Summary
التفريق بين adipocytes أبيض وبيج من الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية موروث يحمل إمكانات لتحسين التمثيل الغذائي في السمنة. يصف لنا البروتوكولات CD34 + CD31 + عزل الخلية البطانية من الدهون البشرية والتوسع اللاحق في المختبر ، والتمايز في adipocytes بيج وأبيض. وتناقش عدة تطبيقات المتلقين للمعلومات.
Abstract
ويرافق البدانة إعادة عرض واسعة من الأنسجة الدهنية في المقام الأول عن طريق تضخم adipocyte. نتائج النمو adipocyte المتطرفة في ضعف استجابة للأنسولين، ونقص المحلية، والتهاب. بحفز التفريق بين adipocytes البيضاء الفنية من فروعه، يمكن منع تضخم جذرية للسكان adipocyte، ونتيجة لذلك، يمكن تحسين صحة التمثيل الغذائي للأنسجة الدهنية جنبا إلى جنب مع تخفيض التهاب. أيضا، عن طريق تنشيط ريق adipocytes بيج/براون، نفقات الطاقة الجسم الكلي يمكن زيادة، مما يؤدي إلى فقدان الوزن. هذا النهج يمكن أن تحول دون تطور المراضات المشارك السمنة مثل داء السكري من النوع 2، وأمراض القلب والأوعية الدموية.
وتصف هذه الورقة العزلة والتوسع، والتفريق في adipocytes أبيض وبيج من مجموعة فرعية خلايا الأنسجة الدهنية البشرية بطانية المشترك تعبر عن علامات CD31 و CD34. الطريقة رخيصة نسبيا وليست كثيفة العمالة. يتطلب الوصول إلى الأنسجة الدهنية البشرية ومستودع تحت الجلد ومناسبة لأخذ العينات. لهذا البروتوكول، عينات الأنسجة الدهنية الطازجة من مواضيع السمنة سقيم [مؤشر كتلة الجسم (BMI) > 35] يتم جمعها خلال إجراءات جراحات. باستخدام إيمونوسيباريشن متسلسلة من الكسر الأوعية الدموية stromal، يتم إنتاج ما يكفي من خلايا من أقل من 2-3 غرام الدهون. هذه الخلايا يمكن توسيعها في ثقافة أكثر من 10-14 يوما، ويمكن cryopreserved، والاحتفاظ بممتلكاتهم أديبوجينيك مع باساجينج حتى سن 5-6. وتعامل الخلايا لمدة 14 يوما مع أديبوجينيك كوكتيل باستخدام مزيج من الأنسولين البشري ومؤثر-روزيغليتازون PPARγ.
يمكن أن تستخدم هذه المنهجية للحصول على دليل على مفهوم التجارب على الآليات الجزيئية التي تدفع ردود أديبوجينيك في الخلايا الدهنية بطانية، أو لفحص العقاقير الجديدة التي يمكن أن تعزز أديبوجينيك الرد موجها أما نحو الأبيض أو التفريق بين adipocyte بيج/براون. باستخدام عينة صغيرة تحت الجلد، يمكن استخدام هذه المنهجية لحجب المواضيع غير المستجيب للتجارب السريرية ويهدف إلى حفز adipocytes بيج/البنى والأبيض لعلاج السمنة والمراضات المشارك.
Introduction
وتبين الأدلة الأخيرة أن الفئران والبشر، يمكن أن تكون متباينة مجموعة فرعية خلايا يقطنون المفرج الأنسجة الدهنية إلى أما أبيض أو بيج/بني adipocytes1،2،3. النمط الظاهري لهذه الخلايا موضوع الخلاف، مع الأدلة المؤيدة لخلايا بطانية أو العضلات الملساء/بيريسيتي، أو طائفة من وسيطة تعمل4،5،،من67. وكان نطاق تطوير هذه المنهجية لاختبار إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + غشائي الخلايا المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة من البشر يعانون من السمنة المفرطة. وتركز دراسات أخرى في الأدب على أديبوجينيك المحتملة في كسر الأوعية الدموية stromal مجموع أو adipocyte المعروفة المتكفل2،،من89. منذ التكنولوجيات الموجودة حاليا يمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا الأنسجة الدهنية بطانية للمخدرات تسليم10، فهم إمكانات هذه الخلايا للخضوع أديبوجينيك توجيهي نحو adipocytes أبيض أو بيج من المهم العلاجات المستهدفة مستقبلا.
وذكرت مجموعات مختلفة مزيج علامات CD31 و CD34 كالأمهات البديلات عزل خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية البشرية11،،من1213. عادة، يتم العزل استخدام اثنين من الخطوات المتسلسلة وتشكيله إيجابية باستخدام الخرز المغناطيسي. واستخدمت في هذا التقرير، إيمونوسيباريشن استخدام CD34 + الخرز المغناطيسي جنبا إلى جنب مع الخرز البلاستيك CD31. وجدنا هذا الأسلوب متفوقة على إيمونوسيباريشن المغناطيسي متسلسلة فيما يتعلق بالحفاظ على مورفولوجيا غشائي حصاة كبيرة نموذجية. أيضا، كنا قادرين على توليد ما يكفي من خلايا المطلوبة لتحريض التوسع وأديبوجينيك بدءاً من أقل من 1-2 غرام الدهون. خزعة عينة صغيرة من الدهون تحت الجلد ما يكفي لإنتاج الكمية المطلوبة من الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. هذا الجانب يحتمل أن تكون هامة، لا سيما إذا كان هذا الأسلوب سوف تستخدم للكشف عن استجابة لتحريض أديبوجينيك في البشر.
