Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

doi: 10.3791/57806 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

Abstract

אורגניזמים חיים באופן קבוע צריך להתמודד עם סביבות המשתנות במהלך מחזור החיים שלהם, לרבות שינויי טמפרטורה, pH, ההצטברות של מינים חמצן תגובתי, ועוד. תנודות אלו יכולים להוביל חלבון נפוץ התגלגלות, מצבור, והתא מוות. לכן, התאים התפתחו רשת דינמיים, הלחץ ספציפיות של מלווים מולקולרית, המקיימות פרוטאום "בריא" במהלך מתח תנאים. מלווים תלויית ATP מהווים שיעור מרכזי אחד של משגיחים מולקולרית, אשר לשמש מולקולות שורה ראשונה הגנה, הגנה מפני צבירת חלבון באופן תלויי-מתח. תכונה אחת שאלה מלווים שמשותף הוא היכולת לנצל פלסטיות מבניים שלהם ההפעלה הספציפי מתח, זיהוי של שחרור של הלקוח misfolded.

בנייר זה, אנו מתמקדים ניתוח פונקציונלי ומבניים של אחד כזה מהותי המתוסבכים, המלווה חיידקי מוסדר חמצון-חיזור Hsp33, אשר מגן על חלבונים נגד צבירת במהלך סטרס חמצוני. כאן, אנו מציגים ארגז של טכניקות מגוונות ללמוד פעילות המלווה מוסדר חמצון-חיזור, כמו גם עבור מיפוי הסתגלותי שינויים של המלווה, בבסיס פעילותה. באופן ספציפי, אנו מתארים זרימת עבודה הכולל הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, ואחריו ניתוח של ה מלווה פעילות אנטי-צבירת במבחנה באמצעות פיזור אור, התמקדות מידת פעילות אנטי-צבירת וקינטיקה שלה. כדי להתגבר על ליניאריים תכופים שנצבר במהלך מבחני צבירה, נתאר את השימוש Kfits, כלי גרפי חדשנית המאפשרת עיבוד קל של מדידות קינטי. בכלי זה ניתן להחיל בקלות סוגים אחרים של מדידות קינטי עבור הסרת ליניאריים התאמת הפרמטרים קינטי. כדי לתאם את הפונקציה עם מבנה החלבון, נתאר את ההתקנה של זרימת העבודה של טכניקה ספקטרומטר מסה מבניים, מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה, המאפשר את המיפוי של שינויים הסתגלותי על המלווה, המצע בשלבים שונים של פעילות Hsp33. המתודולוגיה אותן ניתן ליישם אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליגנד אחרים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאים פוגש לעתים קרובות הצטברות של מינים חמצן תגובתי (ROS) הפיק כמו תוצרי לוואי של נשימה1,2, חלבון, שומנים בדם-חמצון-3,-4תהליכים נוספים5, 6,7. למרות תפקיד של ROS מועיל בתהליכים ביולוגיים מגוונים כגון הסלולר איתות8,9 , התגובה החיסונית10, חוסר איזון בין ROS הייצור שלה ניקוי רעלים עשויה להתרחש, המוביל חמצוני להדגיש7. המטרות הביולוגי של ROS הם חלבונים, ליפידים, חומצות גרעין, החמצון של אשר משפיעים על מבנה ותפקוד שלהם. לכן, ההצטברות של הסלולר חמצון חזק מקושר במגוון רחב של פתולוגיות כולל סרטן9,11,12,דלקת13הזדקנות14, 15, נמצאו מעורבים תחילת התפתחות הפרעות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון של ואת ALS מחלת16,17,18.

חלבונים הן מסונתז לאחרונה, בוגרת רגישים מאוד חמצון לאור כל השינויים מזיקות של השרשראות בצד שלהם, המעצבים חלבון מבנה ותפקוד19,20. לכן, סטרס חמצוני בדרך כלל מוביל חלבון נפוץ איון, misfolding, מצבור, המוביל בסופו של דבר למוות של התא. אחת האסטרטגיות הסלולר אלגנטית להתמודד עם הנזק הפוטנציאלי של חלבון חמצון זה לנצל את מלווים תלויי-חמצון-חיזור, אשר מעכבים את המצבור חלבון נרחבת, במקום יצירת קומפלקסים יציבים עם חלבונים misfolded לקוח21 22, ,23. אלה מלווים שורה ראשונה הגנה מופעלים במהירות על ידי חמצון בייעודי לאתר (בדרך כלל על שאריות ציסטאין) הממיר אותן מולקולות אנטי-צבירת עוצמה24. מאז סטרס חמצוני תוצאות עיכוב של נשימה, ירידה רמות ATP הסלולר25, מלווים תלויית ATP הקנוני הם פחות יעילים בזמן סטרס חמצוני תנאים25,26 ,27. לכן, חמצון-חיזור מופעל מלווים תלויית ATP ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס חלבון על ההצטברות של חמצון ב חיידקים וב פרוקריוטים (למשל, Hsp3328 , רידא29 ב חיידקים, Get330 , שמרים, peroxiredoxins31 פרוקריוטים). הפעילות של אלה מלווים בחום תלוי הפיך הסתגלותי שינויים מבניים הנגרמת על ידי חמצון בייעודי לאתר זה חושף מעורב ההכרה של חלבונים misfolded לקוח הידרופובי אזורים.

מחקר של מנגנון אנטי-צבירת ועקרונות המסדירים את ההכרה של החלבונים הלקוח על ידי מלווים אינה קלה בשל אופיו נדלנית ודינמיקה של המלווה-המצע אינטראקציות32,33, 34,35,36,37. עם זאת, מלווים מוסדר מתח יש הזדמנות לקדם את ההבנה שלנו של פונקציית צבירה אנטי בשל היכולת שלהם: 1) לקבל שתי צורות שונות של המלווה, פעיל (למשל, מחומצן) לא פעיל (למשל, מופחת), עם הקדמה או הסרה של תנאי הלחץ בקלות להחליף ביניהם (למשל, חמצון, צמצום הסוכן), 2), יש מגוון רחב של מצעים, 3) קומפלקסים יציבים מאוד עם החלבונים לקוח זה יכול להיות מוערך על ידי מתודולוגיות מבניים שונים, ו- 4) להתמקד אך ורק על המצע זיהוי ושחרור, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי תלויי-חמצון-חיזור, כמו הרוב המכריע של אלה מלווים חסר יכולת קיפול.

