Summary
Differentiering af hvide og beige adipocytter fra fedtvæv vaskulære stamfaderen bjørne potentiale for metaboliske forbedring i fedme. Vi beskriver protokoller for en CD34 + CD31 + endotel celle isolation fra menneskelige fedt og en efterfølgende in vitro- udvidelse og differentiering af hvide og beige adipocytter. Flere downstream ansøgninger behandles.
Abstract
Fedme er ledsaget af en omfattende ombygning af fedtvæv primært via adipocyt hypertrofi. Ekstreme adipocyt vækst resulterer i en dårlig reaktion på insulin, lokale hypoxi og betændelse. Ved at stimulere differentiering af funktionelle hvid adipocytter fra stamfaderen, radikale hypertrofi af befolkningens adipocyt kan forebygges, og derfor fedtvæv metabolisk sundhed kan forbedres med en reduktion af betændelse. Også, ved at stimulere en differentiering af beige/brun adipocytter, kroppens samlede energi udgifter kan øges, hvilket resulterer i vægttab. Denne tilgang kunne forhindre udviklingen af fedme Co-morbiditeter som type 2-diabetes og hjerte-kar-sygdom.
Dette papir beskriver den isolation, udvidelse og differentiering af hvide og beige adipocytter fra et undersæt af menneskers fedtvæv endotelceller, der samtidig udtrykker CD31 og CD34 markørerne. Metoden er relativt billige og ikke arbejdskrævende. Det kræver adgang til menneskers fedtvæv og subkutane depotet er velegnet til prøveudtagning. For denne protokol, friske fedtvæv prøver fra sygeligt overvægtige emner [body mass index (BMI) > 35] er indsamlet under bariatric kirurgi procedurer. Bruger en sekventiel immunoseparation fra de stromale vaskulære brøkdel, er nok celler produceret fra så lidt som 2-3 g fedt. Disse celler kan udvides i kultur over 10-14 dage, kan være cryopreserved og bevare deres adipogenic egenskaber med passaging op til passage 5 – 6. Cellerne er behandlet i 14 dage med en cocktail ved hjælp af en kombination af human insulin og PPARγ agonist-rosiglitazon adipogenic.
Denne metode kan anvendes til at indhente bevis for konceptet eksperimenter på molekylære mekanismer, der drev adipogenic svar i adipøst endotelceller, eller til screening af nye lægemidler, der kan forbedre adipogenic reaktion rettet enten mod hvid eller beige/brun adipocyt differentiering. Brug små subkutane biopsier, kan denne metode bruges til at frasortere ikke-responder emner for kliniske forsøg har til formål at stimulere beige/brun og hvid adipocytter til behandling af fedme og co-morbiditet.
Introduction
De seneste erfaringer viser, at både mus og mennesker et undersæt af celler bosat i fedtvæv Vaskulaturen kan opdeles i enten hvide eller beige/brun adipocytter1,2,3. Fænotypen af sådanne celler er genstand for kontroverser, med dokumentation for endotelceller, glat muskel/pericyte eller et spektrum af mellemliggende fænotyper4,5,6,7. Muligheder for at udvikle denne metode var at teste adipogenic potentialet af CD34 + CD31 + endotelceller isoleret fra forskellige fedt depoter fra fede mennesker. Andre undersøgelser i litteraturen fokuserer på den potentielle af den samlede stromale vaskulære fraktion eller kendte adipocyt stamfaderen2,8,9adipogenic. Da eksisterende teknologier kan målrette specielt fedtvæv endotelceller for drug delivery10, er forstå potentialet af sådanne celler til at gennemgå adipogenic induktion mod hvide eller beige adipocytter vigtigt for fremtidige målrettede behandlinger.
Forskellige grupper rapporterede kombination af CD31 og CD34 markører som surrogater at isolere endotelceller fra menneskers fedtvæv11,12,13. Typisk, isolering udføres, ved hjælp af to sekventielle trin og en positiv markering med magnetiske perler. I denne rapport, blev immunoseparation brug af CD34 + magnetiske perler kombineret med CD31 plastik perler udnyttet. Vi fandt denne teknik overlegen i forhold til den sekventielle magnetiske immunoseparation med hensyn til bevarelse af typiske brostensbelagte endotel morfologi. Også, vi var i stand til at generere nok celler kræves for ekspansion og adipogenic induktion starter fra så lidt som 1-2 g fedt. Et lille udsnit biopsi af subkutant fedt er nok til at producere den ønskede mængde af celler til downstream applikationer. Dette aspekt er potentielt vigtigt, især hvis denne metode vil blive udnyttet til screening for en lydhørhed over for adipogenic induktion i forsøgspersoner.
I modsætning til andre systemer, der er rapporteret i litteraturen, denne metode udnytter kun to ingredienser til adipogenic induktion af CD34 + CD31 + celler: en PPARγ agonist — rosiglitazon — og humant insulin. Vigtigere, falder mængden af insulin bruges inden for normal/høj vifte af cirkulerende post-absorptive insulin i mennesker14. Graden af lydhørhed over for insulin celler in vitro-, målt ved Akt fosforylering, korrelerer ikke med deres evne til at reagere på induktion cocktail. Interessant, bruger denne induktion cocktail og eksperimentelle betingelser, en blanding af hvid og beige/brun celler blev fremstillet som bestemmes af størrelsen og antallet af intracellulære lipid dråber og udtryk for molekylære markører. Denne enkle og omkostningseffektive induktion protokol sammen med den kvantitative evaluering af Fænotypen af responder celler (hvide vs beige) giver mulighed for en screening af agenter, der potentielt kan ændre balancen af differentierede beige : hvide adipocytter.
Denne metode giver også en translationel tilgang for at forstå de underliggende mekanismer for adipogenesis af vaskulære endotel ophav i menneskers fedtvæv. Med denne specifikke isolation/differentiering teknik, kan efterforskere afhøre forskellige veje ansvarlig for adipogenesis i en delmængde af vascular endothelial celler fra forskellige fedt depoter i magre og fede mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionelle Review Board udvalg på østlige Virginia Medical School godkendt forskning og indsamling af menneskers fedtvæv prøver, der indgår i undersøgelsen. Informeret skriftligt samtykke blev indsamlet fra patienterne.
1. fremstilling af buffere, medier og instrumenter
- Forberede en Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered løsning (KRBBS): 135 mM natriumchlorid, 5 mM kaliumchlorid, 1 mM magnesium sulfat, 0,4 mM kalium fosfat dibasiske, 5,5 mM glucose, 1 mM adenosin, 0,01% antibiotikum/antimykotikum mix (50 µg/mL af penicillin, 50 µg/mL af streptomycin, 30 µg/mL af gentamicin, 15 ng/mL af amphotericin) og 10 mM HEPES (pH = 7.4). Denne løsning er tilberedt frisk hver gang for væv indsamling og fordøjelse.
- Forberede en frisk collagenase løsning: 1 mg/mL af collagenase, type 1, i KRBSS; gør 3 mL/g fedt. Pre varm collagenase løsning ved 37 ° C i et vandbad inden væv fordøjelsen.
- Forberede en CD34 celle Isolation Buffer: 2% føtal bovint serum (FBS) og 1 mM EDTA i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Forberede Adipogenesis medier: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL af penicillin/streptomycin, 1,25 µL/mL af human insulin (5 µg/mL eller 144 mU/mL) og 0,36 µL/mL 2,8 mM rosiglitazon (1 µM).
- Forbered en 0,3% olie røde O (ORO) stamopløsning (vægt/volumen) ved at opløse 0,3 g ORO til 100 mL med isopropanol.
2. adipøst stromale vaskulære brøkdel Isolation
Bemærk: Undersøgelsen omfattede en tværsnits kohorte af sygeligt overvægtige type 2 diabetes (T2D) og ikke-diabetikere emner, i alderen 18-65 år, gennemgår Fedmekirurgi på Sentara Metabolic og vægt tab kirurgi Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Udelukkelseskriterier inkluderet en autoimmun sygdom, herunder type 1 diabetes mellitus, tilstande, der kræver kronisk immunsupprimerende behandling, anti-inflammatoriske medicin, thiazolinendiones, aktiv rygning, kroniske eller akutte infektioner eller en historie af malignitet behandlet inden for de sidste 12 måneder. T2D blev defineret som en fastende plasma glucose på 126 mg/dL eller derover, en glucose på 200 mg/dL eller mere efter en 2 h glukosetolerance test eller brug af mod diabetes medicin.
- Indsamle menneskelige omental (PEØ) og subkutane (SC) fedtvæv (AT) fra forsøgspersoner gennemgår fedmekirurgi.
- Holde OM og SC på i separate hætteglas indeholdende Hank's Buffered saltopløsning med 50 µg/mL af penicillin/streptomycin ved stuetemperatur umiddelbart efter væv udvinding.
- Forsigtigt rense og fjerne fibrotisk og cauterized sektioner af væv ved hjælp af 70% ethanol aftørrede saks og pincet, når prøven ankommer til laboratoriet efter væv udvinding.
- Vejer fedtvæv og partitionere it til 5 g (eller mindre) delprøver for collagenase fordøjelsen.
- Fint hakke på i 5 mL af en collagenase løsning i en scintillation hætteglas ved stuetemperatur, ved hjælp af to par saks. 5 g.
- Tilføje en ekstra 10 mL af collagenase løsning på hakket væv for 15 mL samlede.
- Fordøje prøver i 1 timer ved 37 ° C i et vandbad med fortsatte ryster.
- Skære tip off en 20 mL sprøjte til at gøre en stump ende.
- Klip en 9 cm x 9 cm-pladsen fra en 250 µm mesh og skubbe det halvvejs ind i en 50 mL konisk rør ved hjælp af stump ende sprøjten.
- Hæld prøverne i 20 mL stump ende sprøjte og filtreres gennem de 250 µm nylon mesh ind i 50 mL konisk røret at adskille adipocytter og stromale vaskulære celler fra ufordøjet væv.
Bemærk: Brug ikke mere end 5 g på pr. 50 mL konisk tube, da trådnet vil få tilstoppet på grund af overskydende fibrotisk ufordøjet materiale. - Udviske scintillation hætteglasset med 10 mL af KRBBS og hæld det gennem et filter for at indsamle tilbageværende celler.
- Inkuber de filtrerede prøver for 5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Dette trin er vigtigt at give mulighed for adipocytter til at flyde på toppen af røret og nogle af de stromale vaskulære celler til at slå sig ned på bunden af røret. - Udnytte en 20 mL sprøjte og en 20 G x 6 i pipettering nål til at fjerne det stromale vaskulære brøkdel lag og overføre det til en ren 50 mL konisk slange.
- Tilsættes 10 mL af KRBBS, og prøver at sidde på bænken i 5 min ved stuetemperatur.
- Gentag trin 2.12 – 2.14 to gange.
Bemærk: Disse trin sikrer, at der er ingen forurening af de stromale vaskulære celler med de flydende adipocytter. - Holde de stromale vaskulære fraktioner fra både depoter på is til videreforarbejdning, som beskrevet i nedenstående trin.
Bemærk: Lad ikke cellerne på is til mere end 1 h, som dette kan have en indvirkning på cellernes levedygtighed. Adipocytter kan være flash-frosset i flydende nitrogen til langtidsopbevaring eller bruges frisk til eksperimenter.
3. isolering af fedtvæv Endothelial Cells
- Spin de stromale vaskulære fraktioner (SVF) på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjernes prøverne fra centrifugen og omhyggeligt hæld supernatanten; holde pellet SVF celler.
- Forsigtigt resuspend celle pellets i 5 mL PBS.
Bemærk: Hvis mere end 5 g af en ATT depot blev behandlet i flere delprøver (Se trin 2.4), samle celle pellets. - Spin prøver på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten, resuspend celler i 1 mL PBS, og tælle cellerne.
Bemærk: Her, en automatisk celle counter blev brugt til celle optælling. Cellernes levedygtighed blev fremstillet ved at blande 12 µL af cellesuspension med 12 µL af en acridin orange/propidium Iodid (AO/PI) løsning (Se Tabel af materialer). Det gennemsnitlige antal celler pr. gram af AT for hver depot er: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6.45 x 104. Levedygtigheden af celler fra både depoter var > 90%. - Pellet prøver på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
Bemærk: En CD34 immunomagnetic udvalg protokol (Se Tabel af materialer) blev tilpasset til trin 3.7-3.15. - Resuspenderes i 100 µL af CD34 isolation buffer.
Bemærk: De samlede celletal kræver følgende resuspension rumfang: (a) < 2 x 107 celler: resuspenderes i 100 µL; (b) 2 x 108–5 x 108 celler: resuspenderes i 1 mL. I trin 3,9-3.16, mængderne af de reagenser blev skaleret ned til < 2 x 107 celler. - Tilsæt 10 µL af CD34 cocktail og inkuberes prøven i 15 min. ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5 µL af magnetiske perler og inkuberes prøve i 10 min ved stuetemperatur.
- Tilsættes 2,5 mL af CD34 isolation buffer til hver prøve og placere prøverne i magnet for 5 min ved stuetemperatur.
- Invertere magnet for 5 s til hæld isolation buffer.
- Fjern prøverne fra magneten, og Gentag trin 3.10 og 3.11 4 x.
- Fjerne røret fra magneten og der tilsættes 2 mL af CD34 isolation buffer.
- Sammenpresse cellerne ved 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Resuspend celle pellets i 1 mL af CD34 isolation buffer og tælle cellerne.
Bemærk: Her, det gennemsnitlige antal celler pr. gram på er: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9.53 x 103. En CD31 plast immunobead protokol blev tilpasset for trin 3.16 – 3,34 (Se Tabel af materialer). - Pellet celler på 500 x g i 5 min og resuspenderes i 250 µL af Buffer B og 250 µL af wash buffer.
- Grundigt resuspend CD31 perler af vortexing røret.
- Tilføj 20 µL af CD31 perler.
Bemærk: På grund af cellen total tæller > 1 x 106, volumen var skaleret ned efter producentens input. - Inkuber prøve med vuggende i 30 min. ved stuetemperatur.
- Vedhæfte en si til en steril 50 mL konisk slange.
Bemærk: Den større åbning af sien skal være på toppen. - Før celleseparering, der tilsættes 1 mL af wash buffer til Reagensglasset sien. Påfør blandingen genereret under trin 3.16 at sien.
- Vask si med 5 mL af wash buffer i en cirkulær bevægelse for en samlet maengde paa 20 mL. Fastgør forbindelsesmodulet til en steril 50 mL konisk slange og lukke luer-lock.
- Vedhæfte si til stikket. Der tilsættes 1 mL af wash buffer langs væggen af sien. Der tilsættes 1 mL af aktiverede buffer D langs væggen af sien. Swirl prøven forsigtigt og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 1 mL af wash buffer. Adskille cellerne fra glasperler af pipettering op og ned 10 x.
Bemærk: Undgå at generere luftbobler. - Åbn luer-lock og tillade de fritliggende celler til at flyde ind i 50 mL konisk rør. Vaske si 10 x med 1 mL af vaskebuffer hver gang.
- Kassér den stik og si og centrifugeres prøver ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Resuspenderes celle i 2 mL af komplet EGM-2 medier for kultur.
Note: Det gennemsnitlige antal celler pr. gram på på dette punkt er: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. Levedygtigheden af celler fra både depoter var over 90%.
4. induktion af Adipogenesis i isolerede Endothelial Cells
- Vokse celler i 6-godt vævskultur-behandlede plader med komplet EGM-2 medier i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Erstatte medierne hver 3-4 dage, indtil cellerne når 80-90% sammenløbet.
Bemærk: Befolkning fordobling er mellem 2-3 dage. - Udvid cellerne ved plettering dem på 100 mm petriskåle og opdele celler 1:3 gang. På dette stadium er cellerne på passage 2.
- Tælle celler ved hjælp af en automatisk celle counter (Se Tabel af materialer).
- Frø ca 100-200.000 celler i 6-godt plader sikrer dublerede brønde for hver depot og kultur dem i komplet EGM-2 medier til 2 dage.
- Opsug off nogen vækst medier og erstatte det med 2 mL af DMEM/F12 med 5% FBS og 50 µg/mL af penicillin/streptomycin for kontrolelementet celler og erstatte det med 2 mL af Adipogenesis media (Se trin 1.4) for behandling celler.
- Inkuber celler ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator for 13 dage, erstatter de respektive medier hver 3-4 dage.
Bemærk: Celler vil begynde at akkumulere lipider efter 4 dages behandling. - Gennemføre ORO og Nile rød farvning ifølge offentliggjorte metoder15-17.
- For at isolere cellerne til en RNA udvinding, fjerne medier fra 6-godt induktion plader og vaske det med 1 mL steril PBS.
- Tilføje 350 µL af en guanidium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform løsning (Se Tabel af materialer) til hver godt og Inkuber ved stuetemperatur i 5-10 min.
- Skrab celler fra pladen ved hjælp af en celle skraber og overføre cellerne til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
Bemærk: Prøverne kan opbevares i-80 ° C fryser for RNA udvinding og videreforarbejdning på et senere tidspunkt. - Uddrag mRNA fra prøverne ved hjælp af en tilpasset RNA udvinding protokol (Se Tabel af materialer).
- Udføre en real-time Polymerasekædereaktionen (RT-PCR) at vurdere genekspression ved hjælp af de følgende sonder: adiponectin, UCP-1, og CIDEA (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Her, RT-PCR procedurer blev udført ved hjælp af følgende standard protokollen: denaturering (95 ° C; 15 s), udglødning, og udvidelse (60 ° C, 1 min) for 40 cyklusser. De prøver, der udtrykte gener med CT -værdier > 35 ansås målbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores protokollen har til formål at give en in vitro- metode for at bestemme adipogenic potentiale af CD34 + CD31 + vaskulære celler fra forskellige depoter af menneskers fedtvæv. En forenklet rutediagram diagram er vist i figur 1A. Det første skridt ved hjælp af en positiv markering af CD34 udtrykker celler resulterer i > 95% CD34 + celler i befolkningen i de frisk isolerede celler (figur 1A). Vigtigere, er denne markør tabt, når cellerne er kulturperler for et par passager. Da CD34 er en fælles markør for forskellige hæmatopoietisk og ikke-hæmatopoietisk progenitorceller, er det følgende trin, der kræves for adskillelse i endothelial stamfaderen positiv udvælgelse af CD31 + celler ud af den CD34 + celle befolkning (figur 1A). Selv om CD31 er en markør i endothelial celler, kan den også findes på delmængder af hæmatopoietisk celler. Vi analyseret flere præparater fra begge omental og subkutant fedt ved flowcytometri og fundet konsekvent at CD34 + CD31 + celler ikke udtrykke CD45 markør (figur 1B, top paneler). Typisk, < 1% af celler viste CD45 positivitet, ud af cellen total befolkning. Dette resultat fik os til at konkludere, at vi sandsynligvis fået et stort set fri for hæmatopoietisk stamfaderen forberedelse. For at bestemme, hvis cellerne udtrykke adipocyt stamcelle markør CD24, vi analyseret celler fra både omental og subkutane depoter og fundet, at stort set ingen celler udtrykt CD24 markør i omental depot (figur 1B, bunden paneler) og mindre end 5% af cellerne udtrykt markør i det subkutane depot (ikke vist). Til sidst, opnåede ved hjælp af denne metode, adskillelse, vi CD34 + CD31 + CD45-CD24-celler fra både omental og subkutane depoter af overvægtige forsøgspersoner.
Ved hjælp af de plast perler konjugeret med et antistof, CD31, vi opnåede celler, vises den brostensbelagte endotel morfologi under tidlige passager, i stedet for cellerne adskilt ved hjælp af de magnetiske perler konjugeret med et CD31-antistof, der vises en spindel-formede mesenchymale fænotype umiddelbart efter adskillelse (figur 2A). For at yderligere underbygge i endothelial identitet af CD34 + CD31 + celler, vi udførte to funktionelle assays: en udbredelse af DiI-Ac-LDL og en basalmembran matrix (refereret til som matrix hereon) tube formation in vitro. CD34 + CD31 + celler blev inkuberet med DiI-Ac-LDL og det store flertal af celler var positive for optagelsen (figur 1 c). Som positiv kontrol, vi brugte en menneskers fedtvæv mikrovaskulære endotel primære cellelinje (HAMVEC), der er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer og figur 1 c). Vi har også testet om CD34 + CD31 + celler, bevarer deres endotelfunktion efter dyrkning ved at bestemme sådanne celler evne til at danne spontan fartøj-lignende strukturer i vitro, i en 3D-matrix. Efter 3 passager, CD31 + CD34 + former rørformede fartøj-lignende strukturer i en matrix sammenlignes med en HAMVEC primære menneskelige endotel cellelinje (figur 1 d).
Efter udvidelse af celler til 2 – 3 passager skiftede vi celler fra EGM-2 komplet medier indeholdende pro-angiogene vækstfaktorer i DMEM/F12 medier suppleret med 5% FBS, rosiglitazon (1µM) og insulin (144 mU/mL). Opretholdelse af celler i EGM-2 komplet media dramatisk reduceret deres adipogenic differentiering. Også, en tilføjelse af dexamethason og 3-isobuthyl-1-Methylxanthin til medierne ændre ikke hastigheden og omfanget af lipid ophobning og tilføjelse af indomethacin betydeligt reduceret lipid ophobning (data ikke vist). Baseret på disse indledende forsøg, besluttede vi at kun bruge rosiglitazon og insulin til adipogenic induktion. Efter 14 dage af kultur i adipogenic medier, cellerne var fast og farves med olie røde O eller Nilen rød og atomkerner var counterstained med DAPI (figur 2B). I tallene vises repræsentative billeder af celler isoleret fra parret subkutan (SC) (figur 2B, top paneler) og omental (PEØ) (figur 2B, bunden paneler) fedtvæv tre menneskelige emner med en BMI mellem 37-45 kg/m2. Bemærk venligst at svar på induktion varierer meget mellem emnerne og depoter af samme emne. Som det ses i fluorescerende billedet i figur 2B, en blandet population af unilocular (røde pile) og multilocular (hvide pile) er lipid-holdige celler samt celler der ikke ophobes lipider (gule pile) typisk stede. Forholdet mellem antallet af disse celler er også meget variabel med både emnet og depot af oprindelse. En kvantificering af procentdelen af lipid-holdige celler (baseret på olie røde O positivitet) ud af de samlede celler (baseret på DAPI-farvede kerner) viste en signifikant forskel mellem SC og OM depoterne af samme individuelle, med celler fra SC depot at være mere lydhør over for adipogenic induktion (figur 2 c). Forklaring på heterogenitet i reaktion mellem fagene og depoter af samme emne er ikke klart. Men vi spekulere, der sandsynligvis er relateret til den iboende karakter af cellen befolkningen, der bærer fingeraftryk i vivo fænotype/miljø- og ikke som følge af variabiliteten i isolation-protokollen.
For at bekræfte, at cellerne undergik differentiering for at modne adipocytter, målte vi genekspression af pan-adipocyt markør adiponectin og brun/beige markører UCP-1 og CIDEA i cellerne efter 13 dages adipogenic induktion i forhold til un-induceret kontrol celler. Adiponectin udtryk var steget op til 10,000-fold i de differentierede celler i forhold til kontrol (figur 2D). Gen-ekspression af CIDEA og UCP1 var kun kan påvises i cellerne efter adipogenic stimulation (figur 2D). UCP-1 udtryk var især meget varierende, hvilket afspejler de forskellige andele af hvid: Brun / beige celler inden for befolkningens celle. Udtryk for husholdning gene RPL27 var bemærkelsesværdigt konsekvent mellem prøver med CT -værdier spænder mellem 18 – 20 cykler og fandtes ingen væsentlige forskelle mellem de celler, der undergik adipogenic differentiering og den ubehandlet kontrol. Vi har også opdaget en UCP-1 protein udtryk i de celler, der vises flere locular fænotype, i et punctated mønster, der tyder på en mitokondrie lokalisering (figur 2E). Proteinet UCP-1 var ikke påviselig i celler, der ikke ophobes lipider eller i celler med flere meget små dråber, der ikke er sandsynligvis fuldt differentierede adipocytter (figur 2E).
Vores observation at adipogenic potentiale CD34 + CD31 + celler er depot-specifikke og meget variabel blandt forskellige emner bliver bedt om at søge efter potentielle sammenhænge med BMI, alder og HbA1c. Blandt de testede 28 prøver finde vi ikke nogen betydelig korrelationer mellem adipogenic potentielle og alder eller BMI; men vi fandt en signifikant negativ korrelation mellem HbA1c og lipid ophobning i celler fra OM depot (figur 3A). Dette fund indikerer en mulig forbindelse med kronisk hyperglykæmisk miljøet og fortjener kommende undersøgelse. Dette tyder også på at CD34 + CD31 + celler sandsynligvis bære deres evne til at reagere på en adipogenic induktion i vivo underskrift. Vi viser også, at disse celler vise variable niveauer af Akt fosforylering efter en in vitro- insulin stimulation (figur 3B, top). Men denne variabilitet som reaktion ikke korrelerer godt med deres evne til at gennemgå en adipogenic differentiering, som det fremgår af olie røde O farvning i billeder af de tilsvarende prøver (figur 3B, nederst).
Figur 1: adskillelse og karakterisering af CD34 + CD31 + celler fra menneskers fedtvæv. (A) dette rutediagram diagram viser de vigtigste trin af isolation og differentiering. Efter den positive udvalg brug af CD34 magnetiske perler, > 95% af frisk isolerede celler, før det andet udvalg trin, er CD34 +. (B) Denne repræsentative flowcytometri viser en forward spredte plot gated for levende celle befolkning; en unstained prøve på FITC (BluFl2) kanalen; og CD45 farvning af omental repræsentativ på toppen. Bunden viser samme rækkefølge som vist på toppen, men for CD24 (Alexafluor 647-mærket) celler fra omental prøven. (C) disse repræsentative micrographs Vis en optagelse af DiI-Ac-LDL (rød) af CD34 + CD31 + celler efter 4 h i vitro inkubation (toppanelet). En lignende optagelsen blev fundet i en menneskelig fedtvæv mikrovaskulære endotel celle primære linje (HAMVEC) (nederste panel). Kerner er vist blå af DAPI. (D) disse repræsentative micrographs Vis en in vitro- tube dannelsen af CD34 + CD31 + celler seedede i en 3D-matrix. CD34 + CD31 + celler (passage 3) var seedede i 24-godt plader efter en farvning med FITC-calcein og inkuberes i 4 h i komplet endotel celle medier. Cellerne blev afbildet ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop. HAMVEC, seedet på den samme tæthed, blev brugt til sammenligning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Adipogenic induktion og markører af CD34 + CD31 + celler. (A) disse repræsentant micrographs Vis de morfologiske forskelle mellem CD34 + CD31 + celler isoleret ved hjælp af en positiv markering med CD31 + magnetiske perler vs CD31 + plastik perler. Cellerne blev afbildet på passage 1 efter isolation. Forstørrelsen bruges er 100 X. (B) disse paneler er repræsentative micrographs af olie røde O farves CD34 + CD31 + celler fra parret subkutan (SC) og omental viscerale (PEØ) prøver af 3 forskellige fag. Cellerne var kulturperler for 2-3 passager i EGM-2 komplet media, så tændt DMEM/F12 medier med 5% FBS og behandles med insulin (144 mU/mL) og rosiglitazon (1 µM) i 14 dage, med medier ændret hver 3 dage. Forstørrelsen bruges er 100 X. Repræsentative fluorescerende billedet viser adipo røde lipid dråber (grøn) og DAPI nukleare farvning (blå). Bemærk en blanding af celler, der indeholder unilocular lipider (rød pil), multilocular lipid dråber (hvid pil) eller celler, der viser ingen lipid ophobning (gul pil). Forstørrelsen bruges er 200 X skalalinjen = 50 µm. (C) dette panel viser en kvantificering af adipogenic potentielle udtrykt som olie røde O (ORO) positive celler normaliseret til samlede DAPI-farvede kerner. CD34 + CD31 + celler fra OM og SC depoter af samme emne viser en signifikant forskel i adipogenic potentielle af en parvis t-test (n = 7). (D) genekspression af modne adipocyt markører (adiponectin, UCP-1 og CIDEA) blev målt af RT-PCR i celler efter 14 dage af adipogenic induktion og kontrol celler. Dataene, der er udtrykt som en fold-ændring for adiponectin genekspression. Udtryk for CIDEA og UCP-1 var ikke påviselig i kontrolprøver. Værdierne repræsenterer ΔCt normaliseret til RPL27 som en husholdning genet. CT -værdier for RLP27 var mellem 18 – 20 cyklusser for alle de prøver, der er medtaget i analysen (n = 3-5 fag). Dataene udtrykt som betyder ± SD. En parvis t-test anvendtes til en statistisk analyse af data. p < 0,05 afviser nulhypotesen. (E) dette panel viser protein udtryk for UCP-1 i CD34 + CD31 + celler efter 13 dage af induktion med insulin og rosiglitazon. Immuncytokemi ved hjælp af en menneskelig polyklonale UCP-1 antistof viste en selektiv udtryk for UCP-1 i multi locular adipocytter. Påvisning blev opnået ved hjælp af en rodamin-konjugeret sekundær antistof til (rød) og DAPI farvning for kerner (blå). Den store forstørrelse i indsatsen viser den punctated røde signal svarer til UCP-1 (rød pil) samt flere lipid dråber (LD) i forskellige størrelser omkring cellekernen (N). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Korrelation mellem adipogenic differentiering, HbA1c og in vitro- insulin signalering. (A) Spearman (ikke-parametrisk) og Pearson (parametrisk) korrelationskoefficienter for OM og SC cellerne, henholdsvis, blev brugt til at bestemme sammenhængen mellem HbA1c og lipid ophobning (n = 20). Den null-hypotese blev afvist for p < 0,05. (B) på toppen, en western blotting viser fosforyleres Akt (grønne) og den samlede Akt (rød) udtryk i CD34 + CD31 + celler stimuleret in vitro- med 5 nM insulin i 30 min før adipogenic induktion (n = 8). Nederst, er en olie røde O farvning af de samme celler efter adipogenic induktion i 14 dage vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fokus i dette papir er at fremlægge en metodologi til isolering, ekspansion og adipogenic induktion af CD34 + CD31 + endotelceller fra visceral og subkutane depoter af menneskers fedtvæv.
Metoder er blevet rapporteret for isolation i endothelial celler fra forskellige vaskulære senge af gnavere eller mennesker, der involverer primært teknikker ved hjælp af CD31 antistoffer enten fluorescently mærket eller koblet til magnetiske perler18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. en stor udfordring for den universelle brug af disse teknikker, isolation er heterogenitet i endothelial cellen befolkningen i forskellige vaskulære senge og den store risiko for kontaminering med fibroblaster og vaskulære vægmaleri celler. Justeringer af isolation teknikker til at undgå sådanne forureninger har dog været rapporteret24. Brug af disse teknikker, kan for det meste modne endotelceller isoleres fra væv. Fedtvæv er et stort reservoir af stem/stamceller, herunder endotel stamfaderen25,26. Et par papirer rapporteret rensning i endothelial celler fra menneskers fedtvæv ved hjælp af en kombination af CD34 + og CD31 + antistoffer11,27. Celler, der udtrykker de to markører er en blandet population af modne endotelceller og endotel stamfaderen11,28,29. Flere nylige skelsættende papirer rapporterer, at en lille delmængde i endothelial (CD31 +) eller vægmaleri (PDGFRβ +) celler i adipøst Vaskulaturen er en rig kilde til adipocyt stamfaderen5,30. Disse vaskulære celler med adipogenic potentielle kan producere både hvid eller brun/beige adipocytter og er forbundet med aktiv angiogenese i adipøst Vaskulaturen5. Disse resultater kan give nye terapeutiske muligheder for at forbedre den metaboliske ydeevne i fedme og/eller til at fremkalde vægttab ved at generere hvid og/eller termogeniske adipocytter fra vaskulære stamfaderen. Det er derfor af interesse at identificere en metode til nem og økonomisk isolering, ekspansion og vurdering af adipogenic potentiale af vascular endothelial celler fra menneskers fedtvæv.
CD34 + CD31 + celler fra menneskelige subcutan og omental viscerale fedtvæv depoter var tidligere karakteriseret baseret på deres angiogene potentiale, produktion af inflammatoriske mediatorer, deres gulne markører og andre funktioner11 , 31. der er dog ingen offentliggjorte beviser for adipogenic potentielle af sådanne celler. Tidligere publikationer, der adskilte CD34 + CD31 + celler ved hjælp af magnetiske perler rapport om data fra celler samles fra et stort antal emner (10 eller flere)11. Dette papir rapporter for første gang en protokol for vellykket isolation og udvidelse af CD34 + CD31 + celler fra enkelt menneskelige donorer fra både de subkutane og omental depoter. Vi isoleret og udvidet celler fra så lidt som 2-3 g af fedtvæv. CD34 + CD31 + celler repræsenteret 3 – 5% af de samlede SVF celler og vises > 90% levedygtighed efter isolation. Disse celler var meget proliferativ og viste en bred vifte af reaktioner over for adipogenic differentiering efter en in vitro- stimulation med rosiglitazon og insulin. Tidligere undersøgelser anvendes kun adipøst stamceller eller samlede stromale vaskulære fraktion fra menneskers fedtvæv til at teste adipogenic svar4,32,33,34. En nylig undersøgelse anvendes enkelt celle suspensioner fra microvasculature af menneskers fedtvæv, men det er uklart, om de differentierede adipocytter var vægmaleri eller endotel naturen3.
Yderligere Immunofænotypning af CD34 + CD31 + celler ved hjælp af flowcytometri viste deres manglende CD45 og CD24 markører uanset deres depot af oprindelse. Vigtigere, vi viste, at efter 3 passager i kultur, CD31 + CD34 + celler beholde deres endotel funktionalitet dokumenteret ved ophobning af acetyleret LDL og en in vitro- tube dannelse i en 3D-matrix. De differentierede adipocytter repræsenteret en blandet befolkning på hvide og beige/brun celler, baseret på deres morfologi og molekylære markører, herunder en UCP-1 protein udtryk. Tidligere undersøgelser på mus viste at fedtvæv Vaskulaturen kan være en kilde til både hvid og brun adipocytter5,30 og nyere data viste et lignende resultat med hensyn til differentiering af hvide og funktionelt termogeniske beige celler fra menneskelige adipøst Vaskulaturen3.
I modsætning til de fleste publikationer, der anvendes adipogenic cocktails der indeholder flere ingredienser til adipocyt differentiering fra en vifte af stamfaderen i vitro, fandt vi, at rosiglitazon og insulin er nødvendig og tilstrækkelig for adipogenic Induktion af CD34 + CD31 + celler. Mens vi er klar over, at rosiglitazon alene kan fremkalde en lipid ophobning i ikke-fedt celler35, Molekylær underskrift for pan-adipocyt og brun/beige adipocyt markører, herunder en UCP-1 protein bekræfter udtryk i Marker celler, den modne adipocyt Fænotypen af nogle af de opdelte celler. Vores to-ingrediens adipogenic cocktail forenkler den proceduremæssige protokol og gør det mere omkostningseffektive.
En vigtig observation var at adipogenic reaktion CD34 + CD31 + celler var meget varierende med donor emne og fedt depot. Mens depot-specifikke forskelle i adipogenic svar af adipøst stamceller eller stromale vaskulære ophavene har været rapporteret tidligere32,34, er emnet variation af sådan et svar en roman observation. Ud af de 20 menneskelige prøver analyseres, 3 SC og 7 OM celler ikke reagerer på adipogenic induktion. De mest robuste svar viste > 90% af de celler, der er lydhøre over for induktion 4 prøver fra SC og 2 prøver fra OM. interessant, vi fandt at reaktionsevne er negativt korreleret med HbA1c og ikke korrelerer med svar på en i vitro insulin stimulation i udifferentierede celler. Vi hævde, at forskellen i svar er ikke på grund af de fattige reproducerbarhed af teknikken men snarere afspejler den enkelte fingeraftryk af celler, der efterligner i vivo svar. Bevarelse af dette differential svar kræver yderligere validering og kan repræsenterer en relativt let screeningsmetode for reaktion på terapier har til formål at stimulere adipogenesis i vivo. For yderligere at forstå kilden til individuel variation i den potentielle adipogenic, er yderligere Immunofænotypning nødvendige for at identificere celle delpopulationer CD34 + CD31 + befolkning, der bærer en specifik adipocyt stamfader funktion.
Nogle af begrænsningerne i denne protokol omfatter en ufuldstændig karakterisering af cellepopulationer; relativt lange udvidelse og differentiering gange (2 uger + 2 uger); potentielle begrænsninger til at få adgang til menneskelige prøver og behovet for øjeblikkelig behandling af frisk indsamlet væv; og nuværende mangel på funktionelle data for de differentierede celler. Der er flere fordele ved denne metode, der omfatter en reproducerbar og ikke arbejdskrævende protokol; cellerne, sandsynligt bevare fingeraftryk i deres i vivo fænotype; udvidelse af celler fra meget små mængder af væv med relativt lave omkostninger; muligheden for at cryopreserve cellerne og bevarer deres adipogenic signatur efter re kultur; og mulighed for at generere depoter af disse celler, så de kan bruges til fremtidige screening eller andre formål.
Denne protokol og CD34 + CD31 + celler fremstillet som et slutresultat kan bruges som en translationel platform for Mekanistiske undersøgelser såvel som til screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Becky Marquez, den kliniske koordinator på Sentara Bariatric Center, for hendes hjælp med processen med patienten screening og samtykkende. Denne forskning blev støttet af R15HL114062 til Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
