Summary
生物がその有効期間中に発生する最も困難なストレス条件の 1 つは酸化物質の蓄積を含みます。酸化ストレス時に細胞は分子シャペロンに大きく依存します。HDX MS を用いたシャペロン機能を支配する構造の変更を監視する活動を調査、レドックス制御抗凝集、同様に使用するメソッドを紹介します。
Abstract
生きている有機体は定期的に温度、pH、活性酸素種の蓄積の変化など、ライフ サイクルの間に変動環境に対処する必要があります。これらの変動と広範なタンパク質を展開、集計につながることができます細胞死。したがって、細胞は、ストレス条件の中に「健康」のプロテオームを維持する分子シャペロンの動的およびストレス固有ネットワークを進化してきました。ATP に依存しないシャペロンは、ストレス依存的蛋白質の集合からの保護の最初のライン防衛分子となる分子シャペロンの 1 つの主要なクラスを構成します。これらのシャペロンが共通の機能の 1 つストレス固有活性化、認識、および誤って折りたたまれたクライアントのリリースのための可塑性を利用できることです。
本稿で我々 はそのようなの 1 つの本質的に乱れたシャペロン、タンパク質を酸化ストレス時に集計対象を保護する細菌酸化還元制御 Hsp33 の構造と機能解析に焦点を当てます。ここでは、その活動の基になるしてさまざまな技法、シャペロンの構造変化をマッピングするためだけでなく、酸化還元規制シャペロン活性を研究するためのツールボックスを提示します。具体的には、我々 はシャペロン抗凝集活性の in vitroの程度に焦点を当て、光散乱法を用いた解析に続いて完全還元と酸化型タンパク質の調製を含むワークフローを説明します、抗凝集活性とそのキネティクス。凝集アッセイ中に蓄積された頻繁に外れ値を克服するためにKfits、速度論的測定の容易な処理を可能にする新しいグラフィカル ツールの使用方法をについて説明します。このツールは、外れ値を削除すると、速度論的パラメーターを調整運動測定の他のタイプに簡単に適用できます。タンパク質の構造と機能の相関、するセットアップとシャペロンの構造変化のマッピングを可能にする水素重水素交換質量分析、構造の質量分析技術のワークフローについて述べるとHsp33 活動のさまざまな段階での基板。同様の手法は、他のタンパク質とタンパク質-リガンド相互作用に適用できます。
Introduction
細胞が活性酸素種 (ROS) 呼吸1,2タンパク質と脂質の酸化の3、4、および追加のプロセス5の副産物として生産の蓄積を頻繁に遭遇します。 6,7。ROS の細胞シグナリング8,9と免疫応答10など多様な生物学的プロセスに有益な役割にもかかわらず活性酸素産生とその解毒の間の不均衡が生じる、酸化につながる7を強調します。ROS の生物学的ターゲットには、タンパク質、脂質、核酸を酸化、構造と機能に影響を与えるが。したがって、細胞のオキシダントの蓄積が強く癌9,11, 炎症12,13, と高齢化14,を含む病態の多様な範囲にリンクします。15発症し、アルツハイマー病、パーキンソン病のなどの神経変性疾患の進行と ALS 疾患16,17,18に関与することがわかったとします。
新しく合成と成熟の両方のタンパク質は、タンパク質構造と機能19,20を形作る彼らの側鎖の潜在的に有害な変更により酸化に敏感。したがって、酸化ストレスは、通常、広範なタンパク質不活性化、フォールディング、集約、最終的に細胞死につながるに します。クライアントが誤って折りたたまれたタンパク質21 と安定な錯体を形成する代わりに、広範な蛋白質の集合を抑制する酸化還元に依存したシャペロンを利用するタンパク質の酸化損傷の可能性に対処するエレガントな携帯電話戦略の 1 つです。 ,,2223。これらの最初のライン防衛のシャペロンは、強力な抗凝集分子24に変換する (通常のシステイン残基) サイト固有の酸化によって急速にアクティブ化されます。酸化ストレス条件25,26 中に正規の ATP 依存性シャペロンが少ない効果的な酸化ストレスは結果の呼吸阻害と細胞の ATP レベル25の減少で、以来、27。そのため、ATP に依存しない付き添いのレドックス活性化再生細菌や真核生物におけるオキシダント濃度の蓄積に蛋白質の恒常性を維持する上で重要な役割 (例えば、Hsp3328細菌、Get3 ライダー29 30酵母、真核生物の進化: ペルオキシレドキシン31 )。これらのシャペロン活性は強くクライアント誤って折りたたまれたタンパク質の認識に関与する疎水性領域を明らかにするサイト固有の酸化による可逆的構造構造変化に依存します。
抗凝集機構とシャペロンによるクライアント タンパク質の認識を支配する原則の研究はシャペロン基板相互作用32,33のダイナミックなというヘテロな性質のため容易ではないです。 34,35,36,37。ただし、シャペロンの応力規制能力による抗凝集機能の理解を進めるため機会がある: 1) シャペロン、(例えば、酸化) アクティブおよびアクティブでない (例えばの 2 つの異なるフォームを取得削減)、導入または簡単に (例えば、酸化剤と還元剤)、それらの 2 に切り替えのストレス条件の除去で) 3 基板の広い範囲を持っている) によって評価される可能性がありますクライアント蛋白質と非常に安定した複合体を形成異なる構造方法論、及び 4) 基質認識とリリースでは、これらのシャペロンの大半は、折りたたみ機能を欠いている、酸化還元に依存した構造変化を介したを取り上げます。