כאן, אנחנו מנתחים פעילות אנטי-צבירת חיידקי מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33, מרכיב חיוני של מערכת הביטחון חיידקי נגד חמצון-induced חלבון צבירת28. כאשר מופחתת, Hsp33 הוא חלבון מחייב אבץ בחוזקה מקופל עם שום פעילות המלווה; עם זאת, כאשר הם נחשפים סטרס חמצוני, Hsp33 עובר שינויים נרחבים הסתגלותי החושפות את המצע איגוד אזורים38,39. על חמצון, יון אבץ המאוגד חריפה ארבע ציסטאין שנשמרת מאוד שאריות של התחום C-מסוף הוא שוחרר40. התוצאה על היווצרות שני דיסולפידי חוב, התגלגלות של התחום C-מסוף, לבין הקשורה של אזור מקשר סמוכים41. האזורים C-מסוף, מקשר גמיש במיוחד, מוגדרים כמו מהותית או חלקית סמוקים. עם שובו לתנאים שאינם מתח, cysteines מצטמצמות ומחזירה המלווה למצבו מקופל מקורית עם שום פעילות אנטי-צבירה. Refolding של המלווה מוביל ייפתחו עוד יותר, destabilization של החלבון לקוח מאוגד, אשר מפעיל את ההעברה למערכת המלווה הקנוני, DnaK/J, עבור refolding38. ניתוח האתרים האינטראקציה של Hsp33 מרמז כי Hsp33 משתמשת בשני שלה טעונה סמוקים אזורים, כמו גם את האזורים הידרופובי מקשר, תחום N-מסוף כדי ללכוד misfolded חלבונים הלקוח ולמנוע צבירת שלהם38, 42. במצב מקופל, אזורים אלה מוסתרים על ידי מקופלת מקשר C-מסוף תחום. מעניין, האזור מקשר משמש שוער של מצב מקופל ובלתי פעילה של Hsp33, "חש" מעמד מתקפל שלה מחשבים סמוכים C-מסוף34. ברגע גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי מוטגנזה מכוונת (גם על ידי מוטציה או של ההפרעות רצף מלא), Hsp33 מומר מלווה צורונים פעילים בכל מקרה מצב חמצון-חיזור שלה רגיש חמצון-חיזור cysteines43.

הפרוטוקולים המובאת כאן מאפשרים ניטור של Hsp33 פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, כמו גם שינויים הסתגלותי מיפוי על הפעלת ואיגוד של הלקוח חלבונים. מתודולוגיה זו ניתן להתאים מחקר מלווה-לקוח זיהוי דגמים אחרים, כמו גם אינטראקציות חלבון שאינו מלווה. יתר על כן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור הכנת מלווים מלא מופחת, מחמצנים יכולים לשמש במחקרים אחרים חלבונים חמצון-חיזור-switch, כדי לחשוף את תפקידי פוטנציאלי של חלבון חמצון על פעילות החלבון.

באופן ספציפי, אנו מתארים הליך לפקח המלווה הפעילות במבחנה ולהגדיר שלה ירידה לפרטים המצע תחת סוגים שונים של צבירת חלבון (כימי או תרמית המושרה) באמצעות פיזור אור (LS) נמדדת fluorospectrometer44. במהלך מצבור, אור פיזור ב 360 nm מגדיל במהירות עקב עכירות הגוברת. לפיכך, צבירת ניתן לנטר באופן תלוי-זמן ובאורך הגל הזה. ? האם היא שיטה מהירה ורגיש לבדיקת חלבון צבירת ובכך הפעילות האנטי-צבירה של חלבון עניין באמצעות ריכוז nanomolar, המאפשרת אפיון חלבון צבירת קינטי פרמטרים הקשורים תחת שונות תנאים. יתר על כן, הפרוטוקול LS המתוארים כאן אינו דורש מכשור יקר, ניתן ליצור בקלות במעבדה כלשהי.

עם זאת, די מאתגר כדי להשיג. את עקומות קינטי "נקי" וכדי שואבים פרמטרים קינטי של חלבון אור כזה פיזור ניסויים, בשל רעש ואת המספר הגדול של ליניאריים שנוצרו על-ידי בועות אוויר, אגרגטים גדולים. כדי להתגבר על מכשול זה, אנו מציגים את הרומן כלי גרפי, Kfits45, להשתמש להפחתת רמת הרעש במדידות קינטית שונה, מותאם במיוחד עבור חלבון צבירת נתונים קינטי. תוכנה זו מספקת ראשונית פרמטרים קינטי הערכה מוקדמת של התוצאות ומאפשרת למשתמש "נקי" כמויות גדולות של נתונים במהירות מבלי להשפיע על תכונותיו קינטי. Kfits הוא מיושם פייתון וזמין קוד פתוח בגיל 45.

אחת השאלות מאתגרת בתחום מתייחס מיפוי אתרי האינטראקציה בין מלווים וחלבונים לקוח שלהם ולהבין איך מלווים לזהות מגוון רחב של סובסטרטים misfolded. שאלה זו היא יותר מסובך כאשר לומד קומפלקסים דינמי מאוד חלבון אשר כרוכים ממהותם סמוקים מלווים ותערובות צבירת מועדת. למרבה המזל, ספקטרומטר מסה מבניים התקדמה באופן דרמטי במהלך העשור האחרון, סיפק בהצלחה מועיל גישות וכלים כדי לנתח את פלסטיות מבניים מפת משקעים מעורב חלבון זיהוי46, 47 , 48 , 49. כאן, אנו מציגים אחד כזה טכניקה-מימן-דאוטריום exchange ספקטרומטר מסה (HDX-MS)-מה שמאפשר את המיפוי של שינויים ברמת שאריות קונפורמציה מבנית שינוי חלבון או חלבון/ליגנד מחייב35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS משתמשת ההחלפה רציף של עמוד השדרה hydrogens על ידי דאוטריום, הקצב של אשר מושפעת הסביבה כימי, נגישות, ואת קוולנטיות על קשרים הדדיים56. HDX-MS עוקב אחר תהליכים אלה exchange באמצעות בתור ממיס deuterated, בדרך כלל מים כבדים (D2O), ומאפשר מדידה המבוססת על שינוי משקל מולקולרי בעקבות המימן דאוטריום exchange. איטי שערי החליפין מימן-דאוטריום עלולה לגרום hydrogens השתתפות קשרי מימן, או, בפשטות, מעצורים הסטריים, אשר מציינת שינויים המקומיות מבנה57. שינויים על איגוד ליגנד או שינויים post-translational יכול גם להוביל הבדלים הסביבה מימן, עם איגוד וכתוצאה מכך הבדלים מימן-דאוטריום exchange (HDX) המחירים46,53.

אנחנו להחיל טכנולוגיה זו לאזורים 1) מפה Hsp33 אשר במהירות נפרשים על חמצון, שמוביל ההפעלה של Hsp33, ו- 2) הגדרת ממשק איגוד פוטנציאלי של Hsp33 עם סובסטרט misfolded באורך מלא שלו, ציטרט סינתאז (CS)38.

