Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

واحد من شروط الضغط الأكثر تحديا التي تواجهها الكائنات الحية خلال حياتهم ينطوي على التراكم للتأكسد. خلال الأكسدة، خلايا تعتمد بشدة على مرافقين الجزيئية. نقدم هنا، الأساليب المستخدمة في التحقيق ينظم الأكسدة التجميع المضادة النشاط، وكذلك فيما يتعلق برصد التغيرات الهيكلية التي تنظم وظيفة وصي باستخدام HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد.

Abstract

الكائنات الحية بانتظام بحاجة إلى التكيف مع البيئات المتغيرة خلال دورة حياتها، بما في ذلك التغيرات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة، التراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية، وأكثر. هذه التقلبات يمكن أن يؤدي لبروتين على نطاق واسع التي تتكشف، التجميع، وموت الخلية. ولذلك، تطورت الخلايا شبكة دينامية والإجهاد على حدة من مرافقين الجزيئية، التي تحافظ على البروتين "بصحة جيدة" خلال ظروف الإجهاد. المحرمين ATP مستقلة تشكل فئة رئيسية واحدة من مرافقين الجزيئية، التي تخدم كجزيئات الدفاع السطر الأول، حماية ضد تجميع البروتين بطريقة تعتمد على الإجهاد. هذه مرافقين تشترك في سمة واحدة هي قدرتها على الاستفادة من اللدونة الهيكلية للتنشيط الخاصة بالإجهاد، والاعتراف بها، والإفراج عن العميل تجمعات.

في هذه الورقة، ونحن نركز على تحليل واحد وصي اضطرابه جوهريا هذه، Hsp33 ينظم الأكسدة البكتيرية، التي تحمي البروتينات ضد التجميع خلال الأكسدة الوظيفية والهيكلية. هنا، نحن نقدم مجموعة أدوات تقنيات متنوعة لدراسة النشاط ينظم الأكسدة وصي، فضلا عن تعيين التغييرات conformational من الوصيفة، الكامنة وراء نشاطها. على وجه التحديد، يمكننا وصف سير عمل الذي يشمل الإعداد البروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما، يليها تحليل وصي التجميع لمكافحة النشاط في المختبر باستخدام تشتت الضوء، مع التركيز على الدرجة التجميع لمكافحة نشاط وحركية لها. للتغلب على كثرة القيم المتطرفة المتراكمة خلال فحوصات التجميع، يصف لنا استخدام كفيتس، أداة رسومية رواية التي تتيح معالجة سهلة للقياسات الحركية. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأداة إلى أنواع أخرى من المقاييس الحركية لإزالة القيم المتطرفة والمناسب معلمات الحركية. لربط الدالة مع هيكل البروتين، يصف لنا بالإعداد وسير عمل تقنية الهيكلية الكتلي، الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي، التي تسمح برسم خرائط للتغيرات كونفورماشونال على الوصيفة و الركيزة خلال مراحل مختلفة من النشاط Hsp33. يمكن تطبيق نفس المنهجية لتفاعلات البروتين البروتين والبروتين-يجند أخرى.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وكثيراً ما تواجه الخلايا تراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) أنتجت كمشتقات التنفس1،2، والبروتين والدهن الأكسدة3،4عمليات إضافية5، 6،7. على الرغم من روس بدور مفيد في العمليات البيولوجية المتنوعة مثل الخلوية مما يشير إلى8،9 والاستجابة المناعية10، اختلالاً في التوازن بين إنتاج روس وعن إزالة السموم قد تحدث، مما يؤدي إلى الأكسدة نشدد على7. البيولوجية وتستهدف روس بالبروتينات والدهون والأحماض النووية، أكسدة التي تؤثر في هيكل ووظيفة. ولذلك، تراكم الأكسدة الخلوية يرتبط ارتباطاً قويا بمجموعة متنوعة من الأمراض بما فيها السرطان9،11و12،التهاب13والشيخوخه14، 15، وتم العثور على أن تشارك في ظهور وتطور اضطرابات الأعصاب مثل الزهايمر، باركنسون في والمرض المرض16،،من1718.

البروتينات المركبة حديثا والناضجة حساسة للغاية للأكسدة بسبب التعديلات التي يمكن أن تكون ضارة بهم سلاسل جانبية، والتي تحدد شكل البروتين هيكل ووظيفة19،20. ولذلك، عادة ما يؤدي الأكسدة إلى المنظمة البروتين على نطاق واسع، ميسفولدينج والتجميع، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا. واحدة من استراتيجيات الخلوية أنيقة للتعامل مع الأضرار المحتملة لأكسدة البروتين هو استخدام مرافقين تعتمد على الأكسدة والاختزال، التي تحول دون تجميع البروتين على نطاق واسع، بدلاً من تشكيل مجمعات مستقرة مع العميل تجمعات بروتينات21 ،،من2223. يتم تنشيط هذه مرافقين الدفاع السطر الأول سريعاً من أكسدة الخاصة بالموقع (عادة على بقايا السيستين) الذي يحول منها إلى قوية مناهضة تجميع جزيئات24. منذ الأكسدة ينتج في تثبيط التنفس وحدوث انخفاض في مستويات ATP الخلوي25، المتعارف عليه تعتمد على ATP المحرمين أقل فعالية خلال الأكسدة الشروط25،26 ،27. ولذلك، مرافقين مستقلة ATP تنشيط الأكسدة تلعب دوراً حيويا في الحفاظ على التوازن البروتين عند تراكم المؤكسدات في البكتريا، وحقيقيات النوى (مثلاً، Hsp3328 و رضا29 في البكتيريا، Get330 في الخميرة، بيروكسيريدوكسينس31 في حقيقيات النوى). نشاط هذه مرافقين تعتمد اعتماداً كبيرا على عكسها التغييرات conformational الهيكلية الناجمة عن طريق أكسدة خاصة بالموقع أن يكشف مسعور المناطق المعنية في الاعتراف بالبروتينات العميل تجمعات.

البحث الآلية المضادة التجميع والمبادئ التي تحكم الاعتراف بالبروتينات العميل بمرافقين ليست سهلة نظراً لطبيعة ديناميكية واختلاف الركازة وصي التفاعلات32،33، 34،35،،من3637. لكن مرافقين الإجهاد-وينظم فرصة لتعزيز فهمنا لدالة تجميع المضادة نظراً لقدرتها على: 1) الحصول على شكلين مختلفين وصي ونشط (مثلاً، تتأكسد) وغير نشط (مثلاً، تخفيض)، مع إدخال أو إزالة حالة الإجهاد بسهولة التبديل بينهما (مثلاً، والأكسدة وعامل تخفيض) 2) لديها مجموعة واسعة من ركائز، 3) تشكل مجمعات مستقرة جداً مع البروتينات العميل التي يمكن تقييمها من قبل منهجيات مختلفة الهيكلي، و 4) تركز فقط على الاعتراف الركيزة والإفراج، توسط التغييرات conformational تعتمد على الأكسدة والاختزال، كما غالبية هذه مرافقين تفتقر إلى القدرة قابلة للطي.