ここでは、我々 は細菌酸化還元規制シャペロン Hsp33 の抗凝集活性、酸化誘起タンパク質凝集28に対して細菌の防衛システムの重要なコンポーネントを分析します。減少、Hsp33 はシャペロン アクティビティのないしっかりと折りたたまれた亜鉛結合タンパク質です。しかし、酸化ストレスにさらされたとき、Hsp33 は基板結合領域38,39を公開する大規模な構造変化を経る。酸化に強く行きの C 末端ドメインの 4 つの非常に節約されたシステイン残基が亜鉛イオンはリリースされた40です。これは、結果、隣接するリンカーの地域41の不安定化と C 末端ドメインの 2 つのジスルフィド結合の形成。C 末端とリンカーの地域は非常に柔軟な本質的にまたは部分的に障害として定義されています。非ストレス条件に戻り、減少、システイン、シャペロン抗凝集反応のない本来の折り畳まれた状態に戻ります。シャペロンのリフォールディングさらに展開につながり、バインドされたクライアント タンパク質リフォールディング38正規シャペロン システム DnaK/J への転送をトリガーするの不安定化します。Hsp33 の相互作用部位の分析は、Hsp33 を使用して両方をキャプチャするリンカーと N 末端ドメインの疎水性領域と同様、地域にその請求乱れたミスフォールド蛋白質クライアント防ぎ、その集計38,を示唆しています。42。 折り返しリンカー、C 末端ドメインでたたんだ状態でこれらの地域は非表示。興味深いことに、リンカーの地域は、隣接する C 末端ドメイン34の折りたたみの状態を「検出」Hsp33 の折り返しとアクティブでない状態のゲートキーパーとして機能します。(点突然変異または完全なシーケンスの摂動によってどちらか) の突然変異誘発によって不安定になり、一度 Hsp33 はその酸化還元に依存したシステイン43の酸化還元状態に関係なく恒常活性シャペロンに変換されます。
ここに示すプロトコルは、Hsp33 の酸化還元に依存したシャペロン活性と同様のマッピング活性化に伴う構造変化の監視、クライアントのタンパク質の結合を許可します。この方法論は、他のシャペロン クライアント認識モデルだけでなく、非シャペロン タンパク質-タンパク質相互作用を研究する合わせることができます。また、タンパク質酸化蛋白質の活動の潜在的な役割を明らかにする他のスイッチ酸化還元タンパク質の研究で使用ことができます完全に還元と酸化のシャペロンの準備のためのプロトコルを提案する.
具体的には、我々 はシャペロン活性の in vitro監視し、タンパク質凝集 (化学的にまたは熱) による光散乱 (LS) を使用してさまざまな種類の下でその基質特異性を定義するプロシージャを記述する、fluorospectrometer44。集計中に急速に増加の濁度による 360 nm の増加で散乱光。したがって、集計は、この波長での時間依存的に監視できます。LS は蛋白質の集合およびこうしてナノモル濃度では、異なるタンパク質凝集関連運動パラメーターの評価を有効にするを使用して興味の蛋白質の抗凝集活性テスト高速高感度法条件。さらに、ここで説明した LS プロトコルは高価な機器を必要としない、あらゆる研究室で簡単に設立することができます。
それにもかかわらず、「クリーン」の運動曲線を取得し、このような散乱ノイズと外れ値の空気の泡と大きな凝集体によって生成される数が多いため、実験から蛋白質の速度論的パラメーターを取得する非常に困難です。この障害を克服するために提案する新しいグラフィカル ツール、 Kfits45、特に蛋白質凝集反応速度データの装備別の運動測定の騒音レベルを減らすために使用します。このソフトウェアは、結果の初期評価のため予備の速度論的パラメーターを提供し、「クリーンアップ」する大量データの迅速にその動力学的性質に影響を与えることがなくユーザーをことができます。Kfitsは Python で実装されている45のオープン ソースで利用できます。
フィールドで挑戦的な質問の 1 つは、シャペロンとそのクライアントの蛋白質間相互作用部位のマッピングとシャペロンが誤って折りたたまれた基板の広い範囲を認識する方法を理解することに関係します。この問題はさらに複雑なシャペロンと集計しやすい基板上乱れた本質的に関連する非常にダイナミックな膜タンパク質を勉強します。幸いなことに、構造質量の最後の 10 年間で飛躍的に進んだし、有用なアプローチと構造の可塑性を分析してマップ残留タンパク質認識46、に関連するツールを提供してきました47,48,49紹介 1 つこのような技術水素重水素交換質量分析 (HDX-)-タンパク質修飾やタンパク質・ リガンド結合35、構造構造の残留レベル変更のマッピングが可能。 50,51,52,53,,5455。HDX MS 重水素、割合とは、化学環境、アクセシビリティ、受けますがバックボーンの水素の連続的な交換を使用して、共有結合と共有結合56。HDX MS は重水素化溶媒、一般的重水 (D2O) を使用してこれらの exchange プロセスを追跡し、測定に基づく分子水素を重水素交換に次の変更が可能します。水素重水素交換の遅い速度は、水素の水素結合に参加することや、構造57でローカルの変更を示す立体障害から単に、起因できます。リガンド結合や翻訳後修飾に伴う変化は、水素重水素交換 (HDX) 率46,53の違いの結果バインドで水素環境の違いにつながることができます。
1) マップ Hsp33 の地域に急速に酸化、Hsp33 の活性化につながる時に展開し、2) そのフルレングスの誤って折りたたまれた基板、クエン酸合成酵素 (CS)38Hsp33 の潜在的なバインディング インターフェイスを定義するこの技術を適用されます。
本稿で説明する方法は、蛋白質の生体外蛋白質機能の抗凝集活性と構造変化の役割 (存在する場合) を定義する酸化還元に依存する関数の研究に適用できます。これらの方法は、簡単に多様な生物学的システムに適応して研究室で適用できます。
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Protocol
1. 完全還元と酸化型タンパク質の作製
-
完全に低蛋白質の作製
注: ここでは、亜鉛を含むタンパク質と亜鉛含有、低蛋白状態を復元する使用 ZnCl2ソリューションの削減について述べる.ZnCl2ソリューションを交換または破棄することができます。時間と温度の還元過程のタンパク質の安定性や機能によって異なり、タンパク質ごとの仕様は、注意してください。- 氷の上の蛋白質のサンプルを解凍し、削除集計までスピンします。5 mM DTT の 37 ° C で 20 μ M ZnCl2少なくとも 1.5 h のサンプルをインキュベート (蛋白質の集中の 70% まで)。
注: この段階で温度はタンパク質に依存し、タンパク質の安定性を調整する必要があります。 - DTT 脱塩カラムを使用してを削除します。
注: が利用可能な列を脱塩が異なります。以下のプロトコルは、特定の脱塩列 (材料の表を参照) を使用して手順を説明します。脱塩の他の列を使用する前に、いくつかの脱塩の列可能性があります部分的に興味の蛋白質を吸収するので DTT の除去および蛋白質の回復の効率を調べることをお勧めします。- バッファーで列を完全に充填し、バッファーを点滴によってカリウム リン酸 (KPi) バッファー (40 mM、pH 7.5) でコラムを平衡させ。この手順 2 を繰り返します x。
- 軽くピンセットでそれを押し下げて、削除列の白いディスク フィルターを削除します。KPi のバッファー段間を削除する簡単です。KPi バッファーの列を補充し、3 分間 1,000 × g で遠心分離します。
- クリーン チューブに列を転送列の中央にゆっくりと蛋白質のサンプルを追加して、2 分間 1,000 × g で遠心分離機します。DTT 無料蛋白質はフロー ・ スルーになりました。
- その濃度をチェック (例えばUV/可視分光光度計を使用して) 280 で吸光度を測定して nm。ビールの法則を使用して蛋白質の集中を計算します。
- 因数に蛋白質のサンプルの半分を配布します。嫌気的条件 (例えば、嫌気性チャンバーを用いた) の因数を酸素の完全な除去のために 20 分間インキュベートします。プラスチック フィルムで管を密封し、-20 ° C または蛋白質によって、-80 ° C で試料を保存します。
注: 嫌気性チャンバーを使用する代わりに、チューブはできる脱酸素、アルゴンガスをフラッシュも。
- 氷の上の蛋白質のサンプルを解凍し、削除集計までスピンします。5 mM DTT の 37 ° C で 20 μ M ZnCl2少なくとも 1.5 h のサンプルをインキュベート (蛋白質の集中の 70% まで)。
-
完全に酸化蛋白質の作製
注: 完全還元蛋白質 (前述) から酸化蛋白質のサンプルを準備することをお勧めします。これはシステインの酸化状態の不均一性を減らします。異なる酸化試薬; を使用することが可能です。ここでは、過酸化水素 (H2O2) に注力しています。
注意: は、それは望ましくない分子内ジスルフィド結合と異なるアミノ酸、システイン、メチオニン、チロシンなどの不可逆的酸化につながることができます過剰酸化を避けてください。- 残りの蛋白質のサンプルを 5 mM H2O2 (たて希釈) を追加し、震えながら 40 ° C で 3 時間インキュベートします。
注: この段階で温度はタンパク質に依存し、タンパク質の安定性を調整する必要があります。 - バッファーで列を完全に充填し、バッファーを点滴によって KPi バッファー (40 mM、pH 7.5) でコラムを平衡させ。この手順 2 を繰り返します x。
- 軽くピンセットでそれを押し下げて、削除列の白いディスク フィルターを削除します。KPi のバッファー段間を削除する簡単です。
- KPi バッファーの列を補充し、3 分間 1,000 × g で遠心分離します。
- クリーン チューブに列を移動、列の中央にゆっくりと酸化蛋白質のサンプルを追加、2 分; 1,000 × g で遠心分離酸化タンパク質はフロー ・ スルーになりました。
- 1.2.5、ステップのようにタンパク質の濃度が因数に酸化傷害タンパク質を分割し、それらを店は-20 ° C または-80 ° C、タンパク質に依存を確認します。
- 残りの蛋白質のサンプルを 5 mM H2O2 (たて希釈) を追加し、震えながら 40 ° C で 3 時間インキュベートします。
2. 散乱集計分析
注: この試金の全ての濃度は、シャペロンと基質特異、校正する必要があります。すべてのバッファーは、キュヴェットは清潔でほこりがないとバッファー無料任意の粒子や空気の泡は非常に重要だと 0.22 μ m フィルターをする必要があります。石英キュベットに攪拌機を使用する非常に重要です。望ましくない空気泡を作り出すことがなくソリューション全体の効率的な混合を保障するために異なる攪拌機のサイズと形状を確認してください。また、研究室や施設での異なる flouorospectrometers があります。ここでは、特定の fluorospectrometer が使用された (材料の表を参照してください)。さまざまな楽器がある多様な感度、測定速度、およびサンプラー パラメーター。したがって、知られている集計しやすいタンパク質とその対応する条件を使用して正確な測定パラメーター (例えば、発光および励起帯域幅、感度、および他の人) を最適化する必要があります。クエン酸合成酵素 (CS) および/またはルシフェラーゼをナノモル濃度で初期基板として使用することをお勧めします。
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化学の試
- 40 mM HEPES (pH 7.5) で一晩インキュベーター 12 μ M CS によって変性の基板を準備し、4.5 M GdnCl。PH を維持するために 40 mM HEPES (pH 7.5) で GdnCl を溶解します。
- Fluorospectrometer ソフトウェアを開き、時間コース測定に行きます。パラメーターを設定: 気温: 25 ° CΛem: 360;Em 帯域幅: 5 nm;Λex: 360;Ex 帯域幅: 2.5 nm;データの間隔: 0.5 s。
- サンプルを準備するには、石英キュベットに 40 mm HEPES 1,600 μ L を追加します。キュベットをサンプル ホルダーに挿入し、目的の温度に達するサンプル。
- 攪拌を 600 rpm にセットし、ベースラインが確立されるまで測定を開始します。全体の測定のため攪拌をしてください。
- 120 で、シャペロンの不在で CS の集計を測定する測定に追加 (優しく、しかしすぐに) 変性 CS の 10 μ L (最終濃度 75 nM)。1,200 の測定を続ける s。
- 60 Hsp33 の存在下で CS の集計を測定する測定に追加 Hsp33 (最終濃度 300 nM)。後追加 60 s、変性 CS の 10 μ L を追加 (最終濃度 75 nM)。1,200 の測定を続ける s。
注: 基板またはシャペロン、泡の挿入を避けるために追加する 10 μ L ピペットを使用します。
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加熱凝集アッセイ
注: 温度加熱凝集アッセイをタンパク質の安定性に依存し、独立して各蛋白質にない調整する必要があります。- Fluorospectrometer ソフトウェアを開き、時間コース測定に行きます。パラメーターを次のように設定: 温度: 43 ° C;Λem: 360;発光帯域幅: 5 nm;Λex: 360;励起帯域幅: 2.5 nm;データの間隔: 0.5 s。
- 石英キュベットに予め温めておいた 40 mm HEPES 1,600 μ L を追加してサンプルを準備します。キュベットをサンプル ホルダーに挿入し、43 ° c. に達するサンプル
- 攪拌を 600 rpm にセットし、ベースラインが確立されるまで測定を開始します。全体の測定のため攪拌をしてください。
- 120 で、シャペロンの不在で CS の集計を測定する測定に s は優しく CS を追加 (125 の最終濃度 nM) 1,200 の測定を続けると s。
- 60 Hsp33 の存在下で CS の集計を測定する測定に追加 Hsp33 (最終濃度 600 nM)。後追加 60 s、CS を追加 (125 の最終濃度 nM)。1,200 の測定を続ける s。
注: 基板またはシャペロンに追加する泡の挿入を避けてください。
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Kfits によるデータ解析とノイズ除去
注: KfitsのKfits で利用可能です使用以前 Rimonらに記載されています。45- データ ファイルをアップロードします。
注: 入力は、光散乱測定テキスト コンマ区切りまたはタブ区切り形式での raw の結果です。 - 、任意のノイズを削除するには、解析パラメーターを選択します。使用最高モデルの自動(推奨)、ノイズが信号上常にフラグをマークします。
- 緑と赤の調節可能な行; を使用して明白な外れ値を手動で削除します。この手順は、緑のライン上と下の赤い線のノイズをフィルターします。
- ベースラインとフィット カーブを設定します。ノイズのしきい値を適用すると、処理済みのデータをダウンロードします。
- データ ファイルをアップロードします。
3. 水素重水素交換質量分析法
- バッファーおよび蛋白質のサンプル (Hsp33 と Hsp33-CS の複合体) の準備
- 最終濃度 1 mg/mL ph 7.5 25 mM トリス塩酸バッファー内に蛋白質のサンプルを希釈し、1.5 mL バイアルに転送します。
- 43 ° C で 1:1.5 の割合で CS と Hsp33 の孵化によってタンパク質基質の複雑なサンプルを準備します。
- 任意の迅速な集計を回避し、Hsp33 と熱の CS 間実りのバインディングに段階的に CS を追加します。
- 少なくとも 4 つのステップを使用して (すなわち、最終巻の四分の一を追加するたびに) Hsp33 で CS の保護を許可するすべての付加の後 15 分間サンプルをインキュベートし、。
- 4 ° C で 16,000 x g で 30 分間遠心分離を使用して集計を削除します。
注: 新しいタンパク質基質複合体は新鮮な準備されなければなりません。基板追加は徐々 にすべきであります。そうしないと、集計が発生します。温度、基板および基板濃度は、タンパク質に固有です。 - 準備 H (25 mM トリス-HCl、pH 7.5)、重水素化制御となるバッファーとバッファー D (25 mM Tris DCl, pH 7.09)、重水素化バッファーであります。また新鮮な焼入バッファー (150 mM TCEP, 3 の M GdnCl 0.1% ギ酸) を準備します。
注: 焼入のバッファーは、ペプシン消化後その最長の連なりのカバレッジを得るために興味の蛋白質を最適化する必要があります。 - バイアルにすべてのバッファーとサンプルを転送し、適切な皿にそれらを置きます。25 の ° C (トレイ 25 ° C) で H と D のバッファーを保持します。その一方で、0 - 2 の ° C (0 の ° C ・ トレイ) でサンプルと焼入バッファーを開催します。150 μ L ガラス挿入物のサンプルを配置 (材料の表を参照) 最初に、し、バイアルにそれらを転送します。
- 楽器の準備
注: 質量分析計は、2 つのソフトウェア プログラムに付属が付属して: 1 つはポンプを制御し、他、質量分析計 (材料の表を参照してください)。次の手順は、これらの 2 つのソフトウェア プログラムを使用して説明します。- すべての冷却ユニットを有効に手動で。すべての冷却システムが、ターゲット温度に達すればは、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) と読み込みポンプの両方で手動で切り替えます。
注: 場合、これらは 2 つの冷却槽、冷却ボックス (これはトラップと分析カラムを含む) の構成します。他は 25 ° C でトレイを保持しながら 1 つの冷却装置が 0 の ° C でトレイを冷却します。冷却ボックスの温度は 1-2 ° C です。 - の質量をコントロールするソフトと同様、両方のポンプを制御するソフトウェアを開くMS がスタンバイ状態であることを確認します。
- MS ソースから HPLC アウトレット バルブを切断システム バッファー B とし、「トリプル クリーナー」ソリューション (1% ギ酸、33% アセトニ トリル、33% イソプロパノール、33% メタノール)、最初に (80% アセトニ トリル, 0.1% ギ酸) を洗いし、最後のバッファー (0.1%ギ酸、pH 2.25) し、ペプシン列をシステムに挿入します。バッファーを変更すると、続行する前に両方のポンプを削除ください。
- 両方のポンプの流量は 0.1 mL/分の圧力が安定したことを確認します。
- 定常流と安定した圧力システムを洗浄した後 MS ソースに HPLC コンセントを挿入して MS を入れます。
- すべての冷却ユニットを有効に手動で。すべての冷却システムが、ターゲット温度に達すればは、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) と読み込みポンプの両方で手動で切り替えます。
- 質量パラメーター
- 175 ° c、17、2、aux ガスグローと 4.5 でスプレー電圧鞘ガス流エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) にペプチドのイオン化を設定 kV (補足図 1)。
- 非重水素化サンプルを次のようにパラメーターを設定します。
- パラメーターを設定: 300 - 1500; m/z スキャン範囲解像度 70,000。自動利得制御対象 (AGC) 106;100 ミリ秒で最大射出時間 (それ)。
注: +2 と +6 の荷電状態と 5 の最も強烈なイオン (1.3 × 10 より高い強度4)、30 の動的ウィンドウが孤立したになります。 - 正規化された衝突エネルギー (NCE) 28 の複数衝突電池の高エネルギー衝突解離 (HCD) イオン断片化を実行します。10 の 35,000、AGC ターゲットの解像度でタンデム MS フラグメント イオンを検出5、最大 60 ms、2.0 m/z の分離ウィンドウ。
- パラメーターを設定: 300 - 1500; m/z スキャン範囲解像度 70,000。自動利得制御対象 (AGC) 106;100 ミリ秒で最大射出時間 (それ)。
- 重水素化のサンプルでは、MS1 140,000 の高解像度と似たようなパラメーターのみを採用してください。
- 実験を実行します。
- 次の方法でトレイを設定します。
- トレイ 25 ° C、H と D のバッファーを配置し、0 ° C トレイにサンプルおよび焼入バッファーを配置します。
- 場所 X 空バイアル、両方のトレイで配置、ここで、X = 時間ポイント数 × サンプル数。
注: 25 ° C トレイに空バイアル反応容器として 0 の ° C、トレイに彼らサーブとバイアルを消光として。 - 空の小瓶のそれぞれは空ガラス挿入する処理に含まれています破棄と言った置換実験の間に挿入します。
注: サンプルを同時に実行することができますソフトウェアの最も効率的な最も時間のかからない方法で HDX 実験を実行するために (補足図 2) が使用されました。次の手順は、このソフトウェアを使用して説明します。
- ソフトウェアを開きます。次を実行するプログラムのパラメーターを設定します。
- 選択時間ポイントによっては数分のバッファー D の 45 μ L で各サンプル (5 μ L) を孵化させなさい (例えば1、3、18、40、および 100 分) 25 ° C で代わりに、バッファー時間の 45 μ L で非重水素化サンプルをインキュベートします。
- 、孵化後すぐに冷たい焼入バッファーの 50 μ L に重水素化タンパク質の 50 μ L を混ぜるし、固定化したペプシン列 (直径 2.0 mm、長さ 20 mm) に挿入します。
- バッファー A 50 の速度で 6 分間で洗浄することにより、前の列にペプシン列から任意のペプチドを溶出 μ L/分 Keep バッファーの 0 ° C に冷却ボックスに
- C18 分析カラムに前の列からペプチドの溶出 (C18 カラム、130 Å、1.7 μ m、2.1 mm x 50 mm で、0 ° C で保管) バッファー B としてアセトニ トリル 100% を使用してアセトニ トリル グラデーションを 100 μ L/分実行でアセトニ トリルの線形グラデーションを適用することで区切って: 7 分 2%、10-30%、30-90%、90%、90 8% で、1 分の急勾配で 1.5 分で 2.5 分で 7 分で最終的に 2% で 4 分のコラムを平衡させ、。
- 実行中のシーケンスを構築 (補足図 2参照): すべての時点で、サンプル名、トレイだけでなく、バッファー名の場所と場所を入力してください。
注: ソフトウェアが一度に、効率的に実行時間を短縮するいくつかのサンプルを実行するプログラムにすべての異なった走行時間のアライメントが可能します。
- 次の方法でトレイを設定します。
- データ分析
注意: 我々 はデータ解析、ペプチドの同定と解析シーケンス カバレッジとしてHDX ワークベンチプロテオームの発見者およびMaxQuant (フリー ソフトウェア) を含む過程でいくつかのソフトウェア プログラムで動作します。タンパク質、重水素結合の解析と実験の異なるセット間 HDX 率の比較ができる無料ソフトウェアです。次の手順は、これらのソフトウェア プログラムを使用して説明します。- ソフトウェア (補足図 3) を非重水素化コントロールのサンプルを実行してサンプルのペプチド カバレッジを分析します。次のパラメーターを使用してソフトウェアを設定します。
- (不特定) のない酵素と Sequest HT メソッドを使用して切断します。7 ppm と前駆体のイオンとフラグメントの 0.5 の Da の質量公差 4 144 アミノ酸のペプチドを検索します。動的なメチオニン酸化を可能にします。
- ソフトウェアはペプチド カバレッジを確認することができます蛋白質のためのデータベースを作成します。テキスト形式で識別されたペプチドをエクスポートします。
- HDX ワークベンチ フリーソフト58を使用して重水素化結果を分析します。
- タンパク質エディターを開き、蛋白質シーケンスおよびペプチドのカバレッジ ファイルを挿入することによってタンパク質を定義します。
- 次に、セットアップ ウィザードの実験エディターを開き、要求されたすべての入力を入力してください。
注: サンプル数、タイム ポイントの数、複製の数、バッファー、および温度の pH 値にプログラムが必要です。 - 最後に、プログラムが検出されたペプチドのリストを生成した後、質量分析計に関するパラメーターを入力します。
注: ソフトウェア「HDX「ペプチドを検出、同位体クラスターを検査し、試料中の重水素化明確に可視化を示します。
- ソフトウェア (補足図 3) を非重水素化コントロールのサンプルを実行してサンプルのペプチド カバレッジを分析します。次のパラメーターを使用してソフトウェアを設定します。
- データのプレゼンテーション
- ソフトフェアソフトウェアまたはその他の可視化ソフトウェアを使用して構造上デフ重水素化吸収性領域にラベルを付けます。
- B の係数ではなく重水素吸収レベルを紹介します。
注: https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners で基本的なチュートリアルを見つけることが。
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Representative Results
提示された 2 つのメソッドは、運動活動とシャペロンとその基質蛋白質の相互作用のダイナミクスに従うこと。また、酸化還元プロトコルには、酸化還元に依存した乱れたシャペロン活性化機構のより深い理解を与える、完全還元と酸化型シャペロンの準備ができます。
まず、シャペロンのレドックス依存性活性を調べるために光散乱を使用しました。光散乱酸化 (アクティブ) の存在下での化学的および熱変性 CS タンパク質に対して実行されたまたは減少 (非アクティブ) シャペロン (図 1)。化学変性は不利なバッファーの状態で完全に次のタンパク質のリフォールディングによる急速な CS 集約に します。その一方で、ネイティブ折られた基質の比較的遅い展開から熱誘起集計の結果します。したがって、さまざまな種類の集計処理の速度論的パラメーターで異なります。さらに、異なる集計モードで同一基板の凝集を予防する能力を異なるシャペロンによって異なります。
添加がモル比 1:4 の Hsp33 を酸化変性の両方の形式で (CS: Hsp33) 完全に集約、無視できる値に 360 nm の測定値を下げることを廃止しました。減らされた Hsp33 の存在は、他の一方で、CS の安定性に影響を与えなかったし、シャペロン (図 1) の不在で検出されるものに似た集計曲線を与えた。結果を分析し、 Kfits図 2に模式的に記載されているを使用してバック グラウンド ノイズから掃除します。
重水素酸化物、続いて焼入れと消化、シャペロンのインキュベーション HDX MS 技術の概要から始まり、最後に MS 分析と水素重水素交換プロファイル (図 3)。HDX-MS 中にシャペロンは 25 ° c D2O を含むバッファーでトレイに孵化します。焼入のソリューション、酸性と変化に移管されたタンパク質溶液処理ロボット システム サンプルによって制御される特定の培養時間後、0 ° C でトレイに低 pH ・低温水素交換を減速し、すべてのアミド水素の重水素化レベルを保持しながら変化させる化学物質は消化する適切にそれを有効にする、蛋白質を開きます。ロボット システムは、オンラインのペプシン消化列に流れる冷却ボックスに 0 ° C でトレイからサンプルを転送します。タンパク質の消化後すぐにペプチド脱塩と高速交換 D2O (側鎖の原子に主にある) の除去のため C18 トラップ列に進むと C18 カラムを使用してそれから分かれているし、質量を用いて分析法。1) 有機溶剤によってペプシンの不活性化を防ぐためにペプシンと C18 列バッファーの分離を確保し 2) により、高速に削除するペプチドの脱塩短い 2 つのバルブ システムによってサンプル流量を制御します。交換可能な D2O の分子および塩 (図 4)。
計算力学解析後いただいた各ペプチドの重水素化プロファイル D2o ・ インキュベーション時間の関数としての質量変化を示すHDX ワークベンチソフトウェア (例えば、非連結フォームでアクティブなシャペロン) 各条件の統計解析を作成するのに実験的複製の比較が可能します。次のステップは異なるサンプル間の重水素化曲線の比較たとえば、バインドされているシャペロンと非連結シャペロン。異なるシャペロン状態のこれらの比較は、基質結合に伴う構造の摂動を明らかにできます。遅い exchange バインド済み状態を示す残基は結合パートナーと相互作用する可能性が高い。低下水素重水素交換レートが結合する基質 (図 5A) と実際の直接相互作用することがなく特定の地域のリフォールディングを示すことができますに注意してくださいすることが重要です。HDX ワークベンチソフトウェアにより、タンパク質全体のカバレッジを標準誤差と重水素化を示すことによって「摂動」ビューで結果の検討。
この場合、HDX MS は、その基板の CS に連結および非連結のシャペロン Hsp33 間重水素化パターンを比較する使用されました。結果は、シャペロン (図 5B) の C 末端酸化還元スイッチ ドメイン内のクライアントとの対話サイトを明らかにします。減少、Hsp33 は完全に秩序構造相互作用部位が埋葬されています。Hsp33 の構造を失い、酸化ストレスを感じるときに機能になります。したがって、連結および非連結の条件 (図 5C) の下で減り、酸化 Hsp33 を比較しました。結果は、減らされた Hsp33、かどうか連結または非連結に類似したペプチド曲線を作り出す、間酸化 Hsp33 に有意な差が表示されますを示します。酸化 Hsp33 サンプルは、連結および非連結のシャペロンはアロステリック阻害を示すバインドされた蛋白質の特定の領域での 30% の重水素化違いを示しています。N-末端と thermobile リンカー領域から追加のペプチドの解析は、補足図 3のとおりです。
図 1.光散乱法による集計分析。化学的および熱変性 CS の集計をモニターしていた酸化 Hsp33 (赤) の存在下で減少 Hsp33 (青)、またはシャペロン (黒) がない場合。360 の光散乱 1,200 nm 入院シャペロンのまたは減らされた Hsp33、測定に高原約 300 s に達して急速に集約された CS の存在下での不在で、化学の集計の際に米 (A)。(B) 熱の集計の際に CS はシャペロンのまたは減らされた Hsp33 の存在下での不在で徐々 に集約。両方試金でごくわずか 360 nm 測定値で示した酸化 Hsp33 の存在は集計を完全に廃止。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.Kfits を用いた騒音・ データ解析を削除します。このパネルは、Rimonらテキストで説明されているようにKfitsツールによりデータの分析とノイズ除去を要約スキーマを示しています45.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.HDX MS 方法論のワークフロー 。HDX MS では、蛋白質の背骨に沿って一様にアミド水素の化学的環境を決定する重水素化溶媒を採用しています。興味の蛋白質は、特定の時間帯はネイティブ形式で deuterating バッファー内インキュベートは、低温酸性条件で水素重水素交換を急冷します。タンパク質はペプシンなどの酸性条件下で酵素安定によって消化されます。その後、ペプチドは脱塩、バック交換を避けるために短い時間で区切られました。最後に、ペプチッドは質量分析計による分析、重水素吸収は、 HDX ワークベンチフリーソフト58でたとえば、分析ソフトウェアで評価されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。完全に自動化された HDX MS システムのコンポーネント。この HDX MS の模式図 (A) は、システムのすべての部分を表す: 読み込みポンプと高速液体クロマトグラフィー ポンプ制御バッファー フロー サンプルがシステム内で転送。ロボット システムには、2 つの注射器や重水素化サンプルを準備し、オンライン消化列を介して冷却ボックス (LC コンパートメント) の入力のバルブに蛋白質を転送に使用するトレイが含まれています。消化ペプチドは C18 カラム トラップと分離カラムを監督、その後分離し、質量分析計に指示が。(B) ラボで作成されているために、このパネルは実際の HDX システム セットアップを示しています。(C) このパネルは、オンライン-消化ペプチドの分離の流体構成の図式を示しています。消化と分離システムそれぞれをロードおよび挿入モードの間で切り替えることができる 1 つの弁があります。(左側) 最初の弁は注入ポートに接続されて、ペプシン樹脂に損傷を与えることができます有機溶剤を含まない酸性のバッファーを使用してペプシンの列にサンプルを演出ロード ポンプによって制御されます。サンプルは (主に側鎖) の重水素原子を高速交換し同様、重水素の残基を削除するトラップの列に右のバルブに転送されます。トラップ列で 1-2 分の簡単な洗浄後バルブをロードするためのモードが変更し、アセトニ トリル濃度の増加と高速液体クロマトグラフィー ポンプを使用して C18 分離カラムに試料を洗浄します。このサンプルは、質量分析のための質量分析計に転送されます。チューブの長さはマークされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.HDX MS 結果。結果は、 HDX ワークベンチソフトウェアによって生成されたタンパク質の断片ごと時間をかけて重水素化率として表示されます (A)。各グラフは、いずれかの酸化または減少し、連結および非連結のサンプル間比較蛋白質のサンプルを示しています。ここに示すペプチド フラグメントは YVVITITPSEG は、リンカーの地域で発見されたペプチドおよび LQVMPAQNAQQDDFD は、C 末端ペプチド。(B) 連結および非連結の複合体の重水素化差として提示、最終結果はアミノ酸ごと摂動を示します。(C) A Hsp33 シャペロンの構造モデルは、リンカー、C 末端の不安定な地域で重水素化吸収の相違点を示します。このパネルは、ソフトフェアのソフトウェアを使用して作成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。質量分析計の動作プログラムのインターフェイス。プログラムを使用して、最適化し、HDX 実験用質量分析計のメソッドのパラメーターを定義します。(左側のパネル) にメソッドのパラメーターは、他のプログラムで認識されるようメソッドで保存できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2。この図では、ロボットのサンプリング処理システムと MS LC システムの統合プラットフォームとして機能するソフトウェアのスクリーン ショットを示しています。ソフトウェアは、HDX 実験、重水素化バッファー (青い矢印) で定義されているインキュベーション時間を以下のスケジュールで実行時間を最適化します。たとえば、上記の重水素化バッファーに異なる時間インキュベート Hsp33 バリアント スティルは、の 2 つの複製分析の 17 を実行の図は 0 - 100 分に至るこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 3。これは PGBD および REV34という図は別の Hsp33 亜種からいくつかの Hsp33 ペプチドの重水素吸収の解析。プロットは非連結 (赤) と (青) の束縛状態の Hsp33 で、同じ地域の重水素吸収の変化を示しています。リンカーの地域からのフラグメントを示す展開基板、クエン酸合成酵素との相互作用に HDX 率の大幅な減少、ペプチド N 末端領域は HDX 率に有意差を示さない。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿で我々 は提供されたプロトコルの酸化還元に依存したシャペロン活性解析やクライアントのタンパク質の結合に伴う構造変化の解析。これらは潜在的なシャペロン-基質複合体を定義し、潜在的な相互作用のサイトを分析する相補的な方法論です。
ここでは、よく研究シャペロン基板 CS レドックス調節のシャペロン Hsp33 の複合体のキャラクタリゼーションのためのこれらのプロトコルを適用されます。2 種類の運動と初期状態の異なるタンパク質集計解析の提案: 化学変性時に基板加熱凝集間変性のフォームからその展開プロセスの開始、基板のネイティブ形式から展開を開始しました。
光散乱測定は、蛋白質の集合の相対量を監視する役に立つツールです。シャペロンのアクティブな状態を確認するこのメソッドを使用して、一般的な集計条件、異なる蛋白質の安定性を比較するまたは不安定変異基板とシャペロンの両方を勉強する勉強するそれにさらに使用できます。
そのシンプルさにもかかわらず光散乱法は外れ値をいくつかのノイズの多いデータを生成可能性があります。この問題を克服するためには、上記で説明したKfitsソフトウェアを開発しました。Kfitsソフトウェアは、単に急激に大量のノイズの多いデータを削除し同様と光散乱曲線から速度論的パラメーターを計算することが可能になります。Kfits蛋白質の集合に制限されていないと速度論的測定のあらゆるタイプに適用することができます。
したがって、ここで説明した方法論は、シンプルで簡単に行うには、ない時間がかかる。彼らは、数日以内に調べる、レドックス依存性を有効にする別の分子シャペロンに適用できます。さらに、光散乱とKfitsの説明のプロトコルを使用して、他の非酸化還元依存シャペロンの抗凝集活性を評価できます。温度、タンパク質濃度測定時間など、さまざまなパラメーターがない蛋白質システムごとに独立して調整する必要があることに注意してくださいすることが重要です。
運転サイクル シャペロンを支配する構造の情報を得るために HDX MS 方法論を提案します。光散乱プロシージャと対照をなしてより複雑な技術、質量分析計と、好ましくは、サンプル準備のためのロボット システムを含む特定の計測器が必要です。ただし、この設定を確立できます、既存の施設でのロボット システムがなくても。それが確立されると、手順は比較的簡単です、高分解能手法 (例えば、x 線、NMR) による未到可能性がある挑戦的なタンパク質複合体の解析が可能します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、彼女の役に立つ議論の Meytal Radzinski に感謝と重要な記事のパトリック ・ グリフィンと彼の研究室のメンバーに HDX 解析プラットフォームを確立している間彼らの無制限の支援のために読んでいます。著者はドイツ-イスラエル財団 (私-2332-1149.9/2012)、二国間科学財団 (2015056)、マリー キュリー統合補助金 (618806)、イスラエル共和国の科学技術振興財団に感謝しています (2629 と 1765/13/16)、人間の新領域創成科学金融支援プログラム (CDA00064/2014 年)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX - robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html |
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