ניתן להחיל בשיטות המתוארות בכתב יד זה ללמוד בחריגי חמצון-חיזור של חלבונים במבחנה, צבירת נגד פעילות ואת התפקיד של שינויים מבניים (אם בכלל) בתפקוד החלבון. מתודולוגיות אלה יכול להיות בקלות להתאים מגוון מערכות ביולוגיות ומוחלים במעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת חלבונים מופחת באופן מלא, מלא מחומצנת

  1. הכנה של חלבון מלא מופחת
    הערה: כאן, אנו מתארים ההפחתה של חלבונים המכילים אבץ ושימוש ZnCl2 פתרון כדי לשחזר את המצב חלבון Zn-שילב, מופחתת. הפתרון2 ZnCl ניתן להחליפם או שנמחקו. שימו לב כי הזמן ואת הטמפרטורה של תהליך הפחתת תלוי חלבון יציבות ואת תפקוד, ולכן הוא ספציפי לכל חלבון.
    1. להפשיר את הדגימה חלבון על הקרח ולסובב את זה עד אגרגטים הסרה. דגירה המדגם לפחות 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ מ DTT ו- 20 מיקרומטר ZnCl2 (עד ל-70% ריכוז חלבון).
      הערה: הטמפרטורה בשלב זה היא תלוית חלבון, צריך להיות מותאם ליציבות חלבון.
    2. הסר DTT תוך שימוש בעמודות desalting.
      הערה: שם הם שונים desalting עמודות זמינות. פרוטוקול שלהלן מתאר את ההליך באמצעות עמודות ספציפיות desalting (ראה טבלה של חומרים). לפני השימוש עמודות desalting אחרות, אנו ממליצים על בחינת היעילות שלהם בטיפולים להסרת, החלבון DTT, מאז כמה עמודות desalting חלקית עלולה לספוג את החלבון עניין.
      1. Equilibrate את העמודה עם אשלגן פוספט (KPi) מאגר (40 מ מ, pH 7.5) על ידי ממלא את עמודת לחלוטין עם המאגר ולתת המאגר לטפטף החוצה. חזור על תהליך זה, 2 x.
      2. להסיר את המסנן דיסק לבן בעמודה על-ידי בעדינות דוחף אותו למטה עם פינצטה והסרה . זה הכי קל להסיר העמודה מתמלא מאגר ה-KPi. למלא את העמודה עם מאגר ה-KPi, centrifuge זה ב 1,000 x g למשך 3 דקות.
      3. להעביר את העמודה לתוך צינור נקי, להוסיף לאט את הדגימה חלבון האמצע של העמודה, centrifuge זה ב 1,000 x g למשך 2 דקות. החלבון ללא DTT הוא עכשיו הזרימה דרך.
    3. לבדוק ריכוזים שלה (למשל, להשתמש ספקטרומטר UV/Vis) ולמדוד את ספיגת ב 280 ננומטר. חשב את ריכוז חלבון באמצעות החוק של בירה.
    4. להפיץ את מחצית הדגימות החלבון לתוך aliquots. תקופת דגירה של aliquots בתנאים אנארוביים (למשל, באמצעות תא אנארובי) של 20 דקות הסרה מלאה של חמצן. לאטום את הצינורות עם הסרט פלסטיק ולאחסן את הדגימות ב-20 ° C או -80 ° C, בהתאם החלבון.
      הערה: במקום להשתמש תא אנארובי, הצינורות יכול גם להיות הבזיק בגז ארגון כדי להסיר את החמצן.
  2. הכנה של חלבון מלא מחומצנת
    הערה: מומלץ להכין דגימות חלבון מחומצן חלבונים מופחת באופן מלא (שתואר לעיל). פעולה זו תקטין את הטרוגניות בארצות חמצון של cysteines. ניתן להשתמש ריאגנטים חמצון שונים; כאן, אנו מתמקדים חמצן (H2O2).
    התראה: למנוע חמצון יתר כמו זה יכול להוביל דיסולפידי התפלגות לא רצוי חוב וחמצון בלתי הפיך של חומצות אמינו שונות, כולל ציסטאין, מתיונין, טירוזין ואחרים.
    1. לדגימת חלבונים הנותרים, הוסף 5 מ מ H2O2 (טרי מדולל), תקופת דגירה זה של h 3 ב 40 מעלות צלזיוס תוך טלטול.
      הערה: הטמפרטורה בשלב זה היא תלוית חלבון, צריך להיות מותאם ליציבות חלבון.
    2. Equilibrate את העמודה עם מאגר ה-KPi (40 מ מ, pH 7.5) על ידי ממלא את עמודת לחלוטין עם המאגר ולתת המאגר לטפטף החוצה. חזור על תהליך זה, 2 x.
    3. להסיר את המסנן דיסק לבן בעמודה על-ידי בעדינות דוחף אותו למטה עם פינצטה והסרה . זה הכי קל להסיר העמודה מתמלא מאגר ה-KPi.
    4. למלא את העמודה עם מאגר ה-KPi, centrifuge זה ב 1,000 x g למשך 3 דקות.
    5. להעביר את העמודה לתוך צינור נקי, להוסיף לאט את הדגימה חלבון מחומצן האמצע של העמודה, centrifuge זה ב 1,000 x g למשך 2 דקות; חלבון מחומצן הוא עכשיו הזרימה דרך.
    6. בדוק ריכוז חלבון כמו שלב 1.2.5, לחלק את החלבונים מחומצנת aliquots ואחסן אותם ב-20 ° C או -80 ° C, תלוית חלבון.

2. פיזור Assay צבירת אור

הערה: כל ריכוזים ב assay הזה מלווה המצע ספציפיים או, צריך להיות מכויל. כל מאגרי צריך להיות 0.22 מיקרומטר-מסוננים, כמו זה מאוד חשוב כי המאגרים חופשיים של חלקיקים כלשהם או בועות אוויר, וואקום הם נקיים וללא אבק. חשוב מאוד להשתמש קדירות להציב את cuvette קוורץ. בדוק קדירות שונים גדלים וצורות, על מנת להבטיח יעיל ערבוב של הפתרון כולו מבלי לייצר בועות אוויר בלתי רצויות. יתר על כן, ישנם flouorospectrometers שונים זמינים מעבדות ומתקני. כאן, fluorospectrometer מסוים (ראה טבלה של חומרים) היה בשימוש. מכשירים שונים יש רגישות מגוונות, מדידת מהירות, סמפלר פרמטרים. לכן, הפרמטרים מדויקת (למשל, רוחב פס פליטה ו עירור, רגישות ואחרים) צריך ניתן למטב באמצעות חלבון נוטה צבירת הידוע ואת תנאיה המתאימים. מומלץ להשתמש ציטרט סינתאז (CS) ו/או לוציפראז בשם דיאלקטריים הראשונית בריכוזים nanomolar.

