
- Fint finhacka 5 g AT i 5 mL av en kollagenas lösning i en injektionsflaska av scintillation vid rumstemperatur, med två par saxar.
- Lägga till ett ytterligare 10 mL kollagenas lösning malet vävnaden för 15 mL totalt.
- Smälta proverna för 1 h, vid 37 ° C, i vattenbad under ständig skakning.
- Skär spetsen av en 20 mL spruta för att göra trubbiga änden.
- Skär en 9 x 9 cm kvadrat från en 250 µm mesh och tryck in det halvvägs i en 50 mL konisk tub med den trubbiga änden sprutan.
- Häll 20 mL trubbiga änden sprutan och filtrera genom 250 µm nylon mesh i 50 mL koniska röret att separera adipocyter och vaskulär stromaceller från osmält vävnad proverna.
Obs: Använd inte mer än 5 g AT per 50 mL koniska rör, eftersom maskorna kommer bli igensatta på grund av fibrotiska osmält överskottsmaterial. - Tvätta den scintillation injektionsflaskan med 10 mL KRBBS och häll det genom filtret för att samla in resterande celler.
- Inkubera de filtrerade proverna för 5 min i rumstemperatur.
Obs: Detta steg är viktigt för adipocyter flyta på toppen av röret och några av de vaskulära stromaceller att bosätta sig på botten av röret. - Utnyttja en 20 mL spruta och en 20 G x 6 i pipettering nål för att ta bort stromal vaskulär bråkdel lagret och överföra det till en ren 50 mL koniska tub.
- Tillsätt 10 mL av KRBBS och proverna att sitta på bänken i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 2.12 – 2,14 två gånger.
Obs: Dessa steg kommer att säkerställa att det finns ingen förorening av de vaskulära stromaceller med de flytande adipocyter. - Hålla stromal vaskulär fraktioner från båda depåer på is för vidare bearbetning, som beskrivs i stegen nedan.
Obs: Lämna inte cellerna på is för mer än 1 h, eftersom detta kan ha en inverkan på cellviabiliteten. Adipocyter kan vara flash-frysta i flytande kväve för långsiktig lagring eller används färska i djurförsök.
3. isolering av fettvävnad endotelceller
- Snurra de stromal vaskulär fraktionerna (SVF) på 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort proverna från centrifugen och häll försiktigt bort supernatanten; hålla den pellets som innehåller SVF celler.
- Försiktigt Återsuspendera cell pellets i 5 mL PBS.
Obs: Om mer än 5 g av en AT-depå var förädlas till flera portioner (se steg 2,4), sammanföra cell pellets. - Snurra proverna på 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL PBS räkna cellerna.
Obs: Här, en automatisk cell räknare användes för cell inventering. Cellviabiliteten erhölls genom att blanda 12 µL cellsuspension med 12 µL av en akridin orange/propidium jodid (AO/PI) lösning (se Tabell för material). Det genomsnittliga antalet celler per gram AT för varje depå är: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. Livskraften hos cellerna från båda depåer var > 90%. - Pellet proverna på 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
Obs: Ett CD34 immunmagnetisk urval protokoll (se Tabell för material) anpassades för steg 3,7 – 3.15. - Återsuspendera pelleten i 100 µL av CD34 isolering buffert.
Obs: De totala blodkroppar kräver följande resuspension volymer: a < 2 x 107 celler: återsuspendera pelleten i 100 µL; (b) 2 x 108– 5 x 108 celler: återsuspendera pelleten i 1 mL. I steg 3,9 – 3.16, volymerna av de reagens som används var skalas ner för < 2 x 107 celler. - Tillsätt 10 µL av CD34 cocktail och inkubera provet för 15 min, vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5 µL av magnetiska pärlor och inkubera provet i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2,5 mL CD34 isolering buffert till varje prov och placera proverna i magneten, i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Invertera magneten för 5 s till Häll av isolering bufferten.
- Ta bort proverna från magneten och upprepa steg 3.10 och 3.11 4 x.
- Ta bort röret från magneten och tillsätt 2 mL av CD34 isolering buffert.
- Pellet cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera cell pellets i 1 mL av CD34 isolering buffert och räkna cellerna.
Obs: Här, det genomsnittliga antalet celler per gram AT är: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Ett CD31 plast immunobead protokoll anpassades för steg 3.16 – 3.34 (se Tabell för material). - Pellet celler vid 500 x g i 5 min och återsuspendera pelleten i 250 µL buffert B och 250 µL tvättlösning.
- Grundligt resuspendera CD31 pärlorna av vortexa röret.
- Tillsätt 20 µL av CD31 pärlor.
Obs: På grund av summacell räknar > 1 x 106, volymen var skalas ner enligt tillverkarens input. - Inkubera provet med gunga för 30 min, vid rumstemperatur.
- Bifoga en sil till en steril 50 mL koniska tub.
Obs: Större öppnandet av silen måste vara på topp. - Innan cellen avskiljandet, tillsätt 1 mL av tvättbuffert temperera Silen. Applicera blandningen genereras under steg 3.16 att Silen.
- Tvätta silen med 5 mL av tvättlösning i cirkulära rörelser för en total volym på 20 mL. Fäst sändaren en steril 50 mL koniska tub och Stäng den luer-lock.
- Fast silen på anslutningsdelen. Tillsätt 1 mL av tvättbuffert längs väggen i Silen. Tillsätt 1 mL av aktiverade buffert D längs väggen i Silen. Snurra provet försiktigt och inkubera det i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 mL av tvättbuffert. Separera celler från pärlorna genom pipettering upp och ner 10 x.
Obs: Undvik att generera luftbubblor. - Öppna den luer-lock och låta fristående cellerna att flöda in i 50 mL koniska röret. Tvätta silen 10 x med 1 mL av tvättbuffert varje gång.
- Kassera connector och sil och centrifugera proverna på 300 x g i 10 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera cellpelleten i 2 mL komplett extra bolagsstämma-2-Media för kultur.
Obs: Det genomsnittliga antalet celler per gram AT vid denna punkt är: (a) OM Depot: 5,92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC Depot: 4.12 x 103 ± 2,1 x 103. Livskraften hos celler från båda depåer var över 90%.
4. induktion av Adipogenesis i isolerade endotelceller
- Odla cellerna i 6-väl vävnadsodling-behandlade plattorna med komplett extra bolagsstämma-2-media i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Ersätta media var 3 – 4 dagar tills cellerna når 80 – 90% sammanflödet.
Obs: Befolkningen fördubblingen är mellan 2-3 dagar. - Expandera cellerna av plätering dem på 100 mm petriskålar och dela upp celler 1:3 en gång. I detta skede är cellerna på passagen 2.
- Räkna cellerna med en automatisk cell counter (se Tabell för material).
- Utsäde cirka 100 – 200 000 celler i 6-väl plattor garanterar dubbla brunnar för varje depå och kultur dem fylla i extra bolagsstämma-2-media för 2 dagar.
- Aspirera ut någon tillväxt medier och ersätta det med 2 mL DMEM/F12 med 5% FBS och 50 µg/mL penicillin/streptomycin för kontroll cellerna och ersätta det med 2 mL av Adipogenesis media (se steg 1.4) för cellerna som behandling.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator för 13 dagar, ersätta respektive media varje 3 till 4 dagar.
Obs: Celler börjar ackumuleras lipider efter 4 dagars behandling. - Genomföra ORO och Nile röda färgning enligt publicerade metoder15–17.
- För att isolera cellerna för en RNA-extraktion, ta bort mediet från de 6-väl induktionshällen och tvätta det med 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Tillsätt 350 μl av en guanidium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform lösning (se Tabell för material) till varje brunn och odla den i rumstemperatur i 5 – 10 min.
- Skrapa cellerna av plattan med en cell skrapa och överföra cellerna till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
Obs: Proverna kan förvaras i frysen-80 ° C för RNA-extraktion och vidare bearbetning vid ett senare tillfälle. - Extrahera mRNA från proverna med hjälp av en anpassad RNA-extraktion protokoll (se Tabell för material).
- Utföra en realtid polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) för att bedöma genuttrycket använder följande sonderna: adiponectin, UCP-1 och CIDEA (se Tabell för material).
Obs: Här, RT-PCR förfaranden genomfördes med följande standard protokollet: denaturering (95 ° C; 15 s), glödgning, och förlängning (60 ° C, 1 min) för 40 cykler. De prover som uttryckt gener med CT -värden > 35 ansågs omöjlig att upptäcka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra protokollet syftar till att ge en in vitro -Metod för att bestämma den adipogena potentialen av CD34 + CD31 + vaskulära celler från olika depåer av mänsklig fettvävnad. Ett förenklat flödesschema visas i figur 1A. Det första steget använder ett positivt urval av CD34 uttrycker cellerna resulterar i > 95% CD34 + celler i befolkningen av de färska isolerade cellerna (figur 1A). Viktigast av allt, går denna markör förlorad när cellerna odlas i ett par passager. Eftersom CD34 är en gemensam markör för olika hematopoetiska och icke-hematopoetiska progenitorceller, är det följande steg som krävs för separation av endothelial föräldraparets positiva val av CD31 + celler av CD34 + celler befolkningen (figur 1A). Även om CD31 är en markör för endotelceller, kan det också hittas på en delmängd av hematopoetiska celler. Vi analyserade flera preparat från både det omental och subkutant fettet av flödescytometri och funnit konsekvent att CD34 + CD31 + celler inte uttrycker CD45 markören (figur 1B, övre paneler). Typiskt, < 1% av cellerna visade CD45 positivitet, av befolkningens totala cell. Detta resultat lett oss till slutsatsen att vi sannolikt fått en beredning som är praktiskt taget fri från hematopoetiska progenitorceller. För att avgöra om cellerna express fettceller stamcells markör CD24, Vi analyserade celler från både omental och subkutan depåer och fann att nästan inga celler uttryckt CD24 markören i omental depot (figur 1B, bottenpaneler) och mindre än 5% av cellerna uttryckt markören i subkutan depån (visas inte). Avslutningsvis, fått med hjälp av denna separation metoder vi CD34 + CD31 + CD45-CD24-celler från både omental och subkutan depåer av överviktiga patienter.
Med hjälp av plastpärlor konjugerat med en CD31 antikropp, vi fick celler som visas kullersten endothelial morfologi under tidig passager, i motsats till celler separeras med hjälp av magnetiska pärlor konjugerat med en CD31-antikropp som visas en spolformad mesenkymala fenotyp omedelbart efter avskiljandet (figur 2A). För att ytterligare underbygga endothelial identiteten av CD34 + CD31 + celler, vi utfört två funktionella analyser: en upptag av DiI-Ac-LDL och en basalmembranet matris (kallad matris härefter) rör bildande in vitro. CD34 + CD31 + celler inkuberades med DiI-Ac-LDL och den stora majoriteten av celler var positiva för upptaget (figur 1 c). Som positiv kontroll, vi använde en mänsklig fettvävnad mikrovaskulära endotelceller av primära linje (HAMVEC) som är kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material - och figur 1 c). Vi testade också om den CD34 + CD31 + celler behåller sin endotelfunktion efter odling genom att fastställa sådana cellernas förmåga att bilda spontana fartyget-liknande strukturer i vitro, i en 3D-matris. Efter 3 passager, CD31 + CD34 + former tubulär fartyget-liknande strukturer i en matris som är jämförbar med en HAMVEC primära humana endotelceller linje (figur 1 d).
Efter utbyggnaden av cellerna för 2 – 3 passager bytte vi cellerna från extra bolagsstämma-2 komplett media som innehåller proangiogena tillväxtfaktorer i DMEM/F12 media kompletteras med 5% FBS, rosiglitazon (1µM) och insulin (144 mU/mL). Att behålla cellerna i extra bolagsstämma-2 komplett media dramatiskt minskade deras adipogena differentiering. Dessutom ett tillägg av dexametason och 3-isobuthyl-1-methylxanthine till media ändra inte hastigheten och omfattningen av lipid ackumulering och ett tillägg av indometacin minskas kraftigt lipid ackumulering (inga data anges). Baserat på dessa preliminära experiment, beslutade vi att endast använda rosiglitazon och insulin för adipogena induktion. Efter 14 dagar av kultur i adipogena media, cellerna var fixeras och färgas med Oil Red O eller Nilen rött och atomkärnor var counterstained med DAPI (figur 2B). I siffrorna visas representativa bilder av celler isolerade från Parade subkutan (SC) (figur 2B, övre paneler) och omental (OM) (figur 2B, bottenpaneler) fettvävnad tre försökspersoner med ett BMI på mellan 37-45 kg/m2. Observera att svaret till induktionen varierar kraftigt mellan ämnen och mellan depåer i samma ämne. Som ses i fluorescerande bilden i figur 2B, en blandad befolkning unilocular (röda pilar) och multilocular (vita pilar) är lipid-innehållande celler liksom celler som inte ackumuleras lipider (gula pilar) vanligtvis närvarande. Förhållandet mellan numren på dessa celler är också mycket variabel med både föremål och depån av ursprung. En kvantifiering av procentandelen av lipid-innehållande celler (baserat på olja röd O positivitet) av de totala celler (baserat på DAPI-färgade kärnor) visade en signifikant skillnad mellan SC och OM depåer av samma enskilda, med celler från SC depån att vara mer lyhörd för adipogena induktion (figur 2 c). Förklaringen till heterogenitet i svaren mellan ämnena och depåerna av samma ämne är inte klart. Vi spekulerar dock som är sannolikt relaterade till den inneboende karaktären av cell befolkningen som bär fingeravtrycket i vivo fenotyp/miljön och inte på grund av variationen i protokollet isolering.
För att bekräfta att cellerna genomgick differentiering att mogna adipocyter, mätte vi genuttrycket av den pan-fettceller markör adiponectin och brun/beige markörerna UCP-1 och CIDEA i cellerna efter 13 dagar av adipogena induktion jämfört un-inducerad kontroll celler. Adiponectin uttrycket höjdes upp till 10,000-fold i differentierade cellerna jämfört med kontroller (figur 2D). Genuttrycket CIDEA och UCP1 var bara upptäckas i cellerna efter adipogena stimulering (figur 2D). I synnerhet uttrycket UCP-1 var mycket varierande, vilket återspeglar de olika proportionerna av vit: brunt / beige celler inom cell befolkningen. Uttrycket av genen städning RPL27 var anmärkningsvärt konsekvent mellan proverna med CT -värden som varierar mellan 18 – 20 cykler och inga signifikanta skillnader mellan cellerna som genomgick adipogena differentiering och obehandlade kontroller. Vi har också upptäckt en UCP-1 proteinuttryck i de celler som visas i flera källor fenotyp, i ett punctated mönster som tyder på en mitokondriell lokalisering (figur 2E). Proteinet UCP-1 var inte detekterbar i celler som inte ackumulerar lipider eller i celler med flera, mycket små droppar som inte sannolikt fullt differentierade adipocyter (figur 2E).
Vår observation att adipogena potentialen av CD34 + CD31 + celler är depot-specifika och mycket variabel bland olika ämnen föranledde oss att söka för potentiella korrelationer med BMI, ålder och HbA1c. Bland de 28 prov, hittar vi inte några signifikanta korrelationer mellan adipogena potentiella och ålder eller BMI; men fann vi en signifikant negativ korrelation mellan HbA1c och lipid ackumulering i cellerna från OM depån (figur 3A). Detta fynd indikerar en potentiell länk med kronisk hyperglykemiska miljön och förtjänar framtida utredning. Detta tyder också på att den CD34 + CD31 + celler sannolikt bär i vivo undertecknandet av deras förmåga att reagera på en adipogena induktion. Vi visar också att dessa celler uppvisar varierande nivåer av Akt fosforylering en in vitro- insulin stimulering (figur 3B, överst). Dock korrelerar denna variation i svaren inte väl med deras förmåga att genomgå en adipogena differentiering som visas av den olja röd O färgning i bilder av matchande proverna (figur 3B, botten).
Figur 1: Separation och karakterisering av CD34 + CD31 + celler från mänskliga fettvävnad. (A) detta flödesschema visar de stora stegen i isolering och differentiering. Efter positiva markeringen med CD34 magnetiska pärlor, > 95% av de färska isolerade cellerna, före andra urval steget, är CD34 +. (B) Detta representativa flödescytometri visar en forward spridda tomt gated för levande cell befolkningen. ett ofärgade prov på kanalen FITC (BluFl2); och CD45 färgning av omental representativa på toppen. Botten visar samma sekvens som visas på toppen, men för CD24 (Alexafluor 647-märkt) cellerna från omental provet. (C) dessa representativa micrographs Visa en upptag av DiI-Ac-LDL (röd) av CD34 + CD31 + celler efter 4 h i vitro inkubation (övre panelen). En liknande upptag hittades i en mänsklig fettvävnad mikrovaskulära endotelceller primär cell fodrar (HAMVEC) (nedre panelen). Atomkärnor visas blå av DAPI. (D) dessa representativa micrographs visar en in vitro- tube bildandet av CD34 + CD31 + celler seedade i en 3D-matris. CD34 + CD31 + celler (passage 3) var seedad i 24 brunnar efter en färgning med FITC-calcein och inkuberas i 4 h i komplett endotelceller media. Cellerna var avbildade genom en inverterad fluorescerande Mikroskop. HAMVEC, seedade på samma densitet, användes för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: adipogena induktion och markörer av CD34 + CD31 + celler. (A) dessa företrädare micrographs Visa morfologiska skillnaderna mellan CD34 + CD31 + celler isolerade med ett positivt urval med CD31 + magnetiska pärlor vs. CD31 + plast pärlor. Cellerna var avbildad på passage 1 efter isolering. Förstoringen används är 100 X. (B) dessa paneler är representativa micrographs av olja röd O målat CD34 + CD31 + celler från Parade subkutan (SC) och omental viscerala (OM) prov av 3 olika ämnen. Cellerna var odlade för 2 – 3 passager i extra bolagsstämma-2 komplett media, då påslagen DMEM/F12 media med 5% FBS och behandlas med insulin (144 mU/mL) och rosiglitazon (1 µM) i 14 dagar, med media som byts var tredje dag. Förstoringen används är 100 X. Representativa fluorescerande bilden visar adipo röda lipid droppar (grön) och DAPI nukleär färgning (blå). Observera en blandning av celler som innehåller unilocular lipider (röd pil), multilocular lipid droppar (vit pil) eller celler som visar ingen lipid ackumulering (gul pil). Förstoringen används är 200 X, skalstapeln = 50 µm. (C) i denna panel visas en kvantifiering av adipogena potentiella uttryckt som olja Red O (ORO) positiva celler normaliserade till totala DAPI-färgade kärnor. CD34 + CD31 + celler från OM och SC depåer i samma ämne visar en signifikant skillnad i adipogena potential av parat Students t-test (n = 7). (D), genuttrycket av mogna fettceller markörer (adiponectin, UCP-1 och CIDEA) mättes genom RT-PCR i cellerna efter 14 dagar av adipogena induktion och kontroll cellerna. Data är uttryckta som en-faldig förändring av adiponectin gen uttryck. Uttryck för CIDEA och UCP-1 var inte spåras i kontrollproverna. Värdena representerar ΔCt normaliserade till RPL27 som en städning-genen. CT värdena för RLP27 var mellan 18 – 20 cykler för alla de provexemplar som ingår i analysen (n = 3 – 5 ämnen). Data uttrycks som menar ± SD. Parat Students t-test användes för en statistisk analys av data. p < 0,05 förkastar nollhypotesen. (E) denna panel visar proteinuttryck av UCP-1 i CD34 + CD31 + celler efter 13 dagar av induktion med insulin och rosiglitazon. Immuncytokemi använder en human polyklonala UCP-1 antikropp visade en selektiv uttryck av UCP-1 i flera källor adipocyter. Att upptäcka uppnåddes med ett rodamin-konjugerad sekundär antikropp (röd) och DAPI färgning för kärnor (blå). Stor förstoring i infällt visar den punctated röd signal motsvarar UCP-1 (röd pil) samt flera lipid droppar (LD) olika storlekar omger cellkärnan (N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Korrelation mellan adipogena differentiering, HbA1c och in vitro- insulin signalering. (A) Spearman (icke-parametriska) och Pearson (parametriska) korrelationskoefficienter för OM- och SC-celler, respektive, användes för att fastställa sambandet mellan HbA1c och lipid ackumulering (n = 20). Null-hypotesen avvisades för p < 0,05. (B) överst, en western blotting visar den fosforylerade Akt (grön) och det totala Akt (röd)-uttrycket i CD34 + CD31 + celler stimuleras i vitro med 5 nM insulin för 30 min före adipogena induktion (n = 8). Längst ner visas en olja röd O färgning av samma celler efter adipogena induktion för 14 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fokus för denna uppsats är att tillhandahålla metoder för isolering, expansion och adipogena induktion av CD34 + CD31 + endotelceller från visceral och subkutant depåer av mänsklig fettvävnad.
Metoder har rapporterats för isolering av endotelceller från olika kärlbäddar av gnagare eller människa som involverar främst metoder med CD31 antikroppar antingen fluorescently märkt eller kopplat till magnetiska pärlor18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. en stor utmaning för universell användning av dessa isolering tekniker är endotelceller befolkningen i olika kärlbäddar heterogenitet och hög risk för kontaminering med fibroblaster och vaskulär väggmålning celler. Förbättringar av isolering tekniker att undvika sådana föroreningar har dock rapporterade24. Använda dessa tekniker, är mestadels mogna endotelceller isolerade från vävnader. Fettvävnaden är en stor reservoar av stam-och/eller stamceller, inklusive endothelial föräldraparets25,26. Några tidningar rapporterade rening av endotelceller från mänsklig fettvävnad som använder en kombination av CD34 + och CD31 + antikroppar11,27. Celler som uttrycker de två markörerna är en blandad befolkning mogen endotelceller och endotel föräldraparets11,28,29. Flera nyligen inflytelserika tidningar rapporterar att en liten delmängd av endotelceller (CD31 +) eller väggmålning (PDGFRβ +) celler i den fett kärlsystemet är en rik källa av fettceller föräldraparets5,30. Dessa vaskulära celler med adipogena potentiella kan producera både vit eller brun/beige adipocyter och är associerade med aktiva angiogenes i fett vaskulatur5. Dessa fynd kan ge nya terapeutiska möjligheter att förbättra den metaboliska prestandan i fetma och/eller inducera viktminskning genom att generera vit eller termogena adipocyter från vaskulär stamfäder. Det är därför av intresse att identifiera en metod för lätt och ekonomisk isolering, expansion och bedömning av adipogena potential av vaskulära endotelceller från mänsklig fettvävnad.
Den CD34 + CD31 + celler från mänskliga underhudsfett och omental visceral fettvävnad depåer karakteriserades tidigare baserat på deras angiogena potential, produktionen av inflammatoriska mediatorer, deras åldras markörer och andra funktioner11 , 31. det finns dock inga publicerade bevis för adipogena potential av sådana celler. Tidigare publikationer som avgränsade CD34 + CD31 + celler med magnetiska pärlor rapport på data från cellerna som poolats från ett stort antal försökspersoner (10 eller fler)11. Detta papper rapporterar för första gången ett protokoll för framgångsrika isolering och utbyggnad av CD34 + CD31 + celler från enda mänskliga donatorer från båda subkutana och omental depåer. Vi isolerade och expanderade celler från så lite som 2 – 3 g av fettvävnad. Den CD34 + CD31 + celler representerade 3 – 5% av de totala SVF cellerna och visas > 90% viabilitet efter isolering. Dessa celler var mycket proliferativ och visade ett brett spektrum av svaren mot adipogena differentiering efter en in vitro- stimulering med rosiglitazon och insulin. Tidigare studier används endast fett stamceller eller totala stromal vaskulär fraktionen från mänsklig fettvävnad för att testa adipogena svar4,32,33,34. En nyligen genomförd studie används enda cellsuspensioner från mikrocirkulation av mänsklig fettvävnad, men det är oklart om de differentierade adipocyter var väggmålning eller endotelceller i naturen3.
Ytterligare immunophenotyping av CD34 + CD31 + celler med hjälp av flödescytometri visade deras brist på CD45 och CD24 markörer oavsett deras depå av ursprung. Ännu viktigare, vi visade att efter 3 passager i kultur, den CD31 + CD34 + celler behålla deras endothelial funktionalitet som framgår av ansamling av acetylerade LDL och en in vitro- tube formation i en 3D-matris. Också, de differentierade adipocyter representerade en blandad befolkning av vitt och beige/brun celler, baserat på deras morfologi och molekylära markörer, inklusive en UCP-1 proteinuttryck. Tidigare studier på möss visade att fettvävnad vaskulatur kan vara en källa till både vita och bruna adipocyter5,30 och nyare data visade liknande resultat när det gäller differentieringen av vitt och funktionellt termogena beige celler från mänskliga fett vaskulatur3.
Till skillnad från de flesta publikationer som används adipogena drinkar som innehåller flera ingredienser för fettceller differentiering från en rad stamfäder i vitro, hittade vi att rosiglitazon och insulin är nödvändig och tillräcklig för adipogena induktion av CD34 + CD31 + celler. Medan vi är medvetna om att rosiglitazon ensam kan inducera en lipid ackumulering i icke-adipose celler35, den molekylära signaturen för pan-fettceller och brun/beige fettceller markörer, inklusive ett UCP-1 protein bekräftar uttryck i Välj celler, de mogna fettceller fenotyp av några av de differentierade cellerna. Våra två-ingrediens adipogena cocktail förenklar processuella protokollet och gör det mer kostnadseffektivt.
En viktig observation var att det adipogena svaret av CD34 + CD31 + celler var mycket varierande med givare ämne och fett depå. Depot-specifika skillnaderna i den adipogena Svaren av fett stamceller eller stromal vaskulär stamfäder har varit rapporterade tidigare32,34, är angående variabilityen av sådant svar en roman observation. Av de 20 mänskliga proverna analyseras, 3 SC och 7 OM celler svarade inte på adipogena induktion. Mest robusta Svaren visade > 90% av cellerna som är lyhörd för induktion för 4 prover från SC och för 2 prover från OM. intressant, Vi hittade att lyhördhet är negativt korrelerad med HbA1c och inte korrelerar med svaret på en i vitro insulin stimulering i odifferentierade celler. Vi hävdar att skillnaden i svar beror inte på dålig reproducerbarhet av tekniken men snarare återspeglar individuella fingeravtrycket av celler som efterliknar i vivo svaren. Bevarandet av detta differentiella svar kräver ytterligare validering och kan representerar en relativt enkel screeningmetod för lyhördheten till behandlingar som syftar till att stimulera adipogenesis i vivo. För att ytterligare förstå källan till individuell variation i de potentiella adipogena, är ytterligare immunophenotyping nödvändigt att identifiera cell subpopulationer inom den CD34 + CD31 + befolkningen som bär en specifik fettceller stamceller funktion.
Några av begränsningarna i detta protokoll är en ofullständig karakterisering av de cell populationerna; relativt långa expansion och differentiering gånger (2 veckor + 2 veckor); potentiella begränsningar för åtkomst till mänskliga prover och behovet av omedelbar bearbetning av nyligen uppsamlat vävnader; och nuvarande brist på funktionella data för differentierade cellerna. Det finns flera fördelar med denna metod som inkluderar ett reproducerbart och inte arbetsintensiva protokoll; celler som troligen behålla fingeravtrycket av deras in-vivo fenotyp; utbyggnaden av celler från mycket små mängder av vävnader med relativt låga kostnader. möjlighet att frysa cellerna och behålla sin adipogena signatur efter nytt kultur; och alternativet att generera förråd av dessa celler så att de kan användas för framtida screening eller andra ändamål.
Detta protokoll och CD34 + CD31 + celler som erhållits som ett slutresultat kan användas som en translationell plattform både för mekanistiska studier och vid screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma Becky Marquez, klinisk samordnare på Sentara bariatrisk Center, för hennes hjälp med processen att patienten screening och samtycker. Denna forskning stöddes av R15HL114062 till Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