خلافا لأنظمة أخرى ذكرت في الأدبيات، يستخدم هذا الأسلوب فقط هما مكونان لتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا: مؤثر PPARγ – روزيغليتازون – والإنسولين البشري. الأهم من ذلك، كمية الأنسولين المستخدمة يقع ضمن النطاق العادي/عالية لتعميم بوستابسوربتيفي الأنسولين في البشر14. درجة القدرة على الاستجابة للأنسولين من الخلايا في المختبر، تقاس الفسفرة Akt، ترتبط بمدى قدرتها على الاستجابة لتحريض كوكتيل. من المثير للاهتمام، استخدام هذه الشروط التعريفي كوكتيل والتجريبية، مزيج خلايا البيضاء والبيج/براون تم الحصول عليها كما تحدد حجم وعدد قطرات داخل الخلايا الدهنية والتعبير عن المؤشرات الجزيئية. يسمح هذا البروتوكول تعريفية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة إلى جانب التقييم الكمي للنمط الظاهري لخلايا المستجيب (الأبيض مقابل بيج) لفحص العوامل التي يمكن أن يحتمل أن يغير موازين متباينة بيج : الأبيض adipocytes.
كما يوفر هذا الأسلوب نهجاً متعدية لفهم الآليات الكامنة أديبوجينيسيس فروعه غشائي الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية للإنسان. باستخدام هذه التقنية المحددة العزلة/التمايز، يمكن استجواب المحققين المسارات المختلفة المسؤولة عن أديبوجينيسيس في مجموعة فرعية خلايا البطانية الوعائية من شتى مخازن الدهون في البشر الهزيل والسمنة المفرطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت "لجنة استعراض المجلس المؤسسية" في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية بالأبحاث وجمع عينات الأنسجة الدهنية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. وجمعت من المرضى موافقة خطية مستنيرة.
1-إعداد المخازن المؤقتة، ووسائط الإعلام، والصكوك
- إعداد حل Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (كربس): 135 ملم كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، سلفات المغنيزيوم 1 مم، 0.4 مم بوتاسيوم فوسفات مائي، الجلوكوز 5.5 ملم، الادينوسين 1 مم، مزيج المضادات الحيوية/فطري 0.01 ٪ (50 ميكروغرام/مل من البنسلين، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 30 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين، 15 نانوغرام/مليلتر من الامفوتريسين) و 10 ملم حبيس (pH = 7.4). هذا الحل هو أعدت طازجة كل الوقت لجمع الأنسجة والهضم.
- تعد حلاً كولاجيناز طازجة: 1 ملغ/مل كولاجيناز، اكتب 1، في كربس؛ جعل 3 مل/غرام الدهون. قبل الحارة الحل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل هضم الأنسجة.
- إعداد المخزن مؤقت عزل الخلايا CD34: 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1 مم يدتا في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).
- تعد وسائل الإعلام أديبوجينيسيس: DMEM/F12، 5% FBS، 50 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين و 1.25 ميليلتر/مل من الأنسولين البشري (5 ميكروغرام/مل أو 144 mU/mL) 0.36 ميليلتر/مل من 2.8 مم روزيقليتازون (1 ميكرومتر).
- تحضير حل أسهم س أحمر نفط (أورو) 0.3% (وزن/حجم) بتذويب 0.3 غرام الذهب إلى 100 مل الكحول.
2-الدهنية كسر الأوعية الدموية Stromal العزلة
ملاحظة: شملت الدراسة مجموعة مستعرضة سقيم البدناء النوع 2 السكري (T2D) والمواضيع غير مرضى السكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 18 65 عاماً، تشهد جراحات في سينترا الأيض ومركز جراحة فقدان الوزن (المجموعة الطبية سينترا، نورفولك، فرجينيا). وتشمل معايير الاستبعاد أحد أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك السكري من النوع 1، الظروف التي تتطلب المعالجة الكابتة للمناعة المزمنة أو الأدوية المضادة للالتهابات، ثيازولينينديونيس، وتعاطي التبغ النشطة، الالتهابات الحادة أو المزمنة أو تاريخاً خبيثة تعامل خلال الأشهر ال 12 الماضية. وعرف أنه بلازما جلوكوز أثناء صوم من 126 ملغ/دل أو أكثر، جلوكوز من 200 mg/dL أو أكثر بعد اختبار تحمل جلوكوز ح 2، أو استخدام الأدوية antidiabetic T2D.
- جمع أومينتال البشرية (OM) والأنسجة الدهنية (SC) تحت الجلد (AT) من البشر تمر جراحات.
- الاحتفاظ باوم وفي اتفاقية استكهولم في قنينات منفصلة تتضمن "الحل" هانك الملح مخزنة مع 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد استخراج الأنسجة.
- عناية تنظيف وإزالة المقاطع تليفية وكوتيريزيد للنسيج باستخدام مقص ممسوح الإيثانول 70% وملاقط عند وصول العينة إلى المختبر بعد استخراج الأنسجة.
- وزن الأنسجة الدهنية وقسم تكنولوجيا المعلومات في 5 غ (أو أقل) مختبرين لهضم كولاجيناز.
- فرم ناعما 5 غ AT في 5 مل من حل كولاجيناز في قنينة التﻷلؤ في درجة حرارة الغرفة، باستخدام اثنين من أزواج من المقص.
- إضافة 10 مل إضافية لحل كولاجيناز للأنسجة مفروم لمجموع 15 مل.
- هضم العينات ح 1، في 37 درجة مئوية، في حمام مائي مع الرج المستمر.
- قطع بلاغ المحاقن 20 مل لجعل وضع نهاية غير حادة.
- قص مربع 9 × 9 سم من شبكة 250 µm ويدفع به في منتصف الطريق في أنبوب 50 مل مخروطية استخدام المحاقن نهاية غير حادة.
- صب العينات في محقنة 20 مل نهاية حادة وتصفية من خلال 250 ميكرون النايلون في أنبوب 50 مل المخروطية لفصل adipocytes وخلايا الأوعية الدموية stromal من الأنسجة عسر الهضم.
ملاحظة: لا تستخدم أكثر من 5 غ ات الواحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية، كما سيتم الحصول على انسداد الشبكة نظراً لفائض المواد تليفية عسر الهضم. - تغسل القنينة التﻷلؤ مع 10 مل كربس ومن أجل ذلك من خلال عامل التصفية لجمع الخلايا المتبقية.
- احتضان هذه العينات التي تمت تصفيتها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للسماح adipocytes إلى تعويم في الجزء العلوي من الأنبوب وبعض الخلايا والأوعية الدموية stromal ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب. - الاستفادة من حقنه 20 مل و 20 × 6 في إبرة بيبيتينج إزالة طبقة كسر الأوعية الدموية stromal وتحويلها إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل.
- أضف 10 مل كربس وتسمح العينات للجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات من 2، 12 – 2.14 مرتين.
ملاحظة: هذه الخطوات سوف تضمن أنه لا يوجد أي تلوث من خلايا الأوعية الدموية stromal مع adipocytes العائمة. - تبقى كسور الأوعية الدموية stromal من كلا مستودعات على الجليد لمزيد من المعالجة، كما هو موضح في الخطوات التالية.
ملاحظة: لا تترك الخلايا على الجليد لأكثر من ح 1، كما قد يؤثر على بقاء الخلية. يمكن أن تكون مجمدة فلاش في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل adipocytes أو المستخدمة طازجة للتجارب.
3-عزل خلايا الأنسجة الدهنية بطانية
- تدور الكسور الأوعية الدموية stromal (SVF) في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
- إزالة العينات من أجهزة الطرد المركزي وعناية من أجل إيقاف المادة طافية؛ تبقى بيليه تحتوي على خلايا صندوق التبرعات الخاص.
- بلطف ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: إذا تمت معالجة أكثر من 5 غ مستودع ات إلى مختبرين متعددة (راجع الخطوة 2، 4)، تجمع الكريات الخلايا معا. - تدور العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وحساب الخلايا.
ملاحظة: استخدمت عداد تلقائي خلية هنا، لخلية العد. تم الحصول على بقاء الخلية بخلط 12 ميليلتر من تعليق خلية مع 12 ميليلتر محلول يوديد propidium البرتقالي/(AO/PI) أكريديني (انظر الجدول للمواد). متوسط عدد الخلايا في الغرام ات لكل مستودع: (أ) "مستودع أوم": 1.69 بوصة × 105 ± 4.51 x 104؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.24 س ± 6، 45 × 105 104. كان بقاء الخلايا من كلا مستودعات > 90%. - بيليه العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: بروتوكول اختيار إيمونوماجنيتيك CD34 (انظر الجدول للمواد) تم تكييفها للخطوات 3.7 – 3.15. - ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر CD34 عزلة المخزن المؤقت.
ملاحظة: عدد خلايا مجموع تتطلب إعادة تعليق وحدات التخزين التالية: (أ) < 2 × 107 الخلايا: ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر؛ (ب) 2 x 108–5 x 108 خلايا: ريسوسبيند بيليه في 1 مل. في خطوات 3.9 – 3.16، وحدات تخزين الكواشف المستخدمة تم تقليصها < 2 × 107 الخلايا. - إضافة 10 ميليلتر من CD34 كوكتيل واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 5 ميليلتر من حبات مغناطيسية واحتضان العينة لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2.5 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت لكل عينة ووضع العينات في المغناطيس، لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
- عكس المغناطيس ل 5 ق صب إيقاف المخزن المؤقت العزلة.
- إزالة العينات من المغناطيس وكرر الخطوتين 3، 10 و 3.11 x 4.
- إزالة الأنبوب من المغناطيس وإضافة 2 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت.
- بيليه الخلايا في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لعزل CD34 وحساب الخلايا.
ملاحظة: هنا، متوسط عدد الخلايا كل غرام في: (أ) "مستودع أوم": 4.75 × 104 ± 3.36 × 104؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.06 × 10 ± 9.53 x 104 3. بروتوكول إيمونوبيد بلاستيك CD31 تم تكييفها للخطوات 3.16 – 3.34 (انظر الجدول للمواد). - بيليه الخلايا عند 500 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر من "المخزن المؤقت ب" و 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
- دقة ريسوسبيند الخرز CD31 من فورتيكسينج الأنبوبة.
- إضافة 20 ميليلتر من الخرز CD31.
ملاحظة: بسبب خلية إجمالي حساب > 1 × 106وحدة التخزين تم تقليصها وفقا للإدخال الخاص بالشركة المصنعة. - احتضان العينة مع هزاز مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إرفاق مصفاة لأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل.
ملاحظة: يجب أن تكون افتتاح أكبر مصفاة الأعلى. - قبل فصل الخلية، قم بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي حجته المصفاة. تطبيق الخليط التي تم إنشاؤها ضمن الخطوة 3.16 إلى المصفاة.
- أغسل المصفاة مع 5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في حركة دائرية لإجمالي حجم 20 مل. توصيل الموصل بأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل وإغلاق نظام القفل.
- إرفاق المصفاة للموصل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي على طول الجدار المصفاة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت المنشط د على طول الجدار المصفاة. دوامة العينة بلطف واحتضان عليه لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. فصل الخلايا من الخرز من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 x.
ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء. - فتح قفل اللوير والسماح بالتدفق في أنبوب 50 مل المخروطية الخلايا المنفصلة. أغسل مصفاة 10 x مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في كل مرة.
- تجاهل موصل ومصفاة والطرد المركزي العينات من 300 x ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من "الوسائط" الغير عادية-2 كاملة للثقافة.
ملاحظة: متوسط عدد الخلايا في الغرام ات عند هذه النقطة: (أ) "مستودع أوم": 5.92 × 103 ± 4.27 × 103؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 4.12 × 10 ± 2.1 × 103 3. صلاحية الخلايا من مستودعات على حد سواء كان أكثر من 90%.
4-تنظيم دورات تعريفية أديبوجينيسيس في خلايا بطانية معزولة
- تنمو الخلايا الموجودة في لوحات المعالجة بزراعة الأنسجة 6-جيدا مع الوسائط الغير عادية-2 كاملة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة. استبدال وسائط الإعلام كل 3 – 4 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80 – 90%.
ملاحظة: تضاعف السكان ما بين 2-3 أيام. - توسيع نطاق الخلايا بالطلاء لهم على أطباق بيتري 100 مم وتقسيم الخلايا مرة واحدة في 1:3. وفي هذه المرحلة، الخلايا على المرور 2.
- عد الخلايا باستخدام خلية تلقائية مكافحة (انظر الجدول للمواد).
- خلايا البذور حوالي 100 – 200,000 في لوحات 6-كذلك ضمان آبار المكررة لكل مستودع والثقافة لهم في إكمال وسائط EGM-2 لمدة يومين.
- نضح إيقاف أي وسائط النمو واستبدله مع 2 مل من DMEM/F12 مع 5% FBS و 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين للسيطرة على الخلايا واستبدله مع 2 مل من أديبوجينيسيس وسائل الإعلام (راجع الخطوة 1، 4) لعلاج الخلايا.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 حاضنة لمدة 13 يوما، الاستعاضة عن وسائل الإعلام كل منهما كل 3 إلى 4 أيام.
ملاحظة: سوف تبدأ الخلايا تتراكم الدهون بعد 4 أيام علاج. - إجراء أورو والنيل الأحمر تلطيخ وفقا لأساليب نشر15–17.
- لعزل الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، قم بإزالة الوسائط من لوحات تعريفية 6-جيدا وغسله مع 1 مل PBS العقيمة.
- إضافة 350 ميليلتر من حل ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيديوم (انظر الجدول للمواد) لكل خير واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 – 10 دقائق.
- تتخلص من الخلايا خارج اللوحة مكشطة خلية باستخدام ونقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي ومزيد من المعالجة في وقت لاحق. - استخراج مرناً من العينات باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي تكييف البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
- القيام الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) لتقييم التعبير الجيني باستخدام المسابر التالية: الاديبونكتين، الأعراف والممارسات الموحدة-1، وسيدة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: هنا، إجراءات RT-PCR نفذت باستخدام بروتوكول القياسية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية؛ 15 s)، الصلب، وملحق (60 درجة مئوية؛ 1 دقيقة) لدورات 40. العينات التي أعرب عنها الجينات مع قيم جT > 35 اعتبرت غير قابلة للكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدينا بروتوكول يهدف إلى توفير نهج في المختبر لتحديد إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا الأوعية الدموية من مستودعات مختلفة من الأنسجة الدهنية البشرية. ويبين الشكل 1Aرسم تخطيطي انسيابي مبسطة. الخطوة الأولى استخدام تحديد إيجابي CD34 معربا عن الخلايا يؤدي > 95% CD34 + الخلايا في سكان الخلايا المعزولة حديثا (الشكل 1A). الأهم من ذلك، أن هذه العلامة يتم فقدان بعد تستزرع الخلايا لاثنين من الممرات. منذ CD34 علامة شائعة لفروعه المختلفة المكونة للدم وغير-المكونة للدم، هو الخطوة التالية المطلوبة لفصل غشائي المتكفل التحديد الإيجابي CD31 + الخلايا خارج الخلية السكان CD34 + (الشكل 1A). على الرغم من أن CD31 علامة لخلايا بطانية، فإنه يمكن أيضا الاطلاع على مجموعات فرعية خلايا المكونة للدم. تحليل الأعمال التحضيرية عدة من كلا من الدهون تحت الجلد وأومينتال بواسطة التدفق الخلوي، ووجدت دائماً أن CD34 + CD31 + الخلايا لا تعبر عن علامة CD45 (الشكل 1B، لوحات أعلى). وبشكل نموذجي, < أظهرت 1% الخلايا CD45 الإيجابية، من أصل السكان خلية الإجمالي. هذه النتيجة أدت بنا إلى الاستنتاج بأنه يرجح أن الحصول على إعداد خالية تقريبا من فروعه المكونة للدم. لتحديد إذا كانت الخلايا التعبير عن علامة الخلية الجذعية adipocyte CD24، تحليل الخلايا من مستودعات أومينتال وتحت الجلد على حد سواء، ووجدت أن أي من الخلايا تقريبا أعربوا عن علامة CD24 في مستودع أومينتال (الشكل 1B، الألواح السفلي) وأقل من 5% من وأعرب الخلايا العلامة في مستودع تحت الجلد (غير معروضة). وختاما، استخدام هذه المنهجية الانفصال، حصلنا CD34 + CD31 + CD45-CD24-الخلايا من مستودعات أومينتال وتحت الجلد على حد سواء لأشخاص يعانون من السمنة المفرطة.
استخدام الخرز البلاستيك مترافق مع جسم CD31، وحصلنا على الخلايا التي عرضها مورفولوجية غشائي حصاة كبيرة خلال الممرات في وقت مبكر، بدلاً من خلايا مفصولة باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق مع جسم CD31 التي عرضها على شكل دوران mesenchymal النمط الظاهري مباشرة بعد الفصل (الشكل 2A). كذلك إثبات هوية CD34 + CD31 + خلايا بطانية، أجرينا فحوصات الوظيفية اثنين: الإقبال على دي-سي-LDL ومصفوفة غشاء (المشار إليها كمصفوفة الممتلكات) أنبوب تشكيل في المختبر. CD34 + CD31 + خلايا تم المحتضنة مع دي-سي-LDL والغالبية العظمى من الخلايا كانت إيجابية بالنسبة للاستيعاب (الشكل 1). كعنصر إيجابي، استخدمنا خط خلية الابتدائية غشائي microvascular أنسجة الدهنية بشرية (هامفيك) التي متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد و الشكل 1). نحن أيضا اختبار ما إذا كان CD34 + CD31 + الخلايا تحتفظ بوظيفتها غشائي بعد استزراع بتحديد قدرة هذه الخلايا لتشكيل هياكل السفن تشبه عفوية في المختبر، في مصفوفة 3D. بعد 3 ممرات، CD31 + CD34 + أشكال هياكل شبيهة بسفينة أنبوبي في مصفوفة قابلة لمقارنة بخط خلية بطانية بشرية الأولية هامفيك (الشكل 1).
وبعد توسيع نطاق الخلايا للممرات 2 – 3، تحولنا الخلايا من وسائط كاملة EGM-2 يحتوي على عوامل نمو الأوعية المحترفين في وسائل الإعلام DMEM/F12 تستكمل مع 5% FBS، روزيقليتازون (1µM) والإنسولين (144 mU/mL). الحفاظ على الخلايا في اجتماع فريق الخبراء-2 إكمال الإعلام كبير انخفاض التمايز أديبوجينيك بهم. أيضا، إضافة الديكساميتازون و 3-إيسوبوثيل-1-زانتين لوسائل الإعلام لم يتغير المعدل ومدى تراكم الدهون وإضافة الاندوميتاسين إلى حد كبير تخفيض تراكم الدهون (البيانات لا تظهر). استناداً إلى هذه التجارب الأولية، قررنا استخدام روزيقليتازون والإنسولين فقط لتحريض أديبوجينيك. بعد 14 يوما ثقافة في وسائل الإعلام أديبوجينيك، الخلايا الثابتة وملطخة "الزيت الأحمر س" أو "الأحمر النيل" والنواة كانت كونتيرستينيد مع DAPI (الشكل 2). في الأرقام، تظهر الصور التمثيلية للخلايا المعزولة من إقران تحت الجلد (SC) (الشكل 2B، لوحات أعلى) والأنسجة الدهنية (OM) (الشكل 2B، الألواح السفلي) أومينتال من ثلاثة مواضيع البشرية مع مؤشر كتلة الجسم بين 37 – 45 كجم/م2. يرجى ملاحظة أن الاستجابة لاستحثاث تفاوتاً كبيرا بين المواضيع ومستودعات للموضوع نفسه. كما يتضح في الصورة الفلورية في الشكل 2B، عدد سكان مختلطة من الثلاجات (الأسهم الحمراء) ومولتيلوكولار (الأسهم البيضاء) المحتوية على الدهون الخلايا، فضلا عن الخلايا التي لا تتراكم الدهون (الأسهم الصفراء) موجودة عادة. النسبة بين العدد من هذه الخلايا أيضا درجة عالية متغير مع كل من الموضوع ومستودع المنشأ. إجراء تقييم كمي للنسبة المئوية للدهون التي تحتوي على الخلايا (استناداً إلى الإيجابية يا الأحمر النفط) من مجموع الخلايا (استناداً إلى نويات الملون DAPI) أظهرت فرقا كبيرا بين مستودعات اتفاقية استكهولم وأم من نفس الفردية، مع الخلايا من مستودع SC ويجري أكثر استجابة لتحريض أديبوجينيك (الشكل 2). غير واضح وتفسير التغايرية استجابة بين المواضيع ومستودعات للموضوع نفسه. ومع ذلك، يمكننا التكهن الذي يرجح أن تتصل بالطبيعة الجوهرية للسكان الخلية التي تحمل بصمات الأصابع في فيفو النمط الظاهري/البيئة وليس بسبب التغير في البروتوكول العزلة.
للتأكد من أن الخلايا خضع للتفريق بين أن تنضج adipocytes، قمنا بقياس التعبير الجيني الاديبونكتين ماركر عموم adipocyte وعلامات براون/بيج 1-الأعراف والممارسات الموحدة وسيدة في الخلايا بعد 13 يوما من أديبوجينيك التعريفي بالمقارنة مع مراقبة الأمم المتحدة المستحث الخلايا. وزيدت التعبير الاديبونكتين يصل إلى 10,000-fold في الخلايا المتمايزة بالمقارنة مع عناصر التحكم (الشكل 2D). وكان التعبير الجيني سيدة و UCP1 القابلة للاكتشاف فقط في الخلايا بعد تنشيط أديبوجينيك (الشكل 2D). على وجه الخصوص، كان التعبير 1-الأعراف والممارسات الموحدة اختلافاً كبيرا، مما يعكس أبعادا مختلفة من الأبيض: براون/بيج الخلايا ضمن سكان الخلية. التعبير عن الجين التدبير المنزلي RPL27 يتفق ملحوظ بين العينات مع جر قيم تتراوح ما بين 18 – 20 دورات وتم العثور على لا اختلافات كبيرة بين الخلايا التي خضعت للتفريق بين أديبوجينيك عناصر التحكم غير المعالجة. ونحن أيضا الكشف عن تعبير بروتين 1-الأعراف والممارسات الموحدة في الخلايا التي عرضها النمط الظاهري لوكولار متعددة، في نمط بونكتاتيد أن يوحي تعريب المتقدرية (الشكل 2E). البروتين 1-الأعراف والممارسات الموحدة لم تكن قابلة للكشف في الخلايا التي لا تتراكم الدهون أو في خلايا متعددة، متباينة القطرات الصغيرة جداً التي لا يحتمل تماما adipocytes (الشكل 2E).
ملاحظتنا أن إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا الخاصة بالمستودع والغاية متغير بين مواضيع مختلفة دفعتنا إلى السعي للارتباطات المحتملة مع مؤشر كتلة الجسم، والسن، و HbA1c. بين العينات 28 اختبار، فإننا لم نجد أي الارتباطات الهامة بين أديبوجينيك المحتملة والعمر أو مؤشر كتلة الجسم؛ ومع ذلك، نجد ترابطاً سلبيا كبيرا بين HbA1c وتراكم الدهون في الخلايا من مستودع أوم (الشكل 3A). هذه النتيجة تشير إلى وجود صلة محتملة مع البيئة هايبرجليسيميك المزمن وتستحق التحقيق في المستقبل. وهذا يوحي أيضا أن CD34 + CD31 + الخلايا يحتمل تحمل التوقيع في فيفو من قدرتها على الاستجابة للحث أديبوجينيك. نعرض أيضا أن تعرض هذه الخلايا مستويات متغيرة من الفسفرة Akt بعد تحفيز الأنسولين في المختبر (الشكل 3B، أعلى). ومع ذلك، لا يرتبط هذا التغير في الاستجابة جيدا مع قدرتها على الخضوع تمايز أديبوجينيك كما هو موضح تلطيخ "س الأحمر النفط" في صور للعينات المطابقة (الشكل 3B، أسفل).
رقم 1: فصل وتوصيف CD34 + CD31 + الخلايا من الأنسجة الدهنية البشرية. (أ) هذا المخطط الانسيابي يبين الخطوات الرئيسية للعزلة والتفرقة. بعد التحديد الإيجابي باستخدام الخرز المغناطيسي CD34، > 95% الخلايا المعزولة حديثا، قبل تحديد الخطوة الثانية، هي CD34 +. (ب) يظهر هذا الممثل التدفق الخلوي إلى الأمام الأرض متناثرة بوابات لخلية يعيش السكان؛ نموذج أونستينيد على قناة فيتك (BluFl2)؛ وتلطيخ CD45 من عينة أومينتال في الأعلى. يظهر الأسفل نفس التسلسل كما هو موضح في الأعلى، ولكن للخلايا (المسمى اليكسافلور 647) CD24 من العينة أومينتال. (ج) وهذه ميكروجرافس ممثلة تظهر الإقبال على دي-سي-LDL (أحمر) CD34 + CD31 + الخلايا بعد ح 4 في المختبر الحضانة (اللوحة العلوية). عثر امتصاص مماثلة في خط خلية الابتدائية خلية بطانية microvascular أنسجة الدهنية بشرية (هامفيك) (أسفل اللوحة). تظهر الأنوية الأزرق حسب DAPI. (د) إظهار هذه ميكروجرافس الممثل في المختبر أنبوب تشكيل CD34 + CD31 + خلايا المصنف في مصفوفة 3D. CD34 + CD31 + الخلايا (مرور 3) كانت تبذر في لوحات 24-جيدا بعد تلطيخ مع كالسين فيتك والمحتضنة ح 4 في الخلية البطانية كاملة وسائط الإعلام. الخلايا تم تصويرها باستخدام مجهر فلوري مقلوب. هامفيك، المصنفة في بنفس الكثافة، استخدمت للمقارنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: أديبوجينيك تعريفية وعلامات من الخلايا CD34 + CD31 +- (أ) هذه الممثلة ميكروجرافس إظهار مورفولوجك الاختلافات بين CD34 + CD31 + الخلايا المعزولة باستخدام تحديد إيجابي مع CD31 + الخرز المغناطيسي مقابل CD31 + الخرز البلاستيك. الخلايا تم تصويرها في مرور 1 بعد العزلة. التكبير المستخدمة هو 100 X. (ب) هذه الأفرقة ميكروجرافس ممثلة من "النفط س الأحمر" الملون CD34 + CD31 + الخلايا من عينات (OM) الحشوي أومينتال 3 مواضيع مختلفة وإقران تحت الجلد (SC). الخلايا المستزرعة لمقاطع وسائط كاملة EGM-2 من 2 – 3، ثم تحولت في وسائط الإعلام DMEM/F12 مع 5% FBS وتعامل مع الأنسولين (144 mU/mL) وروزيغليتازون (1 ميكرومتر) لمدة 14 يوما، مع وسائل الإعلام بتغيير كل 3 أيام. التكبير المستخدمة هو 100 X. وتوضح الصورة الفلورية الممثل قطرات الدهن الأحمر أديبو (الأخضر) و DAPI النووية تلطيخ (أزرق). يرجى الملاحظة بمزيج خلايا التي تحتوي على الدهون الثلاجات (السهم الأحمر)، قطيرات الدهن مولتيلوكولار (السهم الأبيض)، أو الخلايا التي تظهر لا تراكم الدهون (السهم الأصفر). التكبير المستخدمة هي 200 ×، شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (ج) هذا الفريق يظهر تحديد كمي أديبوجينيك المحتملة كالنفط الأحمر يا (أورو) تطبيع الخلايا إيجابية لمجموع نوى DAPI الملون وأعرب عن. CD34 + CD31 + الخلايا من مستودعات أوم واتفاقية استكهولم للموضوع نفسه تظهر اختلافاً كبيرا في أديبوجينيك المحتملة بالطالب إقران اختبار t (n = 7). (د) التعبير الجيني من adipocyte ناضجة علامات (الاديبونكتين والأعراف والممارسات الموحدة-1 سيدة) تم قياسه بواسطة RT-PCR في الخلايا بعد 14 يوما تحريض أديبوجينيك وفي الخلايا التحكم. يتم التعبير عن البيانات كحظيرة تغييرا للتعبير الجيني الاديبونكتين. التعبير عن سيدة والأعراف والممارسات الموحدة-1 لم يكن يمكن اكتشافها في عينات السيطرة. وتمثل القيم ΔCt تطبيع إلى RPL27 كجين التدبير المنزلي. قيم جر RLP27 ما بين 18 – 20 دورات لجميع العينات المدرجة في التحليل (n = 3-5 أشخاص). يتم التعبير عن البيانات يعني ± التنمية المستدامة. تم استخدام اختبار t المزدوجة للطالب لإجراء تحليل إحصائي للبيانات. ف < 0.05 ترفض فرضية العدم. (ه) هذا الفريق يظهر تعبير البروتين من الأعراف والممارسات الموحدة-1 في CD34 + CD31 + الخلايا بعد 13 يوما الاستقراء مع الأنسولين وروزيغليتازون. إيمونوسيتوتشيميستري استخدام جسم الأعراف والممارسات الموحدة-1 [بولكلونل] بشرية أظهر تعبير انتقائي للأعراف والممارسات الموحدة-1 في adipocytes لوكولار متعددة. وقد تحقق الكشف عن استخدام مترافق والرودامين الثانوي الأجسام المضادة (أحمر) وتلطيخ DAPI لنوى (أزرق). ويبين التكبير كبيرة في تدرج إشارة حمراء بونكتاتيد المقابلة للأعراف والممارسات الموحدة-1 (السهم الأحمر) فضلا عن قطرات الدهن متعددة (LD) ذات الأحجام المختلفة المحيطة بنواة الخلية (N). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: العلاقة بين التمايز أديبوجينيك، HbA1c وإشارات الأنسولين في المختبر . (أ) سبيرمان (غير حدودي) ومعاملات الارتباط بيرسون (حدودي) للخلايا أوم، واتفاقية استكهولم، على التوالي، استخدمت لتحديد العلاقة بين HbA1c وتراكم الدهون (n = 20). ورفض فرضية العدم ف < 0.05. (ب) في الجزء العلوي، النشاف الغربية يظهر Akt فوسفوريلاتيد (الأخضر) وتحفيز التعبير Akt (أحمر) مجموع CD34 + CD31 + الخلايا في المختبر مع 5 نانومتر الأنسولين لمدة 30 دقيقة قبل تنصيب أديبوجينيك (n = 8). في الجزء السفلي، ويرد تلطيخ "النفط الأحمر يا" من نفس الخلايا بعد تنصيب أديبوجينيك لمدة 14 يوما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تركز هذه الورقة تقديم منهجية للعزل والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من مستودعات الحشوي وتحت الجلد من الأنسجة الدهنية البشرية.
وقد تم الإبلاغ عن المنهجيات لعزل خلايا بطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة من القوارض أو البشر التي تنطوي أساسا على تقنيات استخدام الأجسام المضادة CD31 أما فلوريسسينتلي المسمى أو بالإضافة إلى حبات مغناطيسية18، 19 , 20 , 21 , 22 , 23-تحديا كبيرا لاستخدام هذه التقنيات عزلة عالمية هو عدم تجانس السكان غشائي خلية في أسرة الأوعية الدموية المختلفة وارتفاع خطر التلوث مع الخلايا الجدارية والأوعية الدموية والليفية. ومع ذلك، قد تحسينات تقنيات العزل لتجنب مثل هذا التلوث عنها24. باستخدام هذه التقنيات، معظمها خلايا بطانية ناضجة معزولة من الأنسجة. الأنسجة الدهنية مستودع كبير للخلايا الجذعية/السلف، بما في ذلك فروعه بطانية25،26. وذكرت بضع ورقات تنقية خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام مزيج من CD34 + و CD31 + الأجسام المضادة11،27. الخلايا التي تبدي علامات اثنين من سكان مختلطة من خلايا بطانية ناضجة وفروعه غشائي11،،من2829. التقرير عدة ورقات المنوي مؤخرا أن مجموعة فرعية صغيرة من غشائي (CD31 +) أو الخلايا (PDGFRβ +) الجدارية في المفرج الدهنية مصدرا غنيا من adipocyte المتكفل5،30. يمكن أن تنتج adipocytes أبيض أو بني/بيج هذه الخلايا والأوعية الدموية مع أديبوجينيك المحتملة والمرتبطة بالأوعية النشطة في الدهنية المفرج5. هذه النتائج قد توفر فرص علاجية جديدة لتحسين أداء الأيضي في السمنة و/أو للحث على فقدان الوزن عن طريق توليد adipocytes الأبيض و/أو حرارة من فروعه والأوعية الدموية. ولذلك، أنها تهم تحديد منهجية للعزلة الاقتصادية وسهلة والتوسع، وتقييم إمكانات أديبوجينيك من الخلايا غشائي الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية للإنسان.
CD34 + CD31 + الخلايا من مستودعات تحت الجلد و omental الحشوي الأنسجة الدهنية البشرية تميزت سابقا استناداً إلى إمكاناتها الأوعية وإنتاج الوسطاء التحريضية وبها علامات الشيخوخة و وظائف أخرى11 , 31-ومع ذلك، لا يوجد أي دليل المنشورة لإمكانات أديبوجينيك من هذه الخلايا. المنشورات السابقة التي تفصل CD34 + CD31 + الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي التقرير على البيانات من الخلايا التي جمعت من عدد كبير من المواضيع (10 أو أكثر)11. تقارير هذه الورقة للمرة الأولى بروتوكولا لعزل الناجحة وتوسيع CD34 + CD31 + الخلايا من المانحين البشرية واحدة من كلا من مستودعات تحت الجلد وأومينتال. ونحن عزل وتوسيع نطاق الخلايا من أقل من 2-3 غرام أنسجة الدهنية. CD34 + CD31 + الخلايا تمثل 3 – 5% من مجموع الخلايا صندوق التبرعات الخاص وعرض > بقاء 90% بعد العزلة. هذه الخلايا كانت عالية التكاثري، وأظهرت طائفة واسعة من الاستجابات نحو التفريق بين أديبوجينيك بعد تحفيز في المختبر مع روزيقليتازون والإنسولين. الدراسات السابقة فقط استخدام الخلايا الجذعية الدهنية أو كسر الأوعية الدموية stromal مجموع من الأنسجة الدهنية البشرية لاختبار أديبوجينيك الردود4،32،،من3334. تستخدم إحدى الدراسات الأخيرة تعليق خلية واحدة من ميكروفاسكولاتوري أنسجة الدهنية للإنسان، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت adipocytes المتباينة الجدارية أو بطانية في الطبيعة3.
إيمونوفينوتيبينج إضافية من CD34 + CD31 + الخلايا باستخدام التدفق الخلوي أظهرت افتقارها إلى علامات CD45 و CD24 بغض النظر عن مستودع المنشأ. الأهم من ذلك، نحن أظهرت أن بعد 3 مقاطع من الثقافة، CD31 + CD34 + الخلايا الاحتفاظ وظائفها غشائي اتضح من تراكم الكولسترول أسيتيلاتيد و في المختبر أنبوب تشكيل في مصفوفة 3D. أيضا، adipocytes المتباينة تمثل سكان مختلطة من خلايا بيضاء وبيج/براون، استناداً إلى علم التشكل والمؤشرات الجزيئية، بما في ذلك تعبير بروتين 1-الأعراف والممارسات الموحدة. الدراسات السابقة في الفئران أظهرت أن المفرج الأنسجة الدهنية يمكن أن تكون مصدرا لكل أبيض و adipocytes براون5،30 وبيانات أكثر حداثة وأظهرت نتيجة مماثلة فيما يتعلق بالتفريق بين الأبيض ووظيفيا حرارة الخلايا بيج من المفرج الدهنية البشرية3.
وخلافا لمعظم المنشورات التي تستخدم زجاجات أديبوجينيك التي تحتوي على مكونات متعددة للتفريق بين adipocyte من طائفة من فروعه في المختبر، وجدنا أن روزيقليتازون والإنسولين ضرورية وكافية أديبوجينيك تحريض CD34 + CD31 + الخلايا. حين ندرك أن روزيغليتازون وحدها يمكن أن يستحث تراكم الدهون في الخلايا الدهنية غير35، التوقيع الجزيئي لعموم adipocyte وعلامات adipocyte براون/بيج، التعبير في تحديد الخلايا، بما في ذلك بروتين الأعراف والممارسات الموحدة-1 يؤكد النضج adipocyte النمط الظاهري لبعض الخلايا المتمايزة. لدينا أديبوجينيك اثنين-المقومات كوكتيل يبسط البروتوكول الإجرائية، ويجعلها أكثر فعالية من حيث التكلفة.
ملاحظة هامة أن الاستجابة أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا اختلافاً كبيرا مع موضوع الجهات المانحة ومستودع الدهنية. بينما الاختلافات الخاصة بمستودع في أديبوجينيك وكانت الاستجابات للخلايا الجذعية الدهنية أو فروعه الأوعية الدموية stromal ذكرت سابقا32،34، تقلب الموضوع لهذه الاستجابة ملاحظة رواية. حلل من العينات البشرية 20، 3 7 أوم خلايا واتفاقية استكهولم لم يستجب للحث أديبوجينيك. وأظهرت ردود أقوى > 90% الخلايا استجابة لتحريض لعينات 4 من اتفاقية استكهولم، وعينات 2 من OM. من المثير للاهتمام، وجدنا أن الاستجابة يرتبط ارتباطاً سلبيا ب HbA1c ولا يرتبط بالرد على في المختبر تحفيز الأنسولين في خلايا غير متمايزة. نجادل بأن الفرق في استجابة لا يرجع إمكانية تكرار نتائج سوء تقنية، لكن بدلاً من ذلك يعكس البصمة الفردية للخلايا التي تحاكي في فيفو الردود. الحفاظ على هذه الاستجابة التفضيلية يحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة، وقد تمثل طريقة فحص سهلة نسبيا للاستجابة للعلاجات ويهدف إلى حفز أديبوجينيسيس في فيفو. زيادة فهم مصدر تقلب الفردية في أديبوجينيك المحتملة، إيمونوفينوتيبينج الإضافية ضروري لتحديد الخلية الجمهرات الفرعية داخل CD34 + CD31 + السكان التي تتحمل مهمة السلف adipocyte محددة.
تتضمن بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول توصيف غير مكتملة للسكان الخلية؛ التوسع طويلة نسبيا والتمايز مرات (2 أسابيع + 2 أسابيع)؛ القيود المحتملة للحصول على العينات البشرية والحاجة إلى معالجة فورية من الأنسجة الطازجة التي تم جمعها؛ والافتقار إلى البيانات الوظيفية للخلايا المتمايزة الحالية. وهناك العديد من المزايا لهذه المنهجية التي تشمل بروتوكول استنساخه وليست كثيفة العمالة؛ الخلايا يحتمل أن تحتفظ ببصمات الأصابع من أصدقائهم في فيفو النمط الظاهري؛ توسيع نطاق الخلايا من كميات صغيرة جداً من الأنسجة بتكاليف منخفضة نسبيا؛ إمكانية كريوبريسيرفي الخلايا والاحتفاظ بتوقيعها أديبوجينيك عقب إعادة الثقافة؛ والخيار لإنشاء مستودعات لهذه الخلايا بحيث أنها يمكن أن تستخدم لفحص المستقبل أو لأغراض أخرى.
يمكن استخدام هذا البروتوكول و CD34 + CD31 + الخلايا التي تم الحصول عليها كنتيجة نهائية كمنصة متعدية للدراسات الميكانيكية ولأغراض الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلفون أن نشيد ماركيز بيكي، منسق السريرية في مركز بارياتريك سينترا، لمساعدتها في عملية للمريض الفحص والموافقة. وأيد R15HL114062 إلى Anca دال دوبريان هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