  1. צבירת כימי assay
    1. הכן את המצע denatured באמצעות מיקרומטר 12 ומוכנסות CS לילה ב- 40 מ מ HEPES (pH 7.5) ו- 4.5 מ' GdnCl. על מנת לשמר את ה-pH, לפזר את GdnCl ב 40 מ מ HEPES (pH 7.5).
    2. פתח את תוכנת fluorospectrometer וללכת ומדידת זמן הקורס. קבע את הפרמטרים עבור: טמפרטורה: 25 ° C; Λem: 360; אם רוחב פס: 5 ננומטר; Λex: 360; Ex רוחב פס: 2.5 ננומטר; ומרווח נתונים: 0.5 s.
    3. הכינו את הדגימה על-ידי הוספת 1,600 µL של 40 מ מ HEPES cuvette קוורץ. להכניס את cuvette בעל מדגם ולתת את הדגימה להגיע לטמפרטורה הרצויה.
    4. הגדר את ערבוב 600 סל ד, להתחיל את המדידה עד תוכנית בסיסית היא הוקמה. לשמור את ערבוב המדד כולו.
    5. כדי למדוד את המצבור CS בהיעדרו של מלווה, ב 120 לתוך המדידה, להוסיף (בעדינות, אך במהירות) 10 µL של CS שפגע בסימני (הריכוז הסופי של 75 ננומטר). להמשיך את המידה עבור 1,200 s.
    6. כדי למדוד את המצבור CS בנוכחות Hsp33, 60 s לתוך המדידה, להוסיף Hsp33 (הריכוז הסופי של 300 ננומטר). לאחר 60 נוספים s, להוסיף 10 µL של CS שפגע בסימני (הריכוז הסופי של 75 ננומטר). להמשיך את המידה עבור 1,200 s.
      הערה: בעת הוספת את המצע או המלווה, על מנת למנוע הכנסה של בועות, השתמש פיפטה של 10-µL.
  2. צבירת תרמי assay
    הערה: הטמפרטורה עבור וזמינותו צבירת התרמי תלויה יציבות החלבון, צריך להיות מותאם כדי כל חלבון באופן עצמאי.
    1. פתח את תוכנת fluorospectrometer וללכת ומדידת זמן הקורס. הגדר את פרמטרי כדלקמן: טמפרטורה: 43 ° C; Λem: 360; פליטה רוחב פס: 5 ננומטר; Λex: 360; עירור רוחב פס: 2.5 ננומטר; ומרווח נתונים: 0.5 s.
    2. הכינו את הדגימה על-ידי הוספת µL 1600 מ מ 40 ומחוממת מראש HEPES cuvette קוורץ. להכניס את cuvette בעל מדגם ולתת את הדגימה להגיע 43 ° C.
    3. הגדר את ערבוב 600 סל ד, להתחיל את המדידה עד תוכנית בסיסית היא הוקמה. לשמור את ערבוב המדד כולו.
    4. כדי למדוד את המצבור CS בהיעדרו של מלווה, ב 120 לתוך המדידה, בעדינות מוסיפים למדעי המחשב (הריכוז הסופי של 125 ננומטר) ולהמשיך מדידה עבור 1,200 s.
    5. כדי למדוד את המצבור CS בנוכחות Hsp33, 60 s לתוך המדידה, להוסיף Hsp33 (הריכוז הסופי של 600 ננומטר). לאחר 60 נוספים s, להוסיף למדעי המחשב (הריכוז הסופי של 125 ננומטר). להמשיך את המידה עבור 1,200 s.
      הערה: בעת הוספת את המצע או המלווה, למנוע את ההוספה של בועות.
  3. ניתוח נתונים הסרת רעש על ידי Kfits
    הערה: Kfits הינה זמינה במלון השימוש Kfits בעבר תואר ב. רימון ואח 45
    1. להעלות את קובץ הנתונים.
      הערה: הקלט הוא התוצאות raw של פיזור אור מדידות בתבנית מופרדת באמצעות פסיקים או טאבים טקסטואליים.
    2. כדי להסיר כל רעש, לבחור ניתוח הפרמטרים. שימוש אוטומטי המודל הטוב ביותר (מומלץ), סמן את הדגל רעש הוא תמיד מעל האות .
    3. להסיר באופן ידני ליניאריים ברור באמצעות הקווים מתכווננת ירוק ואדום; שלב זה לסנן את הרעש מעל הקו הירוק, מתחת לקו האדום.
    4. להגדיר את התוכנית הבסיסית העקומה מתאים. לאחר החלת את סף הרעש, להוריד את הנתונים מעובדים.

3. מימן-דאוטריום Exchange ספקטרומטר מסה

  1. הכנת מאגרי ודוגמאות חלבון (מתחם Hsp33 ו- Hsp33-CS)
    1. לדלל את דגימות חלבון ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל במאגר 25 מ מ טריס-HCl ב- pH 7.5 ולהעביר אותם ל 1.5-mL בקבוקונים.
    2. הכן לסובסטרט חלבון דוגמאות מורכבות על ידי המקננת Hsp33 עם CS-, ביחס לגובהה-43 מעלות צלזיוס.
      1. הוסף CS בצורה הדרגתיים כדי למנוע כל צבירה מהירה ולהבטיח איגוד פורה בין Hsp33 של CS תרמית פרש.
      2. להשתמש לפחות ארבעה צעדים (כלומר, בכל פעם להוסיף רבע נפח סופי) דגירה בדגימות למשך 15 דקות לאחר כל תוספת כדי לאפשר הגנה למדעי המחשב על-ידי Hsp33.
    3. להסיר כל אגרגטים באמצעות צנטריפוגה 30-מין ב g 16,000 x-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: מתחמי לסובסטרט חלבון חדש חייב להיות מוכן טריים. תוספת המצע צריך להיעשות בהדרגה; אחרת, צבירת תתרחש. ריכוז טמפרטורה המצע, המצע הם חלבונים ספציפיים.
    4. להכין מאגר H (25 מ"מ. טריס-HCl, pH 7.5), המשמש כאמצעי שליטה deuteration, מאגר D (25 מ מ טריס-DCl, pH 7.09), המהווה מאגר deuteration. גם להכין מאגר quenching טריים (150 מ מ TCEP, GdnCl 3 מ', 0.1% חומצה פורמית).
      הערה: המאגר quenching צריך להיות אופטימיזציה עבור החלבון עניין על מנת לקבל את כיסוי מקסימלי רצף לאחר העיכול פפסין.
    5. להעביר את כל מאגרי ודוגמאות לתוך מבחנות, ומניחים במגשים נאותה. להחזיק מאגרי H ו- D 25 ° c (מגש 25 ° C); מצד שני, החזק את הדגימות ואת מאגר שכבתה ב 0 - 2 ° C (מגש 0 ° C). למקם את הדגימות מוסיף זכוכית 150-µL (ראה טבלה של חומרים) תחילה, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך מבחנות.
  2. הכנה של המכשיר
    הערה: ספקטרומטר מסה מגיע עם שני מלווים תוכנות: אחד שולט המשאבות, ושולט השני של ספקטרומטר מסה (עיין טבלה של חומרים). השלבים הבאים יתוארו באמצעות אלה שתי תוכנות.
    1. להפעיל באופן ידני כל יחידות הקירור. לאחר כל מערכות קירור מגיעים לטמפרטורה היעד שלהם, להחליף באופן ידני על ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) והן משאבות טעינה.
      הערה: במקרה שלנו, אלה מורכבות של שתי אמבטיות לקירור וארגז קירור (המכיל את המלכודת והעמודות אנליטית). יחידת קירור אחת מתקררת המגש ב-0 מעלות צלזיוס, ואילו השני שומר את המגש 25 ° c; הטמפרטורה של תיבת הקירור היא 1-2 מעלות צלזיוס.
    2. לפתוח את התוכנה השולטת הן משאבות, כמו גם את התוכנה השולטת על ספקטרומטר מסה; ודא כי MS הוא בכוננות.
    3. נתק את השסתום עודפים HPLC ממקור MS, לשטוף את המערכת בהתחלה עם פתרון "שואב טריפל" (1% חומצה פורמית, 33% acetonitrile, 33% אלכוהול איזופרופיל, 33% מתנול) ולאחר מכן עם מאגר B (80% acetonitrile, 0.1% חומצה פורמית) ואני סוף סוף עם מאגר של (0.1% חומצה פורמית, pH 2.25), ולאחר מכן להוסיף את העמודה פפסין לתוך המערכת. אם שינוי מאגרים, ודא לטהר שתי משאבות לפני שתמשיך.
    4. להבטיח כי קצב הזרימה עבור שתי משאבות 0.1 mL/min וכי הלחץ יציב.
    5. לאחר שטיפת המערכת עם תזרים קבוע, יציב, להכניס לשקע HPLC המקור MS, להפעיל את MS.
  3. ספקטרומטר מסה פרמטרים
    1. הגדר את יינון פפטיד כדי ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) ב 175 ° C, זרימת הגז נדן בגיל 17, הזוהר גז aux-2, ואת המתח ריסוס ב- 4.5 kV (משלים איור 1).
    2. הגדר את פרמטרי כדלקמן על הדגימות שאינם deuterated.
      1. קבע את הפרמטרים: טווח סריקה מ/z 300-1500; רזולוציה עד 70,000; היעד בקרת הגברה אוטומטית (קובי) 106; והפעם מקסימום הזרקה (IT) ב-100 מילישניות.
        הערה: היונים האינטנסיבי ביותר 5 עם תשלום הברית בין +2 +6 (שלהם בעוצמה גבוהה יותר 1.3 x 104) חלון דינמי של 30 ב יהיה מבודד.
      2. לבצע את הפיצול יון על ידי אנרגיה גבוהה collisional דיסוציאציה (HCD) בתא מרובות-התנגשות עם אנרגיית התנגשות מנורמל (פליטות) שווה ל- 28. לזהות שבר יונים על-ידי טנדם MS ברזולוציה של 35,000, AGC יעד של 105, מקסימום זה 60 ms, ועל חלון בידוד של 2.0 מ'/z.
    3. עבור הדגימות deuterated, מעסיקים MS1 רק עם רזולוציה גבוהה יותר של 140,000 ועם פרמטרים דומה אחרת.
  4. עורכים את הניסוי
    1. להגדיר את המגשים באופן הבא.
      1. למקם את המאגר H ו- D מגש 25 ° C ולאחר מכן מקם את הדגימות ואת מאגר שכבתה במגש 0 ° צלזיוס.
      2. X המקום ריק בקבוקונים, מיושר בשני המגשים, שבו X = מספר דוגמאות x מספר נקודות זמן.
        הערה: במגש 25 ° C, הבקבוקונים ריק לשמש התגובה בקבוקונים, במגש 0 ° צלזיוס, הם משמשים שכבתה בקבוקונים.
      3. כל הבקבוקונים ריק מכיל מוסף כוס ריקה; ביטול והחלף אמר הכנס בין ניסויים.
        הערה: כדי להפעיל את הניסוי HDX בדרך היעילה ביותר ולגזול לפחות, תוכנה המאפשרת דגימות להתנהל בו זמנית (משלים איור 2) שימש. השלבים הבאים יתוארו שימוש בתוכנה זו.
    2. פתח את התוכנה. הגדר את פרמטרי תוכנית כדי לבצע את הפעולות הבאות.
      1. תקופת דגירה כל דגימה (5 µL) עם µL 45 מאגר D של מספר דקות, בהתאם לנקודות זמן שנבחר (למשל, 1, 3, 18, 40 ו- 100 דקות) ב 25 º C. דגירה המדגם הלא-deuterated עם µL 45 מאגר H במקום.
      2. מיד לאחר הדגירה, לערבב 50 µL של חלבון deuterated לתוך µL 50 מאגר שכבתה קר כקרח, להזריק אותם לתוך עמודת פפסין קיבוע (20 מ מ אורך, 2.0 מ מ קוטר).
      3. Elute כל פפטידים מן העמודה פפסין לתוך העמודה מראש על ידי שטיפה עם מאגר A עבור 6 דקות בקצב של 50 לדקה µL לשמור על מאגר A בתיבת קירור ב 0 º C.
      4. Elute של פפטידים מחוץ העמודה מראש לתוך העמודה אנליטי סי18 (עמודה סי18, 130, 1.7 מיקרומטר, 2.1 מ מ x 50 מ מ, שמרו ב-0 מעלות צלזיוס) ולהפריד ביניהם על-ידי החלת מעבר צבע ליניארי של acetonitrile-µL 100/הפעלה מינימלית המילוי ההדרגתי acetonitrile באמצעות acetonitrile 100% כמו מאגר B : 7 דקות ב-2%, 7 דקות ב- 10-30%, מינימום 2.5 ב- 30-90%, מינימום 1.5 ב- 90%, מעבר מהיר עבור 1 דקה 90-8%, ואת סוף סוף equilibrate את העמודה עבור 4 דקות ב-2%.
    3. לבנות רצף הפעלה (ראו משלים איור 2): הזן כל נקודות זמן, לדוגמה שמות, ו במיקומים המגשים, כמו גם את מאגר שמות ומקומות.
      הערה: התוכנה מאפשרת את היישור של כל הזמנים פועל שונים לתוך תוכנית הפועלת מספר דגימות בבת אחת, ביעילות הפחתת פועל פעמים.
  5. ניתוח נתונים
    הערה: אנו עובדים עם מספר תוכנות בתהליך של ניתוח נתונים, כולל פרוטאום Discoverer MaxQuant (תוכנה חופשית) עבור פפטיד זיהוי וניתוח של רצף כיסוי, כמו גם HDX עבודה, שעליו מונחים, תוכנה חופשית המאפשרת הניתוח של שיתוף דאוטריום בחלבונים, השוואה בין המחירים HDX בין קבוצות שונות של ניסויים. השלבים הבאים יתוארו באמצעות תוכנות אלה.
    1. לנתח את הכיסוי פפטיד של המדגם על-ידי הפעלת הדגימות deuterated ללא שליטה דרך התוכנה (משלים איור 3). להגדיר את התוכנה באמצעות הפרמטרים הבאים.
      1. קליב שימוש בשיטת Sequest HT עם לא-אנזים (לא ספציפי). חפש פפטידים של חומצות אמינו 4-144 עם סובלנות המונית של 7 עמודים לדקה ו 0.5 למבשר של יון, שבר. לאפשר חמצון מתיונין דינמי.
      2. צור מסד נתונים של החלבון, שדרכו התוכנה ניתן לקבוע את הכיסוי פפטיד. ייצוא של פפטידים מזוהה בפורמט טקסטואלי.
    2. לנתח את התוצאות deuterated באמצעות תוכנה חופשית של עבודה, שעליו מונחים HDX58.
      1. לפתוח את עורך חלבון ולהגדיר את החלבון על-ידי הוספת את הקובץ כיסוי חלבון רצף ופפטיד.
      2. בשלב הבא, לפתוח את עורך הגדרת הניסוי אשף והזן כל הכניסות המבוקש.
        הערה: התוכנית דורשת מספר דוגמאות, מספר נקודות זמן, מספר משכפל, את ערך ה-pH של המאגרים, הטמפרטורה.
      3. לבסוף, קלט את הפרמטרים לגבי ספקטרומטר מסה בשימוש, לאחר מכן התוכנית יוצרת רשימה של פפטידים שזוהו.
        הערה: התוכנה מזהה את פפטידים "HDX", בודק את האיזוטופ אשכולות ומדגים פריט חזותי ברור של deuteration הדגימות.
  6. מסדי נתונים
    1. תווית האזורים עם ספיגת deuteration משלים על המבנה באמצעות התוכנה PyMol או תוכנות הדמיה אחרות.
    2. להציג את רמות ספיגת דאוטריום במקום הערכים B-פקטור.
      הערה: ניתן למצוא הדרכה בסיסית ב- https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שתי השיטות הציג מאפשרים לעקוב אחר פעילות קינטי של הדינמיקה של חלבון אינטראקציות בין מלווה את המצע שלה. יתר על כן, הפרוטוקול הפחתת-חמצון מאפשר הכנת מלווה מופחת באופן מלא, מלא מחמצנים, נותן הבנה מעמיקה יותר של מנגנון ההפעלה של משגיחים המתוסבכים תלויי-חמצון-חיזור.

ראשית, השתמשנו פיזור אור על מנת לבחון את הפעילות תלויי-חמצון-חיזור של המלווה. פיזור אור בוצעה על חלבון CS denatured כימית, תרמית בנוכחות מחמצנים (פעיל) או מופחתת (לא פעיל) המלווה (איור 1). דנטורציה כימי מוביל צבירה בפקולטה למדעי המחשב מהיר שנגזרות את refolding של מלא denaturized חלבון בתנאים מאגר שלילי. מצד שני, צבירה תרמי-induced נובעת התגלגלות האיטי יחסית של המצע מקופל באופן מקורי. לכן, אלה סוגים שונים של תהליכי צבירת משתנים בפרמטרים קינטי שלהם. יתר על כן, מלווים שונים יכול להשתנות ביכולתם למנוע הצבירה של המצע אותו במצבי צבירה שונים.

שתי צורות של דנטורציה, התוספת של תחמוצת Hsp33 על שן טוחנת יחס של 1:4 (CS: Hsp33) ביטל מצבור, מנמיך את הקריאות nm 360 לערכים זניח לחלוטין. הנוכחות של Hsp33 מופחת, מצד שני, לא היתה השפעה על יציבות CS ונתן מעגל צבירת דומה לזו זוהה בהיעדר מלווה (איור 1). התוצאות נותחו וניקה מרעש רקע, שימוש Kfits, כמו סכמטי המתואר באיור2.

קווי המתאר של הטכניקה HDX-MS מתחיל עם הדגירה של המלווה עם תחמוצת דאוטריום, ואחריו שכבתה, עיכול, ולהחליף סוף סוף ניתוח MS ומימן-דאוטריום פרופיל (איור 3). במהלך HDX-MS, המלווה נדגרה על המגש 25 ° c במאגר המכיל O D2. כעבור זמן דגירה מסוימת בשליטת הדגימה טיפול מערכת רובוטית, הפתרון חלבון הועבר הפתרון quenching, חומצי, denaturing, על המגש ב 0 º C. חומציות נמוכה והטמפרטורה נמוכה מאט את ההחלפה מימן ושומר את רמות deuteration של כל hydrogens אמיד, ואילו הכימיקל denaturing מתגלה החלבון, הפיכתה להתעכל כראוי. מערכת רובוטית מעביר את הדגימה ממגש ב-0 מעלות צלזיוס לתיבה קירור לאן זורם לתוך העמודה עיכול פפסין באינטרנט. מיד לאחר עיכול חלבון, פפטידים להמשיך העמודה סי18 מלכודת עבור desalting והסרה של להחלפה מהירה D2O (בעיקר ממוקם על האטומים שרשרת צד) ואז מופרדים באמצעות העמודה סי18 ואת נותחה באמצעות מסה מסות. הזרם מדגם נשלטת על ידי מערכת שסתום 2, 1) מבטיחה את ההפרדה של פפסין, סי18 עמודה מאגרי כדי למנוע איון של פפסין על ידי ממיסים אורגניים, 2) מאפשר את desalting קצרה של פפטידים כדי להסיר במהירות להחלפה D2O מולקולות ומלח (איור 4).

לאחר הניתוח חישובית, אנו מקבלים פרופיל deuteration עבור כל פפטיד, מציג שינוי במסה כפונקציה של זמן הדגירה D2O. התוכנה HDX עבודה, שעליו מונחים מאפשר השוואת משכפל ניסיוני על מנת ליצור ניתוחים סטטיסטיים של כל תנאי (למשל, של המלווה פעיל בטופס לא מאוגד). השלב הבא הוא השוואה של עקומות deuteration בין מדגמים שונים; לדוגמה, מלווה מאוגד, על המלווה לא מאוגד. השוואות אלה של מדינות שונות המלווה יכול לחשוף את לפליטת מבניים המלוות המצע איגוד. שאריות כי התערוכה החלפה איטי במדינה מאוגד סביר אינטראקציה עם שותף מחייב. חשוב לציין כי שערי חליפין מימן ירד-דאוטריום באפשרותך גם לציין refolding של אזור מסוים על איגוד ללא אינטראקציה ישירה בפועל עם המצע (איור 5א). התוכנה HDX עבודה, שעליו מונחים מאפשרת הבחינה של התוצאות בתצוגת "ההפרעות" על-ידי הצגה של deuteration עם שגיאה סטנדרטית על סיקור החלבון כל.

במקרה זה, HDX-MS שימש כדי להשוות את תבנית deuteration בין המאוגדים והלא מאוגדים המלווה Hsp33 את המצע שלה במדעי המחשב. התוצאות לחשוף אתר הלקוח-אינטראקציה בתוך תחום מתג חמצון-חיזור C-מסוף של המלווה (איור 5B). בזמן מופחת, Hsp33 יש מבנה מסודר לגמרי, שבו קבורים האתרים אינטראקציה. Hsp33 מאבד את המבנה שלו והופך להיות פונקציונלי כאשר היא חשה לחץ חימצוני; לפיכך, השווינו את Hsp33 מופחת ו מחמצנים בתנאים המאוגדים והלא מאוגדים (איור 5C). התוצאות מציגות בעוד Hsp33 מופחת, אם מאוגדים או לא מאוגדים, מייצרת עקומות פפטיד דומה, Hsp33 מחמצנים הצגת הבדל משמעותי. הדגימות Hsp33 מחמצנים להראות הבדל deuteration 30% בין המלווה המאוגדים והלא מאוגדים, עם אזורים מסוימים של החלבון מאוגד המציין של מכשול allosteric. הניתוח של פפטידים נוספים מ- N-מסוף ואת האזורים מקשר thermobile מוצגים משלים באיור3.

Figure 1
איור 1 . צבירת ניתוח על ידי פיזור אור. המצבור של CS מבחינה כימית, תרמית שפגע בסימני נוטרו בנוכחות מחומצנת Hsp33 (אדום), מופחת Hsp33 (כחול), או בהיעדר חלבון סוכך (שחור). פיזור אור ב 360 nm נוטרו תמורת 1,200 ס' (א) במהלך צבירה כימי, בהיעדרו של מלווה או בנוכחות של Hsp33 מופחת, CS המצטברים במהירות, להגיע של s מישור וכ-300 לתוך המדידה. (B) במהלך צבירה תרמי, CS מצטברים בהדרגה בהיעדרו של מלווה או בנוכחות של Hsp33 מופחת. בשני מבחני, הנוכחות של Hsp33 מחמצנים לחלוטין ביטל צבירה, כמו הודגם על ידי קריאות 360-nm זניח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . הסרת רעש וניתוח נתונים באמצעות Kfits. לוח זה מציג סכימה סיכום ניתוח נתונים הסרת רעש על-ידי הכלי Kfits , כפי שמתואר בטקסט, רימון. et al. 45. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . זרימת העבודה של המתודולוגיה HDX-MS- HDX-MS מעסיקה ממיסים deuterated כדי לקבוע את הסביבה הכימית של hydrogens אמיד, מפוזרים בצורה אחידה לאורך עמוד השדרה של החלבון. החלבון עניין מודגרת בתוך מאגר deuterating בצורתו הטבעית לתקופות זמן מסוים, ולאחר מכן ההחלפה מימן-דאוטריום הוא מתרצה לתנאים חומציים בטמפרטורה נמוכה. החלבון הוא מתעכל על ידי יציבה אנזים בתנאים חומציים, כגון פפסין. לאחר מכן, פפטידים desalted, מופרדים בתוך זמן קצר כדי למנוע החלפת גב. לבסוף פפטידים מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסה, תפיסה דאוטריום מוערך על ידי תוכנה ניתוח, לדוגמה על-ידי תוכנה חופשית עבודה, שעליו מונחים HDX 58. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. מרכיבי מערכת HDX-MS אוטומטי לחלוטין. (א) זה תרשים סכמטי של HDX-MS מייצג את כל החלקים של המערכת: המשאבה הטעינה ואת הזרם מאגר hplc, קורס בקרת משאבת המדגם להעביר בתוך המערכת. מערכת רובוטית מכיל שני מזרקים, מגשים בהם נעשה שימוש כדי להכין את הדגימה deuterated ולהעביר את החלבונים העיכול בעזרת טור דרך השסתום קלט של תיבת קירור (LC תא). לאחר מכן, פפטידים מתעכל למזהים ייחודיים של העמודות מלכודת והפרדה סי18, שהופרדו לאחר מכן, להפנות את ספקטרומטר מסה. (B) מציג לוח זה הגדרת מערכת HDX בפועל נוצר במעבדה. (ג) לוח זה מציג מצגת סכמטי של המקוון-העיכול ותצורת פפטיד ההפרדה fluidic. מערכת העיכול והפרדה יש שסתום אחד כל אשר ניתן להחליף בין מצבי עומס , להזריק . השסתום הראשונה (משמאל) מחובר ליציאת ה-הזרקת ונשלט על-ידי המשאבה הטעינה, בימוי דגימות לתוך העמודה פפסין באמצעות המאגר חומצי ללא כל הממס האורגני אשר יכולים לגרום נזק השרף פפסין. המדגם מועבר השסתום לתוך העמודה מלכודת כדי להסיר שאריות של דאוטריום, כמו גם מהר החליפו אטומי deuterated (בעיקר של הרשתות בצד). לאחר שטיפה קצרה של 1-2 דקות בעמודה מלכודת, השסתום משתנה מצב שלה כדי לטעון , המדגם נשטף לתוך העמודה ההפרדה סי18 באמצעות המשאבה HPLC עם הגדלת ריכוזים של acetonitrile. המדגם מועבר את ספקטרומטר מסה עבור ניתוח המוני. אורך הצינורות מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . תוצאות HDX-MS- (א) התוצאות מוצגות כאחוזים deuteration לאורך זמן לכל חלבון שבר, שנוצר על ידי התוכנה HDX עבודה, שעליו מונחים . כל גרף מדגם חלבון, גם מחומצן או מופחתת, ומשווה בין דגימות המאוגדים והלא מאוגדים. השברים פפטיד המוצגות כאן הן את פפטיד ש-YVVITITPSEG הנמצאות באזור מקשר את פפטיד ש-LQVMPAQNAQQDDFD למצוא קצה קרבוקסילי. (B) התוצאות הסופיות, הציג כמו ההבדל deuteration בין מתחמי המאוגדים והלא מאוגדים, הצג את ההפרעות לכל חומצה אמינית. (ג) A מודל מבנית של המלווה Hsp33 מציג את ההבדלים ספיגת deuteration ברחבי מקשר C-מסוף אזורים לא יציב. לוח זה נוצר באמצעות התוכנה PyMol . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 1
משלים איור 1. הממשק של התוכנית פועלת ספקטרומטר מסה. התוכנית משמשת כדי למטב ולהגדיר פרמטרים של פעולות שירות ספקטרומטר מסה המשמש את הניסוי HDX. ניתן לשמור את הפרמטרים שיטה (בחלונית השמאלית) בשיטה שלו, כך מזוהה על-ידי תוכניות אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 2
2 איור משלים. איור זה מציג צילום מסך של התוכנה המשמש פלטפורמת האינטגרציה של דגימה רובוטית מסירת המערכת ועל מערכת MS-LC. התוכנה מיטוב הזמן רץ על-ידי התזמון של הניסוי HDX, בעקבות זמן הדגירה מוגדר במאגר deuterated (חיצים כחולים). לדוגמה, מעל היא דיאגרמה של ריצות 17 של שני ניתוחים replicative של variant Hsp33 סטיל, מודגרות במאגר deuterated לזמנים שונים, הנע בין 0 - 100 מינימלית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Supplementary Figure 3
משלים איור 3. זה איור מציג ניתוח של ספיגת דאוטריום של פפטידים Hsp33 מספר ממשתני Hsp33 שונים, בשם PGBD, REV34. החלקות להדגים שינויים ספיגת דאוטריום באותו האזור ב- Hsp33 לא מאוגדים (אדום) ובמדינות מאוגד (כחול). פפטידים מאזור N-מסוף מציגים הבדל משמעותי במחירי HDX, בעוד חלקים מהאזור מקשר להראות ירידה משמעותית במחירי HDX על האינטראקציה עם המצע פרש, ציטרט סינתאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בנייר זה, סיפקנו פרוטוקולים עבור הניתוח של פעילות המלווה תלוי-חמצון-חיזור, אפיון שינויים מבניים על הכריכה של חלבון הלקוח. אלה משלימים מתודולוגיות להגדיר מתחמי המלווה-המצע פוטנציאליים ולנתח אתרים אינטראקציה פוטנציאלית.

כאן, אנחנו מוחלים פרוטוקולים אלה עבור אפיון קומפלקס בין מוסדר חמצון-חיזור המלווה Hsp33 עם מצע המלווה למד היטב CS. הצגנו שני סוגים שונים של ניתוחים צבירת חלבון, אשר נבדלים מדינתם קינטי, הראשונית: במהלך דנטורציה כימי, המצע מתחיל תהליך התגלגלות שלו מהטופס denatured, בזמן צבירה תרמי, התגלגלות מאותחלת מהטופס מקורית של המצע.

מדידות אור-פיזור הם כלי שימושי כדי לנטר את החלק היחסי של חלבון מצבור. בעוד אנחנו השתמש בשיטה זו כדי לקבוע את מצב פעיל של המלווה, זה עוד יותר ניתן ללמוד תנאי צבירת כללי, כדי להשוות את היציבות של חלבונים שונים, או ללמוד חמוד מוטציות הן את המצע והן המלווה.

למרות פשטותו, שיטת פיזור אור עשוי לייצר נתונים רועשת, עם מספר ליניאריים. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו את התוכנה Kfits שתוארו לעיל. תוכנת Kfits מאפשרת לך בפשטות, במהירות להסיר כמויות גדולות של נתונים רועשת, כמו גם לחשב את הפרמטרים קינטי עקומת פיזור אור. Kfits אינה מוגבלת צבירת חלבון ולא ניתן להחיל על כל סוג של מדידות קינטי.

כך, למתודולוגיות המתוארים כאן הם פשוט, קל לביצוע, לא גוזלת זמן. הם יכולים להחיל על מלווים מולקולרי שונה, המאפשר את התלות חמצון-חיזור להיבדק תוך כמה ימים. יתר על כן, הפעילות האנטי-צבירה של מלווים תלויים אחרים, שאינם חמצון-חיזור שניתן להעריך באמצעות הפרוטוקולים המתואר של פיזור אור ו- Kfits. חשוב לציין כי פרמטרים שונים, כגון טמפרטורה, ריכוז חלבון, מדידת זמן צריך להיות מותאם למערכת כל חלבון באופן עצמאי.

על מנת לקבל מידע מבניים המסדירים מלווה עובד מחזור, הצגנו את המתודולוגיה HDX-MS. בניגוד ההליך פיזור אור, היא טכנולוגיה מורכבת יותר, דורשת מכשור ספציפיים, לרבות ספקטרומטר מסה, רצוי, מערכת רובוטית עבור הכנת המדגם. עם זאת, הגדרה זו ניתן להקים, גם ללא מערכת רובוטית, במתקן קיים. ברגע זה הוא הוקם, בהליך פשוט יחסית ומאפשר הניתוח של קומפלקסים חלבון מאתגר אשר עשוי להיות unreached על ידי מתודולוגיות ברזולוציה גבוהה (למשל, רנטגן ו- NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים הם אסיר תודה מיטל להריץ מתקפה לדיונים מועיל שלה קריטי הקריאה של המאמר, ואת פטריק גריפין, חברי המעבדה שלו לסיוע שלהם ללא הגבלה בזמן הקמת פלטפורמה ניתוח HDX. המחברים מודים על קרן גרמניה-ישראל (I-2332-1149.9 2012), הקרן הדו-לאומית למדע (2015056), מארי קירי אינטגרציה המענק (618806), הקרן הלאומית למדע (1765/13 ו- 2629/16), ואת המדע הגבול האנושי תוכנית (CDA00064/2014) לתמיכה הפיננסית שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292, (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417, (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98, (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25, (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44, (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32, (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12, (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20, (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18, (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19, (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23, (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42, (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82, (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427, (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17, (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291, (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291, (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96, (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56, (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280, (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51, (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427, (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27, (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429, (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281, (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292, (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148, (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135, (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275, (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14, (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285, (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24, (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34, (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24, (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24, (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142, (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291, (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56, (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, (9), 1512-1521 (2012).
הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).More

Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter