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Biochemistry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Abstract

Lebenden Organismen müssen regelmäßig mit wechselnden Umgebungen während ihres gesamten Lebenszyklus, einschließlich Änderungen der Temperatur, pH-Wert und die Anhäufung von reaktiven Sauerstoffspezies zu bewältigen. Diese Schwankungen können führen zu einem weit verbreiteten Protein entfaltet, Aggregation und Zelltod. Daher haben Zellen ein dynamisches und Stress-spezifische Netzwerk von molekularen Chaperone entwickelt, die eine "gesunde" Proteom während Stress-Bedingungen zu gewährleisten. ATP-unabhängige Chaperone bilden eine große Klasse von molekularen Chaperone, die als erste Verteidigungslinie Moleküle, Schutz gegen Proteinaggregation in einer Stress-abhängigen Weise dienen. Eine Eigenschaft, die diese Chaperone gemeinsam haben ist ihre Fähigkeit, Strukturelle Plastizität für ihre Stress-spezifische Aktivierung, die Anerkennung und die Freisetzung von fehlgefaltete Client zu nutzen.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die funktionelle und strukturelle Analyse von einem solchen intrinsisch ungeordneten Chaperon, die bakterielle Redox-regulierten Hsp33, die Proteine gegen Aggregation bei oxidativem Stress schützt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Instrumentarium der verschiedenen Techniken für die Untersuchung von Redox-regulierten Chaperon Aktivität sowie für die Zuordnung von Konformationsänderungen das Chaperon seine Tätigkeit zugrunde liegt. Im einzelnen beschreiben wir einen Workflow umfasst die Vorbereitung der vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteine, gefolgt von einer Analyse des Chaperon Anti-Aggregation Aktivität in Vitro mit lichtstreuenden, mit Schwerpunkt auf den Grad der die Anti-Aggregation-Aktivität und die Kinetik. Um häufige Ausreißer während der Aggregation Assays zu überwinden, beschreiben wir die Verwendung von Kfits, ein neuartiges grafisches Tool die einfache Verarbeitung der kinetische Messungen ermöglicht. Dieses Tool kann leicht auf andere Arten von kinetische Messungen zum Entfernen von Ausreißern und Montage kinetische Parameter angewendet werden. Um die Funktion mit der Proteinstruktur korrelieren, beschreiben wir die Einrichtung und den Workflow einer strukturellen Massenspektrometrie-Technik, Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie, die die Zuordnung von Konformationsänderungen auf das Chaperon ermöglicht und Substrat in verschiedenen Phasen der Hsp33 Aktivität. Dieselbe Methode kann auf andere Protein-Protein und Protein-Ligand-Interaktionen angewendet werden.

Introduction

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Zellen haben häufig eine Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert als Nebenprodukte der Atmung1,2, Protein und Lipid Oxidation3,4und zusatzprozesse5, 6,7. Trotz ROS positive Rolle im vielfältigen biologischen Prozessen wie Mobilfunk Signalisierung8,9 und Immunantwort10auftreten ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und die Entgiftung, führen zu oxidativen betonen Sie7. Die biologische Ziele von ROS sind Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die Oxidation von denen beeinflussen, ihrer Struktur und Funktion. Daher ist die Anhäufung von zellulären Oxidantien stark an ein breites Spektrum von Krankheiten einschließlich Krebs9,11, Entzündung12,13und Altern14, gebunden. 15, und habe bei der Entstehung und Progression von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und ALS Krankheit16,17,18einbezogen werden.

Neu synthetisierten und Reifen Proteine sind sehr anfällig für Oxidation durch die potenziell schädlichen Änderungen ihrer Seitenketten, die Protein-Struktur und Funktion19,20prägen. Oxidativer Stress führt daher meist zu eine weit verbreitete Protein Inaktivierung, Fehlfaltung und Aggregation, was schließlich zum Zelltod. Eines der eleganten zellulären Strategien zur Bewältigung des potenziellen Schadens der Protein-Oxidation ist Redox-abhängige Chaperone, zu verwenden, die die weit verbreitete Proteinaggregation, statt zu bilden stabile komplexe mit Client fehlgefaltete Proteine21 hemmen ,22,23. Diese erste Verteidigungslinie Chaperone sind schnell durch eine ortsspezifische Oxidation (in der Regel auf Cystein Rückstände) aktiviert, die sie potente anti-Aggregation Moleküle24umwandelt. Da oxidativer Stress in der Hemmung der Atmung und sinkt in der zellulären ATP Niveaus25führt, sind kanonische ATP-abhängige Chaperone weniger wirksam bei oxidativem Stress Bedingungen25,26 ,27. Redox-aktivierte ATP-unabhängige Chaperone spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein auf die Anhäufung von Oxidantien in Bakterien und Eukaryoten (z.B., Hsp3328 und RidA29 in Bakterien, Get330 in der Hefe, Peroxiredoxins31 in den Eukaryotes). Die Aktivität der diese Chaperone hängt stark von reversible strukturelle Konformationsänderungen induziert durch eine ortsspezifische Oxidation, die hydrophobe Regionen an der Anerkennung der Client fehlgefaltete Proteine beteiligt deckt.

Forschung von der Anti-Aggregation-Mechanismus und die Grundsätze für die Anerkennung der Client Proteine durch Chaperone ist nicht einfach aufgrund der dynamischen und heterogene Charakter der Chaperon-Substrat Interaktionen32,33, 34,35,36,37. Stress-regulierten Chaperone haben jedoch die Möglichkeit, unser Verständnis von der Anti-Aggregationsfunktion aufgrund ihrer Fähigkeit,: 1) zwei verschiedene Formen der Chaperon (z.B.oxidiert) aktiv und inaktiv (z. B.zu erhalten (reduziert), bei der Einführung oder Entfernung einer Stress-Bedingung, die einfache Umschaltung zwischen ihnen (z.B., Oxidationsmittel und Reduktionsmittel), 2) verfügen über eine breite Palette von Substraten, 3) bilden sehr stabile komplexe mit den Client-Proteinen, die durch ausgewertet werden können verschiedenen strukturellen Methoden, und 4) konzentrieren sich ausschließlich auf das Substrat Anerkennung und Freigabe, vermittelt durch Konformationsänderungen Redox-abhängige, da der Großteil dieser Chaperone die Faltung Fähigkeit fehlt.

Hier analysieren wir die bakterielle Redox-regulierten Chaperon Hsp33 Anti-Aggregation Aktivität, ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Verteidigungssystems gegen Oxidation-induzierte Protein Aggregation28. Wenn reduziert, ist Hsp33 ein dicht gefaltet Zink-bindendes Protein ohne Chaperon-Aktivität; jedoch beim oxidativen Stress ausgesetzt, durchläuft Hsp33 umfangreiche Konformationsänderungen die seine Substrat Bindung Regionen38,39aussetzen. Bei der Oxidation ist die Zink-Ionen, die stark an vier hoch konservierten Cystein-Reste von der C-terminalen Domäne gebunden ist freigegeben40. Dies führt zur Bildung von zwei Disulfid-Bindungen, eine Entfaltung der C-terminalen Domäne und eine Destabilisierung des angrenzenden Linker Region41. Die C-terminale und Linker Regionen sind sehr flexibel und sind definiert als intrinsisch oder teilweise ungeordnet. Nach Rückkehr nach non-Stress-Bedingungen die Cysteine werden reduziert und das Chaperon wieder auf native zusammengeklapptem Zustand ohne Anti-Aggregation-Aktivität. Die umfaltung der Chaperon führt zu einer weiteren Entfaltung und Destabilisierung des Proteins gebundenen Kunden, die ihre Übergabe an die kanonische Chaperon-System DnaK/J, umfaltung38auslöst. Analyse der Hsp33s Interaktion Seiten legt nahe, dass Hsp33 verwendet beide, die Regionen sowie die hydrophoben Regionen auf Linker und N-terminale Domäne erfassen ihrer geladenen ungeordneten Proteine Client misfolded und verhindern deren Aggregation38, 42. im zusammengeklappten Zustand sind diese Regionen durch die gefalteten Linker und C-terminale Domäne versteckt. Interessant ist, dient die Linker-Region als Gatekeeper der Hsp33s gefalteten und inaktiven Zustand, den klappbaren Status seiner benachbarten C-terminale Domäne34"sensing". Sobald durch Mutagenese (entweder durch eine Punktmutation oder eine vollständige Sequenz Störung) destabilisiert, wird Hsp33 in ein konstitutiv aktiv Chaperon unabhängig Redox Bundesstaat seine Redox-Sensitive Cysteine43konvertiert.

Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen Überwachung der Redox-abhängige Chaperone Aktivität Hsp33s sowie Zuordnung Konformationsänderungen auf die Aktivierung und Bindung von Kunden Proteine. Diese Methodik kann andere Chaperon-Client Anerkennung Modelle als auch nicht-Chaperon-Protein-Protein-Wechselwirkungen Forschung angepasst werden. Darüber hinaus präsentieren wir Protokolle für die Zubereitung von vollständig reduzierte und oxidierte Chaperone, die in den Studien von anderen Proteinen Redox-Schalter verwendet werden können, um mögliche Rollen der Protein-Oxidation auf die proteinaktivität zu offenbaren.

Im einzelnen beschreiben wir ein Verfahren zur Überwachung Chaperon Aktivität in Vitro und definieren die Substratspezifität unter verschiedenen Arten von Proteinaggregation (chemisch oder thermisch induzierte) mit Lichtstreuung (LS) gemessen an einem Fluorospectrometer44. Während der Anhäufung Licht Streuung bei 360 nm erhöht sich rasch durch die zunehmende Trübung. Somit kann Aggregation in einer zeitabhängigen Weise bei dieser Wellenlänge überwacht werden. LS ist eine schnelle und empfindliche Methode zum Testen von Proteinaggregation und somit die Anti-Aggregation-Aktivität eines Proteins des Interesses mit nanomolaren Konzentrationen, sodass die Charakterisierung von Protein Aggregation-kinetische Parameter unter verschiedenen Bedingungen. Darüber hinaus das hier beschriebene LS-Protokoll erfordert keine teuren Instrumentierung und kann problemlos in jedem Labor hergestellt werden.

Dennoch ist es ziemlich schwierig, "saubere" kinetischen Kurven zu erhalten und solche Lichtstreuung Experimente, wegen Lärm und die große Zahl der Ausreißer von Luftblasen und großen Aggregaten erzeugt ein Protein kinetische Parameter abgeleitet. Um dieses Hindernis zu überwinden, präsentieren wir ein neues grafisches Tool, Kfits45, für Lärmbelastung in verschiedene kinetische Messungen, speziell ausgestattet für Protein Aggregation kinetische Daten verwendet. Diese Software bietet vorläufige kinetische Parameter für eine frühzeitige Bewertung der Ergebnisse und erlaubt dem Benutzer, "große Datenmengen schnell reinigen" ohne seine kinetischen Eigenschaften. Kfits ist in Python implementiert und in open Source bei 45erhältlich.

Eine der schwierigen Fragen im Bereich bezieht sich auf mapping Interaktion stellen zwischen Betreuer und ihre Client-Proteine und das Verständnis, wie Chaperone eine Vielzahl von fehlgefaltete Substraten erkennen. Diese Frage ist komplizierter, wenn Studium hochdynamische Proteinkomplexe, die per se beinhalten Chaperone und Aggregation neigende Substrate ungeordnet. Glücklicherweise, strukturelle Massenspektrometrie hat in den letzten zehn Jahren drastisch fortgeschritten und hat erfolgreich hilfreiche Ansätze und Instrumente zur Analyse der strukturelle Plastizität und Karte Rückstände an Protein Anerkennung46, 47 , 48 , 49. hier präsentieren wir eine solche Technik-Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie (HDX-MS)-die erlaubt die Zuordnung der Rückstandsgehalt Änderungen in eine strukturelle Anpassung auf Protein-Modifikation oder Protein/Ligand verbindlichen35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS nutzt den kontinuierlichen Austausch von Rückgrat Wasserstoffatome durch Deuterium, die Rate von denen ist von der chemischen Umgebung, Erreichbarkeit, betroffen, und kovalente und nicht-kovalente Bindungen56. HDX-MS verfolgt diese Austauschprozesse mit einem deuterierte Lösungsmittel, häufig Schweres Wasser (D2O) und ermöglicht die Messung basiert auf der Veränderung der Molekulargewicht der Wasserstoff zu Deuterium Austausch nach. Langsamere Rate der Wasserstoff-Deuterium Austausch führt aus Wasserstoffatome an Wasserstoffbindungen teilnehmen oder einfach aus sterische Behinderung, die lokale Veränderungen in Struktur57angibt. Änderungen auf ein Ligand-Bindung oder Post-translationalen Modifikationen führen auch zu Unterschieden in der Wasserstoff-Umgebung mit einer Bindung, die resultierenden Unterschiede in der Wasserstoff-Deuterium Austausch (HDX) Preise46,53.

(1) Karte Hsp33 Regionen, die rasch entfalten auf Oxidation, führt zur Aktivierung des Hsp33, und (2) definieren die mögliche verbindliche Schnittstelle des Hsp33 mit seinem Full-Length fehlgefaltete Substrat, Citrat-Synthase (CS)38haben wir diese Technologie angewendet.

In diesem Manuskript beschriebenen Methoden können angewendet werden, um Redox-abhängige Funktionen der Proteine in Vitro, Definition Anti-Aggregation-Aktivität und die Rolle der strukturellen Veränderungen (falls vorhanden) in Proteinfunktion zu studieren. Diese Methoden können leicht verschiedene biologische Systeme angepasst und angewendet im Labor.

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Protocol

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1. Vorbereitung von vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteinen

  1. Vorbereitung eines vollständig reduzierte Proteins
    Hinweis: Hier beschreiben wir die Reduzierung eines Zink-haltige Protein und eine ZnCl2 Lösung um den Zn eingearbeitet, reduzierte Protein Zustand wiederherzustellen. Die ZnCl-2 -Lösung kann ersetzt oder verworfen werden. Beachten Sie, dass die Zeit und Temperatur des Reduktionsprozesses hängt die proteinstabilität und Funktion und ist somit spezifisch pro Protein.
    1. Die Protein-Probe auf dem Eis Auftauen und bis zu entfernen Aggregate zu spinnen. Inkubation die Probe mindestens 1,5 h bei 37 ° C mit 5 mM DTT und 20 µM ZnCl2 (bis zu 70 % der Proteinkonzentration).
      Hinweis: Die Temperatur in diesem Schritt ist Protein-abhängig und sollte die proteinstabilität angepasst werden.
    2. DVB-t mit Entsalzung Spalten zu entfernen.
      Hinweis: Es gibt verschiedene Entsalzung Spalten zur Verfügung. Das Protokoll unten beschreibt das Verfahren anhand bestimmte Entsalzung Spalten (siehe Tabelle der Materialien). Bevor Sie anderen Entsalzung Spalten verwenden, empfiehlt es sich, ihre Effizienz der DVB-t-Entfernung und Protein Erholung, zu prüfen, da einige Entsalzung Spalten das Protein des Interesses teilweise absorbieren können.
      1. Equilibrate der Spalte mit einem Kalium-Phosphat (KPi)-Puffer (40 mM, pH 7,5) durch die Spalte mit dem Puffer vollständig füllen und lassen den Puffer heraus tropft. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 X.
      2. Entfernen Sie die weißen Scheibenfilter in der Spalte, indem vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken und herausnehmen; Es ist am einfachsten zu entfernen, während die Spalte mit dem KPi-Puffer gefüllt wird. Füllen Sie die Spalte mit KPi-Puffer und 1.000 x g für 3 min zentrifugieren.
      3. Übertragen Sie die Spalte in ein sauberes Röhrchen, fügen Sie die Protein-Muster langsam bis zur Mitte der Spalte hinzu und bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren. Das DVB-t-freie Protein ist jetzt in der durchströmten.
    3. Überprüfen Sie ihre Konzentrationen (z.B., verwenden Sie ein UV/Vis-Spektrometer) und Messen Sie die Absorption bei 280 nm. Berechnen Sie die Konzentration des Proteins mit Hilfe des Beerschen Gesetz.
    4. Verteilen Sie die Hälfte der Proteinproben in Aliquote. 20 min für eine vollständige Entfernung von Sauerstoff inkubieren Sie die Aliquote unter anaeroben Bedingungen (z. B.mit einer anaeroben Kammer). Versiegeln Sie die Rohre mit Kunststoff-Folie und speichern Sie die Proben bei-20 ° C oder-80 ° C, abhängig von dem Protein.
      Hinweis: Anstelle der anaeroben Kammer können die Rohre auch mit Argon-Gas, Sauerstoff zu entfernen geflasht werden.
  2. Vorbereitung eines vollständig oxidierten Proteins
    Hinweis: Es wird empfohlen, oxidierte Proteinproben aus vollständig reduzierte Proteinen (wie zuvor beschrieben) vorzubereiten. Dadurch verringert sich die Heterogenität in Oxidationsstufen von Cysteine. Es ist möglich, verschiedene oxidierende Reagenzien zu verwenden; Hier konzentrieren wir uns auf Wasserstoffperoxid (H2O2).
    Achtung: Nicht über-Oxidations, da es gegen unerwünschte Intramolekulare Disulfid-Bindungen und irreversible Oxidation verschiedener Aminosäuren, Cystein, Methionin, Tyrosin und andere einschließlich führen kann.
    1. Die restlichen Protein-Probe 5 mM H2O2 (frisch verdünnt) hinzugeben und unter Schütteln 3 h bei 40 ° C inkubieren.
      Hinweis: Die Temperatur in diesem Schritt ist Protein-abhängig und sollte die proteinstabilität angepasst werden.
    2. Equilibrate der Spalte mit KPi-Puffer (40 mM, pH 7,5) durch die Spalte mit dem Puffer vollständig füllen und lassen den Puffer heraus tropft. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2 X.
    3. Entfernen Sie die weißen Scheibenfilter in der Spalte, indem vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken und herausnehmen; Es ist am einfachsten zu entfernen, während die Spalte mit dem KPi-Puffer gefüllt wird.
    4. Füllen Sie die Spalte mit KPi-Puffer und 1.000 x g für 3 min zentrifugieren.
    5. Übertragen Sie die Spalte in ein sauberes Röhrchen, fügen Sie die oxidierte Protein-Muster langsam bis zur Mitte der Spalte hinzu und bei 1.000 x g für 2 min zentrifugieren; Das oxidierte Protein ist jetzt in der durchströmten.
    6. Überprüfen Sie proteinkonzentrationen wie in Schritt 1.2.5, teilen die oxidierte Proteine in Aliquote und bei-20 ° C oder-80 ° C, Protein-abhängige lagern.

2. die Lichtstreuung Aggregation Assay

Hinweis: Alle Konzentrationen in diesem Test sind Chaperon und Substrat-spezifisch, und sollte kalibriert werden. Alle Puffer sollte 0,22 µm gefiltert, da es extrem wichtig ist, dass die Puffer sind frei von jeder Partikel oder Luftblasen und die Küvetten sauber und staubfrei sind. Es ist sehr wichtig, ein Rührer platziert in die Küvette Quarz zu verwenden. Prüfen Sie verschiedene Rührer Größen und Formen gewährleisten eine effiziente Durchmischung der gesamten Lösung ohne unerwünschte Luftblasen zu produzieren. Darüber hinaus gibt es verschiedene Flouorospectrometers in Laboratorien und Anlagen. Hier eine spezielle Fluorospectrometer (siehe Tabelle der Materialien) diente. Verschiedene Instrumente haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit, Messgeschwindigkeit und Sampler-Parameter. Daher sollte die genaue Messparameter (z.B.Emissions- und Erregung Bandbreite, Empfindlichkeit und andere) mit einem bekannten Aggregation neigende Protein und seine entsprechende Bedingungen optimiert werden. Verwendung von Citrat-Synthase (CS) und/oder Luciferase als erste Substrate in nanomolaren Konzentrationen wird empfohlen.

  1. Chemischen Aggregation assay
    1. Bereiten Sie das denaturierte Substrat durch Inkubation 12 µM CS Übernachtung in 40 mM HEPES (pH 7,5) und 4,5 M GdnCl. Um den pH-Wert zu erhalten, lösen sich die GdnCl in die 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Öffnen Sie die Fluorospectrometer-Software und gehen Sie auf Kurs Zeitmessung. Legen Sie die Parameter zu: Temperatur: 25 ° C; ΛEm: 360; EM-Bandbreite: 5 nm; Λ-ex: 360; Ex-Bandbreite: 2,5 nm; und Datenintervall: 0,5 s.
    3. Bereiten Sie die Probe durch Zugabe von 1.600 µL 40 mM HEPES, ein Quarz-Küvetten. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter und lassen Sie die Probe, die gewünschte Temperatur zu erreichen.
    4. Das Rühren auf 600 u/min und mit beginnen Sie der Messung, bis eine Baseline hergestellt wird. Halten Sie das Rühren auf für die gesamte Messung.
    5. Zur Messung der CS-Aggregation in Ermangelung von einem Chaperon, bei 120 s in der Messung hinzufügen (sanft, aber schnell) 10 µL denaturierten CS (Endkonzentration von 75 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
    6. Zur Messung der CS-Aggregation in Anwesenheit von Hsp33, bei 60 s in der Messung hinzufügen Hsp33 (Endkonzentration von 300 nM). Nach einer weiteren 60 s, fügen Sie 10 µL denaturierten CS (Endkonzentration von 75 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
      Hinweis: Wenn das Substrat oder Chaperon, hinzufügen um Einfügung von Luftblasen zu vermeiden, verwenden einer 10 µL Pipette.
  2. Thermische Aggregation assay
    Hinweis: Die Temperatur für die thermische Aggregation Assay hängt die proteinstabilität und sollte für jedes Protein unabhängig voneinander eingestellt werden.
    1. Öffnen Sie die Fluorospectrometer-Software und gehen Sie auf Kurs Zeitmessung. Legen Sie die Parameter wie folgt: Temperatur: 43 ° C; ΛEm: 360; Emission-Bandbreite: 5 nm; Λ-ex: 360; Erregung Bandbreite: 2,5 nm; und Datenintervall: 0,5 s.
    2. Bereiten Sie die Probe durch Zugabe von 1.600 µL vorgewärmten 40 mM HEPES, ein Quarz-Küvetten. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter und lassen Sie die Probe 43 ° c erreichen.
    3. Das Rühren auf 600 u/min und mit beginnen Sie der Messung, bis eine Baseline hergestellt wird. Halten Sie das Rühren auf für die gesamte Messung.
    4. Zur Messung der CS-Aggregation in Ermangelung von einem Chaperon, bei 120 s in der Messung hinzufügen sanft CS (Endkonzentration von 125 nM) und weiter Messen für 1.200 s.
    5. Zur Messung der CS-Aggregation in Anwesenheit von Hsp33, bei 60 s in der Messung hinzufügen Hsp33 (Endkonzentration von 600 nM). Nach einer weiteren 60 s, CS hinzufügen (Endkonzentration von 125 nM). Fortsetzen die Messung für 1200 s.
      Hinweis: Wenn das Substrat oder Chaperon hinzufügen, vermeiden Sie das Einfügen von Luftblasen.
  3. Analyse und Lärm Datenentfernung von Kfits
    Hinweis: Kfits finden Sie unter Verwendung von Kfits wurde zuvor bei Rimon Et Al. beschrieben 45
    1. Hochladen Sie die Datendatei.
      Hinweis: Die Eingabe ist die rohe Ergebnisse aus Messungen der Lichtstreuung in ein Textformat kommagetrennten oder Tabulatorzeichen.
    2. Um keinen Lärm zu entfernen, wählen Sie Analyseparameter. Markieren Sie Use- Automatische beste Modell (empfohlen), das Geräusch ist immer über Signal Flag.
    3. Manuell entfernen Sie offensichtliche Ausreißer mit den grünen und roten einstellbare Linien; Dieser Schritt wird den Lärm oberhalb der grünen Linie und unterhalb der roten Linie filtern.
    4. Legen Sie die Grundlinie und die Fit-Kurve. Nach dem Auftragen der Rauschschwelle, herunterladen Sie die verarbeiteten Daten.

(3) Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

  1. Vorbereitung der Puffer und Proteinproben (Hsp33 und Hsp33-CS-Komplex)
    1. Verdünnen Sie die Proteinproben auf eine Endkonzentration von 1 mg/mL in 25 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Fläschchen.
    2. Bereiten Sie Protein-Substrat komplexe Proben von Hsp33 mit CS in einem Verhältnis von 1: 1,5 bei 43 ° c Bebrüten vor
      1. Fügen Sie CS in gewissem Sinne schrittweise zu vermeiden schnelle Aggregation und eine fruchtbare Bindung zwischen der Hsp33 und der thermisch entfaltet CS zu gewährleisten.
      2. Verwenden Sie mindestens vier Schritte (d. h., jedes Mal, wenn eine Viertel der letzte Band hinzufügen) und inkubieren Sie die Proben 15 min nach jeder Zugabe um CS Schutz durch Hsp33 zu ermöglichen.
    3. Entfernen Sie alle Aggregate mit einer 30-min Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 ° c
      Hinweis: Neue Protein-Substrat-komplexen müssen frisch zubereitet werden. Substrat-Zugabe sollte schrittweise erfolgen; Andernfalls tritt eine Aggregation auf. Temperatur, Substrat und Substrat-Konzentrationen sind Protein-spezifisch.
    4. Bereiten Sie einen Puffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), die als Deuterierung Kontrolle dient, und einen Puffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), die der Deuterierung Puffer ist. Bereiten Sie auch einen frischen abschrecken Puffer (150 mM DÄMMUND, 3 M GdnCl, 0,1 % Ameisensäure).
      Hinweis: Die abschrecken Puffer sollte für das Protein des Interesses optimiert werden, um seine maximale Sequenz Deckung nach der Verdauung Pepsin zu erzielen.
    5. Übertragen Sie alle Puffer und Proben in Fläschchen, und legen Sie sie in die richtigen Fächer. Halten Sie Puffer H und D bei 25 ° C (Tray 25 ° C); auf der anderen Seite halten Sie die Proben und abschrecken Puffer bei 0 - 2 ° C (0 ° C Fach). Legen Sie die Proben in 150 µL Glaseinsätzen (siehe die Tabelle der Materialien), und übertragen sie dann ins Fläschchen.
  2. Vorbereitung des Instruments
    Hinweis: Das Massenspektrometer kommt mit zwei begleitenden Software-Programme: man steuert die Pumpen und die andere das Massenspektrometer (siehe die Tabelle der Materialien). Die nächsten Schritte werden durch diese beiden Softwareprogramme beschrieben werden.
    1. Alle Kühlgeräte manuell aktivieren. Sobald alle Kühlsysteme ihre zieltemperaturen erreichen, manuell die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Beladung Pumpen einschalten.
      Hinweis: In unserem Fall besteht diese aus zwei kühlende Bäder und eine Kühlbox (enthält die Falle und analytische Säulen). Ein Kühlgerät kühlt das Fach bei 0 ° C, während die andere das Tablett bei 25 ° C hält; die die Kühlbox beträgt 1 bis 2 ° C.
    2. Öffnen Sie die Software, die sowohl Pumpen steuert sowie die Software, die das Massenspektrometer steuert; Stellen Sie sicher, dass MS auf Standbyist.
    3. Die MS-Quelle der HPLC-Auslassventil trennen und waschen das System zunächst mit einem "dreifachen Reiniger" Lösung (1 % Ameisensäure, 33 % Acetonitril, 33 % Isopropanol, 33 % Methanol), dann mit Puffer B (80 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) und schließlich mit Puffer (0,1 % Ameisensäure, pH 2,25), und fügen Sie dann die Pepsin Spalte in das System. Wenn Puffer ändern, stellen Sie sicher, beide Pumpen, bevor Sie fortfahren zu bereinigen.
    4. Sicherstellen Sie, dass die Durchflussmenge für beide Pumpen 0,1 mL/min ist und der Druck stabil ist.
    5. Nach dem Waschen des Systems mit einem stetigen Strom und gleichmäßigen Druck, die MS-Quelle die HPLC-Steckdose stecken und die MS schalten.
  3. Massen-Spektrometer-Parameter
    1. Legen Sie die Peptid-Ionisation, Electrospray Ionisierung (ESI) bei 175 ° C, die Scheide Gasstrom mit 17 Jahren die Aux-Gas-Glow 2 und die Spray-Spannung bei 4,5 kV (ergänzende Abbildung1).
    2. Richten Sie die Parameter wie folgt für die nicht deuterierter Proben.
      1. Legen Sie die Parameter: Scan-Bereich m/Z-300-1500; Auflösung auf 70.000; Automatische Gain Kontrolle Ziel (AGC) bis 106; und die maximale Einspritzzeit (IT) bei 100 ms.
        Hinweis: Die 5 intensivsten Ionen mit Ladungszustände + 2 bis + 6 (ihre Intensität höher als 1,3 x 104) und eine dynamische Fenster von 30 in isoliert werden.
      2. Durchführen Sie die Ionen-Fragmentierung durch höhere Energie Elektronenstruktur Dissoziation (HCD) in der Multiple-Kollision-Zelle mit normalisierten Aufprallenergie (NCE) 28 gleich. Erkennen von Fragment-Ionen per Tandem MS bei einer Auflösung von 35.000, AGC-Ziel von 105, maximal auf 60 ms und eine Isolierung Fenster von 2,0 m/Z.
    3. Beschäftigen Sie für die deuterierte Proben MS1 nur mit einer höheren Auflösung von 140.000 und ansonsten ähnlichen Parametern.
  4. Durchführung des Experiments
    1. Legen Sie die Tabletts auf folgende Weise.
      1. Legen Sie Puffer, H und D im Fach 25 ° C, dann legen Sie die Proben und abschrecken Puffer in die 0 ° C Fach.
      2. Statt X leeren Fläschchen, in beiden Fächern ausgerichtet, wobei X = Anzahl der Proben x die Anzahl der Zeitpunkte.
        Hinweis: In der Schublade 25 ° C die leeren Fläschchen als Reaktionsgefäße dienen, und in das Fach 0 ° C, sie dienen als Fläschchen abschrecken.
      3. Jeder der die leeren Fläschchen enthält eine leere Glaseinsatz; verwerfen und sagte einfügen zwischen Experimente ersetzen.
        Hinweis: Um die HDX-Experiment auf die effizienteste und wenigsten zeitraubende Weise, eine Software laufen die Proben gleichzeitig ausgeführt werden können diente (ergänzende Abbildung2). Die nächsten Schritte werden mit dieser Software beschrieben.
    2. Öffnen Sie die Software. Richten Sie die Programmparameter Folgendes ausführen.
      1. Jede Probe (5 µL) mit 45 µL Puffer D inkubieren Sie für mehrere Minuten, je nach den ausgewählten Zeitpunkten (z.B.1, 3, 18, 40 und 100 min) bei 25 ° C. Stattdessen inkubieren Sie die nicht deuterierter Probe mit 45 µL Puffer H.
      2. Unmittelbar nach der Inkubation 50 µL eiskalt abschrecken Puffer untermischen Sie 50 µL deuterierte Eiweiß und injizieren sie in eine Spalte immobilisierten Pepsin (20 mm in der Länge, 2,0 mm im Durchmesser).
      3. Eluieren Peptide aus der Spalte "Pepsin" in der Pre-Spalte durch Waschen mit Puffer A 6 min mit einer Rate von 50 µL/min halten Puffer A in die Kühlbox bei 0 ° C.
      4. Die Peptide aus der Pre-Spalte in der Trennsäule C18 eluieren (C18 Säule, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, bei 0 ° C gehalten) und trennen Sie diese durch die Anwendung eines linearen Farbverlaufs von Acetonitril 100 µL/min. laufen mit Acetonitril 100 % als Puffer B Acetonitril-Gradient : 7 min. bei 2 %, 7 min bei 10-30 %, 2,5 min bei 30-90 %, 1,5 min bei 90 %, rasante Steigung für 1 min bei 90-8 %, und schließlich equilibrate die Spalte 4 Minuten bei 2 %.
    3. Eine laufende Sequenz zu bauen (siehe ergänzende Abbildung 2): Geben Sie alle Zeitpunkte, Beispielnamen, und Standorten in die Fächer sowie die Puffer-Namen und Standorten.
      Hinweis: Die Software ermöglicht die Ausrichtung der verschiedenen Laufzeiten in ein Programm, die mehrere Proben gleichzeitig, effizient verringern Laufzeiten ausgeführt wird.
  5. Datenanalyse
    Hinweis: Wir arbeiten mit mehreren Software-Programme in den Prozess der Datenanalyse, einschließlich Proteome Entdecker und MaxQuant (freie Software) für die Peptid-Identifikation und Analyse der Sequenz Abdeckung sowie HDX Werkbank, eine Kostenlose Software, der die Analyse der Deuterium-Einbau in Proteine und ein Vergleich der HDX-Raten zwischen verschiedenen Experimente ermöglicht. Die nächsten Schritte werden durch diese Software-Programme beschrieben werden.
    1. Analysieren Sie die Peptid-Abdeckung der Probe durch die Ausführung nicht deuterierter Kontrollproben durch die Software (ergänzende Abbildung 3). Die Software mit den folgenden Parametern einstellen.
      1. Die Sequest HT-Methode mit einem No-Enzym (unspezifischen) Spalten. Suche nach Peptide 4-144 Aminosäuren mit einer Masse Toleranz von 7 ppm und 0,5 Da für die Vorläufer Ionen und Fragment. Ermöglichen Sie eine dynamische Methionin-Oxidation.
      2. Erstellen Sie eine Datenbank für das Protein, durch das die Software die Peptid-Berichterstattung bestimmen kann. Exportieren Sie die identifizierten Peptide im Textformat.
    2. Analysieren Sie die deuterierte Ergebnisse mit Hilfe der HDX Werkbank freie Software58.
      1. Die Protein-Editor öffnen und das Protein durch Einfügen der Protein-Sequenz und Peptid-Abdeckung-Datei definieren.
      2. Als nächstes öffnen Sie den Setup Assistenten experimentieren Editor und geben Sie alle Eingaben, die angefordert.
        Hinweis: Das Programm muss die Anzahl der Samples, die Anzahl der Zeitpunkte, die Anzahl der Wiederholungen, der pH-Wert der Puffer und der Temperatur.
      3. Zu guter Letzt die Eingabeparameter betreffend das Massenspektrometer verwendet, nach denen das Programm eine Liste der gefundenen Peptide erzeugt.
        Hinweis: Die Software erkennt die "HDX" Peptide, Isotop Cluster inspiziert und zeigt eine klare Visualisierung der Deuterierung in den Proben.
  6. Darstellung der Daten
    1. Beschriften Sie die Regionen mit einer respektvollen Deuterierung Akzeptanz auf des Schachts PyMol -Software oder andere Visualisierungs-Software.
    2. Die Deuterium Aufnahme Ebenen anstelle der B-Faktor Werte einzuführen.
      Hinweis: Ein grundlegendes Tutorial finden Sie auf https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

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Representative Results

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Die zwei vorgestellten Methoden ermöglichen es, die kinetische Aktivität und Dynamik von Protein-Interaktionen zwischen einem Chaperon und seinem Substrat zu folgen. Darüber hinaus ermöglicht die Reduzierung-Oxidation-Protokoll die Zubereitung vollständig reduziert und vollständig oxidierten Chaperon, geben ein vertieftes Verständnis des Aktivierungsmechanismus der ungeordneten Chaperone Redox-abhängige.

Erstens haben wir Lichtstreuung um zu prüfen, die Redox-abhängige Aktivität das Chaperon. Lichtstreuung erfolgte auf einem chemisch und thermisch denaturierten CS-Protein in Anwesenheit einer oxidierten (aktiv) oder verringert (inaktiv) Chaperon (Abbildung 1). Chemische Denaturierung führt zu eine schnelle CS-Aggregation durch die umfaltung eines voll entarteten Proteins in ungünstigen Pufferbedingungen induziert. Auf der anderen Seite ergibt sich die Thermal-induzierte Aggregation aus einer relativ langsamen Entfaltung der nativ gefalteten Substrat. Daher unterscheiden sich diese verschiedenen Arten von Aggregation Prozesse in ihre kinetische Parameter. Darüber hinaus können verschiedene Chaperone in ihrer Fähigkeit, zu verhindern, dass die Aggregation von dem gleichen Substrat in verschiedenen Aggregation Modi variieren.

In beiden Formen der Denaturierung, oxidiert die Zugabe von Hsp33 in einem Molverhältnis von 1:4 (CS: Hsp33) vollständig abgeschafft Aggregation, 360 nm-Lesungen auf vernachlässigbare Werte zu senken. Das Vorhandensein von einem reduzierten Hsp33, auf der anderen Seite hatte keinen Einfluss auf die CS-Stabilität und gab eine Aggregation Kurve ähnlich dem in Ermangelung einer Begleitperson (Abbildung 1) erkannt. Die Ergebnisse wurden analysiert und gereinigt von Hintergrundgeräuschen mit Kfits, wie schematisch in Abbildung 2beschrieben.

Die Gliederung der HDX-MS-Technik beginnt mit die Inkubation von Chaperon mit Deuteriumoxid, gefolgt von abschrecken und Verdauung, und schließlich MS-Analyse und Wasserstoff-Deuterium Austausch Profilerstellung (Abbildung 3). Während der HDX-MS wurde das Chaperon auf dem Tablett bei 25 ° C in einem D2O-haltigen Puffer inkubiert. Nach einer bestimmten Inkubationszeit von der Probe handling-Roboter-System gesteuert, wurde die Proteinlösung, die abschrecken Lösung, sauren und Geruchsstoffen, übertragen auf das Tablett auf 0 ° C. Der niedrige pH-Wert und niedriger Temperatur verlangsamt den Wasserstoff-Austausch und bewahrt Deuterierung Ebenen von allen Amid Wasserstoffatome während die denaturierenden Chemikalie das Protein, so dass es richtig verdaut, entfaltet. Das Robot-System überträgt die Probe aus dem Fach bei 0 ° C an die Kühlbox, wo es in der Online-Pepsin Verdauung Spalte fließt. Unmittelbar nach der Proteinverdauung Peptide fahren Sie mit dem C18-Trap-Säule für die Entsalzung und Entfernung von schnell austauschbaren D2O (vor allem befindet sich auf der Seite Kette Atome) und werden dann getrennt über die C18-Spalte und analysiert mit Masse Spektrometrie. Der Probenstrom wird durch ein zwei-Ventil-System gesteuert, die 1) sorgt für die Trennung von Pepsin und C18 Spalte Puffer um die Inaktivierung der Pepsin durch organische Lösungsmittel zu verhindern, und (2) ermöglicht die kurze Entsalzung der Peptide, schnell zu entfernen austauschbare D2O Moleküle und Salze (Abbildung 4).

Nachdem die computergestützte Analyse erhalten wir ein Deuterierung Profil für jedes Peptid zeigt eine Änderung in der Masse als Funktion der Inkubationszeit in D2O. Die HDX-Workbench Software erlaubt den Vergleich von experimentellen Wiederholungen um statistische Analysen der einzelnen Bedingungen (z.B. eine aktive Begleitperson in ein ungebundenes Formular) zu schaffen. Der nächste Schritt ist ein Vergleich der Deuterierung Kurven zwischen verschiedenen Proben; zum Beispiel eine gebundene Chaperon und eine ungebundene Begleitperson. Diese Vergleiche der verschiedenen Chaperon Staaten können die strukturellen Störungen offenbaren, die Substrat Bindung zu begleiten. Rückstände, die einen langsameren Austausch im gebundenen Zustand aufweisen sind wahrscheinlich mit einem Bindungspartner interagieren. Es ist wichtig zu beachten, dass verminderte Wasserstoff-Deuterium-Wechselkurse auch angeben können, eine umfaltung einer bestimmten Region nach Bindung ohne die tatsächliche direkte Interaktion mit dem Substrat (Abb. 5A). Die HDX Workbench Software erlaubt die Prüfung der Ergebnisse in der "Störung" Ansicht zeigt die Deuterierung mit einem Standard-Fehler über die Abdeckung des gesamten Proteins.

In diesem Fall diente HDX-MS Deuterierung Muster zwischen gebundenen und ungebundenen Chaperon Hsp33 zu seinem Substrat CS vergleichen. Die Ergebnisse zeigen eine Client-Interaktion Website innerhalb der C-terminalen Redox Schalter Domäne das Chaperon (Abb. 5B). Während reduziert, hat Hsp33 eine vollständig geordnete Struktur, wo die Interaktion Seiten begraben sind. Hsp33 verliert seine Struktur und wird funktional, wenn es auf oxidativen Stress empfindet; Wir haben daher die reduzierte und oxidierte Hsp33 gebundenen und ungebundenen Bedingungen (Abbildung 5C) verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass während der reduzierten Hsp33, ob gebunden oder ungebunden, ähnliche Peptid Kurven erzeugt, die oxidierte Hsp33 einen signifikanten Unterschied zeigt. Die oxidierte Hsp33 Beispiele zeigen einen 30 % Deuterierung Unterschied zwischen der gebundenen und ungebundenen Chaperon, mit spezifischen Bereichen des gebundenen Proteins eine allosterische Hindernis angibt. Die Analyse der zusätzlichen Peptide aus der N-terminalen und Thermobile Linker Regionen sind ergänzende Abbildung 3dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1 . Aggregation Analyse durch Lichtstreuung. Die Aggregation von chemisch und thermisch denaturierten CS überwacht wurde im Beisein von oxidierten Hsp33 (rot), Hsp33 (blau), reduziert oder bei fehlender Chaperon (schwarz). Lichtstreuung an 360 nm wurde auf 1.200 überwacht s. (A) während der chemischen Aggregation, bei Abwesenheit von einem Chaperon oder in Anwesenheit eines reduzierten Hsp33, die CS aggregiert schnell, erreichen eine Plateau etwa 300 s in der Messung. (B) während der thermischen Aggregation, aggregiert die CS allmählich in Abwesenheit von einem Chaperon oder in Gegenwart von einem reduzierten Hsp33. In beiden Tests das Vorhandensein von oxidierten Hsp33 komplett abgeschafft Aggregation, vernachlässigbar 360 nm Lesungen bewiesen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Entfernen von Rauschen und Datenanalyse mit Kfits. Dieses Fenster zeigt ein Schema fasst die Datenentfernung Analyse und Lärm durch das Kfits -Tool, wie im Text und in Rimon Et Al. beschrieben 45. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Workflow der HDX-MS-Methodik. HDX-MS beschäftigt deuterierte Lösungsmittel die chemische Umgebung des Amid Wasserstoffatome, gleichmäßig verteilt auf das Rückgrat des Proteins bestimmt. Das Protein des Interesses wird in einem deuterating Puffer in gediegener Form für bestimmte Zeiträume inkubiert, dann wird der Wasserstoff-Deuterium Austausch von sauren Bedingungen bei einer niedrigen Temperatur abgeschreckt. Das Protein wird durch ein Enzym-Stall unter sauren Bedingungen, wie z. B. Pepsin verdaut. Danach werden die Peptide entsalzt und getrennt in kurzer Zeit einen hinteren Austausch zu vermeiden. Schließlich die Peptide werden durch ein Massenspektrometer analysiert und die Deuterium-Aufnahme wird durch eine Analysesoftware, zum Beispiel von HDX Workbench freie Software58ausgewertet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Komponenten des vollautomatischen HDX-MS Systems. (A) diese schematische Darstellung der HDX-MS stellt alle Teile des Systems: der Laden-Pumpe und die HPLC Pumpe Puffer Ablaufsteuerung und der Probe innerhalb des Systems zu übertragen. Das Robot-System enthält zwei Spritzen und Tabletts die deuterierte Probe und die Proteine auf der Online-Verdauung Spalte über das Eingangsventil Kühlbox (LC Fach) verwendet werden. Dann sind die verdauten Peptide angewiesen, die Spalten C18-Falle "und" Trennung anschließend getrennt und zum Massenspektrometer geleitet. (B) dieses Panel zeigt die tatsächliche HDX-System-Setup, wie es im Labor erstellt wurde. (C) dieses Panel zeigt eine schematische Darstellung der online-Verdauung und Peptid Trennung fluidische Konfiguration. Die Verdauung und Trennung Systeme haben ein Ventil, jede, die zwischen Laden und injizieren Modi umgeschaltet werden kann. Das erste Ventil (auf der linken Seite) die Injektion-Port angeschlossen ist und erfolgt durch die Beladung Pumpe, Regie Proben in die Pepsin-Spalte mit der sauren Puffer ohne organische Lösungsmittel, das das Pepsin Harz schädigen können. Die Probe wird in die Trap-Säule, Rückstände von Deuterium zu entfernen, das passende Ventil übertragen als auch schnell ausgetauscht deuterierte Atome (hauptsächlich von den Seitenketten). Nach einer kurzen Wäsche von 1-2 min in die Trap-Säule des Ventils ändert seinen Modus zu Laden und die Probe wird in die Trennsäule C18 mit der HPLC-Pumpe mit steigenden Konzentrationen von Acetonitril gewaschen. Die Probe wird in das Massenspektrometer für eine Masse Analyse übertragen. Die Länge der Rohre ist markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . HDX-MS Ergebnisse. (A) werden die Ergebnisse als Deuterierung Prozentsatz im Laufe der Zeit pro Protein Fragment, von der HDX Workbench Software generiert. Jedes Diagramm zeigt ein Protein-Muster entweder oxidiert oder reduziert und vergleicht zwischen gebundenen und ungebundenen Proben. Die hier gezeigten Peptid-Fragmente sind das Peptid, das YVVITITPSEG in der Linker-Region gefunden und das Peptid fand LQVMPAQNAQQDDFD in der C-Terminus. (B) zeigen die Endergebnisse, präsentiert als Deuterierung Differenz zwischen der gebundenen und ungebundenen komplexe Störung pro Aminosäure. (C) A Strukturmodell des Hsp33 Chaperon zeigt die Deuterierung Aufnahme Unterschiede in den Linker und C-terminalen instabilen Regionen. Dieses Panel wird mit der Software PyMol erstellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1. Schnittstelle des Programms Betrieb Massenspektrometer. Das Programm dient zur Optimierung und Massenspektrometer Methodenparameter verwendet für das HDX-Experiment zu definieren. Die Methodenparameter (in der linken Leiste) können in der Methode gespeichert werden, sodass von anderen Programmen erkannt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 2
Zusätzliche Abbildung 2. Diese Abbildung zeigt einen Screenshot der Software, die als Integrationsplattform der Roboter Probenahme Übergabe und dem MS-LC System dient. Die Software optimiert die Laufzeit durch die Terminierung des HDX-Experiments, nach den definierten Inkubationszeit im deuterierte Puffer (blaue Pfeile). Zum Beispiel oben ist ein Diagramm der 17 Durchläufe zwei replikativen Analysen der Hsp33 Variante STIL, inkubiert in einem deuterierte Puffer für unterschiedliche Tageszeiten im Bereich von 0 - 100 min. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 3
Zusätzliche Abbildung 3. Diese Abbildung zeigt eine Analyse der Deuterium-Aufnahme von mehreren Hsp33 Peptide aus verschiedenen Hsp33 Varianten, PGBD und REV34benannt. Die Grundstücke zeigen Veränderungen der Deuterium-Aufnahme von der gleichen Region in Hsp33 in ungebundenen (rot) und gebunden (blau) Staaten. Peptide aus der N-terminalen Region zeigen keinen signifikanten Unterschied in der HDX-Preise, während Fragmente aus der Linker-Region einen deutlichen Rückgang der HDX-Preise auf die Interaktion mit dem ausgeklappten Substrat, Citrat-Synthase zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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In diesem Papier stellten wir Protokolle für die Analyse der Redox-abhängige Chaperone Aktivität und die Charakterisierung von strukturellen Veränderungen auf die Bindung eines Client-Proteins. Dies sind komplementäre Methoden, um potenzielle Chaperon-Substrat-komplexen zu definieren und analysieren mögliche Standorte werden Interaktion.

Hier haben wir diese Protokolle für die Charakterisierung eines Komplexes zwischen der Redox-regulierten Chaperon Hsp33 mit einem gut untersuchte Chaperon Substrat CS angewandt. Präsentierten wir zwei verschiedene Arten von Protein Aggregation Analysen, die sich in ihren kinetischen und ursprünglichen Zustand unterscheiden: während eine chemische Denaturierung beginnt das Substrat den sich entfaltenden Prozess aus denaturierten Form, während eine thermische Aggregation der Entfaltung wird von der nativen Form des Substrates eingeleitet.

Lichtstreuung Messungen sind ein nützliches Instrument, um die relative Menge der Proteinaggregation überwachen. Während wir diese Methode verwenden, um den aktiven Zustand des das Chaperon festzustellen, kann es weiter verwendet werden, allgemeine Aggregation Bedingungen, um die Stabilität eines anderen Proteins zu vergleichen oder zu destabilisierende Mutationen im Substrat und Chaperon studieren zu studieren.

Trotz seiner Einfachheit kann die Lichtstreuung Methode verrauschten Daten mit einigen Ausreißern führen. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir die oben beschriebene Kfits -Software entwickelt. Die Kfits -Software macht es möglich, schnell und einfach große Mengen von verrauschten Daten zu entfernen, sowie die kinetischen Parameter von der Lichtstreuung Kurve zu berechnen. Kfits beschränkt sich nicht auf Proteinaggregation und kann auf jede Art von kinetische Messungen angewendet werden.

Die hier beschriebenen Methoden sind so einfach, einfach durchzuführen und nicht zeitaufwendig. Sie können auf verschiedene Molekulare Chaperone, damit ihre Redox-Abhängigkeit innerhalb von ein paar Tagen geprüft werden angewendet werden. Darüber hinaus kann die Anti-Aggregation-Aktivität von anderen, nicht-Redox abhängige Chaperone mit den beschriebenen Protokollen der Lichtstreuung und Kfitsausgewertet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Parameter, wie Temperatur, Proteinkonzentration und Messzeit für jedes Protein System unabhängig voneinander eingestellt werden.

Um strukturelle Informationen über ein Chaperon Arbeitszyklus zu gewinnen, präsentierten wir die HDX-MS-Methode. Im Gegensatz zu der Lichtstreuung Verfahren es ist eine komplexe Technologie und erfordert spezielle Instrumente, darunter ein Massenspektrometer und vorzugsweise ein Robotersystem für die Probenvorbereitung. Jedoch kann dieses Setup eingerichtet werden, auch ohne das Robot-System in einer bestehenden Einrichtung. Wenn feststeht, das Verfahren ist relativ einfach und erlaubt die Analyse von anspruchsvollen Proteinkomplexe, die durch hochauflösende Methoden (z.B.Röntgen- und NMR) unerreicht sein könnte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar, dass Meytal Radzinski für ihre hilfreichen Diskussionen und kritische Lektüre des Artikels, und Patrick Griffin und seine Labor-Mitgliedern für ihre uneingeschränkte Unterstützung beim Aufbau der HDX-Analyse-Plattform. Die Autoren sind dankbar, dass der Deutsch-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), der binationale Science Foundation (2015056), Marie-Curie-Integration Grant (618806), der Israel Science Foundation (1765/13 und 2629/16), und das Human Frontier Science Programm (CDA00064/2014) für ihre finanzielle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie
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Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

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