وهنا، نحن نحلل وصي ينظم الأكسدة البكتيرية في Hsp33 للتجميع لمكافحة النشاط، عنصرا حيويا في نظام الدفاع الجرثومي ضد الناجمة عن أكسدة البروتين تجميع28. عند تصغير، Hsp33 بروتين ملزمة الزنك مطوية محكم مع أي نشاط وصي؛ ومع ذلك، عندما تتعرض للأكسدة، يخضع Hsp33 التغييرات conformational واسعة النطاق التي تعرض لها الركازة ربط مناطق38،39. أيون الزنك مرتبط بشدة بأربعة بقايا سيستين عاليا المصانة المجال ج-الطرفية عند الأكسدة، تم إصدارها40. هذه النتائج في تشكيل ثنائي كبريتيد اثنين السندات، تتكشف المجال C--المحطة الطرفية، وزعزعة استقرار المنطقة المتاخمة رابط41. المناطق الطرفية ج ورابط مرنة للغاية وتعرف بأنها جوهريا أو جزئيا اضطرابه. عند العودة إلى ظروف غير الإجهاد، تصبح انخفض سيستينيس والوصيفة يعود إلى حالته المطوية الأصلية مع أي نشاط المضادة تجميع. ريفولدينج الوصيفة يؤدي إلى كذلك تتكشف وزعزعة الاستقرار من البروتين عميل منضم، الذي يشغل نقله إلى نظام متعارف عليه والوصيفة، دناك/ي، ريفولدينج38. يوحي تحليل مواقع التفاعل Hsp33 لأن Hsp33 يستخدم كلا اضطرابه مشحونة المنطقتين، فضلا عن مناطق مسعور على رابط والمجال الطرفي ن لالتقاط تجمعات بروتينات العميل ومنع التراكم على38، 42-في الدولة مطوية، هذه المناطق تكون مخفية بواسطة رابط مطوية والمجال ج--المحطة الطرفية. من المثير للاهتمام، كمنطقة رابط برنامج حماية البوابة Hsp33 لدولة مطوية وغير نشط، "الاستشعار" حالة ج-الطرفية المتاخمة المجال34قابلة للطي. مرة واحدة تؤدي إلى زعزعة الطفرات (أما عن طريق طفرة نقطة أو اضطراب تسلسل كامل)، يتم تحويل Hsp33 إلى كوصي active مؤثرا بغض النظر عن حالة الأكسدة والاختزال في سيستينيس حساسة للأكسدة43.

تسمح البروتوكولات المقدمة هنا رصد وصي الأكسدة والاختزال-تعتمد على النشاط في Hsp33، فضلا عن تعيين التغييرات conformational عند التفعيل وملزمة للعميل البروتينات. هذه المنهجية يمكن تكييفها للبحوث وصي-العميل التعرف على النماذج الأخرى، فضلا عن تفاعلات البروتين البروتين غير وصي. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم البروتوكولات للتحضير لمرافقين تماما مخفضة والمؤكسدة التي يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بالبروتينات الأكسدة والاختزال-التبديل الأخرى، للكشف عن الأدوار المحتملة لأكسدة البروتين على نشاط البروتين.

على وجه التحديد، يمكننا وصف إجراء لرصد وصي النشاط في المختبر وتحديد خصوصيته الركازة تحت أنواع مختلفة من تجميع البروتين (كيميائيا أو حرارياً المستحث) تشتت الضوء (LS) تقاس باستخدام فلوروسبيكتروميتير44. أثناء التجميع، على ضوء تشتت في زيادات nm 360 سريعاً بسبب تعكر متزايد. وهكذا، يمكن رصد التجميع بطريقة تعتمد على الوقت على هذا الطول الموجي. ليرة سورية طريقة سريعة وحساسة لاختبار وتجميع البروتين وهكذا نشاط التجميع المضادة بروتين اهتمام باستخدام تركيزات nanomolar، تمكين توصيف البروتين المتصلة بتجميع معلمات الحركية تحت مختلف شروط. وعلاوة على ذلك، البروتوكول LS الموصوفة هنا لا تتطلب أجهزة مكلفة، ويمكن أن ينشأ بسهولة في أي مختبر.

ومع ذلك، تحد كبير للحصول على منحنيات الحركية "نظيفة" وأن تستمد معلمات نسبة البروتين الحركية الخفيفة مثل نثر التجارب، بسبب الضوضاء وعدد كبير من القيم المتطرفة التي تم إنشاؤها بواسطة فقاعات الهواء ومجاميع كبيرة. للتغلب على هذه العقبة، نقدم الرواية أداة رسومية، كفيتس45، تستخدم للحد من مستويات الضوضاء في المقاييس الحركية المختلفة، المجهزة خصيصا للبروتين تجميع البيانات الحركية. توفير معلمات الحركية الأولية لتقييم أولى للنتائج هذا البرنامج ويسمح للمستخدم "تنظيف" كميات كبيرة من البيانات بسرعة دون التأثير على الخصائص الحركية الخاصة به. و كفيتس المنفذة في بايثون والمتاحة في المصادر المفتوحة في 45.

واحد من الأسئلة الصعبة في المجال يتصل برسم خرائط مواقع التفاعل بين مرافقين والبروتينات على العميل وفهم كيفية التعرف مرافقين مجموعة واسعة من ركائز تجمعات. هذا السؤال يزداد تعقيداً عند دراسة دينامية عالية البروتين المجمعات التي تنطوي في جوهرها اضطرابه مرافقين وركائز المعرضة للتجميع. لحسن الحظ، الكتلي الهيكلية تقدما هائلا على مدى العقد الماضي، ونجحت في تقديم نهج مفيدة وأدوات تحليل اللدونة الهيكلية ورسم خريطة للمخلفات تشارك في البروتين الاعتراف46، 47 , 48 , 49-نقدم هنا، واحد هذه تبادل تقنية-الهيدروجين-الديوتريوم الكتلي (HDX-MS)-الذي يسمح رسم خرائط للتغيرات في مستوى بقايا في تكيف هيكلي عند تعديل البروتين أو بروتين/يجند ملزمة35، 50،،من5152،53،،من5455. HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد يستخدم التبادل المستمر للهيدروجين العمود الفقري بالديوتريوم، معدل الذي يتأثر بالبيئة الكيميائية، وإمكانية الوصول إليها، والتساهميه وسندات غير تساهمية56. HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد المسارات عمليات الصرف هذه باستخدام مذيب الديوتيريوم، عادة الماء الثقيل (د2س)، ويسمح قياس استناداً إلى التغير في الوزن الجزيئي بعد الهيدروجين إلى تبادل الديوتريوم. يمكن أن يؤدي تباطؤ معدلات تبادل الهيدروجين الديوتريوم من الهيدروجين المشاركة في السندات الهيدروجين، أو ببساطة، من عائق الفراغية، التي تشير إلى التغييرات المحلية في هيكل57. التغييرات عند ربط يجند أو تعديلات بوستترانسلاشونال يؤدي أيضا إلى الاختلافات في البيئة الهيدروجين، مع ربط أدى إلى اختلافات في46،أسعار الصرف (HDX) الهيدروجين الديوتريوم53.

قمنا بتطبيق هذه التكنولوجيا إلى المناطق 1) خريطة Hsp33 التي تتكشف عند الأكسدة، مما يؤدي إلى تنشيط Hsp33، بسرعة و 2) تعريف واجهة الملزمة المحتملة من Hsp33 مع أن الركازة تجمعات كاملة الطول، سترات synthase (CS)38.

يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة في هذه المخطوطة دراسة الوظائف المعتمدة على الأكسدة والاختزال للبروتينات في المختبر، تعريف النشاط المضادة التجميع ودور التغيرات الهيكلية (أن وجدت) في وظيفة البروتين. يمكن تكييفها لمختلف النظم البيولوجية هذه المنهجيات بسهولة وتطبيقها في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد بروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما

  1. إعداد البروتين الكامل مخفضة
    ملاحظة: هنا، يمكننا وصف الحد من البروتينات التي تحتوي على الزنك، واستخدام زنكل2 الحل لاستعادة حالة البروتين أدرج الزنك، وانخفاض. يمكن الاستعاضة عن حل2 زنكل أو إهمالها. ملاحظة أن الوقت ودرجة الحرارة في عملية الحد من يعتمد على الاستقرار البروتين ووظيفة، ومن ثم محددة كل البروتين.
    1. إذابة العينة البروتين على الجليد وأنها تدور وصولاً إلى إزالة الركام. احتضان العينة على الأقل 1.5 ح في 37 درجة مئوية مع 5 مم DTT و 20 ميكرومتر زنكل2 (تصل إلى 70% من تركيز البروتين).
      ملاحظة: أن درجة الحرارة في هذه الخطوة تعتمد على البروتين وينبغي تعديلها لاستقرار البروتين.
    2. قم بإزالة القيمة باستخدام أعمدة الملحي.
      ملاحظة: هناك مختلفة الملحي الأعمدة المتوفرة. البروتوكول أدناه وصف الإجراء باستخدام أعمدة معينة الملحي (انظر الجدول للمواد). قبل استخدام الأعمدة الأخرى ديسالتينج، نوصي بدراسة كفاءتها لاسترداد البروتين وإزالة DTT، حيث أن بعض الأعمدة desalting جزئيا قد يمتص بروتين الفائدة.
      1. حجته العمود مع عازلة فوسفات (KPi) بوتاسيوم (40 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) بملء العمود تماما مع المخزن المؤقت والسماح بالتنقيط خارج المخزن المؤقت. كرر هذه العملية 2 x.
      2. إزالة عامل التصفية القرص الأبيض في العمود بلطف دفعتها إلى أسفل مع ملاقط وإزالتها؛ فمن الأسهل لإزالة بينما يتم تعبئة العمود مع المخزن المؤقت KPi. إعادة ملء العمود مع KPi المخزن المؤقت والطرد المركزي أنه في غ س 1,000 لمدة 3 دقائق.
      3. نقل العمود في أنبوب نظيف وإضافة العينة البروتين ببطء إلى منتصف العمود والطرد المركزي أنه في 1,000 غ س ل 2 دقيقة. البروتين خالية من القيمة في التدفق عبر الآن.
    3. التحقق من أن تركيزات (مثلاً، استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية/مقارنة) وقياس امتصاص في 280 نانومتر. حساب تركيز البروتين باستخدام القانون للبيرة.
    4. توزيع نصف عينات البروتين إلى مختبرين. احتضان مختبرين في الظروف اللاهوائية (مثلاً، استخدام دائرة لاهوائي) لمدة 20 دقيقة لإزالة كاملة من الأكسجين. ختم الأنابيب مع الأفلام البلاستيكية وتخزين العينات في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية، تبعاً للبروتين.
      ملاحظة: بدلاً من استخدام قاعة اللاهوائية، الأنابيب يمكن أيضا أن تومض بغاز الأرجون لإزالة الأوكسجين.
  2. إعداد البروتين الكامل المؤكسدة
    ملاحظة: من المستحسن إعداد عينات البروتين المؤكسدة من البروتينات مخفضة تماما (المذكورة سابقا). وهذا سوف يقلل من عدم التجانس في أكسدة دول سيستينيس. من الممكن استخدام الكواشف المؤكسدة المختلفة؛ وهنا، نحن نركز على بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2).
    تنبيه: تجنب الإفراط الأكسدة كما أنها يمكن أن تؤدي إلى سندات ثنائي كبريتيد إينتراموليكولار غير مرغوب فيه ولا رجعة فيها أكسدة الأحماض الأمينية المختلفة، بما في ذلك سيستين، الميثيونين، التيروزين، وغيرها.
    1. نموذج البروتين المتبقية، إضافة 5 مم ح2س2 (الطازج المخفف) واحتضان من أجل ح 3 عند 40 درجة مئوية بينما تهز.
      ملاحظة: أن درجة الحرارة في هذه الخطوة تعتمد على البروتين وينبغي تعديلها لاستقرار البروتين.
    2. حجته العمود مع المخزن المؤقت KPi (40 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) بملء العمود تماما مع المخزن المؤقت والسماح بالتنقيط خارج المخزن المؤقت. كرر هذه العملية 2 x.
    3. إزالة عامل التصفية القرص الأبيض في العمود بلطف دفعتها إلى أسفل مع ملاقط وإزالتها؛ فمن الأسهل لإزالة بينما يتم تعبئة العمود مع المخزن المؤقت KPi.
    4. إعادة ملء العمود مع KPi المخزن المؤقت والطرد المركزي أنه في غ س 1,000 لمدة 3 دقائق.
    5. نقل العمود في أنبوب نظيف وإضافة العينة البروتين المؤكسد ببطء إلى منتصف العمود والطرد المركزي أنه في 1,000 س ز 2 دقيقة؛ البروتين المؤكسد في التدفق عبر الآن.
    6. تحقق من تركيزات البروتين كما في الخطوة 1.2.5، تقسيم البروتينات المؤكسدة إلى مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية، وتعتمد على البروتين.

2-الضوء تناثر المقايسة التجميع

ملاحظة: جميع التركيزات في هذا التحليل هي وصي والركيزة محددة، وينبغي أن تكون محسوبة. يجب أن تكون كافة المخازن المؤقتة 0.22 ميكرومتر-تمت تصفيتها، كما أنه من الأهمية بمكان المخازن خالية من أي جزيئات أو فقاعات الهواء والترعة نظيفة وخالية من الغبار. من المهم جداً استخدام محرض وضعها في ومبومو الكوارتز. تحقق محرض مختلفة الأحجام والأشكال من أجل ضمان كفاءة خلط الحل الكامل دون إنتاج فقاعات الهواء غير مرغوب فيها. وعلاوة على ذلك، هناك فلووروسبيكتروميتيرس المختلفة المتوفرة في المختبرات والمرافق. (انظر الجدول للمواد) استخدمت هنا، فلوروسبيكتروميتير محددة. الصكوك المختلفة لديها حساسية مختلفة وقياس السرعة والمعلمات العينات. ولذلك، ينبغي أن يكون الأمثل معلمات القياس الدقيق (مثلاً، الانبعاثات والإثارة عرض النطاق الترددي، والحساسية، وغيرها) باستخدام بروتين معروفة معرضة لتجميع وشروطه المقابلة. من المستحسن استخدام سترات synthase (CS) و/أو لوسيفراس كركائز الأولية في تركيزات نانومولار.

  1. تجميع المواد الكيميائية بالانزيم
    1. تعد الركيزة التشويه والتحريف من تحضين ميكرومتر 12 CS بين عشية وضحاها في 40 مم هيبيس (درجة الحموضة 7.5) و 4.5 متر جدنكل. من أجل الحفاظ على درجة الحموضة، حل جدنكل في 40 مم من حبيس (درجة الحموضة 7.5).
    2. فتح برنامج فلوروسبيكتروميتير والذهاب قياس الوقت بالطبع. تعيين المعلمات إلى: درجة الحرارة: 25 درجة مئوية؛ Λم: 360؛ عرض النطاق الترددي م: 5 نانومتر؛ Λالسابقين: 360؛ ت عرض النطاق الترددي: 2.5 نانومتر؛ والفاصل الزمني للبيانات: 0.5 s.
    3. تحضير العينة بإضافة 1,600 ميليلتر من عيار 40 ملم هيبيس ومبومو كوارتز. إدراج في ومبومو صاحب العينة وترك العينة تصل إلى درجة الحرارة المطلوبة.
    4. تعيين التحريك إلى 600 دورة في الدقيقة، وبدء القياس حتى يتم وضع خط أساس. الحفاظ الإثارة قياس كامل.
    5. لقياس تجميع CS في الغياب كوصي، في 120 إضافة s إلى القياس، (بلطف ولكن بسرعة) 10 ميليلتر من التشويه والتحريف CS (تركيز نهائي 75 نانومتر). مواصلة قياس 1,200 s.
    6. لقياس تجميع CS حضور Hsp33، 60 s في القياس، إضافة Hsp33 (تركيز النهائية من 300 نانومتر). بعد 60 إضافية s، إضافة 10 ميليلتر من التشويه والتحريف CS (تركيز نهائي 75 نانومتر). مواصلة قياس 1,200 s.
      ملاحظة: عند إضافة الركازة أو وصي، تفاديا للإدراج فقاعات، استخدم ماصة 10 ميليلتر.
  2. التحليل الحراري التجميع
    ملاحظة: درجة حرارة للمقايسة التجميع الحراري يعتمد على استقرار البروتين وينبغي تعديلها لكل البروتين بشكل مستقل.
    1. فتح برنامج فلوروسبيكتروميتير والذهاب قياس الوقت بالطبع. تعيين المعلمات على النحو التالي: درجة الحرارة: 43 درجة مئوية؛ Λم: 360؛ عرض النطاق الترددي الانبعاثات: 5 نانومتر؛ Λالسابقين: 360؛ عرض النطاق الترددي الإثارة: 2.5 نانومتر؛ والفاصل الزمني للبيانات: 0.5 s.
    2. تحضير العينة بإضافة 1,600 ميليلتر من قبل حرارة 40 مم حبيس ومبومو كوارتز. إدراج في ومبومو صاحب العينة وترك العينة تصل إلى 43 درجة مئوية.
    3. تعيين التحريك إلى 600 دورة في الدقيقة، وبدء القياس حتى يتم وضع خط أساس. الحفاظ الإثارة قياس كامل.
    4. لقياس تجميع CS في الغياب كوصي على 120 إضافة s إلى القياس، بلطف CS (التركيز النهائي من 125 نانومتر) ومواصلة قياس ل 1,200 s.
    5. لقياس تجميع CS حضور Hsp33، 60 s في القياس، إضافة Hsp33 (تركيز نهائي 600 nM). بعد 60 إضافية s، إضافة خدمات العملاء (التركيز النهائي من 125 نانومتر). مواصلة قياس 1,200 s.
      ملاحظة: عند إضافة الركازة أو وصي، تجنب إدراج الفقاعات.
  3. إزالة بيانات التحليل والضوضاء بواسطة كفيتس
    ملاحظة: قد تم وصف كفيتس يتوفر في استخدام كفيتس سابقا في ريمون et al. 45
    1. تحميل ملف البيانات.
      ملاحظة: الإدخال هو النتائج الأولية من قياسات تشتت الضوء في شكل نص مفصولة بفاصلة أو علامة التبويب محدد.
    2. لإزالة أي ضجيج، اختر معلمات التحليل. استخدام أفضل نموذج تلقائي (مستحسن)، وضع علامة الضجيج دائماً فوق إشارة .
    3. يدوياً إزالة القيم المتطرفة الواضحة باستخدام خطوط خضراء وحمراء قابلة للتعديل؛ هذه الخطوة سوف تصفية الضجيج فوق الخط الأخضر وتحت الخط الأحمر.
    4. تعيين خط الأساس وتناسب المنحنى. وبعد تطبيق عتبة الضوضاء، تحميل البيانات المجهزة.

3-الهيدروجين-الديوتريوم التبادل الكتلي

  1. إعداد المخازن المؤقتة وعينات البروتين (مجمع Hsp33 و Hsp33--CS)
    1. تمييع عينات البروتين بتركيز 1 ملغ/مل في المخزن المؤقت 25 مم تريس-HCl في درجة الحموضة 7.5 نهائي وتحويلها إلى 1.5 مل القوارير.
    2. إعداد البروتين-الركيزة العينات المعقدة التي تفرخ Hsp33 مع خدمات العملاء بنسبة 1:1.5 في 43 درجة مئوية.
      1. إضافة خدمات العملاء على نحو تدريجي لتجنب أي التجميع السريع، وضمان ربط مثمر بين Hsp33 وخدمات العملاء تكشفت حرارياً.
      2. استخدم على الأقل أربع خطوات (أي، كل مرة إضافة ربع الحجم النهائي) واحتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة بعد كل بالإضافة إلى السماح لحماية خدمات العملاء ب Hsp33.
    3. إزالة المجاميع أي استخدام الطرد المركزي 30 دقيقة في 16,000 س ز في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: مجمعات البروتين-الركيزة الجديدة يجب أن تكون مستعدة الطازجة. وينبغي إضافة الركازة تدريجيا؛ وبخلاف ذلك، سوف تحدث التجميع. تركيزات درجة الحرارة والركيزة الركيزة الخاصة بالبروتين.
    4. إعداد المخزن مؤقت ح (25 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5)، الذي يعمل كعنصر التحكم ديوتيراتيون، ومنطقة عازلة د (25 مم تريس-DCl، الأس الهيدروجيني 7.09)، وهو المخزن المؤقت ديوتيراتيون. كما تعد منطقة عازلة التبريد العذبة (حمض الفورميك 0.1% تسيب، جدنكل م 3، 150 مم).
      ملاحظة: المخزن المؤقت التبريد ينبغي أن يكون الأمثل لبروتين اهتمام من أجل الحصول على تغطية تسلسل القصوى بعد هضم بيبسن.
    5. نقل كافة المخازن المؤقتة وعينات في قارورة، ووضعها في علب الورق الصحيح. عقد مخازن ح ود عند 25 درجة مئوية (علبة 25 درجة مئوية)؛ من ناحية أخرى، تعقد بالعينات ومخزن التبريد 0-2 درجة مئوية (علبة 0 درجة مئوية). وضع العينات في إدراج الزجاج 150 ميليلتر (انظر الجدول للمواد) أولاً، ومن ثم تحويلها إلى قارورة.
  2. إعداد الصك
    ملاحظة: مطياف الشامل يأتي مع اثنين المصاحبة للبرامج: أحد يتحكم المضخات، والآخر يتحكم مطياف كتلة (الرجوع إلى الجدول للمواد). وسيجري وصف الخطوات التالية استخدام هذه البرامج برنامجين.
    1. يدوياً بتشغيل كافة وحدات التبريد. حالما تصل جميع أنظمة التبريد إلى درجات الحرارة المستهدفة بها، التبديل يدوياً على كل من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) ومضخات التحميل.
      ملاحظة: في حالتنا، هذه تتألف من اثنين من حمامات التبريد وتبريد مربع (التي تحتوي على فخ وأعمدة تحليلية). وحدة تبريد واحدة يبرد العلبة في 0 درجة مئوية، بينما الآخر يبقى علبة الورق عند 25 درجة مئوية؛ درجة الحرارة في مربع التبريد هو 1-2 درجة مئوية.
    2. افتح البرنامج الذي يتحكم في مضخات على حد سواء، فضلا عن البرنامج الذي يتحكم في مطياف الشامل؛ تأكد من أن مرض التصلب العصبي المتعدد في وضع الاستعداد.
    3. قطع صمام مأخذ [هبلك] من مصدر مرض التصلب العصبي المتعدد ويغسل النظام مع حل "منظف ثلاثي" (حمض الفورميك 1%، 33% الاسيتو الانيتريل، الايزوبروبانول 33%، 33% ميثانول) أولاً، ثم مع المخزن المؤقت ب (الاسيتو الانيتريل 80%، حمض الفورميك 0.1%)، وأخيراً مع المخزن المؤقت (0.1% حمض الفورميك، الأس الهيدروجيني 2.25)، ثم قم بإدراج العمود بيبسن في النظام. إذا تغيير المخازن المؤقتة، تأكد من إزالة كل المضخات قبل المتابعة.
    4. التأكد من أن معدل التدفق لكلا مضخات 0.1 مل/دقيقة والضغط مستقر.
    5. بعد الغسيل النظام مع تدفق مستمر والضغط المستمر، إدراج المنفذ [هبلك] إلى مصدر MS وتشغيل MS.
  3. مطياف كتلة معلمات
    1. تعيين التأين الببتيد للتأين اليكتروسبراي (ESI) على 175 درجة مئوية، وتدفق الغاز غمد الساعة 17، توهج الغاز aux في 2، والجهد رذاذ في 4.5 كيلو فولت (تكميلية الشكل 1).
    2. قم بإعداد المعلمات كما يلي للعينات غير الديوتيريوم.
      1. تعيين المعلمات: نطاق المسح m/z إلى 300-1500؛ القرار إلى 70 ألفا؛ الهدف مراقبة الكسب التلقائي (AGC) إلى 106؛ ووقت الحقن كحد أقصى (IT) في 100 مللي ثانية.
        ملاحظة: 5 الأكثر كثافة الأيونات مع الدول المسؤول بين + 2 و + 6 (كثافة أعلى من 1.3 × 104) وسوف تكون نافذة ديناميكية من 30 في عزلة.
      2. إجراء تجزئة أيون بارتفاع الطاقة الاصطدامية الانفصال (HCD) في الخلية متعددة-تصادم مع الاصطدام تطبيع الطاقة (NCE) يساوي 28. الكشف عن أيونات يفتت بالترادف مرض التصلب العصبي المتعدد في دقة الهدف AGC 35,000، 105، الحد الأقصى من 60 مرض التصلب العصبي المتعدد، ونافذة عزلة من 2.0 m/z.
    3. للعينات الديوتيريوم، تستخدم MS1 فقط مع دقة أعلى من 140,000 والمعلمات وإلا مماثلة.
  4. تشغيل التجربة
    1. مجموعة الصواني بالطريقة التالية.
      1. وضع المخزن المؤقت ح ود في علبة 25 درجة مئوية، ثم وضع العينات ومخزن التبريد في علبة 0 درجة مئوية.
      2. س مكان إفراغ قنينة، ومحاذاة في الصواني على حد سواء، حيث X = عدد العينات × عدد النقاط الزمنية.
        ملاحظة: في علبة 25 درجة مئوية، قنينة فارغة بمثابة قارورة من رد فعل، وفي علبة 0 درجة مئوية، هي بمثابة تبريد القوارير.
      3. ويتضمن كل قنينة فارغة إدراج زجاج فارغ؛ تجاهل واستبدال قال إدراج بين التجارب.
        ملاحظة: من أجل تشغيل هذه التجربة HDX بالطريقة الأكثر كفاءة والأقل استهلاكاً للوقت، برمجيات التي تسمح العينات ليتم تشغيلها في نفس الوقت استخدمت (تكميلية الشكل 2). وسيجري وصف الخطوات التالية باستخدام هذا البرنامج.
    2. قم بفتح البرنامج. قم بإعداد معلمات البرنامج القيام بما يلي.
      1. احتضان كل عينة (5 ميليلتر) مع ميليلتر 45 د المخزن المؤقت لعدة دقائق، طبقاً للنقاط الزمنية المحددة (مثلاً، 1، 3، 18 و 40 و 100 دقيقة) عند 25 درجة مئوية. احتضان العينة غير الديوتيريوم مع 45 ميليلتر من المخزن المؤقت ح بدلاً من ذلك.
      2. فورا بعد الاحتضان، مزيج 50 ميليلتر من البروتين الديوتيريوم في 50 ميليلتر من مخزن التبريد المثلج وحقن لها في عمود بيبسن المعطل تداولها (20 ملم في الطول، 2.0 مم في القطر).
      3. الوتي أي الببتيدات من بيبسن عمود إلى العمود قبل قبل غسله مع المخزن المؤقت A لمدة 6 دقائق بمعدل 50 ميكروليتر/دقيقة الاحتفاظ المخزن المؤقت A في المربع التبريد عند 0 درجة مئوية.
      4. الوتي الببتيدات من العمود قبل في عمود C18 التحليلية (عمود C18، 130 ميكرومتر، 1.7، 2.1 مم × 50 مم، أبقى في 0 درجة مئوية) وفصلها عن طريق تطبيق تدرج خطي من الاسيتو الانيتريل في 100 ميليلتر/دقيقة تشغيل التدرج الاسيتو الانيتريل استخدام الاسيتو الانيتريل 100% كالمخزن المؤقت ب : دقيقة 7% 2، 7 دقيقة بنسبة 10-30%، 2.5 دقيقة في 30-90 ٪، 1.5 دقيقة بنسبة 90%، الانحدار السريع لمدة 1 دقيقة 90-8 في المائة، وأخيراً حجته العمود لدقيقة 4% 2.
    3. بناء تسلسل قيد تشغيل (انظر التكميلية الرقم 2): إدخال جميع النقاط الزمنية وعينه الأسماء، والمواقع في الإدراج، فضلا عن أسماء المخزن المؤقت والمواقع.
      ملاحظة: البرنامج يسمح المحاذاة في جميع الأوقات المختلفة قيد التشغيل في برنامج يقوم بتشغيل عدة عينات في وقت واحد، وكفاءة خفض أوقات التشغيل.
  5. تحليل البيانات
    ملاحظة: نحن نعمل مع عدة برامج عملية تحليل البيانات، بما في ذلك البروتين المكتشف و ماكسكوانت (البرمجيات الحرة) لتحديد الببتيد وتحليل تغطية تسلسل، فضلا عن منضدة HDX، البرمجيات الحرة أن يسمح تحليل الديوتيريوم التأسيس في البروتينات، ومقارنة بين معدلات HDX بين مجموعات مختلفة من التجارب. وسيجري وصف الخطوات التالية استخدام هذه البرامج.
    1. تحليل تغطية الببتيد العينة عن طريق تشغيل العينات غير الديوتيريوم التحكم عن طريق البرنامج (تكميلية الشكل 3). قم بإعداد البرامج باستخدام المعلمات التالية.
      1. تنشق استخدام الأسلوب HT سيكويست مع الإنزيم لا (غير محدد). البحث عن الببتيدات أحماض الأمينية 4-144 مع تسامح شامل 7 جزء في المليون ودا 0.5 لايون السلائف ويفتت. السماح أكسدة ميثيونين دينامية.
      2. إنشاء قاعدة بيانات للبروتين، التي من خلالها يمكن تحديد البرنامج تغطية الببتيد. تصدير الببتيدات التي تم تحديدها في شكل نص.
    2. تحليل الديوتيريوم النتائج باستخدام البرمجيات الحرة منضدة HDX58.
      1. فتح محرر البروتين وتحديد البروتين عن طريق إدراج ملف التغطية الببتيد وتسلسل البروتين.
      2. بعد ذلك، فتح محرر تجربة إعداد المعالج وإدخال جميع المدخلات المطلوبة.
        ملاحظة: يتطلب البرنامج عدد العينات، العدد النقاط الزمنية، وعدد replicates، قيمة الرقم الهيدروجيني في المخازن، ودرجة الحرارة.
      3. وأخيراً، إدخال المعلمات بخصوص مطياف كتلة المستخدمة، بعد ذلك سيقوم البرنامج بإنشاء قائمة الببتيدات تم الكشف عنها.
        ملاحظة: البرنامج يكشف الببتيدات "HDX" ويتفقد كتل النظائر ويوضح وضع تصور واضح ديوتيريشن في العينات.
  6. العرض التقديمي للبيانات
    1. قم بتسمية المناطق امتصاص ديوتيريشن تفضيلية على الهيكل باستخدام البرمجيات بيمول أو أي برامج أخرى في التصور.
    2. الأخذ بمستويات امتصاص الديوتريوم بدلاً من قيم عامل ب.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على البرنامج تعليمي أساسي في https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أسلوبي عرض تجعل من الممكن لمتابعة النشاط الحركي وديناميات تفاعلات البروتين بين كوصي وعلى الركازة. وعلاوة على ذلك، يسمح بروتوكول الحد من أكسدة إعداد كوصي انخفاض تماما والمؤكسدة تماما، إعطاء فهم أكثر عمقاً لتفعيل إليه من مرافقين اضطرابه تعتمد على الأكسدة والاختزال.

أولاً، كنا تشتت الضوء من أجل دراسة نشاط تعتمد على الأكسدة والاختزال والوصيفة. أجرى على بروتين CS التشويه والتحريف كيميائيا وحراريا حضور المؤكسدة (نشطة) تشتت الضوء أو تخفيض وصي (غير نشط) (الشكل 1). تمسخ الكيميائية يؤدي إلى تجميعاً CS سريع الناجم عن ريفولدينج بروتين ديناتوريزيد تماما في الظروف غير المواتية في المخزن المؤقت. من ناحية أخرى، نتيجة تجميع المستحثة الحرارية تتكشف بطيئة نسبيا من الركازة مطوية أصلاً. لذلك، تختلف هذه الأنواع المختلفة من عمليات التجميع في المعلمات الحركية الخاصة بهم. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تختلف مرافقين مختلفة في قدرتها على منع تجميع الركيزة نفسه في أوضاع مختلفة من التجميع.

في كل أشكال تمسخ، تتأكسد الإضافة Hsp33 بنسبة 1:4 مولى (CS: Hsp33) ألغيت تماما التجميع، خفض قراءات nm 360 لقيم لا تذكر. من ناحية أخرى، وجود انخفاض Hsp33، لم يؤثر على استقرار CS وأعطى منحنى تراكم مماثلة للتي اكتشفت في غياب كوصي (الشكل 1). تحليل النتائج وتنظيفها من الضوضاء الخلفية باستخدام كفيتس، كما تخطيطياً هو موضح في الشكل 2.

الخطوط العريضة لهذه التقنية HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد تبدأ الحضانة والوصيفة مع أكسيد الديوتريوم، تليها تبريد والهضم، وأخيراً تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد والهيدروجين الديوتريوم تبادل التنميط (الشكل 3). خلال HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد، كان المحتضنة وصي على درج عند 25 درجة مئوية في مخزن يحتوي على س2د. بعد فترة حضانة محددة تسيطر عليها العينة التعامل مع نظام الروبوتية، نقلت الحل البروتين في حل التبريد، الحمضية ويشوه، في العلبة في 0 درجة مئوية. بانخفاض درجة الحموضة ودرجة الحرارة منخفضة يؤدي إلى إبطاء تبادل الهيدروجين ويحافظ على مستويات ديوتيراتيون جميع أميد الهيدروجين، في حين تتكشف هذه المادة الكيميائية يشوه البروتين، مكنها من أن يهضم بشكل صحيح. نظام الروبوتية نقل العينة من علبة الورق عند 0 درجة مئوية إلى مربع التبريد حيث أنه يتدفق إلى العمود الهضم بيبسن على الإنترنت. فورا بعد هضم البروتين، الببتيدات المضي إلى عمود C18 فخ الملحي وإزالة تبديل سريع د2س (تقع أساسا على الذرات سلسلة جانبية) ويتم فصل ثم استخدام عمود C18 وتحليلها باستخدام الكتلة قياس الطيف الكتلي. يتم التحكم في تدفق العينة بنظام صمام ثنائي, 1) يضمن الفصل بين بيبسن ومخازن عمود C18 بغية منع المنظمة بيبسن واسطة المذيبات العضوية، و 2) تمكن الملحي قصيرة من الببتيدات لإزالة سريعة د2س جزيئات قابلة للصرف وأملاح (الشكل 4).

بعد التحليل الحسابي، ونتلقى ملف ديوتيراتيون لكل الببتيد، تغيرا في الكتلة كدالة للوقت حضانة في د2o. يسمح برنامج منضدة HDX بالمقارنة بين replicates التجريبية بغية خلق التحليلات الإحصائية لكل شرط (مثلاً، وصي نشطة في نموذج غير منضم). والخطوة التالية مقارنة منحنيات ديوتيريشن بين العينات المختلفة؛ على سبيل المثال، كوصي منضم ووصي غير منضم. يمكن أن تكشف هذه المقارنات بين الدول المختلفة والوصيفة الاضطرابات الهيكلية التي تصاحب ملزمة الركازة. المخلفات التي يحمل على تبادل أبطأ في الدولة المنضمة المحتمل أن تتفاعل مع شريك ملزم. من المهم ملاحظة أن الديوتريوم الهيدروجين انخفاض أسعار الصرف يمكن أن تشير أيضا إلى من ريفولدينج منطقة محددة عند الربط دون التفاعل المباشر الفعلي مع الركازة (الشكل 5ألف). يسمح برنامج منضدة HDX بدراسة النتائج في طريقة العرض "اضطراب" بإظهار ديوتيراتيون مع خطأ معياري على مدى التغطية للبروتين الكامل.

في هذه الحالة، استخدم HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد لمقارنة نمط ديوتيراتيون بين Hsp33 وصي المنضمة وغير المنضمة إلى أن الركيزة CS. وتكشف النتائج موقع عميل-تفاعل داخل مجال تبديل الأكسدة ج-محطة الوصيفة (الشكل 5ب). في حين خفضت، قد Hsp33 بنية مرتبة تماما، حيث دفن مواقع التفاعل. Hsp33 يفقد هيكلها ويصبح الوظيفية عندما كان يستشعر الأكسدة؛ ومن ثم فنحن مقارنة Hsp33 مخفضة والمؤكسد تحت ظروف المنضمة وغير المنضمة على حد سواء (الشكل 5ج). وتظهر النتائج أنه بينما Hsp33 مخفضة، عما إذا كان منضم أو غير منضم، تنتج مماثلة الببتيد المنحنيات، Hsp33 المؤكسد يعرض فرقا كبيرا. عينات Hsp33 المؤكسد تظهر فرق ديوتيراتيون 30% بين وصي المنضمة وغير المنضمة، مع مجالات محددة من البروتين ملزمة مما يشير إلى عائق اللوستيريك. يبين تحليل الببتيدات إضافية من N--المحطة الطرفية والمناطق رابط ثيرموبيلي التكميلية الرقم 3.

Figure 1
الشكل 1 . تحليل التجميع بتشتت الضوء. رصد تجميع CS التشويه والتحريف كيميائيا وحراريا بحضور المؤكسد Hsp33 (أحمر)، تخفيض Hsp33 (الأزرق)، أو في حالة عدم وجود وصي (أسود). تشتت ضوء في 360 نانومتر وراقب ل 1,200 س. (A) أثناء تجميع المواد الكيميائية، في غياب كوصي أو حضور انخفاض Hsp33، CS مجمعة سريعاً، التوصل إلى دا هضبة حوالي 300 إلى القياس. (ب) أثناء التجميع الحراري، مجمعة CS تدريجيا في غياب كوصي أو حضور انخفاض Hsp33. في كلا فحوصات، ألغى وجود Hsp33 المؤكسد تماما التجميع، كما يتضح من القراءات 360-شمال البحر الأبيض المتوسط لا يعتد بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . إزالة الضوضاء وتحليل البيانات باستخدام كفيتس. يظهر هذا الفريق مخطط يلخص إزالة الضوضاء وتحليل البيانات بواسطة الأداة كفيتس ، كما هو موضح في النص وفي ريمون et al. 45- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . سير عمل منهجية HDX-MS. وتوظف HDX-MS الديوتيريوم المذيبات لتحديد البيئة الكيميائية للهيدروجين أميد، وزعت في شكل موحد على طول العمود الفقري للبروتين. بروتين الفائدة هو المحتضنة في المخزن مؤقت ديوتيراتينج في شكله الأصلي لفترات زمنية محددة، ثم تبادل الهيدروجين الديوتريوم هو مروي بالظروف الحمضية عند درجة حرارة منخفضة. هو يهضم البروتين إنزيم مستقرة تحت الظروف الحمضية، مثل بيبسن. وبعد ذلك، الببتيدات ديسالتيد وفصل في فترة زمنية قصيرة لتجنب إجراء تبادل مرة أخرى. وأخيراً، الببتيدات يتم تحليلها بواسطة مطياف كتلة واستيعاب الديوتريوم بتقييم برنامج تحليل، على سبيل المثال ب البرمجيات الحرة منضدة HDX 58. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. مكونات نظام HDX MS مؤتمتة بالكامل. (أ) هذا الرسم التخطيطي HDX-التصلب المتعدد يمثل جميع أجزاء المنظومة: المضخة تحميل و [هبلك] مضخة التحكم في التدفق المخزن المؤقت والعينة نقل داخل النظام. ويتضمن النظام الروبوتية اثنين من المحاقن والصواني التي تستخدم في تحضير العينة الديوتيريوم ونقل البروتينات الهضم على الخط العمود عن طريق صمام الإدخال في مربع التبريد (LC المقصورة). ثم، الموجهة إلى الأعمدة فخ وفصل C18 الببتيدات هضمها وفصل فيما بعد وتوجه إلى مطياف كتلة. (ب) يظهر هذا الفريق إعداد النظام HDX الفعلية كما تم إنشاؤها في المعمل. (ج) هذا الفريق عرضاً تخطيطي الهضم-على الإنترنت وتكوين الببتيد فلويديك الانفصال. وقد نظم الهضم وفصل صمام واحد كل ذلك يمكن أن تحول بين أوضاع تحميل و حقن . متصل بالمنفذ حقن الصمام الأول (على اليسار) ويتم التحكم بواسطة المضخة تحميل، توجيه عينات في محيط العمود باستخدام المخزن المؤقت الحمضية دون أي المذيبات العضوية التي يمكن أن تلحق الضرر الراتنج بيبسن. العينة منقولا إلى صمام الحق في العمود مصيدة لإزالة مخلفات الديوتريوم، فضلا عن سرعة تبادل ذرات الديوتيريوم (أساسا من سلاسل جانبية). بعد يغسل قصيرة من 1-2 دقيقة في العمود فخ، الصمام بتغيير طريقة عملها تحميل ويتم غسلها العينة في عمود فصل C18 باستخدام المضخة [هبلك] مع تزايد تركيزات الاسيتو الانيتريل. يتم نقل العينة إلى مطياف الشامل لإجراء تحليل شامل. يتم وضع علامة طول الأنابيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . نتائج HDX-MS. (أ) تعرض النتائج كنسبة مئوية ديوتيراتيون مع مرور الوقت كل جزء البروتين، إنشاؤها بواسطة البرنامج منضدة HDX . يظهر الرسم البياني كل عينة بروتين، أما المؤكسدة أو تخفيض، ويقارن بين العينات المنضمة وغير المنضمة. ببتيد شظايا المعروضة هنا هي الببتيد يففيتيتبسيج وجدت في منطقة رابط والببتيد لقفمباقناققدفد وجدت في ج-المحطة. (ب) إظهار النتائج النهائية، وقدم كالفرق ديوتيراتيون بين المجمعات المنضمة وغير المنضمة، اضطراب كل من الأحماض الأمينية. (ج) نموذج الهيكلية لوصي Hsp33 يوضح الاختلافات امتصاص ديوتيريشن طوال رابط والمناطق غير المستقرة ج--المحطة الطرفية. يتم إنشاء هذا الفريق باستخدام البرمجيات بيمول . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 1
التكميلية الرقم 1. واجهة برنامج التشغيل مطياف كتلة- يتم استخدام البرنامج لتحسين وتحديد معلمات الأسلوب مطياف أسلحة استخدمت في التجربة HDX. يمكن حفظ معلمات الأسلوب (في اللوحة اليمنى) في الأسلوب، مثل أن من المسلم به بواسطة برامج أخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 2
التكميلية رقم 2. يظهر هذا الشكل لقطة من البرنامج الذي يخدم كمنصة تكامل العينات الروبوتية تسليم النظام ونظام MS-LC. البرنامج يحسن إدارة الوقت بالجدول الزمني للتجربة HDX، بعد فترة حضانة محددة في المخزن المؤقت الديوتيريوم (الأسهم الزرقاء). على سبيل المثال، أعلاه رسم تخطيطي ليدير 17 من تحليلات replicative اثنين من المتغير Hsp33 ستيل، المحتضنة في المخزن مؤقت الديوتيريوم لأوقات مختلفة، تتراوح من 0-100 دقيقة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 3
التكميلية الرقم 3. وهذا يظهر الشكل تحليلاً لاستيعاب الديوتريوم الببتيدات Hsp33 العديد من متغيرات Hsp33 المختلفة، اسمه بجبد والقس34. القطع تظهر التغييرات في استيعاب الديوتريوم من نفس المنطقة في Hsp33 غير منضم (أحمر) والدول المرتبطة (أزرق). تظهر الببتيدات من منطقة الطرفي ن لا يوجد اختلاف كبير في معدلات HDX، بينما تظهر أجزاء من منطقة رابط انخفاضا كبيرا في معدلات HDX عند التفاعل مع الركيزة تكشفت، سترات synthase. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذه الورقة، قدمنا البروتوكولات لتحليل النشاط وصي تعتمد على الأكسدة والاختزال وتوصيف التغيرات الهيكلية على ربط بروتين العميل. هذه منهجيات متكاملة لتحديد المجمعات وصي-الركيزة المحتملة وتحليل مواقع التفاعل المحتملة.

هنا، قمنا بتطبيق هذه البروتوكولات لتحديد خصائص معقدة بين وصي ينظم الأكسدة Hsp33 مع الركازة وصي مدروسة CS. قدمنا نوعين مختلفين من البروتين تجميع التحليلات التي تختلف في حالتها الحركية والأولية: خلال تمسخ كيميائية، يبدأ الركيزة عمليتها الجارية من خلال نموذج التشويه والتحريف، بينما خلال تجميعاً الحرارية، هو بدأت تتكشف من النموذج الأصلي من الركازة.

قياسات تشتت الضوء أداة مفيدة لرصد المبلغ النسبي لتجميع البروتين. بينما يمكننا استخدام هذا الأسلوب لتحديد الحالة النشطة للوصيفة، كذلك استخدامه لدراسة شروط التجميع العام، قارن استقرار البروتين المختلفة، أو دراسة الطفرات المزعزعة للاستقرار في الركيزة ووصي على حد سواء.

على الرغم من بساطتها، طريقة تشتت الضوء قد تنتج بيانات صاخبة، مع العديد من القيم المتطرفة. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير البرمجيات كفيتس الموصوفة أعلاه. البرنامج كفيتس يجعل من الممكن ببساطة وسرعة إزالة كميات كبيرة من بيانات صاخبة، فضلا عن حساب المعلمات الحركية من منحنى الضوء. كفيتس لا يقتصر على تجميع البروتين ويمكن تطبيقها على أي نوع من المقاييس الحركية.

وهكذا، المنهجيات الموصوفة هنا بسيطة وسهلة لتنفيذ ولا تستغرق وقتاً طويلاً. يمكن تطبيقها لمرافقين الجزيئية المختلفة، تمكن اعتمادهم الأكسدة والاختزال لفحصها في غضون بضعة أيام. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم نشاط التجميع المضادة مرافقين التابعة الأخرى، غير الأكسدة استخدام البروتوكولات وصف تشتت الضوء و كفيتس. من المهم ملاحظة أن معلمات مختلفة، مثل درجة الحرارة وتركيز البروتين وقياس الوقت يجب أن تعدل بحيث كل نظام البروتين بشكل مستقل.

من أجل الحصول على معلومات هيكلية الإدارة كوصي العامل دورة، قدمنا المنهجية HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد. وعلى النقيض من الإجراء تشتت الضوء، تكنولوجيا أكثر تعقيداً وتتطلب الأجهزة المحددة، بما في ذلك من مطياف كتلة، ويفضل أن يكون ذلك، نظام روبوتية لإعداد نموذج. ومع ذلك، يمكن إنشاء برنامج الإعداد هذا، حتى بدون نظام الروبوتية، في مرفق قائم. عندما يتم إنشاؤها، الإجراء بسيط نسبيا ويسمح تحليل البروتين المجمعات الصعبة التي قد تكون لم يشملهم بالمنهجيات ذات الدقة العالية (مثلالأشعة السينية وأشعة الرنين المغناطيسي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب ممتن رادزينسكي ميتال لبلدها مناقشات مفيدة والحرج من قراءة المقالة، وباتريك غريفين وله أعضاء مختبر لمساعداتها غير محدود أثناء تأسيس منصة تحليل HDX. الكتاب ممتنون للمؤسسة الألمانية لإسرائيل (I-2332-1149.9/2012)، ومؤسسة العلوم ثنائية (2015056)، منح التكامل ماري كوري (618806)، "المؤسسة" للعلوم في إسرائيل (1765/13 و 2629/16)، و "علم الحدود البشرية" برنامج (CDA00064/2014) لتقديم الدعم المالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292, (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417, (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98, (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25, (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44, (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32, (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12, (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20, (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18, (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19, (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23, (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42, (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82, (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427, (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17, (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291, (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291, (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56, (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280, (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51, (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427, (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27, (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429, (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281, (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292, (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135, (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275, (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285, (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24, (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34, (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24, (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24, (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142, (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291, (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56, (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, (9), 1512-1521 (2012).
تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter